CN107073165A

CN107073165A - 微载体的调制方法、微载体及其应用

Info

Publication number: CN107073165A
Application number: CN201580057504.XA
Authority: CN
Inventors: 卡洛琳娜·安东尼娅·弗朗辛娜·玛利亚·凡斯普勒韦-古森斯
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2035-10-22
Also published as: JP6346672B2; EP3210634B1; ES2744547T3; EP3210634B8; JPWO2016063935A1; WO2016063935A1; US10842877B2; EP3210634A4; EP3210634A1; US20190201536A1; US10279043B2; CN107073165B; US20170304458A1

Abstract

本发明的课题在于提供一种能够获得具有特有的性质及粒度分布的多孔微载体的调制方法，并提供一种具有优异的细胞增殖特性的明胶多孔微载体。根据本发明，提供一种包括使用了具有特定HLB值的乳化剂的含量的乳化工序的基因重组明胶多孔微载体的调制方法及具有特定的空隙的明胶多孔微载体。

Description

微载体的调制方法、微载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种明胶多孔微载体、基因重组明胶多孔微载体的调制方法及多孔微载体的应用。

背景技术

人或动物的身体受到损伤时，为小规模的组织损伤时，则通常能够利用自身原本具备的修复系统进行修复。然而，伴随心肌梗塞或外伤之类的严重的组织损伤的损伤常会超过自身的再生能力。为严重的组织损伤时，需要帮助组织修复的处理。

作为由广泛的组织损伤产生的问题之一，存在如何关闭或填充所产生的空间或孔这样的问题点。考虑到该问题，能够使用支架作为用于填充到组织所缺损的部位的空间或孔中的(半)永久性填充材料。并且，支架还能够作为用于放出生长因子和药品的、或用于运送细胞的缓释储存场所来使用。通过在对身体注射或移植细胞之前在支架上预先播种所期望的细胞，从而能够进行细胞运输。

明胶经常以多孔微载体等方式被用作支架的构成材料。因此，明胶多孔微载体的产品引人注目。

专利文献1(WO03/104313)中提出有一种天然明胶多孔微载体的调制方法，其中，尼尔森(Nilsson)能够用作组织再生的支架。尼尔森的调制方法包括两个阶段的乳化工序，在每一个工序中，使用HLB值(hydrophilic-balance)被规定的表面活性剂。尼尔森在第一乳化工序中，对包含HLB值大于9的乳化剂的均匀的水溶性明胶溶液进行调制，并添加包含有机溶剂及HLB值大于9的乳化剂的第一组合物。并且，尼尔森在第二乳化工序中，添加包含有机溶剂及HLB值小于8的乳化剂的第二组合物，将明胶材料进行冷却并使其凝固，最终获得微载体。

发明内容

发明要解决的技术课题

在本发明人等的研究中，本研究人员等通过尼尔森等的天然明胶的方法，从基因重组明胶中，试图调制多孔微载体。然而，将尼尔森的方法用于基因重组明胶时，获得搅拌粉末之类的粒子或不均匀的粒子的块，对于细胞培养，均为不理想。因此，本发明的课题在于提供一种能够获得具有特有的性质及粒度分布的多孔微载体的调制方法。

并且，在本发明人等的研究中，本研究人员等本研究者尝试对具有经改善的细胞增殖特性的多孔微载体进行调制。因此，本发明的课题在于提供一种具有优异的细胞增殖特性的明胶多孔微载体。

用于解决技术课题的手段

本发明人等进行了深入研究，其结果令人惊奇的是本发明人等发现了，能够通过实施第二乳化工序来获得具有细胞增殖优异的性质的基因重组明胶多孔微载体，所述第二乳化工序中，改变尼尔森等上述方法，并使用几乎不包含或完全不包含HLB小于8的乳化剂的非水溶性液体。该发现是与在第二乳化工序中使用显著量的乳化剂的尼尔森的方法完全相反的见解。并且，如以下所详述，为了提供为了基因重组明胶而从以前未知的特有的性质及粒度分布的多孔微载体而能够使用尼尔森的方法中的该变更。

并且，本发明人等惊奇地发现，具有如后述那样定义的特性的微载体能够通过上述方法等进行调制，相比于可在市面上获得的微粒子具有特别优异的细胞增殖特性。

[1]一种基因重组明胶多孔微载体的调制方法，其包括：工序(a)，混合包含水、基因重组明胶、非水溶性液体及乳化剂的组合物，生成第一乳液；工序(b)，以比明胶的凝胶化温度高的温度混合上述第一乳液和非水溶性液体，生成第二乳液；及工序(c)，将第二乳液冷却至明胶凝固的温度，上述工序(b)中所使用的非水溶性液体包含含量小于0.5重量％的HLB值小于8的乳化剂。

[2]根据[1]所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述工序(b)中所使用的非水溶性液体不包含HLB值小于8的乳化剂。

[3]根据[1]所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述工序(b)中所使用的非水溶性液体不包含乳化剂。

[4]根据[1]～[3]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述工序(a)中所使用的乳化剂的HLB值大于9。

[5]根据[1]～[4]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述第一乳液的pH在3～11的范围内。

[6]根据[1]～[5]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述基因重组明胶的等电点至少为5。

[7]根据[1]～[6]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述基因重组明胶不包含羟基脯氨酸。

[8]根据[1]～[7]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其还包括从第二乳液中去除已凝固的明胶的工序(d)。

[9]根据[1]～[8]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述基因重组明胶包含至少3个RGD基序。

[10]根据[1]～[9]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述基因重组明胶包含至少两个赖氨酸残基，两个赖氨酸残基为末端的赖氨酸残基，第一末端的赖氨酸残基为最靠近明胶的N末端的赖氨酸残基，第二末端的赖氨酸残基为最靠近明胶的C末端的赖氨酸残基，上述末端的赖氨酸残基与明胶中的总氨基酸残基数相差至少25％。

[11]根据[1]～[10]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述工序(b)中上述非水溶性液体的体积大于上述第一乳液的体积。

[12]根据[1]～[11]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述工序(c)中以0.1～20℃/分钟进行冷却。

[13]根据[1]～[12]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述第一乳液包含至少1～15重量％的基因重组明胶。

[14]根据[1]～[13]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其中，上述工序(a)中所使用的组合物包含：1～15重量％的基因重组明胶；10～70重量％的水；20～90重量％的非水溶性液体；及0.5～20重量％的乳化剂。

[15]根据[1]～[14]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其还包括在上述工序(b)中和/或工序(b)之后交联明胶的工序。

[16]根据[1]～[15]中任一个所述的多孔微载体的调制方法，其还包括在上述工序(b)之后进行明胶的脱水热交联的工序。

[17]一种基因重组明胶多孔微载体，其通过[1]～[16]中任一个所述的多孔微载体的调制方法而获得。

[18]根据[17]所述的基因重组明胶多孔微载体，其具倍具有至少5μm的平均直径的表面孔，并具有至少50体积％的平均空隙率。

[19]根据[17]或[18]所述的基因重组明胶多孔微载体，其中，平均粒径为20～800μm。

[20]根据[17]～[19]中任一个所述的基因重组明胶多孔微载体，其中，平均密度为0.04～0.5g/cm³。

[21]根据[17]～[20]中任一个所述的基因重组明胶多孔微载体，其中，平均体积为2～25cm³/g。

[22]根据[18]～[21]中任一个所述的基因重组明胶多孔微载体，其通过[1]～[16]中任一个所述的多孔微载体的调制方法而获得。

[23]根据[17]所述的基因重组明胶多孔微载体，其中，平均粒径为20～800μm，至少80％的微载体具有平均粒径的30％～200％的粒径。

[24]一种[17]～[23]中任一个所述的基因重组明胶多孔微载体作为细胞载体的应用。

[25]一种[17]～[23]中任一个所述的基因重组明胶多孔微载体作为用于修复组织损伤的支架的应用。

[26]一种复合材料，其包含[17]～[23]中任一个所述的基因重组明胶多孔微载体及细胞，上述细胞存在于上述微载体的表面和/或内部。

[27]一种注射用组合物，其包含药理学上可接受的载体及[17]～[23]中任一个所述的基因重组明胶多孔微载体或[26]所述的复合材料。

[28]根据[27]所述的注射用组合物，其能够通过具有80～4000μm的内部口径的注射器进行注射。

[29]一种明胶多孔微载体，其具有空隙，至少一半的上述空隙为球状和/或至少一半的上述空隙相对于平均空隙直径具有-30％～+30％的直径。

[30]根据[29]所述的微载体，其具有表面孔，所述表面孔具有至少5μm的平均直径。

[31]根据[29]或[30]所述的微载体，其具有至少50体积％的平均空隙率。

[32]根据[29]～[31]中任一个所述的微载体，其中，上述空隙的平均直径在微载体的平均粒径的5～25％的范围。

[33]根据[29]～[32]中任一个所述的微载体，其中，平均粒径为20～800μm。

[34]根据[29]～[33]中任一个所述的微载体，其中，平均密度为0.04～0.5g/cm³。

[35]根据[29]～[34]中任一个所述的微载体，其中，平均体积为2～25cm³/g。

[36]根据[29]～[35]中任一个所述的微载体，其中，平均粒径为20～800μm，至少80％的微载体具有平均粒径的30％～200％的粒径。

[37]根据[29]所述的微载体，其具有：具有至少5μm的平均直径的表面孔；至少50体积％的平均空隙率；及20～800μm的平均粒径，且至少一半以上的空隙为球状，至少80％的微载体具有平均粒径的30％～200％的粒径，空隙的平均直径在微载体的平均粒径的5～25％的范围。

[38]根据[29]所述的微载体，其具有：具有至少5μm的平均直径的表面孔；至少50体积％的平均空隙率；及20～800μm的平均粒径，且至少一半以上的空隙具有相对于平均空隙直径为-30％～+30％的直径，至少80％的微载体具有平均粒径的30％～200％的粒径，空隙的平均直径在微载体的平均粒径的5～25％的范围。

[39]根据[37]或[38]所述的微载体，其中，至少75％的空隙为球状。

[40]根据[29]～[39]中任一个所述的微载体，其中，上述明胶为基因重组明胶。

[41]根据[29]～[40]中任一个所述的微载体，其中，上述明胶为等电点至少为5的基因重组明胶。

[42]根据[29]～[41]中任一个所述的微载体，其中，上述明胶为不包含羟基脯氨酸的基因重组明胶。

[43]根据[29]～[42]中任一个所述的微载体，其中，上述明胶为包含至少3个RGD基序的基因重组明胶。

[44]根据[29]～[43]中任一个所述的微载体，其中，上述明胶为如下基因重组明胶：包含至少两个赖氨酸残基，两个赖氨酸残基为末端的赖氨酸残基，第一末端的赖氨酸残基为最靠近明胶的N末端的赖氨酸残基，第二末端的赖氨酸残基为最靠近明胶的C末端的赖氨酸残基，上述末端的赖氨酸残基与明胶中的总氨基酸残基数相差至少25％。

[45]一种根据[29]～[44]中任一个所述的微载体作为细胞载体的应用。

[46]一种根据[29]～[44]中任一个所述的微载体作为用于修复组织损伤的支架的应用。

[47]一种复合材料，其包含[29]～[44]中任一个所述的微载体及细胞，上述细胞存在于上述微载体的表面和/或内部。

[48]一种注射用组合物，其包含药理学上可接受的载体及[29]～[44]中任一个所述的微载体或[47]所述的复合材料。

[49]根据[47]所述的注射用组合物，其能够通过具有80～4000μm的内部口径的注射器进行注射。

发明效果

根据本发明的基因重组明胶多孔微载体的调制方法，能够提供如以下详述为了基因重组明胶而具有从以前未知的特有的性质及粒度分布的多孔微载体。

并且，本发明的明胶多孔微载体相比于可在市面上获得的微粒子具有特别优异的细胞增殖特性。

附图说明

图1中，图1a～1c表示工序(b)中所使用的非水溶性液体包含含量小于0.5重量％的HLB值小于8的乳化剂的、通过本发明的方法所获得的微载体的SEM(scanning electronmicroscope：扫描型电子显微镜)照片。

图2中，图2a～2c表示工序(b)中所使用的非水溶性液体包含含量为0.5重量％以上的HLB值小于8的乳化剂的、从本发明的方法改变之后的比较例的微载体的SEM照片。

图3中，图3a～3c表示可从GE公司购买的市售的CultiSpherG(注册商标)微载体的SEM照片。

图1a表示50倍的放大率下的、通过本发明的方法所获得的微载体的概观。图1a的微载体适当地为球状，具有狭窄范围的尺寸分布，几乎不存在或完全不存在粒子聚在一起的块。图1b表示230倍的高放大率下的通过本发明的方法所获得的微载体，能够明确地观察表面孔(1)。表面孔(1)与微粒子内的空隙相连(这些内部空隙在该照片中无法看到)。图1c为通过本发明的方法所获得的微载体的剖视图，并表示内部空隙(2)，至少一半的空隙为球状，并且至少一半的上述空隙具有相对于平均空隙直径为-30％～+30％的直径。并且，表示内部空隙比以图2c及图3c的比较例的微载体所表示的、所对应的剖视图的内部空隙大。另外，图1c的空隙(2)大致为球状，在球状的空腔彼此重复或接触时与相邻的空隙结合的空隙的壁中具有小的细孔。空隙(2)在与微载体的大小的关系中大致较大，且具有狭窄范围的尺寸分布(例如，空隙(2)分别为大致相同的大小)。

本发明的微载体能够提供伴随在细胞量及细胞率的观点来看良好的细胞增殖的细胞培养，尤其能够在维持培养的微载体的悬浮的动态的细胞培养中适当地使用，操作也容易。

图2a为100倍的放大率下的通过上述比较例的方法所获得的微载体的概观。比较例的微载体为如实施例的项目中详细记载那样工序(b)的玉米油包含5重量％的HLB值小于8的乳化剂的通过其他方法所获得的微载体。图2a的微载体的大部分分别一同成为块，其结果，形成不一样的形状的二次粒子，并具有广范围的尺寸分布。图2b为750倍的放大率下的通过比较例的方法所获得的微载体。比较例的微载体为非球状的形状，并具有较大的表面孔(3)，分别一同成为块，形成二次结构。图2c为通过比较例的方法所获得的微载体的剖视图，并且可知内部空隙(4)在大小、形状的观点出发为不规则，其中大多与图1b所示的本发明的微载体相比，相对于微载体的直径非常小。另外，图2c的微粒子中的空隙(4)具有非常广范围的尺寸分布。图2c的大部分空隙(4)不是球状，不到一半的该空隙具有相对于平均空隙直径为-30％～+30％的直径。

图3a是50倍的放大率下的、市售的CultiSpherG(注册商标)微载体的概观。图3b为600倍的放大率下的一个CultiSpherG(注册商标)微载体，能够明确地观察表面孔(5)。图3c是300倍的放大率下的CultiSpherG(注册商标)微载体的剖视图。与图1c相比，图3c所示的CultiSpherG(注册商标)微载体内的空隙(6)为不规则的大小和形状，大多数比起球状的空隙，倒不如为圆筒状或管状的孔。图3c所述的多数空隙(6)比微载体的粒径小，并且与图1c的微载体相比，为广范围的尺寸分布。如此一来，图3c的大部分空隙(6)不是球状，不到一半的该空隙具有相对于平均空隙直径为-30％～+30％的直径。

具体实施方式

本说明书中所使用的术语“基因重组明胶”包括基因重组胶原，术语“明胶”包括胶原。因此，在本说明书中，术语“明胶”、“胶原”、“胶原多肽”及“明胶多肽”以相同的意义使用。

空隙有时记载为空间或空腔。

本发明所涉及的基因重组明胶中，平均分子量优选小于150kDa，更优选小于100kDa，并且优选为至少5kDa，更优选为至少10kDa，进一步优选为至少30kDa。基因重组明胶的平均分子量的优选范围为50kDa～100kDa、20kDa～75kDa及5kDa～40kDa。为了低粘度而需要高质量浓度的明胶时，优选更低的分子量。并且，本发明的明胶多孔微载体的明胶不限定于基因重组明胶，明胶的平均分子量的优选范围是与上述基因重组明胶相关的记载相同的范围。

另外，本发明所涉及的明胶优选为基因重组明胶。

基因重组明胶在市面上能够购买例如Fujifilm Corporation制造的明胶。基因重组明胶能够利用已知的方法进行调制，例如，能够使用专利申请EP0926543、EP1014176中所记载的方法，该方法的内容通过参考包含于本说明书中。调制基因重组明胶的方法“Highyield secretion of recombinant gelatins by Pichia patoris，M.W.T.Werten etal.Yeast 15，1087-1096(1999)”也有记载。优选的基因重组明胶在WO2004/85473中也有记载。

作为一实施方式，能够举出如下：基因重组明胶包含至少两个赖氨酸残基，两个赖氨酸残基为末端的赖氨酸残基(extreme lysine residue)，第一末端的赖氨酸残基为最靠近明胶的N末端的赖氨酸残基，第二末端的赖氨酸残基为最靠近明胶的C末端的赖氨酸残基，末端的赖氨酸残基脱离明胶中的总氨基酸残基数的至少25％。这种基因重组明胶例如能够通过US2009/0246282中所记载的方法获得。

另外，作为本发明的其他实施方式，能够举出如下：基因重组明胶包含至少两个氨基酸残基，该两个氨基残基为末端的氨基酸残基(extreme amino acid residue)，它们分别独立地选自天冬氨酸残基及谷氨酸残基，第一末端的天冬氨酸残基或谷氨酸残基为最靠近多肽的N末端的天冬氨酸残基或谷氨酸残基，第二末端的天冬氨酸残基或谷氨酸残基为最靠近多肽的C末端的天冬氨酸残基或谷氨酸残基，这些末端的天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基脱离基因重组明胶多肽中的总氨基酸残基数的至少25％。另外，作为本发明的其他实施方式，基因重组明胶为在上述末端的天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基具有至少一个天冬氨酸残基或谷氨酸残基的明胶。

作为一实施方式，基因重组明胶的多肽尤其在不是高于5℃的温度，或高于25℃的温度下不形成稳定的三股螺旋。

本发明所涉及的基因重组明胶优选在相当于哺乳动物或鱼等源自低温动物的明胶的GXY三联体中包含脯氨酸。

为了防止稳定的三股螺旋的形成，优选小于2％，更优选小于1％的存在于基因重组明胶中的氨基酸优选为具有羟基的氨基酸。羟基脯氨酸的存在能够通过并不共表达进行脯氨酸残基的羟基化的酶的微生物中的发现、或利用其他方法满足该作用来防止。实际上所谓0是指酵母等的生长培养基中的羟基脯氨酸的存在导致几个这些氨基酸掺入到明胶中。

作为优选的实施方式，基因重组明胶具有优异的细胞粘接特性，优选不表示任何健康相关的风险。这个情况能够通过使用增加了RGD的基因重组明胶、例如RGD基序相对于氨基酸的总数的比例至少为0.4的基因重组明胶来实现。如果增加了RGD的明胶具有350以上的氨基酸时，优选350个氨基酸的各范围具有至少一个RDG基序。RGD基序的比例优选至少为0.6，更优选至少为0.8，进一步优选至少为1.0，进一步优选至少为1.2，最优选至少为1.5。

RGD基序的比例0.4每250个氨基酸与一个RGD序列对应。RGD基序的数为整数，因此，为了至少对应于0.4％，包含251个氨基酸的明胶必须具有至少两个RGD序列。增加了RGD的基因重组明胶优选每250个氨基酸具有至少两个RGD，更优选每250个氨基酸具有至少3个RGD，最优选每250个氨基酸具有至少4个RGD。作为其他实施方式，增加了RGD的明胶具有至少4个RGD基序，优选具有至少6个RGD基序，更优选具有至少8个RGD基序，最优选具有至少12～16个RGD基序。

本发明所涉及的基因重组明胶优选为源自胶原序列。对胶原进行编码的核酸大体记载于公知文献中(例如参考Fuller and Boedtker(1981)Biochemistry 20：996-1006；Sandell et al.(1984)J Biol Chem 259：7826-34；Kohno et al.(1984)J Biol Chem259：13668-13673；French et al.(1985)Gene 39：311-312；Metsaranta et al.(1991)JBiol Chem266：16862-16869；Metsaranta et al.(1991)Biochim Biophys Acta 1089：241-243；Wood et al.(1987)Gene 61：225-230；Glumoff et al.(1994)Biochim BiophysActa 1217：41-48；Shirai et al.(1998)Matrix Biology 17：85-88；Tromp et al.(1988)Biochem J 253：919-912；Kuivaniemi et al.(1988)Biochem J 252：633640；and Ala-Kokko et al.(1989)Biochem J 260：509-516)。

增加了RGD基序的基因重组明胶例如能够通过US2006/0241032中所记载的通常的方法来调制。

为了用于医药或医疗用途，优选为具有与天然人胶原的氨基酸序列接近或相同的氨基酸序列的基因重组明胶明胶的氨基酸序列更优选为包括位于天然人胶原的重复氨基酸序列、尤其为了制作增加了RGD的基因重组明胶而包含RGD基序的序列的明胶。所选择的序列中的RGD基序的比例依赖于所选择的序列的所选择的长度，更短序列的选择必然带来最终基因重组明胶更高的RGD基序的比例。所选择的氨基酸序列的重复使用能够为了提供具有比天然明胶高的分子量的基因重组明胶而使用。另外，与天然明胶相比，能够获得非抗原性且增加了RGD的基因重组明胶。

因此，作为优选的实施方式，基因重组明胶包括一部分天然人胶原序列。明胶优选为增加了包含至少80％的一个以上的天然人体明胶氨基酸序列的一个以上的部位的RGD的明胶。人体明胶序列的这种部位分别具有优选至少30个氨基酸的长度，更优选至少45个氨基酸的长度，进一步优选至少60个氨基酸的长度，例如具有240个为止的长度，优选150个为止的长度，更优选120个为止的长度，每一个部位优选包括一个以上的RGD序列。增加了RGD的明胶优选包括一个以上的天然人胶原序列的一个以上的部位。

适合于本发明的方法中所使用的基因重组明胶的起源的例为人COL1A1-1。包括RGD序列的250个氨基酸的部位记载于WO04/85473中。基因重组明胶的RGD序列能够与被称作整合素的细胞表面上的特定的受体结合。

增加了RGD的明胶例如能够通过EP-A-0926543、EP-A-1014176或WO01/34646、尤其最初的两个专利公开公报的实施例中记载的基因重组方法来制造。制造增加了RGD的基因重组明胶的优选的方法包括以对包括RGD氨基酸序列的对一部分胶原蛋白进行编码的天然核酸序列开始的方法。通过重复该序列，能够获得增加了RGD的基因重组明胶。

这样一来，基因重组明胶能够通过利用适当的微生物表达对明胶进行编码的核酸来制造。该方法能够在真菌细胞或酵母细胞中适当地进行。宿主细胞适合为汉逊酵母属(Hansenula)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、脉孢菌(Neurospora)或毕赤酵母属(Pichia)等高表达的宿主细胞。由于它们不易受到重复的序列的不适当的表达，因此真菌及酵母细胞比细菌优选。宿主更优选不具有攻击明胶结构的表达的高级蛋白酶。在这一点上，毕赤酵母属(Pichia)或汉逊酵母属(Hansenula)能够列举为非常合适的表达系统的例。作为表达系统，毕赤酵母属表达系统(Pichia pastoris)的应用在EP0926543及EP1014176中有公开。微生物能够消除特定的如脯氨酸的羟基化、赖氨酸的羟基化等翻译之后的处理机构的活化。代替宿主系统能够通过将明胶高效地进行羟基化而具有内源性的脯氨酸羟基化活性。

作为其他实施方式，基因重组明胶具有例如170℃以上，尤其180度以上比天然明胶更高的玻璃化转变温度(Tg)。具有比天然明胶高的Tg的基因重组明胶在WO 05/11740中有记载。

作为另一实施方式，基因重组明胶具有比天然明胶低的糖基化，例如小于2重量％，优选小于1重量％，更优选小于0.5重量％，进一步优选小于0.2重量％，进一步优选小于0.1重量％的糖基化。作为优选的实施方式，基因重组明胶不具有糖基化。糖基化的重量％的程度是指明胶的每单位重量的总碳水化合物(carbohydrate)重量，例如通过基于MALDI-TOF-MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization mass spectrometry)或杜布瓦(Dubois)滴定法来确定。术语“糖基化”不仅是指单糖，还指多糖、例如二-、三-及四-糖类。

有糖基化较少或丢失这样的方法。糖基化是翻译后的修饰，由此，碳水化合物与存在明胶的氨基酸共价键和。氨基酸序列及宿主细胞(及酶，尤其糖基转移酶)确定糖基化的程度。有两种类型的糖基化，N―糖基化将GIcNAc(N-actylglucosamine)与天冬酰胺(N或Asn)的酰胺基建立关联，由此开始，O-糖基化通常将GaINAc与氨基酸的丝氨酸(S或Ser)或苏氨酸(T或Thr)建立关联。

因此，通过修饰或选择缺失由适当的表达宿主的选择和/或宿主的糖基转移酶所识别的共有部位的序列，糖基化能够得到控制，尤其是减少或防止。明胶的化学合成也能够为了调制未糖基化的明胶而使用。使用已知的方法，包含糖基化的基因重组明胶在生成之后，去除全部或大部分的碳水化合物、或能够将未经糖基化的明胶从经糖基化的明胶分离。

作为其他优选的实施方式，基因重组明胶的小于10％、优选小于5％的氨基酸残基为羟基脯氨酸。优选基因重组明胶不包含羟基脯氨酸残基。基因重组明胶还优选不包含被羟基化的氨基酸残基。

作为其他实施方式，基因重组明胶具有至少5、例如5～11的等电点，更优选具有6以上的等电点，进一步优选具有7以上的等电点。该目的在于提供在生理学的条件时带净正电荷的基因重组明胶。不受理论的束缚，认为该正电荷往往有助于整体具有被负电荷的膜的细胞的吸引力、相互作用及键合。

本发明的明胶多孔微载体在明胶为基因重组明胶时，能够通过本发明的基因重组明胶多孔微载体的调制方法进行调制。

优选工序(a)中所使用的组合物在优选为3～11、更优选为4～8的范围具有pH。优选第二乳液在优选为3～11、更优选为4～8的范围具有pH。优选工序(a)中所使用的组合物包含具有优选大于9、更优选大于10、尤其优选13～19的HLB(hydrophilic-lipophilicbalance)的乳化剂。也能够使用两个以上的这种乳化剂。作为合适的乳化剂的例，能够举出PEG400单油酸聚氧乙烯单油酸(HLB 11.4)、PEG400单硬脂酸酯聚氧乙烯单硬脂酸酯(HLB：11.6)、PEG 400单月桂酸酯聚氧乙烯单月桂酸酯(HLB：13.1)、油酸钾(HLB：20.0)、月桂基硫酸钠(HLB：40)、油酸钠(HLB：18)、Myrj(注册商标)52(聚氧乙烯硬脂酸、HLB：17)、Brij(注册商标)58(聚氧乙烯鲸蜡醇、HLB：16)、Tween(注册商标)20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇月桂酸单酯、HLB：16.7)、Tween21(聚氧乙烯脱水山梨糖醇月桂酸单酯、HLB：13.3)、Tween40(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、HLB：15.6)、Tween60(聚氧乙烯单硬脂酸脱水山梨糖醇、HLB：14.9)、Tween61(聚氧乙烯单硬脂酸脱水山梨糖醇、HLB 9.6)、Tween65(聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、HLB：10.5)、Tween80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇油酸单酯、HLB：15.0)、Tween81(聚氧乙烯脱水山梨糖醇油酸单酯、HLB：10.0)及Tween85(聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯、HLB：11.0)。以上中，优选为Tween80、Tween40、Myrj52及Brij58以及包含它们的两种以上的组合。

工序(a)中所使用的合适的非水溶性液体为烷基酯(例如，乙酸乙酯)、烃(例如，己烷、庚烷、环己烷、甲苯、二甲苯等)、卤代烃(例如，二氯甲烷、一氯苯、二氯苯等)及油(例如，植物油(例如，玉米油))、石蜡油或工业润滑油以及包含它们的两种或其以上的组合。尤其优选的非水溶性液体为玉米油。

工序(b)中所使用的非水溶性液体优选包含含量小于0.1重量％的HLB值小于8的乳化剂，工序(b)中所使用的非水溶性液体更优选不包含HLB值小于8的乳化剂，工序(b)中所使用的非水溶性液体进一步优选不包含乳化剂。

作为HLB值小于8的乳化剂的例，能够举出单硬脂酸甘油酯(HLB：3.8)、Span(注册商标)40(脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、HLB：6.7)、Span60(脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、HLB：4.7)、Span65(脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、HLB：2.1)、Span80(脱水山梨糖醇单油酸酯、HLB：4.3)及Span85(脱水山梨糖醇三油酸酯、HLB：1.8)。

工序(b)中所使用的非水溶性液体可以与工序(a)中所使用的非水溶性液体相同也可以不同。在工序(a)中，水与非水溶性液体的体积比小于1:1，尤其优选小于1:2，在工序(b)中，水与非水溶性液体的体积比小于2:1，尤其优选小于1:1。

通常，第一乳液及第二乳液分别包括二相即非水溶性相和水相。工序(a)优选以非水溶性相的体积与水相的体积相等或比其大，例如，2倍或更大的方式进行。工序(b)优选以非水溶性相的体积大于第一乳液的体积，例如大2倍以上的方式进行。

本发明的方法还能够在工序(b)中和/或工序(b)之后包括将明胶进行交联的工序。交联为化学交联，例如为使用了交联剂的化学交联，优选为热交联，例如脱水热交联。明胶例如能够经由赖氨酸的氨基，并经由谷氨酸或天冬氨酸的羧基或它们的组合进行交联。

作为化学交联的合适的交联剂，优选在生物降解中释放时，不引起毒性或抗原性的交联剂。作为合适的交联剂，例如能够举出戊二醛、水溶性碳二亚胺、双环氧化合物、福尔马林、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、双-羟基-琥珀酰亚胺、缩水甘油醚(例如，亚烷基乙二醇二缩水甘油醚或聚甘油聚缩水甘油醚)、二异氰酸酯(例如，六亚甲基二异氰酸酯)、二苯基磷酰基叠氮化物、D核糖及京尼平以及它们的组合。交联的方法在“Weadocket.al.in Evaluation of collagen cross-linking techniques(Biomater.Med.DevicesArtif.Organs，1983-1984，11(4)：293-318)”中也有记载。其中，能够适当地使用水溶性的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。除此之外，能够适当地使用六亚甲基二异氰酸酯。其他合适的交联剂可举出二氯羟基三嗪等三嗪。作为其他的交联化合物，能够举出二乙烯基砜、二酸酐、双官能亚氨酸酯、二-环氧化物或二马来酰亚胺(dimaleiimidines)。一种化合物中能够使用双官能交联剂，所述双官能交联剂具有例如包含环氧化物及酸酐的如双官能交联化合物那样不同的活性取代基。基于酶的交联剂，例如转谷氨酰胺酶也是有用的。

交联剂可以具有多于2的官能团，例如可举出氰尿酰氯(三官能团)及包含两个环氧化物和酸酐的化合物。这种交联剂通常与存在于明胶的氨基酸中的氨基和/或硫氢基反应。如果需要，能够使用多于一种的交联剂。交联剂与明胶接触时，或者调节pH等之后或光引发后，或者通过其他活化机理，交联自发地开始。

特别有用的交联剂为戊二醛，其交联两个赖氨酸残基。其他合适的生物相容性的交联剂为EDC，其耦接氨基和羧基。六亚甲基二异氰酸酯也能够用作交联剂。脱水热交联通过存在于明胶中的氨基和羧基的缩合来诱导交联，从而形成酰胺键。脱水热交联优选在120℃以上的温度下进行。

本发明的明胶多孔微载体为基因重组明胶之外的明胶时，针对交联的优选实施方式与上述交联相关的记载相同。

为了有助于粒子形成，本发明所涉及的明胶及基因重组明胶优选具有至少两个赖氨酸残基。本发明所涉及的明胶及基因重组明胶优选具有至少3个或至少4、5、6、7、8、9、10、11或12个赖氨酸残基。作为另一实施方式，本发明所涉及的明胶及基因重组明胶优选除了赖氨酸残基之外，优选包含至少两个选自天冬氨酸及谷氨酸的氨基酸，本发明所涉及的明胶及基因重组明胶更优选包含至少3个或至少4、5、6、7、8、9、10、11或12个冬氨酸及谷氨酸残基。

为了有助于微载体的三维网络结构，本发明所涉及的明胶及基因重组明胶优选包含分散在明胶分子中的、赖氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸。因此，作为一实施方式，在各50个氨基酸残基中，优选包含至少1个、优选至少2个赖氨酸残基、或至少1个、优选至少2个天冬氨酸或谷氨酸残基、或至少1个赖氨酸残基及至少1个天冬氨酸或谷氨酸残基。优选各40个氨基酸残基、更优选各25个氨基酸残基中，优选包含至少1个赖氨酸残基和/或至少1个天冬氨酸或谷氨酸残基。

本发明所涉及的明胶及基因重组明胶优选各自包含不相邻的可交联的氨基酸残基，例如可交联的氨基酸残基优选通过至少5个、更优选至少10个不可交联的氨基酸而分离。可交联的氨基酸残基包含伯胺(除了为了形成蛋白质骨架中的酰胺键而通常使用的伯胺之外)、-SH和/或羧酸(除了为了形成蛋白质骨架中的酰胺键而通常使用的羧酸之外)。

基因重组明胶比天然明胶包含高比例(％)或大量的赖氨酸残基，尤其用于随后的交联，是优选的。大量的交联剂与赖氨酸残基和/或N末端胺键合。天然明胶通常每1000个氨基酸包含25～27个赖氨酸残基及112～133个谷氨酸和天冬氨酸。用于本发明的基因重组明胶中，能够使赖氨酸残基的数量例如相同或每1000个氨基酸减少到少于约20、15、10或5个的赖氨酸，并且，根据需要，例如相同或每1000个氨基酸增加至多于约30、40或50个的赖氨酸。用于本发明的基因重组明胶中所存在的谷氨酸或天冬氨酸残基的数量例如相同或每1000个氨基酸减少至少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个的赖氨酸，并且，根据需要，例如相同或每1000个氨基酸增加至多于150个的赖氨酸。根据需要，将基因重组明胶中所存在的一些或所有谷氨酰胺及天冬酰胺残基脱氨基化，也能够将它们转换为天冬氨酸及谷氨酸残基。

作为一实施方式，通过包括使本发明所涉及的明胶或基因重组明胶与每1克明胶或基因重组明胶为0.02～1.0mmol的交联剂接触的工序交联明胶或基因重组明胶。例如，每1克本发明所涉及的明胶或基因重组明胶，能够使用约0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.9mmol的交联剂。

作为其他实施方式，通过包括使本发明所涉及的明胶或基因重组明胶与每1克明胶或基因重组明胶为0.5～5.0mmol的交联剂接触的工序交联明胶或基因重组明胶。例如，每1克本发明所涉及的明胶或基因重组明胶，能够使用约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0及5.0mmol的交联剂。

这样一来，为了确定或定制微载体的物理特性，能够使用所使用的交联剂的量以及可交联的氨基酸残基的数量。通过可交联的残基的数量大和/或交联化合物的浓度高，由此能够获得尤其有助于施加机械应力的用途的、牢固的微载体。可交联的氨基酸残基的数量少和/或交联化合物的浓度低，由此能够容易地获得尤其适合于注射或药剂用途且易变形的微载体。

热交联能够避免微载体用于药剂用途时尤其优选的、本发明所涉及的明胶或基因重组明胶的潜在化学污染，因此优选热交联。

交联的程度影响明胶微载体在体内降解的时间。因此，能够控制用于预期用途的微载体的降解的比例。其一例为在皱纹的部位注射不携带细胞的本发明的微载体时的整形外科。微载体周边的细胞移动到微载体，从而制作菌群。微载体逐渐被周边的酶(例如，基质金属蛋白酶)降解，移动后的细胞占据皱纹的部位。这将会拉伸皱纹。

工序(a)中，水与非水溶性液体的体积：体积比例优选为5:1～1:10，更优选为1:1～1:5，进一步优选为2:3～1:3。

工序(a)中所使用的组合物(及所获得的第一乳液)优选包含1～15重量％、更优选1.5～10重量％、尤其优选3～5重量％的基因重组明胶，并包含10～70重量％、更优选20～50重量％、尤其优选30～40重量％的水，包含20～90重量％、更优选40～80重量％、尤其优选50～70重量％的非水溶性液体，包含0.5～20重量％、更优选1～10重量％、尤其优选2～6重量％的乳化剂。

工序(a)优选在10～100℃、更优选20～80℃、尤其优选30～60℃的温度下进行。

工序(a)及工序(b)中进行的混合可以通过任何适当的方法进行，例如能够通过振动或搅拌进行。优选通过搅拌进行混合，尤其使用溶解器型的搅拌时，优选以20～5000rpm(revolutions per minute)、更优选200～1000rpm、尤其优选250～600rpm的速度进行搅拌。工序(a)中的混合速度可以与工序(b)中的混合速度相同也可以不同。

在工序(b)中，第一乳液相对于与第一乳液混合的非水溶性液体的体积：体积比例优选为5:1～1:100，更优选为2:1～1:10，尤其优选为1:1～1:3。

第二乳液优选包含1～85重量％、更优选10～65重量％、尤其优选25～50重量％的第一乳液，并包含15～99重量％、更优选35～90重量％、尤其优选50～75重量％的上述非水溶性液体(即，加入到来自工序(a)的第一乳液中已经存在的非水溶性液体中的、工序(b)中第一次包含的非水溶性液体)。在工序(b)中与第一乳液混合的非水溶性液体优选包含优选0～0.1重量％、更优选0重量％的HLB小于8的乳化剂。在工序(b)中与第一乳液混合的非水溶性液体优选不包含乳化剂。

工序(b)优选在比明胶的凝胶化温度高的温度下进行。也能够通过任何适当的方法确定明胶的凝胶化温度。例如能够使用“Tosh et al in Applied Physics Letters，Vol.84，Number 21，24May 2004”中所记载的方法，尤其能够使用其中记载的第三个方法。凝胶化温度取决于明胶的相同性及明胶的浓度程度。

工序(b)优选在比明胶的凝胶化温度高1～80℃、优选高3～70℃、尤其优选高5～60℃的温度下进行。

取决于明胶，但工序(b)通常在10～100℃、例如在15～70℃、尤其在20～60℃的范围的温度下进行。

实际上，以高程度的准确性掌握明胶的凝胶化温度通常并不重要，以大致的识别足以。这是因为，仅通过只掌握没有实际测量凝胶化温度或计算的、大致的凝胶化温度，能够在比肯定发生凝胶化的凝胶化温度足够高的温度下进行工序(b)。

工序(c)中所进行的冷却可以是被动的也可以是主动的。例如，被动冷却能够简单地通过将第二乳液自然冷却至明胶凝固的温度为止来进行。主动冷却能够通过使用用于降低第二乳液的温度(例如，以受到控制的冷却速度)的冷却方法(例如，冰或冰水)来进行。主动冷却用于调制最终的微载体的性质。

然而，工序(c)优选以由每1分钟0.1～20℃、更优选1～10℃的比例冷却第二乳液的方式进行。这些冷却速度能够提供具有尤其有用的特性的微载体。例如，第二乳液为60℃时，优选的冷却速度为每1分钟1.8℃。30分钟后，所获得的混合物最终成为6℃的温度。冷却速度可以是线性的也可以不是线性的。

本发明的方法优选还包括从工序(d)第二乳液去除已凝固的明胶的工序、优选通过过滤去除的工序。

鉴于上述，第一本发明的方法优选具有以下特征。

(i)工序(a)中所使用的组合物包含3～5重量％的基因重组明胶、30～40重量％的水、50～70重量％的非水溶性液体及2～6重量％的乳化剂；

(ii)工序(a)及工序(b)的混合各自独立地通过以250～600rpm的速度搅拌来进行；

(iii)在工序(a)中水相对于非水溶性液体的体积：体积比例设为2:3～1:3的范围；

(iv)工序(a)优选在30～60℃范围的温度下进行；

(v)工序(b)中所使用的组合物包含25～50重量％的第一乳液、50～75重量％的非水溶性液体，非水溶性液体不包含乳化剂；

(vi)优选以由每1分钟1～10℃的比例冷却第二乳液的方式进行工序(c)；及

(vii)本发明的方法任意地还包括交联所获得的基因重组明胶微载体的工序、优选通过脱水热交联进行交联的工序。

根据第二本发明，提供具有一个或多个以下特征的基因重组明胶多孔微载体。并且，本发明的明胶多孔微载体优选具有一个或多个以下特征。

(a)具有至少5μm、例如6～30μm、尤其是10～20μm的平均直径的表面孔。表面孔优选具有小于微载体的粒径的平均直径。

(b)至少50体积％、例如51～95体积％、尤其是60～90体积％的平均空隙率。

(c)20～800μm、例如40～600μm、尤其是100～500μm的平均粒径。

(d)0.04～0.50g/cm³、例如0.06～0.25g/cm³、尤其是0.1～0.2g/cm³的平均密度。

(e)2～25cm³/g、例如4～17cm³/g、尤其是5～10cm³/g的振实体积。

(f)20～800μm的平均粒径。至少80％的微载体具有平均粒径的30～200％的粒径。

平均粒径为体积加权平均直径(volume-weighted mean diameter)，能够使用莫尔文粒度仪(Malvern Mastersizer)进行测定。

表面孔的平均直径能够通过微电脑断层摄影术(CT)图像分析进行测定。例如，优选能够使用Skyscan 1172MicroCT apparatus(Bruker公司制)，并具备VGStudio MAX2.2software。

微载体的平均空隙率以下述式(1)定义。

P＝(pvI/V)×100％式(1)

在此，P为平均空隙率，pvI为微载体内的平均总空间体积，V为微载体的总体积，还包括空间体积。

pvI能够通过微CT测量来确定(例如，优选能够使用Skyscan 1172Micr oCTapparatus(Bruker公司制)，具备VGStudio MAX 2.2software。)。

V能够通过以下方式来计算：测量微载体的体积(例如通过使用通过微载体的微CT测量图像的分析进行确定的大小)；及计算数学平均体积。

通过第一本发明的方法获得的基因重组明胶微载体优选具有一个或多个上述特征(a)～(f)和/或与第三本发明相关的一个或多个下述特征。能够通过第一本发明的方法获得基因重组明胶多孔微载体。上述特征(a)至(f)能够应用于交联或未交联的本发明的微载体这两者。可在市场上获得的微载体为了获得具有完全不同的三维结构的明胶微载体，能够使用本发明的方法。

这样一来，根据第三本发明，能够提供一种具有空隙，该空隙具有微载体的粒径的5～25％(优选10～20％)的平均直径的基因重组明胶多孔微载体。本发明的基因重组明胶多孔微载体及明胶多孔微载体中，优选空隙通过细孔与相邻的空隙结合。优选空隙的平均直径在微载体的平均粒径的5～25％的范围。为了容许生物细胞进入到空隙中，优选至少一半、更优选至少75％、进一步优选90％的空隙彼此完全连接，并与微载体的外部(例如，经由细孔)连接。空隙优选具有生物细胞能够进入的多孔壁(例如，包含孔的壁)。空隙壁中的细孔(或孔)优选具有至少5μm、更优选至少10μm的平均直径。

优选至少一半、更优选至少75％、尤其优选80％的空隙相对于平均空隙直径具有-30％～+30％的直径。优选至少一半、更优选至少75％、尤其优选80％的空隙为球状。优选至少一半、更优选至少75％、尤其优选80％的空隙具有凹陷的壁。这样一来，明胶微粒子能够提供例如在两个空隙重叠时，容许细胞或医药物质进入到空隙中的支架中的多个球状的空隙/凹陷的壁、及细孔/孔中具有特征的支架。

为了制作包含空隙的微载体而使用的明胶优选为基因重组明胶，关于其他本发明，尤其优选其中所记载的基因重组明胶。

本发明对每一个以及集合这两者中均提供微载体。本发明还提供平均具有上述性质的多个微载体(1批次至少500mg的微载体)。本发明的明胶微载体可以是任何外形，但本发明的方法特别适合于调制球状的粒子。这样一来，通过本发明的方法获得的微载体优选为球形，例如优选它们是微球。

根据第四本发明，提供包含明胶多孔微载体及细胞，细胞存在于微载体的表面和/或内部的复合材料，该微载体为本发明的明胶多孔微载体或本发明的基因重组明胶多孔微载体。

本发明的复合材料所涉及的细胞的种类没有限制，还包含人或动物细胞。例如，能够使用皮肤的细胞获得的复合材料能够用于治疗各种皮肤的损伤。另一例是例如能够用于治疗心肌梗塞的成肌细胞(肌肉细胞)。另一例是能够用于未损伤的肝脏病变中的毒物的肝细胞。作为优选的实施方式，细胞为干细胞，例如胚胎干细胞、造血干细胞、神经元干细胞、表皮干细胞及间充质干细胞。能够使用的其他细胞中还包含多能细胞、内皮细胞、前体细胞及源自骨髓的细胞。

本发明的复合材料能够通过培养所期望的细胞和微载体来进行调制。通常，在培养容器中将包含微载体及所期望的细胞的悬浮液与营养素进行混合。所使用的培养容器取决于生产规模。为了小规模生产，能够使用以小实验室为基础的搅拌容器。为了大规模生产，能够使用具有几千升体积的灌。

营养素通常通过生长的细胞选择，在市面上能够购买大量的营养素的混合物及培养基。例如能够使用DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)、BME(basal mediumeagle)、DMEM/F12培养基、Ham's F-10及F-12培养基、medium 199、MEM、Ames'media、BGJbmedium(Fitton-Jackson Modification)、Click's medium、CMRL-1066medium、Fischer'smedium、GMEM(Glascow Minimum Essential Medium)、IMDM(Iscove's ModifiedDulbecco's Medium)、L-15Medium(Leibovitz)、McCoy's 5A Modified Medium、NCTCMedium、Swim's S-77Medium、Waymouth Medium、William's Medium E及RPMI 1640Media。

本发明的微载体在很多用途中，例如能够作为细胞载体、作为用于修复组织损伤的支架来使用。因此，为了培养人造皮肤、人造组织、脂肪细胞、肌肉、血管等，能够使用微载体。所使用的微载体能够用作细胞培养的细胞的载体，并且用作在移植到人体或动物体内之前或之后为了生产所期望的物质而生存的细胞的载体这两者。细胞可以是宿主自身(自体移植)的细胞或其他来源的细胞(同种或异种)。在一些情况下，能够为了将作为所期望的生成物的细胞、例如移植后的初始阶段的载体上的脂肪细胞(前脂肪细胞)转化为脂肪细胞而增殖。用途之一的领域例如为整形外科。

能够在人体或动物体中不添加细胞来移植本发明的微载体。移植后，体内接近的细胞移动到微载体并形成菌群。降解经移植的微载体之后，形成菌群的细胞形成与移植相对应的结构。根据第五本发明，能够提供包含药理学上可接受的载体和本发明的微载体或组合物的注射用组合物。

组合物优选能够通过具有80～4000μm的内部口径的注射器进行注射。优选的药理学上可接受的载体中包含液体、例如水、乙醇以及包含水和/或乙醇的混合物。药理学上可接受的载体优选为无菌，能够任意包含防腐剂。

[实施例]

通过以下不受限制的实施例说明本发明。

使用以下缩写。

“RG1”是指10重量％溶液、pH5.4的、增加了RGD的基因重组明胶溶液(MWT：51.2kDa)。对人COLlAl-I明胶的氨基酸序列的部分进行编码，根据改变了核酸序列的核酸序列调制明胶。使用了EP-A-0926543、EP-A-1014176及WO01/34646中所记载的方法。该明胶不含羟基脯氨酸，包括序列编号1中所记载的以下氨基酸序列。

序列编号1的氨基酸序列：

序列编号1为571个氨基酸长度，其包括12个RGD基序。

“RG2”包含4重量％的明胶来代替10重量％，除此之外与“RG1”相同。

“RG3”包含15重量％的明胶来代替10重量％，除此之外与“RG1”相同。

“Tween(注册商标)80”为聚氧乙烯脱水山梨糖醇油酸单酯。

“PBS”为磷酸盐缓冲生理盐水。

“DAPI”为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(细胞染色)。

实施例1

工序(a)第一乳液的调制

将RG1(15g)及Tween80(1.0g)的混合物加热至60℃，该温度保持15分钟。一边以550rpm搅拌混合物，一边历时7分钟添加非水溶性液体(玉米油30cm³)。一边保持60℃的温度，一边进一步以550rpm继续搅拌3分钟，获得第一乳液。

工序(b)第二乳液的调制

一边以350rpm进行搅拌，一边在室温下对非水溶性液体(玉米油55cm³)历时3分钟滴加第一乳液。添加完成时，在20℃下继续搅拌3分钟，从而获得第二乳液。

工序(c)第二乳液的冷却

在工序(b)中所记载的3分钟之后，将第二乳液一边以350rpm继续搅拌,一边历时5分钟冷却至5.5℃。混合物成为5.5℃时，进一步在该温度下继续搅拌15分钟。使用冰浴将含有丙酮(300ml)的容器冷却至-1～+1℃的温度。之后，一边以350rpm进行搅拌，一边将第二乳液添加到已冷却的丙酮中。以350rpm搅拌5分钟之后，从冰浴中取出容器，在室温下继续搅拌一小时，丙酮将混合物中所形成的微载体进行脱水。过滤去除微载体，利用丙酮清洗几次，直到水及玉米油从微载体中去除。之后，在60℃下，在烘箱中干燥微载体。

任意工序(d)交联

通过如下进行脱水热处理来交联从工序(c)获得的微载体。

将干燥后的微载体置于玻璃小瓶中，在Binder VD53vacuum stove中，在真空下96小时置于145℃的温度下。所获得的基因重组明胶多孔微载体称为MS1，将该特性记载于以下表1(微载体MS1的特性)中。另外，MS1的至少一半的空隙为球状，并且至少一半的上述空隙具有相对于平均空隙直径为-30％～+30％的直径。

[表1]

平均空隙直径及形状通过切割微载体，并使用微CT数据(使用具备Bruker公司的VGStudio MAX 2.2software的Skyscan 1172MicroCT apparatus)分析该截面而确定(参考图1c)。

平均空隙率由上述式(1)确定。

平均粒径为微载体的体积加权平均直径(volume-weighted mean diameter)使用莫尔文粒度仪(Malvern Mastersizer)进行计算。

微载体的平均密度测量1g微载体的总体积(包括空隙及球体之间的空间)，通过1g除以微载体的总体积来计算并确定。

微载体的平均体积测量并确定1g微载体的体积(包括空隙及球体之间的空间)。

实施例2～9及比较例1

除了下述表2所示的变更之外，重复实施例1。所获得的微载体的特性示于表3。另外，MS2～9的微载体均是至少一半的空隙为球状，并具有至少一半的上述空隙相对于平均空隙直径为-30％～+30％的直径。另一方面，CMS1及Cultispher G均是至少一半的空隙不是球状，并且至少一半的上述空隙不具有相对于平均空隙直径为-30％～+30％的直径。

[表2]

[表3]

如实施例1所记载那样测量平均空隙直径、平均空隙率、平均粒径、平均密度及平均体积。

CMS1或CultispherG的空隙不是球状，因此无法测定表中的*。

通过扫描电子显微镜(SEM)分析试料MS1、CMS1及市售的CultiSpher G。所获得的照片示于附图中。MS1示于图1a～1c中，比较例CMS1示于图2a～2c中，并且市售的CultiSpherG示于图3a～3c中。

附图表示MS1微载体充分分离，并且很好地区分，具有球状的空隙，实际上为球状。另一方面，比较例的微载体CMS1中，微载体具有非球形的形状、大表面的孔，一同结块并赋予二次结构。图2c表示通过比较例的方法获得的微载体的截面，并表示与图1a所示的本发明的微载体相比，空隙小于微粒子的粒径。另外，图2c中所示的微粒子的空隙的大小及形状不规则。

微载体-细胞组合物的调制及测试

通过染色测量的细胞增殖

如下调制上述实施例及比较例中所记载的、交联的含有明胶多孔微载体的合成物。

杀菌工序

在评价阶段将每一个微载体(100mg)置于磷酸盐缓冲盐水(PBS、10cm³、无钙和镁)中。在室温下1小时后，不去除PBS，通过高压釜来将微载体杀菌。杀菌后，去除PBS，并添加新的PBS。重复三次该循环。最终获得的经杀菌的微载体直到使用为止保存在4℃且包含10％FBS(foetal bovine serum)的DMEM培养基中。

C2C12细胞(肌成纤维细胞小鼠，ATCC CRL 1772)的调制

在T75培养瓶中预培养细胞，使细胞汇合50～60％，当活跃地增殖时，进行传代。用PBS(1ml/5cm²)冲洗细胞，并去除包含10％FBS(foetal bovine serum)的DMEM培养基。将胰蛋白酶/EDTA溶液添加到细胞中(3-4ml/75cm²)、在37℃下孵育6分钟。添加完全培养基，相对于胰蛋白酶的量，使用比例为1:2，中和胰蛋白酶。在室温下以5分钟、125rpm使所获得的单细胞溶液离心分离。取上清液，轻轻地将所获得的细胞沉淀物内的细胞重新悬浮在包含10％FBS的DMEM培养基中。使用显微镜确定细胞密度。

旋转烧瓶培养

用纯水(10cm³)清洗25ml的无菌的旋转烧瓶(Wheaton)。在评价阶段将已干燥的微球(40mg)添加到该旋转烧瓶中。烧瓶在细胞培养DMEM/10％FBS培养基中填满至最终体积的8ml为止。烧瓶在培养箱中放置30分钟，以使其平衡。接着，在培养基中添加上述C2C12细胞(2cm³中添加2×10⁶的细胞)，以50rpm将所获得的混合物搅拌5分钟，停止搅拌，静置40分钟，以这样的循环搅拌3小时。该循环进行了四次。接着，添加一部分培养基(10cm³)，以37℃、5％CO₂、80rpm的条件，在加湿培养箱中将细胞培养7天。每天，除去培养基的50％，替换成未使用的培养基。

分析

细胞培养7天后，用DAPI染色所获得的合成物(微载体+细胞)。与双链DNA结合时，DAPI在358nm(紫外线)的波长下具有吸收最大值，其发光最大值为461nm(蓝色)。细胞的核能够看作突出显示蓝色的斑点。计数细胞核的数量，这表示与被交联的微载体相关的细胞增殖的程度。细胞培养后的球体的截面的SEM分析明示了微球内的细胞增殖的程度。微载体的外表面也被轻微染色。将结果示于表4(通过DAPI染色法进行评价的增殖结果)。

[表4]

表4中使用了以下的分数。

“+++”表示通过目视检查确定的“非常良好的细胞增殖”。

“++”表示通过目视检查确定的“良好的细胞增殖”。

“+”表示通过目视检查确定的“中等的细胞增殖”。

从表4可知，实施例的细胞增殖优于CMS1及CultiSpherG的比较例。

<110> 富士胶片株式会社

<120> 微载体的调制方法、微载体及其应用

<130> 15F03330

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 571

<212> PRT

<213> 重组体

<400> 1

Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly

1 5 10 15

Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu

20 25 30

Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro

35 40 45

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

50 55 60

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

65 70 75 80

Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro

85 90 95

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

100 105 110

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

115 120 125

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro

130 135 140

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly

145 150 155 160

Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala

165 170 175

Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro

180 185 190

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly

195 200 205

Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp

210 215 220

Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

225 230 235 240

Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly

245 250 255

Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys

260 265 270

Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg

275 280 285

Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly

290 295 300

Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu

305 310 315 320

Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro

325 330 335

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

340 345 350

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

355 360 365

Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro

370 375 380

Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly

385 390 395 400

Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro

405 410 415

Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro

420 425 430

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

435 440 445

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

450 455 460

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala

465 470 475 480

Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly

485 490 495

Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro

500 505 510

Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

515 520 525

Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly

530 535 540

Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys

545 550 555 560

Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly

565 570

Claims

1.一种基因重组明胶多孔微载体的调制方法，其包括：

工序(a)，混合包含水、基因重组明胶、非水溶性液体及乳化剂的组合物，生成第一乳液；

工序(b)，以比明胶的凝胶化温度高的温度混合所述第一乳液和非水溶性液体，生成第二乳液；及

工序(c)，将第二乳液冷却至明胶凝固的温度，

所述工序(b)中所使用的非水溶性液体包含含量小于0.5重量％的HLB值小于8的乳化剂。

2.根据权利要求1所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述工序(b)中所使用的非水溶性液体不包含HLB值小于8的乳化剂。

3.根据权利要求1所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述工序(b)中所使用的非水溶性液体不包含乳化剂。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述工序(a)中所使用的乳化剂的HLB值大于9。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述第一乳液的pH在3～11的范围内。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述基因重组明胶的等电点至少为5。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述基因重组明胶不包含羟基脯氨酸。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其还包括从第二乳液中去除已凝固的明胶的工序(d)。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述基因重组明胶包含至少3个RGD基序。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述基因重组明胶包含至少两个赖氨酸残基，两个赖氨酸残基为末端的赖氨酸残基，第一末端的赖氨酸残基为最靠近明胶的N末端的赖氨酸残基，第二末端的赖氨酸残基为最靠近明胶的C末端的赖氨酸残基，所述末端的赖氨酸残基与明胶中的总氨基酸残基数相差至少25％。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述工序(b)中所述非水溶性液体的体积大于所述第一乳液的体积。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述工序(c)中以0.1～20℃/分钟进行冷却。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述第一乳液包含至少1～15重量％的基因重组明胶。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其中，

所述工序(a)中所使用的组合物包含：

1～15重量％的基因重组明胶；

10～70重量％的水；

20～90重量％的非水溶性液体；及

0.5～20重量％的乳化剂。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其还包括在所述工序(b)中和/或工序(b)之后交联明胶的工序。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的多孔微载体的调制方法，其还包括在所述工序(b)之后进行明胶的脱水热交联的工序。

17.一种明胶多孔微载体，其具有空隙，

至少一半的所述空隙为球状，和/或

至少一半的所述空隙相对于平均空隙直径具有-30％～+30％的直径。

18.根据权利要求17所述的微载体，其具有表面孔，所述表面孔具有至少5μm的平均直径。

19.根据权利要求17或18所述的微载体，其具有至少50体积％的平均空隙率。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的微载体，其中，

所述空隙的平均直径在微载体的平均粒径的5～25％的范围。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的微载体，其中，

平均粒径为20～800μm。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的微载体，其中，

平均密度为0.04～0.5g/cm³。

23.根据权利要求17至22中任一项所述的微载体，其中，

平均体积为2～25cm³/g。

24.根据权利要求17至23中任一项所述的微载体，其中，

平均粒径为20～800μm，至少80％的微载体具有平均粒径的30％～200％的粒径。

25.根据权利要求17所述的微载体，其具有：

具有至少5μm的平均直径的表面孔；

至少50体积％的平均空隙率；及

20～800μm的平均粒径，

至少一半以上的空隙为球状，

至少80％的微载体具有平均粒径的30％～200％的粒径，

空隙的平均直径在微载体的平均粒径的5～25％的范围。

26.根据权利要求17所述的微载体，其具有：

具有至少5μm的平均直径的表面孔；

至少50体积％的平均空隙率；及

20～800μm的平均粒径，

至少一半以上的空隙相对于平均空隙直径具有-30％～+30％的直径，

至少80％的微载体具有平均粒径的30％～200％的粒径，

空隙的平均直径在微载体的平均粒径的5～25％的范围。

27.根据权利要求25或26所述的微载体，其中，

至少75％的空隙为球状。

28.根据权利要求17至27中任一项所述的微载体，其中，

所述明胶为基因重组明胶。

29.根据权利要求17至28中任一项所述的微载体，其中，

所述明胶为等电点至少为5的基因重组明胶。

30.根据权利要求17至29中任一项所述的微载体，其中，

所述明胶为不包含羟基脯氨酸的基因重组明胶。

31.根据权利要求17至30中任一项所述的微载体，其中，

所述明胶为包含至少3个RGD基序的基因重组明胶。

32.根据权利要求17至31中任一项所述的微载体，其中，

所述明胶为如下基因重组明胶：包含至少两个赖氨酸残基，两个赖氨酸残基为末端的赖氨酸残基，第一末端的赖氨酸残基为最靠近明胶的N末端的赖氨酸残基，第二末端的赖氨酸残基为最靠近明胶的C末端的赖氨酸残基，所述末端的赖氨酸残基与明胶中的总氨基酸残基数相差至少25％。

33.一种根据权利要求17至32中任一项所述的微载体作为细胞载体的应用。

34.一种根据权利要求17至32中任一项所述的微载体作为用于修复组织损伤的支架的应用。

35.一种复合材料，其包含权利要求17至32中任一项所述的微载体及细胞，所述细胞存在于所述微载体的表面和/或内部。

36.一种注射用组合物，其包含药理学上可接受的载体及权利要求17至32中任一项所述的微载体或权利要求35所述的复合材料。

37.根据权利要求36所述的注射用组合物，其能够通过具有80～4000μm的内部口径的注射器进行注射。