CN102727899A - 载蛋白质类药物的plga复合微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载蛋白质类药物的PLGA复合微球及其制备方法，其采用改良复乳-溶剂挥发法，即在复乳法的基础上，应用海藻酸钠与钙离子螯合形成缓释凝胶的原理，以PLGA为微球载体，冻干注射用重组人干扰素-α、牛血清白蛋白等为包裹对象，制备载药微球。其形态圆整，粒度分布均匀，平均粒径分布在70微米左右，载药量为0.6％以上，包封率可达50％左右，体外释药性能符合长效制剂特征。
Description
技术领域
本发明涉及一种载蛋白质类药物的聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)复合微球及其制备方法，属于生物医用高分子材料与生物活性药物控释制剂的交叉研究领域。
背景技术
近年来，随着基因工程重组技术和蛋白组学的发展，多肽和蛋白质类药物已成为目前医药研发领域中最活跃，进展最快的部分，众多新型多肽、蛋白类药物在治疗艾滋病、癌症、肝炎、糖尿病、慢性疼痛等疾病效果显著，另外在诊断以及疫苗预防疾病等方面也发挥着重要的作用。由于该类药物体内外不稳定性，临床上主要的剂型是溶液型注射剂和冻干粉针。注射给药后，药物很快就被清除或降解，为了达到疗效常常需要频繁、大剂量及长时间给药，导致毒副作用及耐受性的产生，严重限制了其在临床上的应用。
近年来，人们对于多肽、蛋白类药物长效剂型的研究越来越多，采用可降解材料将药物包封而成的缓释肌注微球制剂发展很快。国内外科学家在研制缓释微球制剂时，使用最多的生物降解高分子材料是PLGA，因其具有良好的生物降解性、相容性和可吸收性，已被FDA批准为药用辅料。目前已有肌注微球生产上市，用于治疗一些激素依赖性疾病，如促黄体激素释放激素、亮丙瑞林等聚乳酸缓释微球，而国内只上市了小分子肽类——亮丙瑞林的肌注微球仿制剂。总体而言，肌注微球的上市品种少，不能满足临床需求，另外还没有成熟的制备工艺可广泛应用于多肽、蛋白微球的给药体系。
目前国内外学者制备多肽及蛋白类药物微球的方法较多，如溶剂挥发法、喷雾冷冻干燥法、相分离法、喷雾干燥法等，但都存在一些不足。最常用的制备工艺为溶剂挥发法，该法制得的微球包封率较好、药物易于释放，但药物突释现象明显、呈现出两相释放即后期只能维持很低的血药浓度水平难以满足治疗需求。
发明内容
本发明的目的在于提出一种载蛋白质类药物的PLGA复合微球的制备方法，该方法制备的复合微球药物突释低，药物作用时间延长。
实现上述目的的技术方案如下：
一种载蛋白质类药物PLGA复合微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)PLGA溶液的配制
将PLGA溶解于有机溶液中形成有机相，PLGA的浓度为10％～25％(g/ml)；
(2)含蛋白质类药物的海藻酸钠溶液的配制
将蛋白质类药物溶解于含稳定剂的海藻酸钠溶液中形成内水相，蛋白质类药物的浓度为0.5％～10％(g/ml)，稳定剂的浓度为0.1％～5％(g/ml)；海藻酸钠的浓度为0.1％～5％(g/ml)；
(3)初乳的制备
将内水相注射进有机相中形成初乳(W/O)，有机相与内水相的体积比为4∶1～50∶1；
(4)复乳的制备
把初乳在搅拌的情况下加到外水相1中，乳化形成复乳(W/O/W)；所述外水相1为含一定浓度乳化剂的CaCl2水溶液，初乳与外水相1的体积比为1∶10～1∶100；乳化剂的浓度为0.2％～5％(g/ml)，CaCl2浓度为0.1％～10％(g/ml)；
(5)微球的形成
将复乳溶液转移到外水相2中，低速搅拌至有机溶剂挥发完全，离心、洗涤后收集微球；所述外水相2为CaCl2溶液或含乳化剂的CaCl2溶液，其中，CaCl2浓度为0.1％～10％(g/ml)，乳化剂浓度为0.05％～5％(g/ml)，外水相2的体积为复乳的0.8～8倍；
(6)冷冻干燥，即得载蛋白质类药物的PLGA复合微球。
本发明的PLGA复合微球制备方法，是采用改良复乳-溶剂挥发法。将PLGA溶于有机溶媒中；将冻干的重组人干扰素或牛血清白蛋白等蛋白药物溶解于含稳定剂的海藻酸钠溶液中形成内水相；再将内水相注射进有机相中，搅拌乳化成初乳(W/O)；然后将初乳在搅拌的条件下加到含乳化剂的氯化钙水溶液(外水相1)中，乳化成复乳(W/O/W)；再在大体积的氯化钙或含乳化剂的氯化钙溶液(外水相2)中低速搅拌，使有机溶剂挥发完全；离心、洗涤、收集微球，冷冻干燥即得PLGA复合微球粉末。
在其中一个实施例中，所述蛋白质类药物为重组人干扰素-α。
在其中一个实施例中，所述蛋白质类药物为牛血清白蛋白。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，PLGA的浓度为15％～20％(g/ml)。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，蛋白质类药物的浓度为1％～5％(g/ml)，稳定剂的浓度为0.5％～2.5％(g/ml)；海藻酸钠的浓度为0.5％～2.0％(g/ml)。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，有机相与内水相的体积比为10∶1～15∶1；乳化速度为3000～20000rpm，乳化时间为1～10分钟。
在其中一个实施例中，步骤(4)中，初乳与外水相1的体积比为1∶15～1∶75；乳化剂溶液的浓度为0.2％～3％(g/ml)，CaCl2水溶液的浓度为0.5％～4％(g/ml)；复乳形成的搅拌速度为1000～3000rpm，乳化时间为5～20分钟。
在其中一个实施例中，步骤(5)中，外水相2中，CaCl2浓度为0.5～4％(g/ml)，乳化剂浓度为0.1％～3％(g/ml)，外水相2的体积为复乳的3～8倍；搅拌速度为200～2000rpm，离心速度为500～5000rpm，离心时间为5～20分钟，洗涤次数为2～6次。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述的蛋白质类药物的稳定剂为泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、吐温20、吐温80、聚氧乙烯蓖麻油或明胶。
在其中一个实施例中，所述的外水相1和外水相2中的乳化剂为聚乙烯醇、聚乙二醇1000、明胶、吐温20或者聚乙烯吡咯烷酮。
在其中一个实施例中，将所制微球进行冷冻干燥的条件为：-15℃，48h；-25℃，36h；-50℃，24h；-50℃ 48h。
本发明的另一目的是提供一种载蛋白质类药物的PLGA复合微球。
具体技术方案如下：
按照上述方法制备得到的载蛋白质类药物的PLGA复合微球。
本发明是在复乳法的内水相中添加海藻酸钠，外水相中添加氯化钙，在复乳及微球固化过程中，海藻酸钠与钙离子螯合形成缓释凝胶分散在微球骨架中，阻碍蛋白扩散，并使微球结构更为致密。极大地改善普通复乳法制备微球的理化性质，从而降低突释和提高后期释药浓度，达到增加药物稳定性，延长药物作用时间，减少注射次数和用量，提高药物疗效与经济效益的目的。
本发明提出一种改良复乳溶剂挥发法制备PLGA复合微球，在复乳法的基础上，应用海藻酸钠与钙离子螯合形成缓释凝胶的原理，以PLGA为微球载体，冻干注射用重组人干扰素-α、牛血清白蛋白等蛋白药物为包裹对象，制备载药微球。其结构致密表面孔洞较少，从体外释放实验可见该法制备的微球与普通复乳法相比，可降低药物突释，延长药物作用时间。
在同等条件下(其中，改良复乳法为本发明所述微球的制备方法，普通复乳法为内水相中海藻酸钠溶液改为PBS缓冲液(pH＝7.4)，外水相1和外水相2均为不含氯化钙的PVA溶液)制备的干扰素复合微球的理化性质数据如下：
表1 不同制备方法所得复合微球的理化性质
本发明的积极效果是：本发明采用改良复乳-溶剂挥发法制备出的载药PLGA复合微球，相对现有技术中的复乳-溶剂挥发法制备出的载药PLGA微球，本发明所述的复合微球制备工艺稳定、可行，微球的形态圆整，表面光滑，结构致密，流动性好，粒度分布均匀，平均粒径为70微米左右，载药量为0.6％以上，包封率为50％左右，其体外释药突释小，体外释药性能符合长效制剂特征。将蛋白药物制成缓释微球制剂，可延长药物作用时间，提高药物疗效与经济效益。
附图说明
图1本发明制备的干扰素PLGA复合微球的光学显微镜和扫描电子显微镜照片与现有技术中的干扰素PLGA复合微球的比较；
图2为实施例1所述干扰素PLGA复合微球的体外释放曲线图；
图3为实施例2所述干扰素PLGA复合微球的示差扫描量热图谱(DSC)；
图4实施例4所述牛血清白蛋白PLGA复合微球的扫描电子显微镜照片；
图5为实施例4所述牛血清白蛋白PLGA复合微球的考马斯亮蓝G-250染色图。
具体实施方式
以下实施例对本发明作进一步的描述，以便本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 干扰素PLGA复合微球的制备
(1)PLGA溶液的配制
将600mg PLGA溶解于4ml二氯甲烷中形成有机相(15％g/ml)。
(2)干扰素海藻酸钠溶液的配制
将6mg冻干重组人干扰素-α溶解于300ul含1％泊洛沙姆188和1.5％(g/ml)海藻酸钠溶液中形成内水相；
(3)初乳的制备
将内水相注射进有机相中，在10000rpm条件下搅拌乳化1分钟以形成初乳(W/O)；
(4)复乳的制备
把初乳在1800rpm搅拌的情况下加到含2.5％(g/ml)PVA和3.0％(g/ml)CaCl2溶液(外水相1)中，乳化10分钟，乳化成复乳(W/O/W)；其中初乳与外水相1的比例为1∶40；
(5)微球的形成
将复乳溶液转移到5倍量含0.5％(g/ml)PVA和0.5％(g/ml)CaCl2水溶液(外水相2)中，400rpm低速搅拌至有机溶剂挥发完全，1800rpm离心5分钟，用蒸馏水洗涤2次、洗涤后收集微球；
(6)冷冻干燥的条件为冷冻干燥的条件为：-25℃，36h。
将所制微球进行冷冻干燥，在上述冷冻干燥条件下得到白色疏松粉末状干扰素PLGA复合微球。
所得干扰素复合微球，如图1所述，形态圆整，表面光滑，流动性好，粒度分布均匀，平均粒径为71.04μm，载药量为0.7243％，包封率为61.85％，体外释药性能符合长效制剂特征。
图1采用本实施例干扰素PLGA微球的光学显微镜(c)和扫描电子显微镜照片(a)，其中，(b)是根据现有的复乳法的技术(其中，改良复乳法为本发明所述复合微球的制备方法，普通复乳法为内水相中海藻酸钠溶液改为PBS缓冲液(pH＝7.4)，外水相1和外水相2均为不含氯化钙的PVA溶液。)得到干扰素PLGA复合微球的扫描电子显微镜照片，从图中，可以显著看出，本发明所述方法所制备的干扰素PLGA复合微球形态圆整，表面光滑，流动性更好。
图2为本实施例改良复乳法制备的干扰素PLGA复合微球(◆)与根据现有的普通复乳法(同等条件下，内水相中海藻酸钠溶液改为PBS缓冲液(pH＝7.4)，外水相1和外水相2均为不含氯化钙的PVA溶液)得到干扰素PLGA微球(×)的体外释放曲线图，可见，在同等条件下制备的干扰素微球，现有的复乳法制备的微球1天的突释可达37％，大于本发明的所述方法制备的复合微球(改良复乳法)的突释百分比30％。
实施例2 干扰素PLGA复合微球的制备
(1)PLGA溶液的配制
将600mg PLGA溶解于4ml二氯甲烷中形成有机相(15％g/ml)。
(2)干扰素海藻酸钠(Sa)溶液的配制
将6mg冻干重组人干扰素-α溶解于300ul含1％泊洛沙姆407和0.8％(g/ml)海藻酸钠溶液中形成内水相；
(3)初乳的制备
将内水相注射进有机相中，在5000rpm条件下搅拌乳化10分钟以形成初乳(W/O)；
(4)复乳的制备
把初乳在1600rpm搅拌的情况下加到含2.5％(g/ml)PVA和1.5％(g/ml)CaCl2溶液(外水相1)中，乳化10分钟，乳化成复乳(W/O/W)；其中初乳与外水相1的比例为1∶60；
(5)微球的形成
将复乳溶液转移到3倍量含4％(g/ml)CaCl2水溶液(外水相2)中，400rpm低速搅拌至有机溶剂挥发完全，2000rpm离心10分钟，用蒸馏水洗涤3次、洗涤后收集微球；
(6)冷冻干燥的条件为冷冻干燥的条件为：-15℃，48h。
将所制微球进行冷冻干燥，在上述冷冻干燥条件下得到白色疏松粉末状干扰素PLGA复合微球。
所得干扰素微球的形态圆整，表面光滑，流动性好，粒度分布均匀(光学显微镜和扫描电子显微镜照片与实施例1基本相同，在此省略)平均粒径为70.8μm，载药量为0.6009％，包封率为50.1％，体外释药性能符合长效制剂特征。
参见图3，本实施例所述干扰素PLGA微球的差示扫描量热器图谱(DSC)，实验条件为：温度范围：20～300℃；升温速度：10℃/min；氮气流保护；测样量约为5mg。DSC曲线中，横坐标表示温度，纵坐标为热流速率(Heat Flow)，单位为mW/mg，峰向下为吸热。其中，A为空白微球，B为重组人干扰素冻干粉；C为本实施例所制备的干扰素PLGA微球。从图3可见，干扰素冻干粉分别在72℃和223℃有两个吸热峰。空白微球则在50.1℃和71.4℃有吸热峰。干扰素微球仅在57.7℃有吸热峰，比空白微球的第一个吸热峰所对应的温度升高了7.6℃，另外在223℃的干扰素冻干粉的吸热峰也消失了。从而初步确定至少有部分干扰素冻干粉被包裹在PLGA微球中，而不单是吸附在微球表面。
实施例3 干扰素PLGA复合微球的制备
(1)PLGA溶液的配制
将800mgPLGA溶解于4ml二氯甲烷中形成有机相(20％g/ml)。
(2)干扰素海藻酸钠溶液的配制
将6mg冻干重组人干扰素-α溶解于300ul含1％泊洛沙姆188和0.5％(g/ml)海藻酸钠溶液中形成内水相；
(3)初乳的制备
将上述内水相注射进上述有机相中，在18000rpm条件下搅拌乳化1分钟以形成初乳(W/O)；
(4)复乳的制备
把初乳在2500rpm搅拌的情况下加到含2.5％(g/ml)PVA和1.5％(g/ml)CaCl2溶液(外水相1)中，乳化15分钟，乳化形成复乳(W/O/W)；其中初乳与外水相1的比例为1∶30；
(5)微球的形成
将复乳溶液转移到5倍量含0.5％(g/ml)PVA和3.5％(g/ml)CaCl2水溶液(外水相2)中，400rpm低速搅拌至有机溶剂挥发完全，2500rpm离心10分钟，用蒸馏水洗涤3次、洗涤后收集微球；
(6)冷冻干燥的条件为冷冻干燥的条件为：-50℃，24h。
将所制微球进行冷冻干燥，在上述冷冻干燥条件下得到白色疏松粉末状干扰素PLGA微球。
所得干扰素微球的，同实施例1和2一样，形态圆整，表面光滑，流动性好，粒度分布均匀，平均粒径为53.4μm，载药量为0.5637％，包封率为59.9％，体外释药性能符合长效制剂特征。
实施例4 牛血清白蛋白PLGA复合微球的制备
(1)PLGA溶液的配制
将300mg PLGA溶解于2ml二氯甲烷中形成有机相(15％g/ml)。
(2)牛血清白蛋白海藻酸钠溶液的配制
将3mg牛血清白蛋白溶解于150ul含1％泊洛沙姆188和1.5％(g/ml)海藻酸钠溶液中形成内水相；
(3)初乳的制备
将内水相注射进有机相中，在10000rpm条件下搅拌乳化1分钟以形成初乳(W/O)；
(4)复乳的制备
把初乳在1500rpm搅拌的情况下加到含2.5％(g/ml)PVA和0.5％(g/ml)CaCl2溶液(外水相1)中，乳化10分钟，乳化成复乳(W/O/W)；其中初乳与外水相1的比例为1∶45；
(5)微球的形成
将复乳溶液转移到8倍量含0.25％(g/ml)PVA和3.5％(g/ml)CaCl2水溶液(外水相2)中，600rpm低速搅拌至有机溶剂挥发完全，3500rpm离心5分钟，用蒸馏水洗涤4次、洗涤后收集微球；
(6)冷冻干燥的条件为：-50℃，48h。
将所制微球进行冷冻干燥，在上述冷冻干燥条件下得到白色疏松粉末状牛血清白蛋白PLGA复合微球。
所得牛血清白蛋白复合微球，参见图4牛血清白蛋白的复合微球的扫描电子显微镜照片，其形态圆整，表面光滑，流动性好，粒度分布均匀，平均粒径为100.8μm，载药量为0.6981％，包封率为55.48％，体外释药性能符合长效制剂特征。
考马斯亮蓝G-250染色液可以专属性地对蛋白染色，游离的G-250可与蛋白结合形成蓝色复合物，通过判断复合微球的表面染色的深浅程度可得知复合微球表面蛋白的分布情况。本次实验分别对空白微球a、本发明的改良复乳法b和普通复乳法c制备的牛血清白蛋白PLGA复合微球进行染色，结果见图5。
从图可见空白微球呈浅蓝色，普通复乳法、改良复乳法制备的牛血清白蛋白微球分别呈现出深蓝色和蓝色中夹杂着深蓝色的微粒。说明与普通复乳法制备的微球比较，使用改良复乳法制备的微球表面蛋白的分布量较少。改良法制备的微球结构更紧密，更多的蛋白被包载在微球内部，停留在微球表面的蛋白量相对减少。
实施例5 牛血清白蛋白PLGA复合微球的制备
(1)PLGA溶液的配制
将600mg PLGA溶解于4ml二氯甲烷中形成有机相(15％g/ml)。
(2)牛血清白蛋白海藻酸钠溶液的配制
将6mg牛血清白蛋白溶解于300ul含1％泊洛沙姆188和1.5％(g/ml)海藻酸钠溶液中形成内水相；
(3)初乳的制备
将内水相注射进有机相中，在15000rpm条件下搅拌乳化2分钟以形成初乳(W/O)；
(4)复乳的制备
把初乳在1800rpm搅拌的情况下加到含2.5％(g/ml)PVA和1.5％(g/ml)CaCl2溶液(外水相1)中，乳化15分钟成复乳(W/O/W)；其中初乳与外水相1的比例为1∶52；
(5)微球的形成
将复乳溶液转移到3.5倍量含0.4％(g/ml)PVA和0.7％(g/ml)CaCl2水溶液(外水相2)中，400rpm低速搅拌至有机溶剂挥发完全，2000rpm离心10分钟，用蒸馏水洗涤4次、洗涤后收集微球；
(6)冷冻干燥的条件为：-50℃，24h。
将所制微球进行冷冻干燥，在上述冷冻干燥条件下得到白色疏松粉末状牛血清白蛋白PLGA复合微球。
所得牛血清白蛋白微球的形态圆整，表面光滑，流动性好，粒度分布均匀，平均粒径为72.5μm，载药量为0.524％，包封率为54.70％，体外释药性能符合长效制剂特征。
实施例6 牛血清白蛋白PLGA复合微球的制备
(1)PLGA溶液的配制
将1.2g PLGA溶解于8ml二氯甲烷中形成有机相(15％g/ml)。
(2)牛血清白蛋白海藻酸钠溶液的配制
将12mg牛血清白蛋白溶解于600ul含2％吐温80和1.5％(g/ml)海藻酸钠溶液中形成内水相；
(3)初乳的制备
将内水相注射进有机相中，在12000rpm条件下搅拌乳化1分钟以形成初乳(W/O)；
(4)复乳的制备
把初乳在3000rpm搅拌的情况下加到含2％(g/ml)PVA和1.5％(g/ml)CaCl2溶液(外水相1)中，乳化5分钟，乳化成复乳(W/O/W)；其中初乳与外水相1的比例为1∶70；
(5)微球的形成
将复乳溶液转移到6倍量含0.25％(g/ml)PVA和0.4375％(g/ml)CaCl2水溶液(外水相2)中，300rpm低速搅拌2h有机溶剂挥发完全，2000rpm离心15分钟，用蒸馏水洗涤2次、洗涤后收集微球；
(6)冷冻干燥的条件为：-50℃，48h。
将所制微球进行冷冻干燥，在上述冷冻干燥条件下得到白色疏松粉末状牛血清白蛋白PLGA复合微球。
所得牛血清白蛋白微球的形态圆整，表面光滑，流动性好，粒度分布均匀，平均粒径为54.7μm，载药量为0.5877％，包封率为58.4％，体外释药性能符合长效制剂特征。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.一种载蛋白质类药物的PLGA复合微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)PLGA溶液的配制
将PLGA溶解于有机溶液中形成有机相，PLGA的浓度为10％～25％(g/ml)；
(2)含蛋白质类药物的海藻酸钠溶液的配制
将蛋白质类药物溶解于含稳定剂的海藻酸钠溶液中形成内水相，蛋白质类药物的浓度为0.5％～10％(g/ml)，稳定剂的浓度为0.1％～5％(g/ml)；海藻酸钠的浓度为0.1％～5％(g/ml)；
(3)初乳的制备
将内水相注射进有机相中形成初乳，有机相与内水相的体积比为4∶1～50∶1；
(4)复乳的制备
把初乳在搅拌的情况下加到外水相1中，乳化形成复乳；所述外水相1为含一定浓度乳化剂的CaCl2水溶液，初乳与外水相1的体积比为1∶10～1∶100；乳化剂的浓度为0.2％～5％(g/ml)，CaCl2浓度为0.1％～10％(g/ml)；
(5)微球的形成
将复乳溶液转移到外水相2中，低速搅拌至有机溶剂挥发完全，离心、洗涤后收集微球；所述外水相2为CaCl2溶液或含乳化剂的CaCl2溶液，其中，CaCl2浓度为0.1％～10％(g/ml)，乳化剂浓度为0.05％～5％(g/ml)，外水相2的体积为复乳的0.8～8倍；
(6)冷冻干燥，即得载蛋白质类药物的PLGA复合微球。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述蛋白质类药物为重组人干扰素-α或牛血清白蛋白。
3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中，PLGA 的浓度为15％～20％(g/ml)；所述有机溶液为二氯甲烷。
4.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，步骤(2)中，蛋白质类药物的浓度为1％～5％(g/ml)，稳定剂的浓度为0.5％～2.5％(g/ml)；海藻酸钠的浓度为0.5％～2.0％(g/ml)。
5.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，步骤（3）中，有机相与内水相的体积比为10:1～15:1；乳化速度为3000～20000rpm，乳化时间为1～10分钟。
6.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，步骤（4）中，初乳与外水相1的体积比为1:15～1:75；乳化剂溶液的浓度为0.2%～3%（g/ml），CaCl2水溶液的浓度为0.5%～4%（g/ml）；复乳形成的搅拌速度为1000～3000rpm，乳化时间为5～20分钟。
7.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，步骤（5）中，外水相2中，CaCl2浓度为0.5%～4%（g/ml），乳化剂浓度为0.1%～3%（g/ml）；外水相2的体积为复乳的3～8倍；搅拌速度为200～2000rpm，离心速度为500～5000rpm，离心时间为5～20分钟，洗涤次数为2～6次。
8.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的蛋白质类药物的稳定剂为泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、吐温20、吐温80、聚氧乙烯蓖麻油或明胶。
9.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，所述的外水相1和外水相2中的乳化剂为聚乙烯醇、聚乙二醇1000、明胶、吐温20或者聚乙烯吡咯烷酮。
10.根据权利要求1或2述制备方法，其特征在于，所制微球进行冷冻干燥的条件为：-15℃,48h；-25℃,36h；-50℃，24h；或-50℃ 48h。
11.根据权利要求1-10任一项制备方法得到的载体蛋白质类药物的PLGA 复合微球。
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