CN118240741A - 用于细胞培养的细胞支架/微载体复合体系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自组装肽，由所述自组装肽与微载体所构成的组合在细胞培养中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体地涉及用于细胞培养的微载体。
背景技术
自组装肽水凝胶作为一种三维支架材料，具有良好的生物相容性及功能多样性，在3D细胞培养、药物传递、药物筛选与评价、组织工程等生物医学领域被广泛应用。其中刺激响应型多肽因其凝胶化过程可调控而备受关注。但是，自组装肽的凝胶化往往依赖于温度(CN 202010572759.2)、pH的变化(如US 201/03262451A1中所述肽水凝胶随pH变化而改变、CN201680012178.5中所述肽水凝胶需在pH＜3.5时应用)、增加或减少特定的光照(CN201680061179.9中肽的凝胶化依赖于光活化)、引入金属盐离子(US 2011/0165200A1提出了包括MAX1的一系列肽，能与钙离子配位凝胶化；CN 202110863352.X中用于皮肤修复的肽水凝胶需要特定钠离子浓度)或某种外源性物质(CN201810783581.9中涉及一种肽复合水凝胶，凝胶化过程需要引入磷酸钙)等。这种严格的凝胶化条件伴随更复杂的使用流程，并带来额外的风险。将上述水凝胶用于生物实验时，非生理条件的温度和pH值对细胞活性造成不可忽视的威胁；光响应凝胶化的实现依托复杂昂贵的外设装置；较高的金属盐离子浓度影响细胞微环境的渗透压；外源性物质可能引起免疫反应，产生一定的安全风险。而现有的能够对内源性物质响应实现凝胶化的肽种类较少，且多限定为单一的内源物质(如CN201380063880.0涉及肽-白蛋白水凝胶)，适用范围有一定的限制。
微载体在动物细胞培养中的使用始于20世纪60年代，目前市场上已有十几种商业产品可供选择，微载体由于其多孔结构，比表面积大，在同体积条件下可以提供远高于二维培养体系的表面积用于细胞粘附和生长。例如，在培养过程中，通过向培养体系中补充加入微载体，细胞可以自发从培养体系中已有的微载体迁移到新加入的微载体上，采用简单操作即可实现细胞的快速增殖，因而在体外大规模细胞培养中具有很大的潜力。
微载体培养细胞分为静态培养和动态培养2种模式，其中动态培养占据较多的市场，动态培养适用于体外细胞培养的大规模扩增；而静态培养适用于小型试验，以其操作简单便捷的优点适用于诸多方案的试验中。对于静态培养而言，由于环境是静态的，微载体会全部沉淀在细胞培养孔板或反应器底端，微载体的沉积会导致细胞培养过程中营养物质分布不均，细胞代谢产物堆积，并且影响细胞生长代谢过程中的气体交换，最终导致细胞凋亡。静态培养培养时间一般2-3天，不适用于长时间培养。相比静态培养来说，动态培养会解决以上存在的细胞营养物质分布，细胞代谢废物，气体交换等问题，动态培养是动态的，适用于细胞长期培养，如8-10天，但是，需要与之配套的设备如生物反应器辅助进行，操作比较复杂，生产成本较高，而且，整个细胞培养周期内需要搅拌，搅拌速度需要根据细胞种类合理调控，并且，搅拌的存在对细胞对微载体的附着产生一定的影响，剪切力的存在可能会使体系中存在一部分游离的单个细胞，这样会对后续的细胞增殖产生影响。
因此，开发出能够将上述静态培养和动态培养相结合的微载体，从而将静态培养和动态培养的优点相组合，并且无需添加其他的引发物质在生理条件下，或者细胞培养环境及人体中广泛存在物质条件下，无需额外的磁场、温度、pH值、光和机械力等物理或生化刺激，即可使用的微载体将具有十分重要并且广泛的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种自组装肽/微载体的复合应用，所述微载体用生物支架材料支撑，无需搅拌等复杂的配套设备，实现了微载体的均匀分散和悬浮状态，能更好地帮助细胞粘附和促进细胞增殖，而且，在整个细胞培养周期内微载体始终保持悬浮均匀分散的状态。所述用生物支架材料支撑的微载体能够将静态培养和动态培养的优点相结合，成功的解决了微载体静态培养和动态培养细胞存在的一些问题。而且，所述生物支架材料无需额外的磁场、温度、pH值、光和机械力等物理或生化刺激，在生理条件下，或者细胞培养环境及人体中广泛存在物质条件下即可实现对微载体的支撑。
第一方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含微载体和自组装肽。
所述自组装肽包含疏水结构域和亲水结构域，所述亲水结构域包含至少两个连续的能够形成β-转角的β-转角区。
在一些实施方案中，所述至少一个β-转角区在末端包含或连接一个或多个酸性氨基酸，优选包含或连接一个酸性氨基酸。
在一些实施方案中，至少一个β-转角区在末端包含酸性氨基酸。
在一些实施方案中，所述β-转角区包含由3-6个氨基酸形成的β-转角基序，所述β-转角基序具有如下结构：
X1X2X3，X1X2X3X4，X1X2X3X4X5，或X1X2X3X4X5X6，
其中，X1，X2，X3，X4，X5，X6为氨基酸残基，各β-转角基序中X1，X2，X3，X4，X5，X6分别彼此相同或不同。
在一些实施方案中，所述β-转角基序包含一个羟脯氨酸(O)，优选地，所述X2为羟脯氨酸(O)。
在一些实施方案中，所述亲水结构域包含2-8个β-转角区。
在一些实施方案中，所述亲水结构域包含2，3，4，5，6，7或8个β-转角区。
优选地，所述亲水结构域包含2-6个β-转角区。更优选地，所述亲水结构域包含2-4个β-转角区。
优选地，所述亲水结构域包含2或3个β-转角区。
在一些实施方案中，所述至少一个β-转角区中的β-转角基序包含或连接一个酸性氨基酸。
在一些实施方案中，所述至少一个β-转角区中的β-转角基序包含或连接一个谷氨酸(E)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，天冬氨酸(D)或赖氨酸(K)。
在一些实施方案，所述亲水结构域中包含两个β-转角区，所述的β-转角区末端包含酸性氨基酸E。
在一些实施方案中，所述亲水结构域中包含两个β-转角区，其中一个β-转角区末端包含酸性氨基酸E，另一个β-转角区末端包含氨基酸V或者K。
在一些实施方案，所述亲水结构域中包含两个β-转角区，所述的β-转角区末端包含酸性氨基酸D。
在一些实施方案中，所述亲水结构域中包含两个β-转角区，其中一个β-转角区末端包含酸性氨基酸D，另一个β-转角区末端包含氨基酸V。
在一些实施方案中，所述亲水结构域中包含至少一个X2为羟脯氨酸O的β-转角基序，或者所述亲水结构域中包含至少一个X2为脯氨酸P的β-转角基序。
在一些实施方案，所述亲水结构域中包含至少一个X2为O的β-转角基序。
在一些实施方案，所述亲水结构域中包含至少一个X1为G的β-转角基序。
在一些实施方案，所述亲水结构域中包含一个X2为O的β-转角基序，以及一个X2为P的β-转角基序。
在一些实施方案，所述亲水结构域中包含至少一个X2为P的β-转角基序。
在一些实施方案，所述亲水结构域中包含两个X2为P的β-转角基序。
在一些实施方案中，所述X1，X3和X4中的一个或多个为甘氨酸(G)，和/或所述X3和X4中的一个或两个为丙氨酸(A)。
在一些实施方案中，所述β-转角基序包括选自如下的氨基酸序列：
GPGG(SEQ ID NO.:33)，GPGA(SEQ ID NO.:34)，GPAG(SEQ ID NO.:35)，GPG，GPAA(SEQ ID NO.:36)，GPGGG(SEQ ID NO.:37)，GOGG(SEQ ID NO.:38)，GOGA(SEQ ID NO.:39)，GOAG(SEQ ID NO.:40)，GOGGA(SEQ ID NO.:41)，GOAA(SEQ ID NO.:42)，GOG，或GOGV(SEQID NO.:43)。
优选地，所述β-转角基序具有选自如下的氨基酸序列：
GPAGE(SEQ ID NO.:44)，GPGGE(SEQ ID NO.:45)，GOGAE(SEQ ID NO.:46)，GOGGAE(SEQ ID NO.:47)，GOGE(SEQ ID NO.:48)，GOGGE(SEQ ID NO.:49)，GPGAD(SEQ ID NO.:50)，GOGGD(SEQ ID NO.:51)，GPGGV(SEQ ID NO.:52)，GOGGV(SEQ ID NO.:53)，GPGGK(SEQID NO.:54)，GOGGK(SEQ ID NO.:55)，GPGAE(SEQ ID NO.:56)，GOGAD(SEQ ID NO.:57)，GPAAD(SEQ ID NO.:58)，GOAAE(SEQ ID NO.:59)，GPGGD(SEQ ID NO.:60)，GPGGGV(SEQ IDNO.:61)，GPGV(SEQ ID NO.:62)，GOGGI(SEQ ID NO.:63)或GOGVI(SEQ ID NO.:64)。在一些实施方案中，所述X1和X4形成氢键。
在一些实施方案中，所述亲水结构域包含2，3，4，5，6，7或8个β转角基序，优选地，所述亲水结构域包含2或3个β转角基序。
在一些实施方案中，所述β转角基序具有选自如下的氨基酸序列：GOGG(SEQ IDNO.:38)，GPGG(SEQ ID NO.:33)，GOGA(SEQ ID NO.:39)，GOAG(SEQ ID NO.:40)，GPGA(SEQID NO.:34)或GPAG(SEQ ID NO.:35)。
所述亲水结构域中至少有一个β转角基序包括一个丙氨酸，从而提高所述自组装肽的机械性能。
在一些实施方案中，所述亲水结构域的C末端可以用选自如下的试剂或基团进行修饰：羧酸、硫醇、酮酸盐、亚硝酸盐、膦酸盐、亚硫磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙烯基砜、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、马来酰亚胺、硫醇、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、酯、硫酯、芳基和/或硅烷修饰。
所述亲水结构域的氨基酸序列相较于疏水结构域的氨基酸序列亲水。
在一些实施方案中，所述疏水结构域包含3-10个疏水性氨基酸。优选地，所述疏水结构域包含3-7个疏水性氨基酸，优选地，所述疏水结构域包含3-5个疏水性氨基酸。更优选地，所述疏水结构域包含5个疏水性氨基酸。
优选地，所述疏水性氨基酸选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和丙氨酸(A)中的一种或者多种。
在一些实施方案中，所述疏水性氨基酸选自I、V、L、F中的一种或者多种。
在一些实施方案中，所述疏水结构域的N末端用选自如下的试剂或基团进行修饰：乙酰、醇、醛、胺、亚胺、马来酰亚胺、硫醇、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、酯、硫酯、芳基和/或硅烷修饰。
在一些实施方案中，所述疏水结构域具有选自如下的氨基酸序列：
LLLL(SEQ ID NO.:65)，FIIII(SEQ ID NO.:66)，IIIII(SEQ ID NO.:67)，IIII(SEQ ID NO.:68)，ILILI(SEQ ID NO.:69)，FLFLF(SEQ ID NO.:70)，IVIVI(SEQ ID NO.:71)，VLFIIV(SEQ ID NO.:72)，VLIII(SEQ ID NO.:73)，IVALF(SEQ ID NO.:74)，LFIVL(SEQID NO.:75)，FIAIV(SEQ ID NO.:76)，FIIIV(SEQ ID NO.:77)，Ac-VLFIIV(SEQ ID NO.:78)，Ac-IVIVI(SEQ ID NO.:79)，Ac-IIIII(SEQ ID NO.:80)，IIIIII(SEQ ID NO.:81)，FLIVI(SEQ ID NO.:82)，FLIIA(SEQ ID NO.:83)，FIFIF(SEQ ID NO.:84)，IFIFI(SEQ IDNO.:85)，IAILI(SEQ ID NO.:86)或LLLLL(SEQ ID NO.:87)。
所述疏水结构域的氨基酸序列相较于亲水结构域的氨基酸序列疏水。
在一些实施方案中，所述自组装肽还包括连接域，在疏水结构域与亲水结构域之间提供间隔区。
在一些实施方案中，所述连接域包含2-8个氨基酸残基，优选4-5个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述连接域包含小侧链氨基酸、侧链带有羟基的氨基酸和/或远离疏水区域的疏水氨基酸。
在一些实施方案中，所述侧链较小的氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)和丝氨酸(S)。
在一些实施方案中，所述侧链带有羟基的氨基酸选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和羟脯氨酸(O)，
在一些实施方案中，所述远离疏水结构域的疏水氨基酸选自I、V、L、F和A，所述疏水氨基酸I、V、F、L、A可以互换。
在一些实施方案中，所述连接域具有选自如下的氨基酸序列：
GSII(SEQ ID NO.:88)，GPOGI(SEQ ID NO.:89)，GPOGV(SEQ ID NO.:90)，GSGII(SEQ ID NO.:91)，GSVI(SEQ ID NO.:92)，GOII(SEQ ID NO.:93)，GPOGL(SEQ ID NO.:94)，OGII(SEQ ID NO.:95)或GTVI(SEQ ID NO.:96)，其中，S、T、O能彼此互换。
更优选地，所述连接域具有选自如下的氨基酸序列：
GSII(SEQ ID NO.:88)，GTII(SEQ ID NO.:97)，GTVI(SEQ ID NO.:96)，GOVI(SEQID NO.:98)，GSVI(SEQ ID NO.:92)，GSVL(SEQ ID NO.:99)，GSGII(SEQ ID NO.:91)，GSGVI(SEQ ID NO.:100)，GOII(SEQ ID NO.:87)，OGII(SEQ ID NO.:87)，GOGVI(SEQ ID NO.:101)或GOGII(SEQ ID NO.:102)。
在一些实施方案中，所述疏水结构域与所述连接域之间还包含一个或者多个G，用于增强所述自组装肽的柔软性和灵活度。
在一些实施方案中，所述自组装肽的长度为15-50个氨基酸，优选为15-25个氨基酸。
在一些实施方案中，所述自组装肽包含2，3，4，5，6，7或8个β转角，优选地，所述自组装肽包含2或3个β转角。
在一些实施方案中，所述自组装肽具有选自如下SEQ ID NOs:1-7和SEQ ID NOs:9-32的氨基酸序列：
IIIIIGSIIGPGGDGPGGV(SEQ ID NO.:1)；
IIIIIGSIIGPGGEGPGGV(SEQ ID NO.:2)；
IIIIIGSIIGOGGEGPGGV(SEQ ID NO.:3)；
IIIIGSIIGOGGEGPGGV(SEQ ID NO.4)；
IIIIIGSIIGOGGEGPGGGV(SEQ ID NO.5)；
IIIIIGSIIGOGGEGPGV(SEQ ID NO.6)；
IIIIIGSIIGOGAEGPGGV(SEQ ID NO.7)；
IIIIIGSIIGOGGVGPGGV(SEQ ID NO.9)；
IIIIIIGSIIGOGAEGPGGVGPGGV(SEQ ID NO.:10)；
FLIVIGSIIGOGAEGPGGV(SEQ ID NO.:11)；
FLIIAGSIIGPGGDGOGGV(SEQ ID NO.:12)；
IIIIIGOGIIGPGGEGPGGE(SEQ ID NO.:13)；
FIFIFGTVIGPGGEGOGGV(SEQ ID NO.:14)；
IFIFIGTVIGPGGEGOGGK(SEQ ID NO.:15)；
IAILIGTVIGPGGEGOGGE(SEQ ID NO.:16)；
IVIVIGSIIGPGGDGPGGV(SEQ ID NO.:17)；
IVIVIGSIIGOGGDGPGGV(SEQ ID NO.:18)；
IVIVIGSIIGPGGEGOGGV(SEQ ID NO.:19)；
FLIVIGOGIIGOGGEGPGGE(SEQ ID NO.:20)；
IVIVIGOGIIGOGGDGOGGV(SEQ ID NO.:21)；
IVIVIGSGIIGPGGEGPGGV(SEQ ID NO.:22)；
FIIIVGSIIGPGGEGPGGV(SEQ ID NO.:23)；
FIIIVGSIIGPGGEGPGGE(SEQ ID NO.:24)；
IIIIIGOGIIGOGGEGPGGV(SEQ ID NO.:25)；
Ac-IIIIIGSIIGPGGEGOGGV(SEQ ID NO.:26)；
FLIVIGSIIGOGAEGPGGV(SEQ ID NO.:27)；
FLIVIGSIIGOGAEGOGGV(SEQ ID NO.:28)；
LLLLLGSVLGPAGEGPAGE(SEQ ID NO.:29)；
LLLLLGPHypGLGPAGEGPAGE(SEQ ID NO.:30)；
LLLLLGPHypGVGPAGEGPAGE(SEQ ID NO.:31)；
LLLLLGPHypGIGPAGEGPAGE(SEQ ID NO.:32)。
具有上述结构的本发明的自组装肽可以由引发剂引发而形成三维网状支架材料。
所述三维网状支架材料具有纳米结构。
在一些实施方案中，所述微载体为微球或微载片。
在一些实施方案中，所述微载体为大孔明胶微载体、甲基丙烯酸明胶微载体、海带多糖微载体、羧基甜菜碱微载体、异丙基丙烯酰胺微载体、聚乙烯醇/纤维素微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇/壳聚糖、骨胶原微载体、壳聚糖微载体、几丁质微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、聚氨酯泡沫微载体、聚乳酸微载体、聚丙交酯微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体，例如3D TableTrixTM微载片，Cytodex1，Cytodex2，Cytodex3，Cytopore和Cytoline。
在一些实施方案中，所述微载体的粒径为50-500μm，优选为100-200μm。
在一些实施方案中，所述组合物为冻干粉的形式。在进行细胞培养前，通过将自组装肽配制成溶液，然后添加到微载体细胞培养体系中，可以实现由自组装肽自组装形成的三维网状支架材料支撑微载体从而进行细胞培养。
在一些实施方案中，所述组合物为溶液的形式，不同浓度的微载体含量，可以选择与之相对应的最低支架材料浓度，较高的支架材料浓度可以支撑起更多的微载体。
在一些实施方案中，根据细胞生长在微载体上的合适细胞密度选择微载体浓度，例如，为0.05-1.0wt％，支架材料浓度为0.025-1.0wt％，培养体系中支架材料和微载体的质量比为1-20:1-20。
在一些实施方案中，所述组合物还包含正电荷源物质作为引发剂。
所述正电荷源物质包括带有正电基团、或正电离子的物质。
在一些实施方案中，所述正电荷源物质为中性条件下氢键受体数小于氢键供体数的生物大分子、药物，功能分子，或金属离子、氨基酸等小分子，或包含上述物质中的一种或多种的混合物。
在一些实施方案中，所述生物大分子包括但不限于有机酸、蛋白质、多糖及其衍生物，所述有机酸包括但不限于乳酸、单宁酸、柠檬酸等。
在一些实施方案中，所述蛋白质选自中性生理条件下能够提供氢离子的蛋白质。
优选地，所述蛋白质独立地选自等电点(PI)值低于7.0(优选3.4-6.05)的蛋白质。
在一些实施方案中，所述蛋白质包括但不限于纤维蛋白原、球蛋白、血红蛋白、转铁蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、玻连蛋白等。
在一些实施方案中，所述多糖及其衍生物包括但不限于几丁质、壳聚糖等。
在一些实施方案中，所述的药物包括但不限于抗生素、多巴胺等；优选地，所述抗生素包括但不限于卡那霉素、庆大霉素等。
在一些实施方案中，所述的功能分子包括但不限于抗氧化剂、细胞增殖促进成分等；
在一些实施方案中，所述的抗氧化剂包括但不限于烟酰胺等维生素等。
在一些实施方案中，所述细胞增殖促进成分包括但不限于精胺、亚精胺等。
在一些实施方案中，所述金属离子包括但不限于钾、钙、镁离子等。
在一些实施方案中，所述氨基酸包括但不限于氨基酸或其聚合物，如：赖氨酸、精氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸等。
在一些实施方案中，所述正电荷源物质为尿素或烟酰胺单核苷酸。
在一些实施方案中，所述正电荷源物质为血清、血浆、动植物组织液等或包含上述正电荷源物质的混合液。
在采用所述组合物进行的细胞培养体系中，细胞贴附在微载体上，微载体在体系中被自组装肽自组装形成的支架材料支撑起来，虽然是静态培养，但是与动态培养类似，微载体悬浮在体系中，分布均匀且保持静止状态。
与静态培养相比较，解决了静态培养过程细胞营养成分分布不均和细胞代谢产物堆积的问题，微载体均匀分布使细胞分布更加均匀，实现了更好的细胞生长增殖效果；与动态培养相比，摒弃了繁琐的搅拌过程，不再受相关设备的禁锢，在静态培养条件下既可实现悬浮三维培养的效果。
第二方面，本发明提供了生物反应体系，所述生物反应体系中包含微载体和自组装肽自组装形成的三维网状支架材料，所述微载体由所述三维支架材料支撑。
在一些实施方案中，所述微载体为微球或微载片。
在一些实施方案中，所述微载体为大孔明胶微载体、甲基丙烯酸明胶微载体、海带多糖微载体、羧基甜菜碱微载体、异丙基丙烯酰胺微载体、聚乙烯醇/纤维素微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇/壳聚糖、骨胶原微载体、壳聚糖微载体、几丁质微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、聚氨酯泡沫微载体、聚乳酸微载体、聚丙交酯微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体，例如3D TableTrixTM微载片，Cytodex1，Cytodex2，Cytodex3，Cytopore和Cytoline。
在一些实施方案中，所述微载体的粒径为50-500μm，优选为100-200μm。
在进行细胞培养前，通过将自组装肽配制成溶液，然后添加到微载体细胞培养体系中，可以实现由自组装肽自组装形成的三维网状支架材料支撑微载体从而进行细胞培养。
在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养体系为溶液的形式，不同浓度的微载体含量，可以选择与之相对应的最低支架材料浓度，较高的支架材料浓度可以支撑起更多的微载体。
在一些实施方案中，根据细胞生长在微载体上的合适细胞密度选择微载体浓度，例如，为0.05-1.0wt％，支架材料浓度为0.025-1.0wt％，培养体系中支架材料和微载体的质量比为1-20:1-20。
在一些实施方案中，所述生物反应器还包含正电荷源物质作为引发剂。
所述正电荷源物质包括带有正电基团、或正电离子的物质。
在一些实施方案中，所述正电荷源物质为中性条件下氢键受体数小于氢键供体数的生物大分子、药物，功能分子，或金属离子、氨基酸等小分子，或包含上述物质中的一种或多种的混合物。
在一些实施方案中，所述生物大分子包括但不限于有机酸、蛋白质、多糖及其衍生物，所述有机酸包括但不限于乳酸、单宁酸、柠檬酸等。
在一些实施方案中，所述蛋白质选自中性生理条件下能够提供氢离子的蛋白质。
优选地，所述蛋白质独立地选自等电点(PI)值低于7.0(优选3.4-6.05)的蛋白质。
在一些实施方案中，所述蛋白质包括但不限于纤维蛋白原、球蛋白、血红蛋白、转铁蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、玻连蛋白等。
在一些实施方案中，所述多糖及其衍生物包括但不限于几丁质、壳聚糖等。
在一些实施方案中，所述的药物包括但不限于抗生素、多巴胺等；优选地，所述抗生素包括但不限于卡那霉素、庆大霉素等。
在一些实施方案中，所述的功能分子包括但不限于抗氧化剂、细胞增殖促进成分等；
在一些实施方案中，所述的抗氧化剂包括但不限于烟酰胺等维生素等。
在一些实施方案中，所述细胞增殖促进成分包括但不限于精胺、亚精胺等。
在一些实施方案中，所述金属离子包括但不限于钾、钙、镁离子等。
在一些实施方案中，所述氨基酸包括但不限于氨基酸或其聚合物，如：赖氨酸、精氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸等。
在一些实施方案中，所述正电荷源物质为尿素或烟酰胺单核苷酸。
在一些实施方案中，所述正电荷源物质为血清、血浆、动植物组织液等或包含上述正电荷源物质的混合液。
在采用所述生物反应器进行的细胞培养体系中，细胞贴附在微载体上，微载体在体系中被自组装肽自组装形成的支架材料支撑起来，虽然是静态培养，但是与动态培养类似，微载体悬浮在体系中，分布均匀且保持静止状态。
与静态培养相比较，解决了静态培养过程细胞营养成分分布不均和细胞代谢产物堆积的问题，微载体均匀分布使细胞分布更加均匀，实现了更好的细胞生长增殖效果；与动态培养相比，摒弃了繁琐的搅拌过程，不再受相关设备的禁锢，在静态培养条件下既可实现悬浮三维培养的效果。
在本发明的生物反应器中，细胞贴附在微载体上，微载体在体系中被自组装肽自组装形成的支架材料支撑起来，虽然是静态培养，但是与动态培养类似，微载体悬浮在体系中，分布均匀且保持静止状态。
与静态培养相比较，解决了静态培养过程细胞营养成分分布不均和细胞代谢产物堆积的问题，微载体均匀分布使细胞分布更加均匀，实现了更好的细胞生长增殖效果；与动态培养相比，摒弃了繁琐的搅拌过程，不再受相关设备的禁锢，在静态培养条件下既可实现悬浮三维培养的效果。
本发明的生物反应体系能够提供新型的微载体培养细胞模式，即微载体通过三维网状支架材料支撑起来，实现微载体的均匀分散和悬浮状态，进而更好的帮助细胞粘附和促进细胞增殖，并且在整个细胞培养周期内始终保持微载体悬浮均匀分散的状态，不聚集不沉淀。该模式结合了静态培养和动态培养的优点，将静态培养和动态培养这两种模式整合成一种新的模式，成功解决了微载体培养细胞存在的一些问题。本发明将这种新的模式与静态培养及动态培养这三种不同的实验方案进行细胞培养实验，进行比较，从而验证了该新模式的可行性和优势。该模式下细胞粘附在微载体上，微载体在体系中被三维网状支架材料支撑起来，与动态培养类似，微载体悬浮在体系中，不聚集、不沉淀，分布均匀且保持静止状态。
在一些实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，所述细胞包括但不限于Vero细胞，CHO细胞，干细胞，BHK细胞，SP2/0细胞，MDCK，PK15，Marc-145，HEK293细胞，ST细胞，癌细胞，猪肌肉卫星细胞。
在一些实施方案中，所述干细胞为胚胎干细胞，脐带血干细胞，间充质干细胞，或诱导多能干细胞(iPS)，所述间充质干细胞例如为脐带间充质干细胞，脂肪间充质干细胞，皮肤间充质干细胞等。
第三方面，本发明提供了培养细胞的方法，所述方法包括利用第一方面的组合物或第二方面的生物反应体系培养细胞的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括利用微载体培养细胞的步骤，所述微载体是用第一方面中的自组装肽自组装形成的三维支架材料支撑的微载体。
在一些实施方案中，所述微载体为微球或微载片。
在一些实施方案中，所述微载体为大孔明胶微载体、甲基丙烯酸明胶微载体、海带多糖微载体、羧基甜菜碱微载体、异丙基丙烯酰胺微载体、聚乙烯醇/纤维素微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇微载体、D,L-乳酸-共-乙二醇/壳聚糖、骨胶原微载体、壳聚糖微载体、几丁质微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、聚氨酯泡沫微载体、聚乳酸微载体、聚丙交酯微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体，例如3D TableTrixTM微载片，Cytodex1，Cytodex2，Cytodex3，Cytopore和Cytoline。
在一些实施方案中，所述微载体的粒径为50-500μm，优选为100-200μm。
在进行细胞培养前，通过将自组装肽配制成溶液，然后添加到微载体细胞培养体系中，可以实现由自组装肽自组装形成的三维网状支架材料支撑微载体从而进行细胞培养。
在一些实施方案中，包含所述微载体的培养体系为溶液的形式，不同浓度的微载体含量，可以选择与之相对应的最低支架材料浓度，较高的支架材料浓度可以支撑起更多的微载体。
在一些实施方案中，根据细胞生长在微载体上的合适细胞密度选择微载体浓度，例如，为0.05-1.0wt％，支架材料浓度为0.025-1.0wt％，培养体系中支架材料和微载体的质量比为1-20:1-20。
第四方面，本发明提供了第一方面的组合物，第二方面的生物反应体系或第三方面的方法在细胞培养中的应用。
在一些实施方案中，所述细胞培养为二维培养或三维培养。
本发明在无需搅拌的静态条件下达到了微载体分散均匀和悬浮培养的效果，细胞粘附在微载体上，从而实现了细胞三维培养的目的，且细胞分布均匀，营养物质分布均匀，可以满足细胞生长需求，细胞代谢良好，细胞粘附和增殖效果良好，收获的细胞活性良好，细胞换液和细胞收获方式简单；整个过程无需搅拌，操作简单，无需与之配套的生物反应器辅助进行，使用方便。
具体实施方式
本发明通过对多肽二级结构的巧妙控制，疏水结构域中疏水性氨基酸的独特选择，亲水结构域中亲水性氨基酸的独特选择，以及疏水性氨基酸与亲水性氨基酸的平衡以及精密配合获得自组装肽。
所述自组装肽在生理条件下对生物体内常见的正电离子/基团源物质或细胞培养基中常见的正电离子/基团源物质响应，形成包含自组装肽的三维纳米纤维网状结构。
本发明的自组装肽因在亲水结构域β转角基序中羟脯氨酸(O)的存在，支撑作用更强。并且，本发明发现，相比于亲水结构域β转角基序中存在的脯氨酸(P)，羟脯氨酸(O)的存在，自组装肽的支撑作用更强。
所述自组装肽在pH小于6时溶液中，能够自引发形成水凝胶。
所述自组装肽在pH6-10之间时，加入正电荷源物质作为引发剂可以形成水凝胶。
本发明的自组装肽的酸性氨基酸与引发剂之间相互作用引发肽水溶液自组装成肽水凝胶。在中性条件下，加入引发剂可以给出带正电的物质，从而使多肽分子上带负电的酸根离子得到中和，从而降低了多肽分子间的斥力，多肽分子进而通过疏水作用与氢键实现多肽分子的自组装，最终形成了纳米三维网络结构。
本发明的优点还体现在本发明的自组装肽可以在中性条件下配制成多肽溶液，并且这样的多肽溶液在加入引发剂之前并不形成三维网状支架材料，从而保持了使用前自组装肽溶液的操作便捷性。原因在于多肽上亲水结构域含有至少一个酸性氨基酸，中性条件下带负电，多肽分子之间存在电荷斥力，无法形成紧密的分子堆叠，即便疏水结构域的疏水作用为分子的聚集提供了动力，但是分子之间的静电互斥作用阻碍了稳定有序的排列。此外，亲水结构域的酸性氨基酸是亲水氨基酸，亲水氨基酸倾向于暴露在溶液中，β转角的结构使得酸性氨基酸附近的其他侧链对其干扰减少。所以，β转角的结构有利于酸性氨基酸发挥作用。β转角结构使得多肽上酸性氨基酸的侧链基团更加活泼，加剧了分子间的排斥，影响分子的排列方式，进一步增加了自组装肽形成三维网状支架结构的难度。而且，自组装肽分子在运动过程中彼此接近时，由于静电作用被赋予了加速度，使得整个体系的动能增加。因此，在中性条件下仅有多肽的溶液中，自组装肽分子的分布较为混乱，不能形成三维网状支架材料。
一旦这样的自组装肽溶液中加入正电荷源引发剂，当正电离子/基团存在时，自组装肽上的羰基会与之形成静电作用。自组装肽分子上的负电荷被“屏蔽”或“中和”，分子间的静电互斥减少，多肽序列中的β转角结构则增强了肽之间的嵌合作用，而包含羟基的苏氨酸、丝氨酸及羟脯氨酸则会由于形成氢键的作用从而进一步增强多肽之间的相互作用，进而在疏水作用和氢键的驱动下使分子有序的聚集、规则的分布，形成三维网状支架材料。本发明多肽的这种触发方式对于细胞培养的优点尤为明显，非常便于功能成分的混合，在使用时也非常便于操作，而在细胞培养条件下则迅速自组装形成凝胶发挥作用。而当进行细胞3D培养时，溶液状态的多肽溶液也非常方便细胞的接种，当与细胞混合以后，在进行自组装启动，从而实现对细胞的支撑功能。
尤其是，在生理条件，例如中性生理条件下，加入蛋白质类物质或包含蛋白质类物质的混合体系提供正电荷，从而使自组装肽分子上带负电的酸根离子得到中和，从而降低了自组装肽分子间的斥力，自组装肽分子进而通过疏水作用与氢键实现自组装肽分子的自组装，最终形成了三维网络纳米结构。
因此，本发明的优点还体现在本发明的自组装肽可以在中性条件下配制成自组装肽溶液，并且这样的自组装肽溶液在加入正电荷源引发剂之前并不形成三维网状支架材料，从而保持了使用前自组装肽溶液的稳定性。原因在于自组装肽上亲水结构域含有至少一个酸性氨基酸，中性条件下带负电，自组装肽分子之间存在电荷斥力，无法形成紧密的分子堆叠，即便疏水结构域的疏水作用为分子的聚集提供了动力，但是分子之间的静电互斥作用阻碍了稳定有序的排列。此外，亲水结构域的酸性氨基酸是亲水氨基酸，亲水氨基酸倾向于暴露在溶液中，β转角的结构使得酸性氨基酸附近的其他侧链对其干扰减少。所以，β转角的结构有利于酸性氨基酸发挥作用。β转角结构使得自组装肽上酸性氨基酸的侧链基团更加活泼，加剧了分子间的排斥，影响分子的排列方式，进一步增加了自组装肽形成三维网状支架结构的难度。而且，自组装肽分子在运动过程中彼此接近时，由于静电作用被赋予了加速度，使得整个体系的动能增加。因此，在中性条件下仅有自组装肽的溶液中，自组装肽分子的分布较为混乱，不能形成三维网状支架材料。这对于用于制备注射治疗用水凝胶的优点尤为明显。
一旦这样的自组装肽溶液中加入正电荷源引发剂，当正电离子/基团存在时，自组装肽上的羰基会与之形成静电作用。自组装肽分子上的负电荷被“屏蔽”，分子间的静电互斥减少，疏水作用和氢键使分子有序的聚集、规则的分布，形成三维网状支架材料。
在加入引发剂之前，自组装肽的形式由弯曲交织的纳米纤维组成，纤维分布不均匀，纤维弯曲，柔性强，相比之下，引发物质的存在使得纤维的弯曲度降低，纤维长度和直径显著提高，纤维的排列方式也发生了变化，纤维紧密有序的排列形成纤维束，纤维束与纤维束之间相互交织。圆二色谱(CD)分析显示，加入引发剂以后，自组装肽组装成的纳米纤维的二级结构主要为β-转角，纳米纤维的二级结构中增加了β-折叠，为形成更多的β-折叠结构及使纤维结构更加规则有序提供有利基础；而且，纤维的二级结构更加多样，二级结构的增加促进纤维结构的稳定。
本发明还证实了在亲水结构域中引入羟脯氨酸可以通过多肽与多肽之间增强的氢键网络而显著增强多肽自组装所形成的β-折叠的稳定性，从而提升自组装支架的稳定性，从而增强细胞的支撑功能。同时亲水区域内β-折叠结构通过单个丙氨酸对甘氨酸的替代，以及谷氨酸对天冬氨酸的替换，在不破坏亲水区域β-转角结构的前提下增强氨基酸侧链的疏水性，可以通过疏水相互作用同样可以起到增加自组装材料的稳定性，从而使支架材料对细胞的支撑性更强。
此外，由于红细胞的细胞膜整体带负电，缺少正电离子/基团时，自组装肽无法形成有效的三维网状支架材料，无法提供支撑细胞的条件，本发明中，在不同种类的正电离子/基团的刺激下，自组装肽形成了三维网状支架材料，使得红细胞实现三维立体分布。
在二维环境下生长的细胞的细胞增殖在培养一段时间后速率呈现逐渐下降的趋势，细胞状态变差，随后细胞总数骤降；本发明的自组装肽自组装形成的三维网状支架使得细胞在整个培养周期内均以相对均一稳定的增值速率生长，表明本发明的三维网状支架材料不仅对细胞无毒害、生物相容性良好，还能使细胞在网状支架的支撑下以良好的状态长时间稳定增殖。
含有正电荷源天然物质的细胞培养基中添加本发明的自组装肽可以高度还原细胞在体内的生长环境，在体外实现长时间的三维细胞培养。
采用本发明的自组装肽自组装形成的三维网状支架所进行的造血干细胞储存体系的储存效果要好于传统二维储存，极大改善了细胞存活率。
微载体通常是细胞培养中使用的无毒性、非刚性、密度均一的微球或微载片，能使依赖贴壁的细胞悬浮培养时贴附在颗粒表面单层生长，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。微载体在体外细胞大规模增殖领域能发挥巨大作用。根据微载体的形状，可以主要划分为球状和片状，尺寸约100-500um。制备微载体的原料有玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、葡聚糖、明胶、海藻酸钠、聚乳酸、壳聚糖等，表面可经过修饰带电荷；密度一般控制在比水高3％-4％或更低，只需轻微搅动即可悬浮，且可通过离心或沉降等廉价的方式实现固液分离。因此，目前常见的商业化微载体，按原料可分为交联葡聚糖微载体、纤维素微载体、蛋白微载体、以及人工合成高分子为基质的微载体，其中，交联葡聚糖微载体以Cytodex系列为代表，采用变性胶原或二乙胺乙基(DEAE)进行表面改性，整体带正电荷，利于细胞粘附，是应用较为广泛的一类微载体；纤维素微载体以Cytopore为代表，通过DEAE改性而带正电，具有多孔结构，除提供细胞粘附的表面积外也可保护细胞不受剪切力损伤；蛋白微载体多以明胶或变性胶原为基质，如Tantti 3D细胞培养支架以天然胶原蛋白为原料，具有立体大孔结构，可用于体外细胞放大培养。除上述天然高分子外，其他人工合成材料，如玻璃、聚苯乙烯等制备的微载体，具有重复性高的特点，然而，由于其表面缺乏可供细胞识别粘附的位点，导致其应用受限。现有的商业化微载体多用于生物医药和细胞培养领域，食品行业的相关应用较少。
选择微载体用于体外细胞培养时，除密度、表面特性等常规参数对细胞附着、扩增的影响需考虑外，还对可分离或可降解等有特殊要求，否则培养完成后还需额外的分离步骤，增加工艺的复杂程度和生产成本。
名词解释：
水凝胶(hydrogel)是一种亲水的高分子聚合物材料，可通过化学交联或物理交联的方式形成三维网状结构。水凝胶材料可以来自天然和合成来源。天然聚合物，如壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸(HA)、胶原蛋白、明胶等具有可生物降解、携带整合素结合位点的优点，但存在免疫原性。人工合成聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯醇(PVA)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等具备机械性能强、可定制性、低免疫原性等优点，但缺乏先天的生物功能，必须经过重要的后处理才能在体内引发所需的反应。
水凝胶具有以下特性：
1.具备良好的生物相关性：高分子聚合物中含有大量亲水基团，能够吸收超过自身几十倍的水分，且在水中具有溶胀不溶解的特性，具有良好的保水能力；
2.类似于细胞外基质：通过结构设计，可使水凝胶的物理性质与化学性质及机械性能与细胞外基质相似，有利于细胞生长繁殖；
3.生物降解性：部分天然聚合物材料，可生物降解，避免植入物取出所导致的二次损伤。正是这些独有的优势，使得水凝胶在生物医用材料中大放光彩。
在本发明中，当同时具备亲水性表面和疏水性表面的结构的肽在本发明所述条件下，尤其是生理条件下自组装时，通过包封水而获得的水凝胶。
自组装肽(Peptide Self Assembly)是具有交替的电荷域和极性域的氨基酸短链。当溶于中性溶剂和生理盐浓度时，这些多肽通过氢键、离子键、疏水相互作用或范德华力自发组装成分级纳米结构。源自这些组件的材料具有无毒、非免疫原性、非血栓形成、可降解和易于代谢的优点。同时纳米纤维与天然ECM纤维具有相同的尺寸规模，可以很容易地设计为模拟各种软组织的刚度，并且可以通过细胞相互作用肽结构域或细胞因子和生长因子的附着来进一步功能化，因此，可以用来设计生物学相关的培养环境并改进对增殖细胞群的控制。
自组装肽作为药物载体可用作伤口治疗的水凝胶，还可用作癌症治疗的多肽纳米纤维，用于持续释放小分子、生长因子和单克隆抗体。例如，自组装肽可用于促进再生组织内的血管生成和利用基于多肽的支架修复皮肤创面的研究。然而，自组装肽可用于注射治疗水凝胶领域仍处于初级阶段。
自组装肽中交替的亲水和疏水氨基酸残基，因此，自组装肽能够保留大量的水从而形成水凝胶。亲水残基侧链可直接与水相互作用，水分子形成包合物以包围疏水残基侧链。自组装肽中疏水残基和亲水残基的数量需要巧妙的设计和配比，如果疏水残基太多，则所述自组装肽会不溶于水并从水中沉淀出来；另一方面，如果亲水残基太多，则所述自组装肽是高度水溶性的，因此不能形成水凝胶。此外，也需要精密巧妙诱导肽分子自组装成有序的纳米结构材料，例如纳米纤维，纳米管和纳米囊泡。
“氨基酸”包含那些天然存在的以及非天然存在的氨基酸，例如D-天然氨基酸，β和γ衍生物。按照标准术语，氨基酸残基序列可用三个字母或一个字母的代码来命名，例如：丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天门冬酰胺(Asp，N)；天门冬氨酸(天冬氨酸，D)，半胱氨酸(半胱氨酸，C)；谷氨酰胺(谷氨酰胺，Q)；谷氨酸(谷氨酸，E)；甘氨酸(Gly，G)；组氨酸(His，H)，异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(赖氨酸，L)，蛋氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(丙氨酸，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)；缬氨酸(Val，V)；含硒半胱氨酸(Sec，U)；羟脯氨酸(Hyp，O)。
本发明中“肽”是氨基酸链。特别是，肽是由2至40个氨基酸的长度。
本发明中“自组装”是指通常环境条件下多肽聚集形成有序的结构。
本发明中“β-折叠”是指多肽链中一段较伸展的周期性折叠的锯齿形的主链构象，呈平行或反平行排列，从而形成β-折叠(片层)。平行或反平行构象是基于肽从N至C端排列的方向进行确定。平行排列是指肽链都是从N到C端方向排列。反平行排列是指，肽链以相反的方向排列(即第一肽链是从N到C端排列，而相对的第二肽链是从C至N端排列)。平行排列可以包含肽平移造成的肽两端彼此交错。至少肽的一半长度涉及肽间相互作用力。在反平行的排列中，多肽通常是排列成一条线来提供平齐的两个端点。这是一个典型的终端到终端互补肽。
β-转角是蛋白质中一种不规则的二级结构，其引起多肽链方向的变化。β-转角常发生在肽链进行180°回折的转角上。β-转角由3-5个氨基酸残基组成，第2个残基为脯氨酸(P)或羟脯氨酸(O)。β-转角基序通常是指通过第n个氨基酸残基的羰基氧原子与第n+3个氨基酸残基的酰胺质子形成氢键而稳定化的转角结构。β-转角也称作β-弯头、反向弯头或β-环，用于连接β-链。
本发明中的“疏水性”是指倾向于排斥水，或者是完全不能在水中溶解的性质。
本发明中的“亲水性”，是指容易吸收水分并具有很强的易与水相互作用的极性基团的性质。
亲水性氨基酸，即极性氨基酸，其R基团呈极性，一般能和水分子形成氢键，故对水分子具有一定的亲和性。亲水性氨基酸包括：S、T、Y、C、U、N、Q、D、E、O、R、K、H。
疏水性氨基酸，即非极性氨基酸，其R基团呈非极性，对水分子的亲和性不高或者极低，但对脂溶性物质的亲和性较高。它们包括：G、A、V、L、I、P、M、F和W。
“纳米结构”是指具有纳米尺寸的结构，纳米结构可以为一维，二维，或三维空间的任何形状，包含纳米薄膜，纳米纤维，纳米棒，纳米线，纳米纤维网络，纳米球，纳米螺旋线及其中几种的混合物。纳米结构的表面具有纳米级的一维结构，即物体的表面厚度为0.1nm到100nm之间。纳米管具有纳米尺寸的两个维数，纳米管的直径为0.1至100nm，长度可能更大。球形纳米粒子在纳米尺寸上有三个维度，即粒子纳米在每个空间维度上的尺寸为0.1至100纳米。
大多数微载体体外细胞培养的方案分为2种：一种是静态培养，即直接将细胞悬液滴加至微载体片剂上，之后用完全培养基分散成微载体，通过孔板或者其他生物反应器途径培养细胞，但在整个周期内始终是一种静态培养的过程，静态培养操作相对简单，使用方便；另一种是动态培养，即将细胞悬液和微载体悬液按比例混合后，在125ml旋转瓶或者生物反应器条件下进行细胞培养，通过调节转速使微载体均匀悬浮于培养瓶中，从而帮助细胞接种在微载体上，最终实现细胞粘附和生长。动态培养需要相关配套的设备辅助进行，操作较为繁琐，但细胞培养结果比静态培养更好。
附图说明
图1A-1B显示以精氨酸作为引发剂，不加引发剂的自组装肽为液态(A)，精氨酸存在时，自组装肽为水凝胶(B)；图1C显示以组织液为引发剂,自组装肽可以形成水凝胶,经注射器挤出后仍为凝胶状态。
图2A-2J显示不同的引发物质与自组装肽混合均可得到本发明三维网状支架材料。
图3显示以纤维蛋白原、转铁蛋白、γ球蛋白为引发剂形成的水凝胶三维网状支架材料。
图4A-4B显示以纤维蛋白原、转铁蛋白、γ球蛋白为引发剂形成的肽纤维水凝胶的硫黄素T的荧光变化。
图5显示自组装肽不同的序列结构在对形成三维网状支架的红细胞支撑影响。
图6显示引发成分对自组装肽溶液对红细胞的支撑影响。
图7显示不同自组装肽的序列结构的流变性质变化。依次为SEQ ID NO.:7(A)、SEQID NO.:3(B)、SEQ ID NO.:2(C)、SEQ ID NO.:1(D)、SEQ ID NO.:5(E)、SEQ ID NO.:6(F)、SEQ ID NO.:4(G)、SEQ ID NO.:10(H)SEQ ID NO.:8(I)。
图8A-8E显示了显示了本发明自组装肽材料分别被精胺(B)、高糖完全培养基(C)、组织液(D)、血清(E)引发后支撑细胞效果的共聚焦激光扫描电镜图像，其中自组装肽浓度均为0.1wt.％，(A)为不加任何引发成分的缓冲液；
图9显示了显示了使用不同浓度的本发明自组装肽在完全培养基中被引发形成的三维网状支架材料培养的细胞在5天中的相对活力(A)和在5天内的生长曲线(B)；
图10显示了在细胞培养体系中添加本发明自组装肽材料引发其组装成纤维网络支架并培养细胞3天(A)和7天(C)的共聚焦激光扫描电镜图像，其中(B)和(D)分别代表的培养细胞3天和7天体系中典型的细胞团簇，各个实验组别中使用的自组装肽材料的浓度为0.1wt.％；
图11A-11D显示了在细胞培养体系中添加0.1wt.％本发明自组装肽材料引发其组装成纤维网络支架并培养细胞，分别于第五天、第十天和第十五天统计细胞球直径(A)，并拍摄培养体系中特征细胞球(B、C、D)；
图12显示了在细胞培养体系中添加0.1wt.％本发明自组装肽材料引发其组装成纤维网络支架并培养细胞，15天后收获细胞测其在5天中的相对活力。
图13显示了自组装肽对微载体的悬浮支撑作用，及采用该体系针对小鼠间充质干细胞的增殖培养。
自组装肽对微载体的悬浮支撑作用，及采用该体系针对小鼠间充值干细胞的增殖培养，其中，A为SEQ ID NO.:25自组装肽支撑聚苯乙烯微载体，B为SEQ ID NO.:19自组装肽支撑大孔明胶微载体，C为SEQ ID NO.:26自组装肽支撑聚乳酸微球，D为静态培养条件的荧光显微镜图像，E细胞计数结果。
实施例
实施例1自组装肽化合物的合成
通过标准固相自组装肽合成方法合成本发明的自组装肽或类肽化合物，氨基酸序列见序列SEQ ID NOs:1-32。
实施例2极性肽或类肽溶液的制备
将实施例1的自组装肽或类肽加入水或磷酸盐(PBS)缓冲液(pH＝7.2-7.4，如未特殊说明，本说明中使用的PBS缓冲液均为此pH值)中，滴加碱液至自组装肽完全溶解，将溶液调至中性7.2，获得5wt.％的自组装肽或类肽母液，高压灭菌后于4℃储存、备用。利用该母液进行自组装肽浓度调整，即可得到预定浓度的自组装肽或类肽材料。取一定量的自组装肽或类肽母液用PBS缓冲液稀释后得到0.5wt.％的自组装肽或类肽溶液。
实施例3自组装肽在正电离子/基团刺激下形成的三维网状支架材料的制备
将实施例2中所得自组装肽或类肽溶液与引发物质溶液混合均匀，并保证混合溶液中自组装肽或类肽与引发物质的浓度比范围在(1-100):(1-100)，即可获得具有多种引发物质的、自组装的、三维网络支架的可调控自组装肽水凝胶材料，所得混合溶液pH值为中性(约pH6至约pH8，优选约pH6.5-7.5，优选约pH7-7.5)。
以氨基酸序列IIIIIGSIIGPGGDGPGGV(SEQ ID NO：1)显示的自主装肽为例，引发物质以精氨酸为例，0.5wt.％肽溶液(参见图1A)为液态，样品瓶倒立后，溶液倒流集中在瓶子瓶口，精氨酸存在时，肽浓度为0.5wt.％的对引发物质精氨酸响应自组装的肽水凝胶(参见图1B)，样品瓶倒立，由于形成了水凝胶，故材料不会掉落。图1C显示以组织液为引发剂,自组装肽可以形成水凝胶,经注射器挤出后仍为凝胶状态。对其他类型的引发物质响应形成的肽水凝胶材料也具有同等或类似的效果。
而以氨基酸序列LLLLLGSVLGPAGEGPAGE(SEQ ID NO：29)显示的自主装肽为例，浓度为2％的自组装肽与等体积的人体组织液混合后迅速形成水凝胶,该水凝胶可以用注射器吸取，经注射挤出后仍然保持成胶状态。对其他类型的引发物质响应形成的肽水凝胶材料也具有同等或类似的效果。
按照该方法可以配置本发明所描述任意预定肽浓度自组装肽或类肽与引发物质浓度比的自组装肽水凝胶材料，结果如下表1所示。
实施例4本发明自组装肽所形成支架材料的结构表征
实验一透射电子显微镜(TEM)
所述极性肽或类肽以SEQ ID NO:3(IIIIIGSIIGOGGEGPGGV)为例；所述引发物质以聚赖氨酸、精胺、庆大霉素、赖氨酸、精氨酸、亚精胺、卡那霉素、壳聚糖、镁离子为例。
实验方法：用超纯水分别稀释实施例3所得自组装肽材料母液(SEQ ID NO:3)与实施例2所得自组装肽对引发物质响应自组装形成的三维网状支架材料，为了得到在生理条件下水凝胶的纳米级形态，在37℃孵育1小时，取10μL置于300目碳支撑膜铜网(新兴百瑞)上，真空干燥。使用2wt.％的磷钨酸负染液对样品染色，每次60s，重复三次。将染色后的铜网置于常温下干燥。使用Talos G2 200X透射电子显微镜进行成像观察。
实验结果：如图2A-2J所示，不同的引发物质与自组装肽混合均可得到本发明三维网状支架材料，A-J依次对应的引发物质是：聚赖氨酸、精胺、庆大霉素、赖氨酸、精氨酸、亚精胺、卡那霉素、壳聚糖、镁离子。自组装肽材料形成的结构(图2A)由弯曲交织的纳米纤维组成，纤维分布不均匀，纤维弯曲，柔性强。引发物质的存在使得纤维的弯曲度降低(图2B-2J)，纤维长度和直径显著提高，纤维的排列方式也发生了变化，纤维紧密有序的排列形成纤维束，纤维束与纤维束之间相互交织。
实验二、圆二色谱(CD)分析
圆二色光谱是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构、监测蛋白质分子在外界条件诱导下构象变化的方法，该手段是对液体进行检测，所得结果更为贴近真实生理环境下蛋白质的二级结构，是研究蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。
实验方法：用于CD检测的自组装肽或其衍生物溶液的制备：将所得的0.2wt％的自组装肽溶液用PBS缓冲液稀释至自组装肽浓度为0.02wt％。
用于CD检测的蛋白质溶液的制备：将层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、γ球蛋白、玻连蛋白分别加入超纯水中至蛋白质浓度为0.02wt％。
自组装肽或其衍生物样品的制备：将实施例2中所得的0.2wt％的自组装肽溶液用PBS缓冲液稀释至自组装肽浓度为0.01wt％，于37℃孵育一小时。
本发明肽水凝胶样品的制备：将0.02wt％的自组装肽溶液分别与0.02wt％的蛋白质溶液以1:1体积比混匀，于37℃孵育一小时，得到自组装肽终浓度为0.01wt％的混合体系，由于自组装肽/蛋白水凝胶为溶胀体系，因此虽然此实验自组装肽浓度低于0.1wt％。该结果仍然验证了自组装肽与蛋白之间的相互作用。
分别将400μL所制备的各样品装入光路长度为1mm的矩形石英池中，使用MOS-450/AF-CD光谱仪(Bio-Logic，Claix，France)在室温下，以0.5nm的分辨率和0.5nm/s的扫描速度进行各自在190nm-260nm波段的圆二色检测，每组检测均扣除背景后进行三次。以SEQ IDNO.:13(IIIIIGOGIIGPGGEGPGGE)自组装肽分别和纤维蛋白原、转铁蛋白、γ球蛋白形成的肽水凝胶为例，结果见图3。
圆二色检测结果表明，自组装肽或其衍生物对蛋白质响应性，表现为二级结构的改变。图3表明在中性环境下自组装肽或其衍生物单独存在(见对照组)时，其组装成的纳米纤维的二级结构主要为β-转角，而在分别引入蛋白质的体系内，可以看到圆二色谱图中在200nm附近的正峰发生不同程度的右移，这表明，相比于自组装肽或其衍生物单独存在未被引发时，对蛋白质的响应使得自组装肽或其衍生物组装成的纳米纤维的二级结构中增加了β-折叠，为形成更多的β-折叠结构及使纤维结构更加规则有序提供有利基础。且加入蛋白质组(见纤维蛋白原引发组、转铁蛋白引发组、γ球蛋白引发组)在192nm附近出现了负峰，这是自组装肽中脯氨酸或羟脯氨酸参与到自组装肽组装中形成的特征聚合结构在纤维二级结构上的体现，表明对这三种物质的响应，使由本发明自组装肽组装成的纤维的二级结构更加多样，二级结构的增加促进纤维结构的稳定。本实验说明，虽然自组装肽或其衍生物自身即可组装成特定二级结构的纳米纤维，但对蛋白质的响应性使自组装肽或其衍生物组装成结构更加复杂有序的纳米纤维，从而在宏观上表现出像实验一中出现的交联紧密、孔隙均匀的三维网络状结构。
实验结论：实验二证明引发物质的存在使得所述极性肽自组装形成了有利于细胞粘附和三维培养的凝胶常见网状分布。结合实验一、实验二可以确定，自组装肽与引发物质之间的相互作用改变了自组装肽自组装的路径，促使了自组装肽形成三维网状支架材料，形成了与未加引发物质截然不同的微观形貌。
当采用本发明的自组装肽或类肽时，或者符合本发明所述的自组装肽结构时，在引发物质的刺激下均能获得与实验一、二相似的实验结果，不再一一具体列举。
实验三、硫黄素T荧光实验
实验方法：硫黄素T可以与自组装肽结构中β-折叠结构结合，从而使荧光强度增强。在本实验中我们将利用SEQ ID NO.:13(IIIIIGOGIIGPGGEGPGGE)通过检测硫黄素T的荧光变化从而验证自组装肽在自组装过程的二级结构变化。将800μM(0.148wt％)、400μM(0.072wt％)、200μM(0.036wt％)多肽溶胶与0.072wt％的触发剂按体积比1：1混合，对照用超纯水代替触发剂。静置15分钟后，与100μM硫黄素T溶液等体积混合。在450-550nm范围内进行荧光发射测量，并为每个样品采集5个光谱。激发波长为442nm，激发和发射的狭缝分别为5nm和2.5nm。
实验结果：利用能够给富含β-折叠结构的肽纤维染色的硫黄素T(ThT)对CD光谱数据进行验证，证实了β-折叠的存在，并揭示了其与肽浓度的关系。自组装肽溶胶中存在β-折叠，其含量与自组装肽浓度呈正相关，表明自组装肽是一种浓度依赖性自组装肽(图4A)。这是因为肽单体的增加更易于分子间的接触，从而提高了组装程度。添加引发剂后凝胶生成组的β-折叠含量远远高于溶胶组(图4B)。CD和ThT染色数据表明，在中性pH条件下，蛋白引发剂活化自组装肽生成的超分子聚合物呈现典型的β-折叠结构。
实施例5氨基酸序列结构以及引发成分对本发明肽自组装材料的物性和功能性影响，以及自组装的机理验证
实验一、液态条件下不同序列对红细胞支撑验证
在本次实验中，以红细胞为例，我们验证氨基酸序列对细胞的支撑影响，尤其是验证氨基酸序列中羟脯氨酸和丙氨酸对细胞的支撑影响。
实验方法：以PBS缓冲液分别配置浓度为0.1wt％的SEQ ID NO.:1(IIIIIGSIIGPGGDGPGGV)、SEQ ID NO.:2(IIIIIGSIIGPGGEGPGGV)、SEQ ID NO.:3(IIIIIGSIIGOGGEGPGGV)、SEQ ID NO.:7(IIIIIGSIIGOGAEGPGGV)自组装肽母液，高温灭菌。
使用2ml透明玻璃瓶，4种材料分别配置0.1wt％，0.05wt％，0.01wt％的2mL自组装肽溶液(含终浓度为0.1wt％的纤维粘连蛋白)和空白组(不含自组装肽溶液，含0.1wt％的纤维粘连蛋白)。加入5×109红细胞母液，使其终浓度为1×108，吹打均匀。每4小时进行一次拍照，比较不同材料对红细胞的支撑效果。
实验结论：相近的氨基酸序列的自组装肽中，羟脯氨酸和丙氨酸对液态条件下的支架溶液的细胞支撑能力具有显著影响。如图5所示，在高浓度条件下(0.1wt％，0.05wt％)，四种自组装肽溶液均可以有效支撑浓度为1×108的红细胞；然而，在低浓度条件下(0.01wt％)，亲水结构域中的羟脯氨酸、丙氨酸和谷氨酸体现了对红细胞支撑能力的显著影响。四种自组装肽溶液分别在8小时、24小时、32小时、48小时出现出明显的沉降。四种自组装肽的支撑能力由弱到强：SEQ ID NO.:1(IIIIIGSIIGPGGDGPGGV)<SEQ ID NO.:2(IIIIIGSIIGPGGEGPGGV)<SEQ ID NO.:3(IIIIIGSIIGOGGEGPGGV)<SEQ ID NO.:7(IIIIIGSIIGOGAEGPGGV)。基于纤维粘连蛋白响应所形成的支架网络，相对于SEQ ID NO.:1而言，SEQ ID NO.:2亲水区域中的谷氨酸，SEQ ID NO.:3亲水区域中的谷氨酸和羟脯氨酸，以及SEQ ID NO.:7亲水区域中的谷氨酸、羟脯氨酸和丙氨酸依次表现出了对细胞支撑能力越来越强的增强作用。羟脯氨酸在动物的胶原组织中大量存在，可以通过其中的羟基所形成的氢键而增强蛋白基质的弹性和支撑力。在本专利通过引入羟脯氨酸可以通过自组装肽与自组装肽之间增强的氢键网络而显著增强自组装肽自组装所形成的β-折叠的稳定性，从而提升自组装支架的稳定性，从而增强细胞的支撑功能。同时亲水区域内β-折叠结构通过单个丙氨酸对甘氨酸的替代，以及谷氨酸对天冬氨酸的替换，在不破坏亲水区域β-转角结构的前提下增强氨基酸侧链的疏水性，可以通过疏水相互作用同样可以起到增加自组装材料的稳定性，从而使支架材料对细胞的支撑性更强。
实验二、红细胞支撑实验，不同引发成分的影响
实验方法：取0.16mL红细胞原液(9.17×109/mL)，用10mM PBS稀释至10mL(9.17×107/mL)，取4.5mL红细胞稀释液加入10ml圆底试管中，并加入4.5mL 4mmol/L的Calcein-AM溶液，在37℃条件下孵育20min，放于离心机中在4℃，1500r/min条件下，离心3min，去上清，加入PBS重悬，反复5次，获得约1.5ml的清洗后的红细胞重悬液(1×108/mL)，待用。
实验结果：在红细胞重悬液加入PBS缓冲液，将红细胞稀释至1×107/mL，混匀静止4小时，结果如图6A管所示。
添加实施例2中得到的1wt％自组装肽SEQ ID NO.:3溶液，使体系中最终肽浓度为0.05wt％，红细胞最终浓度为1×107/mL，混匀静置4小时，结果如图6B管所示。
在红细胞重悬液中添加实施例3中得到的多肽SEQ ID NO.:3与赖氨酸混合溶液，即多肽在赖氨酸的存在下形成的三维网状支架材料材料，使体系中最终肽浓度为0.05wt.％，混匀静置，结果如图6C管所示。
在红细胞重悬液中添加实施例2中得到的自组装肽SEQ ID NO.:3与庆大霉素混合溶液，即多肽在庆大霉素的存在下形成的三维网状支架材料材料，使体系中最终肽浓度为0.05wt.％，混匀静置，结果如图6D管所示。
在红细胞重悬液中添加实施例2中得到的自组装肽SEQ ID NO.:3与聚赖氨酸混合溶液，即自组装肽在聚赖氨酸的存在下形成的三维网状支架材料材料，使体系中最终肽浓度为0.05wt.％，混匀静置，结果如图6E管所示。
在红细胞重悬液中添加实施例3中得到的自组装肽SEQ ID NO.:3与纤维蛋白原混合溶液，即自组装肽在纤维蛋白原的存在下形成的三维网状支架材料材料，使体系中最终肽浓度为0.05wt.％，混匀静置，结果如图6F管所示。
不添加自组装肽和正电离子/基团物质的对照组，结果如图6A管所示。红细胞集中分布在离心管底部。
B组中，红细胞发生明显的沉降，有三维分布的趋势，但是并不明显，C-E组中，红细胞呈现立体分布，离心管中可以观察到红色部分的高度增加。对比C-F管，在不同种类的正电离子/基团的刺激下，自组装肽形成了三维网状支架材料，使得红细胞实现三维立体分布，而此时体系状态仍为溶液状态。结合实验一的结果，可知自组装肽对正电离子/基团的响应体现在分子组装形成的二级结构发生改变，这种改变使得自组装肽形成了不同形貌的纤维，而且纤维的分布方式改变(实验一)。这种微观的变化解释了本实验中C-F管与A与B管的不同，红细胞吸附在自组装肽响应形成的三维纳米纤维上，得以呈现三维立体的分布。仅有自组装肽(B)，由于红细胞的细胞膜整体带负电，缺少正电离子/基团时，自组装肽无法形成有效三维网状支架材料，无法提供支撑细胞的条件。
实验三、流变实验，自组装肽二级结构及氨基酸序列的影响
实验方法：自组装肽材料样品制备：使用实施例2所得2wt％的自组装肽溶液SEQID NO.:1(IIIIIGSIIGPGGDGPGGV)、SEQ ID NO.:2(IIIIIGSIIGPGGEGPGGV)、SEQ ID NO.:3(IIIIIGSIIGOGGEGPGGV)、SEQ ID NO.:4(IIIIGSIIGOGGEGPGGV)、SEQ ID NO.:5(IIIIIGSIIGOGGEGPGGGV)、SEQ ID NO.:6(IIIIIGSIIGOGGEGPGV)、SEQ ID NO.:7(IIIIIGSIIGOGAEGPGGV)、SEQ ID NO.:8(IIIIIGSIIOGGAEGPGGV)、SEQ ID NO.:9(IIIIIGSIIGOGGVGPGGV)，SEQ ID NO.:10(IIIIIIGSIIGOGAEGPGGVGPGGV)。
自组装肽溶液在细胞完全培养基响应下形成的水凝胶样品的制备：用磷酸缓冲液稀释实施例2所得的2wt％自组装肽材料母液，加入小牛血清，自组装肽终浓度为0.5％，血清终浓度为10v/v％，pH为中性的混合溶液。
混合溶液的储能模量(G’)用MARS 60流变仪在20mm平板上测得。为了确定三维纳米基质的形成速率，溶液制备后立即置于平板上测试。使用500μm的间隙，并在间隙处添加矿物油以防止样品脱水，并开始收集数据。进行动态时间扫描实验(DTS)，以监测储能模量(G’)模量随时间(1Hz频率，1％应变)的变化，持续2000分钟。
实验结果：本发明肽水凝胶的机械强度能有效为细胞、功能分子、药物等提供支撑、包封效果，有利于实现三维细胞培养、组织修复、药物缓释等。实验证明，通过混合肽溶液和血清混合，可以即刻获得自组装肽对引发物质响应组装成储能模量大于10的水凝胶材料。操作方便，凝胶化时间短。而比较不同的序列发现(参见图7)，SEQ ID NO.:7(IIIIIGSIIGOGAEGPGGV)>SEQ ID NO.:3(IIIIIGSIIGOGGEGPGV)>SEQ ID NO.:2(IIIIIGSIIGPGGEGPGGV)≥SEQ ID NO.:1(IIIIIGSIIGPGGDGPGGV)；该实验现象与实验三的结果一致，即羟脯氨酸可以增强本发明所形成水凝胶的机械强度，从而增强支架材料的支撑功能。同时对比SEQ ID NO.:5(IIIIIGSIIGOGGEGPGGGV)与SEQ ID NO.:6(IIIIIGSIIGOGGEGPGV)的结果发现，当形成β-转角氨基酸为6个(SEQ ID NO.:5)和3个(SEQID NO.:6)，及增加β-转角结构为连续3个(SEQ ID NO.:10)，或者疏水性氨基酸的个数为4个(SEQ ID NO.:4)时，自组装肽依然可以形成弹性较弱的水凝胶结构。图7中，A对应于序列SEQ ID NO.:7、B对应序列SEQ ID NO.:3、C对应序列SEQ ID NO.:2、D对应序列SEQ ID NO.:1、E对应序列SEQ ID NO.:5、F对应序列SEQ ID NO.:6、G对应序列SEQ ID NO.:4、H对应序列SEQ ID NO.:10、I对应序列SEQ ID NO.:8。
在SEQ ID NO.:8中，我们通过调整SEQ ID NO.:7中第10-11个氨基酸GO为OG从而完全破坏了SEQ ID NO.:7中第一个β-转角的形成条件，形成了序列SEQ ID NO.:8；结果我们发现，SEQ ID NO.:8完全失去了对血清的自组装响应。该现象进一步证明了连续的两个β-转角是本发明中自组装肽具有自组装能力的最基本条件。而对比SEQ ID NO.:9(IIIIIGSIIGOGGVGPGGV)与SEQ ID NO.:4(IIIIGSIIGOGGEGPGGV)我们发现，当β-转角的末端不再连接一个酸性氨基酸的时候，自组装肽水溶液不再对血清响应，其在中性水溶液中即可形成水凝胶；在此我们进一步验证了至少一个自组装肽的亲水区域中β-转角末端所连接的酸性氨基酸是本发明自组装肽自组装材料对引发成分响应的前提条件。
实施例6本发明的肽水凝胶材料在生物医药领域的应用
实验一、被引发后的本发明自组装肽在三维空间内的细胞支撑效果
细胞在二维平面上生长是人为的非自然培养方式，因为这与细胞能够以最佳状态进行增值的生物体内环境大相径庭。因此，传统的2D细胞培养法收获的细胞因在与生物体内相差较远的环境中生长，所以会出现细胞结构和刺激应答功能缺失。而细胞三维培养能够更好地模拟生物体内细胞生存的自然环境，可高度保持细胞自身正常的生化反应和细胞间的相互作用，因此处于三维环境中的细胞具有能影响其迁移、粘附、增殖和基因表达等功能的特征性生物学信号，对内源性和外源性刺激应答更接近于它们在体内的反应。组织工程中特定细胞过程，如分化，已被证明在三维环境中比二维环境中更容易发生。实现细胞的三维立体空间培养就要求培养细胞的材料具有优秀的支撑细胞效果和生物相容性。
本实验以常见的贴壁细胞HepG2为细胞模型，采用SEQ ID NO.:13(IIIIIGOGIIGPGGEGPGGE)，选用血清作为携带正电基团的天然生物大分子的混合物代表、精胺作为带正电荷的天然小分子物质的代表去引发自组装肽，探究其组装形成的三维网状支架支撑细胞的效果。同时，为探究本发明自组装肽材料在真实细胞培养和生物医药领域内应用时的细胞支撑效果，使用高糖培养基、组织液和血清作为携带正电荷源的物质去引发本发明自组装肽，以模拟真实使用环境。
在37℃、CO2含量5％的温和湿润的环境下，使用血清含量为10％的高糖培养基在细胞培养瓶中培养HepG2细胞，培养后收集细胞并用适量高糖培养基(血清含量10％)重悬细胞，获得浓度为5×105个细胞/mL的细胞悬液。配好的细胞悬液和Calcein-AM/PI染液以体积比为2:1的比例混合均匀，在37℃条件下避光孵育15分钟。于玻璃底培养皿中加入被各携带正电荷物质引发组装成三维网状支架的本发明自组装肽水凝胶材料(自组装肽水凝胶配置方法见实施例3)，再加入避光孵育后的细胞悬液并混匀，使玻璃底培养皿内总体积为200加入、自组装肽终浓度为0.1wt％。制备对照组样品时，使用等体积的PBS缓冲液替换实验组中的本发明自组装肽水凝胶材料。随后使用LSM 980with Airyscan2快速超分辨激光共聚焦显微镜观察各实验样品。
图8展示了本实验结果，在不含本发明自组装肽水凝胶的对照组中，如图8A所示，细胞均自然沉落在玻璃底培养皿的底部，未被支撑，是2D平面分布；当体系中引入被携带正电荷源物质引发的本发明自组装肽时，如图8B、8C、8D、8E所示，体系内的细胞均被自组装肽组装形成的三维网状支架支撑，呈现在3D环境内的立体分布。
此实验现象证明本发明自组装肽材料可被带正电荷的天然小分子物质精胺引发，形成具有良好细胞支撑效果的3D网络支架(图8B)，可有效实现细胞体外三维空间下的生长培养，阻止其发生沉落贴壁进而二维环境生长。细胞完全培养基(图8C)、组织液(图8D)和血清(图8E)是细胞培养和生物医药领域内广泛应用且携带大量正电荷源物质的综合体系，图8C、8D、8E表明本发明多肽材料均可被这三种综合体系引发组装成三维网状支架并展现出良好的细胞支撑效果，且整个引发过程条件温和、无需额外添加上述三个综合体系以外的新物质，使用有效、便捷、对细胞无损伤，展现了本发明的多肽材料在细胞培养和生物医药领域内优秀的巨大潜力。
其它序列编号显示的自组装肽的实验与本实施例结果类似，在此不一一赘述。
实验二、本发明自组装肽材料细胞相容性
为了证明本发明自组装肽材料具有良好的生物相容性，本实验以SEQ ID NO.:13(IIIIIGOGIIGPGGEGPGGE)为例，依次展开为期五天的HepG2细胞相对活力和增殖数的测量。
按实验一中制备浓度为制备浓度5×105个细胞/mL细胞悬液的方法制备浓度为5×104个细胞/mL的细胞悬液。将获得的浓度为5×104个细胞/mL的细胞接种到96孔板中，使每孔含有约5000个细胞，其中，实验组别中添加按实施例2中讲述方法配制的自组装肽溶胶，使得多肽在终体系内的浓度分别为0.1％、0.3％、0.5％、0.7％，对照组添加等体积的PBS缓冲液替换肽液，各组别混匀后展开为期5天的实验，期间不另更换和添加培养基。实验期间每24小时一添加10％培养体积的CCK-8试剂盒，孵育30分钟后使用酶标仪(参数设置：主波长450nm、次波长630nm)测量各组OD值，所有实验设置5个平行组别，实验结果如图9A所示。细胞相对活力使用下方公式求得：
细胞相对活力(％)＝(At-A0t)/(A1-A01)×100％；
其中，At为培养细胞t天后测得的OD值的平均值，A0t为t天后测得的空白背景的OD值平均值，A1为培养细胞1天后测得的OD值的平均值，A01为1天后测得的空白背景的OD值平均值。
另将获得的浓度为5×104个细胞/mL的细胞接种到12孔板中，使每孔含有约50000个细胞，其中，实验组别中添加按实施例2中讲述方法配制的自组装肽溶胶，使得多肽在终体系内的浓度分别为0.1％、0.3％、0.5％、0.7％，对照组添加等体积的PBS缓冲液替换肽液，各组别混匀后展开为期5天的实验，期间不另更换和添加培养基。实验期间每24小时一收集细胞进行细胞计数，所有实验设置5个平行组别，实验结果如图9B所示。
通过CCK-8试剂盒测量细胞相对活力实验结果(图9A)可知，添加了本发明自组装肽材料的各实验组中的细胞在为期5天的实验过程中，细胞的活力呈现均匀持续的稳步增长，细胞状态良好，呈现出典型的贴壁细胞在三维空间内生长的特征，说明细胞已被多肽组装形成的三维网状支架支撑起来；而对照组中细胞的活力先激增随后断崖式下降，呈现出典型的贴壁细胞在二维空间内生长的特征，二维培养会因生长空间受限、贴壁细胞接触抑制导致其增殖抑制，培养后期细胞大量死亡。这两个现象说明本发明的自组装肽不但生物相容性良好对细胞无毒害作用，还能实现细胞在体外三维空间的长时间培养，在相同培养体积内扩大细胞生长空间，还原细胞在生物体内的生长状态。
通过细胞在5天内的生长曲线(图9B)可知，在二维环境下生长的细胞(对照组)前四天随细胞总数均高于各实验组，但细胞增殖速率呈现逐渐下降的趋势，细胞状态变差，且第五天细胞总数骤降；而各实验组在整个培养周期内均以相对均一稳定的增值速率生长，表明本发明多肽材料不仅对细胞无毒害、生物相容性良好，还能使细胞在本材料组装成的网状支架的支撑下以良好的状态长时间稳定增殖。该实验现象同样印证了测量细胞相对活力实验的结论。
并且通过总结上述两个实验现象还可得出，对比各实验组，细胞活性和增殖速率会随多肽材料浓度的调整而出现略微差异，表明在实际应用中可以通过调节材料使用浓度来调节细胞增殖速率，更好的实现个人使用需求。
实验二使用HepG2细胞为细胞模型，不但印证了实验一得出的“本发明多肽材料可有效实现体外支撑细胞”的结论，还证明本发明材料具有良好的生物相容性，且在用其培养期间细胞能维持较高的活性，以良好的状态和均匀的速率持续增殖。
其它序列编号显示的自组装肽的实验与本实施例结果类似，在此不一一赘述。
实验三、使用本发明自组装肽水凝胶进行细胞培养
贴壁细胞的自身属性就是易于聚集并在阻碍其粘附到某一平面的条件下形成球体，即生长在立体空间内易于生长成细胞球。细胞球内具有氧气、营养物质、代谢废物的浓度梯度，能够模拟固态组织的多种特性，是研究实体瘤发生和干细胞分化的重要3D生理模型，在生物医药领域内应用广泛。而且，细胞球相比其他的3D生理模型更为简易，在研究过程中可以通过常见的实验手段实现成像分析，如光学、荧光、共聚焦显微镜，简化研究中的实验过程。本实验用被高糖培养基引发的本发明多肽材料培养常见的贴壁细胞HepG2，通过能否形成细胞球来验证本发明材料可以在体外实现近似于生物内的细胞培养。
按实验二中制备浓度为5×105个细胞/mL细胞悬液的方法制备浓度为1×105个细胞/mL的细胞悬液。以SEQ ID NO.:13(IIIIIGOGIIGPGGEGPGGE)为例，将获得的浓度为1×105个细胞/mL的细胞悬液接种到已添加本发明自组装肽材料的24孔板中(每孔内多肽终浓度为0.1wt.％)，使每孔含有约100000个细胞。培养期间每周使用“半量换液法”更换两次培养基。为了能更直观观察细胞在培养期间形态、分布等方面的变化，使用Calcein-AM/PI染液为培养三天和七天后的细胞染色，并于LSM 980with Airyscan2快速超分辨激光共聚焦显微镜下观察，结果如图10所示。
如图10A所示，仅在0.1wt.％的被高糖培养基引发组装成三维网状支架的本发明多肽材料的培养下，HepG2不但成球，而且只需72小时，表明本发明自组装肽材料可以在体外即可实现近似于生物体内细胞生长效果的细胞培养，并且能有效促使贴壁细胞快速成球。72小时后观察到细胞球大小近似，并且其中的细胞状态良好、无凋亡(图10B)。培养7天后细胞球直径明显增加(图10C)，证明细胞在该培养体系内能以三维空间下的生长状态增殖，即在含有正电荷源天然物质的细胞培养基中添加本发明多肽可以高度还原细胞在体内的生长环境。观察培养7天后的细胞球(图10D)，细胞球大小相近，且其中的细胞状态良好。少数凋亡细胞出现是因为，细胞在以球状不断增殖的过程中，因存在的氧气、营养物质和代谢废物的浓度梯度逐渐增加，球中心的细胞因得到的氧气和营养物质越来越少而代谢废物越来越多而凋亡，属自然现象。
我们还分别于培养的第5天、10天和15天后在倒置显微镜下观察并记录培养体系中50个细胞球的直径，这三天收集到的细胞球直径数据分别求平均后绘制成柱状图(图11D)，检测被培养在本发明多肽材料中的HepG2细胞是否能实现体外长时间增殖，并拍摄特征细胞球(图11A、11B、11C)。由图12可知，在含有0.1wt.％的被引发的本发明多肽材料的培养体系下，HepG2细胞被支撑并后续以细胞球的形式生长增殖，随培养时间延长，细胞球变得越来越紧实且其直径始终以相似的幅度增加，说明HepG2细胞在为期15天的培养中能以均匀的速率稳定增殖，即本材料可以用于细胞的长时间体外三维培养。细胞相对均一的增殖速率也说明其在培养期间内状态良好，本发明材料并不会对细胞造成损伤。
实验一和实验二均证明本发明多肽材料具有优秀的细胞支撑力，实验二还证明本发明多肽材料的生物相容性良好，可用于细胞培养。实验三证明在含有正电荷源天然物质的细胞培养基中添加本发明多肽可以高度还原细胞在体内的生长环境，在体外实现长时间的三维细胞培养。
其它序列编号显示的自组装肽的实验与本实施例结果类似，在此不一一赘述。
实验四、对使用本发明自组装肽水凝胶培养后收获的细胞的状态评估
本实验将实验三中在含有0.1wt.％的被高糖培养基引发的本发明多肽SEQ IDNO.:13(IIIIIGOGIIGPGGEGPGGE)培养的细胞球离心收集后消化成单个细胞，通过对比经本发明材料培养后的细胞与未经本发明材料培养的细胞之间的细胞活性来深一步评价本发明材料在细胞培养和生物医药领域内的可应用性。
将实验三中培养了15天后的细胞球离心收集，使用胰酶将细胞球消化成单一细胞后离心并收集，向收集的细胞内加入适量高糖培养基制成浓度分别为5×105个细胞/mL和5×104个细胞/mL的细胞悬液。将浓度为5×104个细胞/mL的细胞悬液接种到96孔板中，使每孔中含有5000个细胞。按实验七中制备浓度为5×105个细胞/mL细胞悬液的方法制备浓度为5×104个细胞/mL的细胞悬液，将其接种到96孔板中，使每孔中含有5000个细胞，作为本实验的对照组。开展为期5天的细胞活性测试，实验期间每天更换培养基，设置5个平行组。
如图12所示，经被高糖培养基引发的本发明多肽材料培养后收获的细胞与对照组相比，细胞活性在五天之内的变化趋势几乎相同，且每天实验组的细胞活性还略优于对照组，表明使用含有组装成三维网状纤维的本发明自组装肽材料的体系培养后，细胞仍能维持自身原有的生理活性。这说明在细胞培养过程中本发明材料不会对细胞造成生理功能上的损伤，可以十分安全可靠的使细胞在维持自身原有的生理活性的基础上以高度类似体内的生长状态增殖，实现在不损耗细胞生理功能的基础上的扩增。
其它序列编号显示的自组装肽的实验与本实施例结果类似，在此不一一赘述。
实验五、本发明的自组装肽水凝胶与细胞3D培养微载体在细胞增殖中的应用
实验方法：将合成的SEQ ID NO.:25(IIIIIGOGIIGOGGEGPGGV)所示自组装肽溶于细胞培养基中，涡旋至充分溶解后得到自组装肽浓度为0.1％的溶液，用0.1M NaOH溶液调节溶液pH7.4。随后，与聚苯乙烯微载体(粒径在100-500μm之间)混合，加入10％的小牛血清，最后分装得到注射用含微载体1％的自组装肽混合注射剂，可以看到溶液变得不透明，微球均匀稳定分布在自组装肽溶液中(图13A)。所得含微球的自组装肽混合注射剂室温下放置一个月可以看到所得注射剂均为均匀的混悬状态，均无明显的固液分离现象。同样的实验方法利用SEQ ID NO.:19(IVIVIGSIIGPGGEGOGGV)支撑大孔明胶微载体(3DTableTrixTM微载片)(图13B)，利用SEQ ID NO.:26(Ac-IIIIIGSIIGPGGEGOGGV)支撑聚乳酸微球(粒径在100-500μm之间)(图13C)。
本实验进一步验证了复合利用SEQ ID NO.:25(IIIIIGOGIIGOGGEGPGGV)与聚苯乙烯微球对小鼠间充质干细胞增殖的影响。将第9代大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)解冻，并在添加10％FBS和1％青霉素/链霉素(Gibco)的αMEM培养基中培养。本研究中使用的所有细胞都在第8-15代。在细胞接种之前，将聚苯乙烯微载体浸入70％(v/v)乙醇中1小时，然后暴露在紫外线下30分钟。在细胞接种之前，将聚苯乙烯微载体在培养基中孵育12小时。将BMSC接种并在37℃、含5％CO2的湿润环境中孵育。细胞达到80％汇合后，用含EDTA的胰酶收获。在无TC处理的48孔板中以每mg接种1-2×104个细胞的密度接种细胞，微载体浓度为1wt％，在培养第2天加入自组装肽实现3D培养。每两天，抽取80％的培养基并用等量的新鲜培养基和自组装肽代替。为了研究细胞附着和生长，在细胞培养的第1天、第3天、第5天、第7天和第9天采集样品并进行细胞计数，并在第1天、第4天和第7天用AM/PI细胞活染色试剂盒染色后通过激光共聚焦显微镜进行分析。
实验结果：首先，在静态条件下评估本发明自组装肽对聚苯乙烯微载体的支撑，进而验证该复合体系中小鼠间充质干细胞的增殖情况。静态培养条件的荧光显微镜图像表明(图13D)，第1天聚苯乙烯微载体上附着了少量细胞，说明该微载体对于细胞吸附能力较强。随后在细胞培养的第4天和第7天显示出细胞有了可见的增殖，微球上细胞数目明显增多，说明自组装肽3D支架与微载体复合体系可以维持细胞增殖、无细胞毒性。细胞计数结果也支持了这一情况(图13E)，2D组在3天后细胞出现了接触抑制，细胞不再增殖，而3D组细胞一直保持在增殖状态，说明该3D培养体系适合用于干细胞的大规模培养。
其它序列编号显示的自组装肽的实验与本实施例结果类似，在此不一一赘述。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于使得本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (24)
1.包含自组装肽和微载体的组合物，所述自组装肽包含疏水结构域和亲水结构域，所述亲水结构域包含至少两个连续的β-转角区。
2.根据权利要求1的组合物，所述至少一个β-转角区在末端包含或连接一个或多个酸性氨基酸，优选包含或连接一个酸性氨基酸。
3.根据权利要求1的组合物，所述每个β-转角区包含由3-6个氨基酸形成的β-转角基序，所述β-转角基序具有如下结构：
X1X2X3，X1X2X3X4，X1X2X3X4X5，或X1X2X3X4X5X6，
其中，X1，X2，X3，X4，X5，X6为氨基酸残基，各β-转角基序中X1，X2，X3，X4，X5，X6分别彼此相同或不同。
4.根据权利要求3的组合物，所述β-转角基序包含一个羟脯氨酸(O)。
5.根据权利要求1的组合物，所述亲水结构域包含2-8个β-转角区。
6.根据权利要求3的组合物，所述至少一个β-转角区中的β-转角基序在末端包含或连接一个选自谷氨酸(E)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，天冬氨酸(D)和赖氨酸(K)的氨基酸。
7.根据权利要求3的组合物，所述亲水结构域中包含至少一个X2为羟脯氨酸O的β-转角基序，或者所述亲水结构域中包含至少一个X2为脯氨酸P的β-转角基序。
8.根据权利要求3的组合物，所述X1，X3和X4中的一个或多个为甘氨酸(G)，和/或所述X3和X4中的一个或两个为丙氨酸(A)。
9.根据权利要求1的组合物，所述β-转角基序包括选自如下的氨基酸序列：
GPGG(SEQ ID NO.:33)，GPGA(SEQ ID NO.:34)，GPAG(SEQ ID NO.:35)，GPG，GPAA(SEQIDNO.:36)，GPGGG(SEQ ID NO.:37)，GOGG(SEQ ID NO.:38)，GOGA(SEQ ID NO.:39)，GOAG(SEQ ID NO.:40)，GOGGA(SEQ ID NO.:41)，GOAA(SEQ ID NO.:42)，GOG，或GOGV(SEQ IDNO.:43)；
优选地，所述β-转角基序具有选自如下的氨基酸序列：
GPAGE(SEQ ID NO.:44)，GPGGE(SEQ ID NO.:45)，GOGAE(SEQ ID NO.:46)，GOGGAE(SEQID NO.:47)，GOGE(SEQ ID NO.:48)，GOGGE(SEQ ID NO.:49)，GPGAD(SEQ ID NO.:50)，GOGGD(SEQ ID NO.:51)，GPGGV(SEQ ID NO.:52)，GOGGV(SEQ ID NO.:53)，GPGGK(SEQ IDNO.:54)，GOGGK(SEQ ID NO.:55)，GPGAE(SEQ ID NO.:56)，GOGAD(SEQ ID NO.:57)，GPAAD(SEQ ID NO.:58)，GOAAE(SEQ ID NO.:59)，GPGGD(SEQ ID NO.:60)，GPGGGV(SEQ ID NO.:61)，GPGV(SEQ ID NO.:62)，GOGGI(SEQ ID NO.:63)或GOGVI(SEQ ID NO.:64)。
10.根据权利要求1的组合物，所述亲水结构域的C末端用选自如下的试剂或基团进行修饰：羧酸、硫醇、酮酸盐、亚硝酸盐、膦酸盐、亚硫磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙烯基砜、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、马来酰亚胺、硫醇、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、酯、硫酯、芳基和/或硅烷修饰。
11.根据权利要求1的组合物，所述疏水结构域包含3-10个疏水性氨基酸，
优选地，所述疏水结构域包含3-7个疏水性氨基酸，
优选地，所述疏水性氨基酸选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和丙氨酸(A)中的一种或者多种。
12.根据权利要求1的组合物，所述疏水结构域的N末端用选自如下的试剂或基团进行修饰：乙酰、醇、醛、胺、亚胺、马来酰亚胺、硫醇、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、酯、硫酯、芳基和/或硅烷修饰。
13.根据权利要求1的组合物，所述疏水结构域包含：
LLLL(SEQ ID NO.:65)，FIIII(SEQ ID NO.:66)，IIIII(SEQ ID NO.:67)，IIII(SEQ IDNO.:68)，ILILI(SEQ ID NO.:69)，FLFLF(SEQ ID NO.:70)，IVIVI(SEQ ID NO.:71)，VLFIIV(SEQ ID NO.:72)，VLIII(SEQ ID NO.:73)，IVALF(SEQ ID NO.:74)，LFIVL(SEQ ID NO.:75)，FIAIV(SEQ ID NO.:76)，FIIIV(SEQ ID NO.:77)，Ac-VLFIIV(SEQ ID NO.:78)，Ac-IVIVI(SEQ ID NO.:79)，Ac-IIIII(SEQ ID NO.:80)，IIIIII(SEQ ID NO.:81)，FLIVI(SEQID NO.:82)，FLIIA(SEQ ID NO.:83)，FIFIF(SEQ ID NO.:84)，IFIFI(SEQ ID NO.:85)，IAILI(SEQ ID NO.:86)或LLLLL(SEQ ID NO.:87)。
14.根据权利要求1的组合物，其还包括连接域，所述连接域包含2-8个氨基酸残基，优选4-5个氨基酸残基；并且
所述连接域包含小侧链氨基酸、侧链带有羟基的氨基酸和/或远离疏水区域的疏水氨基酸，
所述小侧链氨基酸选自G、A和S，所述侧链带有羟基的氨基酸选自S、T和O，所述远离疏水结构域的疏水氨基酸选自I、V、L、F和A，
优选地，所述连接域具有选自如下的氨基酸序列：
GSII(SEQ ID NO.:88)，GPOGI(SEQ ID NO.:89)，GPOGV(SEQ ID NO.:90)，GSGII(SEQID NO.:91)，GSVI(SEQ ID NO.:92)，GOII(SEQ ID NO.:93)，GPOGL(SEQ ID NO.:94)，OGII(SEQ ID NO.:95)或GTVI(SEQ ID NO.:96)，其中，S、T、O能彼此互换；
更优选地，所述连接域具有选自如下的氨基酸序列：
GSII(SEQ ID NO.:88)，GTII(SEQ ID NO.:97)，GTVI(SEQ ID NO.:96)，GOVI(SEQ IDNO.:98)，GSVI(SEQ ID NO.:92)，GSVL(SEQ ID NO.:99)，GSGII(SEQ ID NO.:91)，GSGVI(SEQ ID NO.:100)，GOII(SEQ ID NO.:87)，OGII(SEQ ID NO.:87)，GOGVI(SEQ ID NO.:101)或GOGII(SEQ ID NO.:102)。
15.根据权利要求1的组合物，所述自组装肽具有选自SEQ ID NOs:1-7和SEQ ID NOs:9-32的氨基酸序列。
16.根据权利要求1的组合物，所述微载体选自大孔明胶微载体，甲基丙烯酸明胶微载体，海带多糖微载体，羧基甜菜碱微载体，异丙基丙烯酰胺微载体，聚乙烯醇/纤维素微载体，D,L-乳酸-共-乙二醇微载体，D,L-乳酸-共-乙二醇微载体，D,L-乳酸-共-乙二醇微载体，D,L-乳酸-共-乙二醇/壳聚糖微载体，骨胶原微载体，壳聚糖微载体，几丁质微载体，聚苯乙烯微载体，PHEMA微载体，聚氨酯泡沫微载体，聚乳酸微载体，聚丙交酯微载体，藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体。
17.根据权利要求1所述的组合物，所述微载体的粒径为50-500μm，优选100-200μm。
18.根据权利要求1所述的组合物，还包含正电荷源物质作为引发剂，所述正电荷源物质为生物大分子，药物，功能分子，金属离子、氨基酸，或包含上述物质中的一种或多种内源或外源的混合物，
所述生物大分子选自有机酸、蛋白质、多糖及其衍生物，
优选地，所述有机酸选自乳酸、单宁酸和柠檬酸；
优选地，所述蛋白质为中性生理条件下能够提供氢离子的蛋白质，
优选地，所述蛋白质为等电点PI值低于7.0，优选3.4-6.05的蛋白质，
优选地，所述蛋白质选自纤维蛋白原、球蛋白、血红蛋白、转铁蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白和玻连蛋白；
优选地，所述多糖及其衍生物选自几丁质和壳聚糖；
所述药物选自抗生素和多巴胺，
优选地，所述抗生素选自卡那霉素和庆大霉素；
所述功能分子选自抗氧化剂和细胞增殖促进成分，
优选地，所述抗氧化剂为维生素类抗氧化剂，
优选地，所述细胞增殖促进成分为精胺或亚精胺；
优选地，所述金属离子为钾离子、钙离子或镁离子；
优选地，所述氨基酸为赖氨酸、精氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸；
优选地，所述正电荷源物质为血清、血浆、动植物组织液或一种或多种的混合液。
19.根据权利要求1的组合物，所述自组装多肽和所述微载体以粉末的形式置于同一容器中；或，所述自组装肽和所述微载体以粉末的形式分别置于不同的容器中；或，所述自组装肽以溶液的形式置于一个容器，所述微载体以粉末的形成置于另一个容器中；或，所述自组装肽以粉末的形式置于一个容器，所述微载体以溶液的形成置于另一个容器中；或所述自组装肽和所述微载体以溶液的形式置于同一个容器中。
20.细胞培养体系，所述细胞培养体系中包含权利要求1-19任一项中的微载体和自组装肽自组装形成的三维网状支架材料，所述微载体由所述三维支架材料支撑。
21.根据权利要求20的细胞培养体系，所述微载体浓度为0.05-10.0wt％，支架材料浓度为0.025-1.0wt％，支架材料和微载体的质量比为1-20:1-20。
22.根据权利要求21所述的细胞培养体系，还包含正电荷源物质作为引发剂，所述正电荷源物质为生物大分子，药物，功能分子，金属离子、氨基酸，或包含上述物质中的一种或多种内源或外源的混合物，
所述生物大分子选自有机酸、蛋白质、多糖及其衍生物，
优选地，所述有机酸选自乳酸、单宁酸和柠檬酸；
优选地，所述蛋白质为中性生理条件下能够提供氢离子的蛋白质，
优选地，所述蛋白质为等电点PI值低于7.0，优选3.4-6.05的蛋白质，
优选地，所述蛋白质选自纤维蛋白原、球蛋白、血红蛋白、转铁蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白和玻连蛋白；
优选地，所述多糖及其衍生物选自几丁质和壳聚糖；
所述药物选自抗生素和多巴胺，
优选地，所述抗生素选自卡那霉素和庆大霉素；
所述功能分子选自抗氧化剂和细胞增殖促进成分，
优选地，所述抗氧化剂为维生素类抗氧化剂，
优选地，所述细胞增殖促进成分为精胺或亚精胺；
优选地，所述金属离子为钠离子、钾离子、钙离子或镁离子；
优选地，所述氨基酸为赖氨酸、精氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸；
优选地，所述正电荷源物质为血清、血浆、动植物组织液或一种或多种的混合液。
23.细胞培养的方法，所述方法包括利用权利要求1-19任一项的组合物或权利要求20-22任一项的细胞培养体系培养细胞的步骤。
24.权利要求1-19任一项的组合物，权利要求20-22任一项的细胞培养方法或权利要求23的细胞培养方法在细胞培养及储存中的应用。
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