CN111876379A - 一种高效促进纤维环源干细胞增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶三维培养法和生物力学作用高效促进纤维环源干细胞增殖的方法。本发明所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，以Collagel凝胶支架作为三维基质，通过将纤维环源干细胞与Collagel凝胶混合为细胞悬液进行培养，形成模拟体内生长环境的三维结构微环境，同时联合生理性的动态压力作用，模拟体内椎间盘纤维环组织承载的动态压力作用，促进体外培养的纤维环源干细胞增殖。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶三维培养法和生物力学作用高效促进纤维环源干细胞增殖的方法。
背景技术
椎间盘退变是一种常见疾病，尤其是随着人口老龄化和人们工作生活方式的改变，椎间盘突出、椎管狭窄等脊柱退行性疾病的发生率不断升高，部分症状严重患者甚至需要接受手术治疗。目前，髓核摘除和椎间融合是脊柱退行性疾病的主要手术疗法，但术中却不可避免地会造成纤维环的缺损。
纤维环是指位于椎间盘的周缘部、由纤维软骨组成的纤维组织，纤维环的纤维在椎体间斜行，并在横切面上排列成同心环状，相邻环的纤维具有相反的斜度，而相互交叉。纤维环的前方有坚强的前纵韧带，前纵韧带的深层纤维并不与纤维环的浅层纤维融合在一起，却十分加强纤维环的力量；而纤维环的后方有后纵韧带，并与之融合在一起，后纵韧带虽较前纵韧带为弱，亦加强纤维环后部的坚固性。简言之，纤维环在吸收震荡和保持髓核组织形态上发挥了重要作用。纤维环的损坏会导致椎间盘不再处于密闭环境，而椎间盘压力降低等一系列微环境改变均不利于椎间盘的修复和再生，术后长时间很可能会出现邻近节段退变、继发性脊柱不稳等一系列问题。因此，纤维环的完整性对限制髓核的突出及维持椎间盘的功能尤为重要。纤维环源干细胞具有向纤维环不同原始细胞的能力，利用组织工程技术重建纤维环结构可能成为比较理想的治疗方式。
研究表示，在体外建立模拟体内的三维生长环境，并给予纤维环源干细胞生理性动态压力作用，对于体外培养的纤维环源干细胞具有更好的促进增殖及作用，尤其是体外建立适合细胞生长的生理微环境对纤维环源干细胞行为及生理功能具有重要影响。目前，体外纤维环源干细胞的培养主要分为普通培养法和三维培养法两大类别，其中，普通培养法由于缺少三维结构支撑，培养的纤维环源干细胞处于贴壁状态，无论是在形态、结果和功能方面都与体内自然生理环境生长的细胞想去甚远，给予动态压力作用时，难以实现细胞全方位受力而出现受力不均的情况，不利于纤维环源干细胞在椎间盘组织修复和纤维环组织再生中的应用，以及医学组织工程学的研究。
三维细胞培养技术(three-dimensionalcell culture，TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养技术可提供类似体内生长环境的三维支架或基质，模拟细胞生长的体内生理环境，形成三维生长架构，促进细胞建立起细胞间及细胞与细胞外基质的联系，促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动。目前，纤维环源干细胞的三维培养法主要包括海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝胶及Matrigel凝胶法。其中，海藻酸钙凝胶法虽然操作时条件温和，对活细胞损伤小，但固定后却存在机械强度不高的缺陷；琼脂糖凝胶虽具有较大的空隙，允许大分子物质自由扩散，却更适合培养悬浮细胞；Matrigel凝胶法存在步骤复杂、成本较高的缺陷，并且无法在生理环境的不同生物力学状态下保持长时间的高度凝胶状态，导致三维基质结构容易破坏，培养的纤维环源干细胞粘附能力较差，从而失去三维结构的支撑，细胞与细胞或细胞外基质的相互作用减弱，影响到细胞的生长功能，不利于模拟体内生理性生物力学环境下，纤维环源干细胞生长的研究。
另外，由于纤维环组织本身具有一定的强度和弹性，这对于维持椎间盘组织的生理功能、保持脊柱运动时的稳定性具有重要的作用，而且，由于体内生理环境下或脊柱运动过程中，与中央的髓核组织相比，位于外周的纤维环组织承受更多的拉伸应力，也使得一般状态下的三维培养方式对于纤维环源干细胞的增殖，并非是最理想的培养方试。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于Collagel凝胶三维培养法和生物力学作用高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，以解决现有技术中传统三维细胞培养技术效果不理想的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，包括如下步骤：
(1)配制Collagel凝胶培养基质，备用；
所述Collagel凝胶培养基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM；
试剂B：FBS(胎牛血清)；
试剂C：1M Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM的混合液；
(2)取分离的纤维环源干细胞，制成单细胞悬液，并计数；
(3)将所述细胞与所述Collagel凝胶培养基质混合均匀，得到细胞-Colagel悬液；
(4)取细胞培养板，并以表面包被材料对所述细胞培养板表面进行包被，并培养过夜，备用；
(5)取步骤(3)得到的细胞-Colagel悬液加入至包被后的细胞培养板中，置于CO2培养箱中进行细胞培养；
(6)将步骤(5)培养后的细胞置于细胞组织压力加载培养与分析系统，对所述纤维环源干细胞进行动态压力刺激，即得。
具体的，所述步骤(1)中，所述Collagel凝胶培养基质的配置步骤具体包括：
(a)取所述试剂A、试剂B和试剂C进行混合，备用；
(b)另取试剂D和Collagel，并调节混合液pH7.0-7.2，备用；
(c)分别将上述步骤(a)和(b)制备的混合液混匀，即得。
具体的，所述试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和Collagel的体积比为(6-10)：(2-8)：(0.5-2)：(1-3)：(30-40)，并优选8：4：1：2：35。
具体的，所述步骤(3)中，还包括调节细胞浓度，使平均Collagel培养基基质中细胞浓度为2.0×105细胞/mL的步骤。
具体的，所述步骤(3)中，还包括将所述细胞-Colagel悬液进行固液分离并收集细胞以所述Collagel培养基质进行重悬的步骤。
具体的，所述步骤(4)中，所述细胞培养步骤为置于35-40℃、3-8％CO2恒温培养。
具体的，所述步骤(5)中，所述动态压力刺激步骤中，控制压力为20-90kPa。
具体的，所述步骤(5)中，控制所述动态压力刺激步骤的作用时间为3-12h。
具体的，所述步骤(5)中，所述细胞培养步骤为置于35-40℃、3-8％CO2恒温培养。
具体的，所述步骤(5)中，还包括对以显微镜观察细胞生长状态的步骤、通过MTT法检测细胞增殖情况的步骤。
本发明还公开了由所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法培养的纤维环源干细胞。
本发明所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，以Collagel凝胶支架作为三维基质，通过将纤维环源干细胞与Collagel凝胶混合为细胞悬液进行培养，Collagel凝胶在液态时包裹细胞，固态时可以形成交联网络，形成模拟体内生长环境的三维结构微环境，促进培养的细胞在生长过程中均衡获取营养物质、进行气体交换和废物排出的理想生理场所；同时联合生理性的动态压力作用，模拟体内椎间盘纤维环组织承载的动态压力作用，促进体外培养的纤维环源干细胞增殖。该方法不仅可以促进纤维环源干细胞的生长、增殖等生物学功能，还可促进其更好的粘附于三维凝胶支架、向特定的纤维环组织定向，更好的模拟体内不同生理性生物力学作用下细胞生长的微环境。因此，不仅可广泛应用于椎间盘组织修复和纤维环组织再生等医学组织工程领域，还可应用于生物力学领域的研究。
本发明所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，由于Collagel凝胶的主要成分是胶原蛋白，胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白(约占总蛋白25％)，是细胞外基质中最常见的蛋白质，胶原蛋白纤维上还有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)等氨基酸序列，不仅可以促进培养的细胞在生长过程中均衡获取营养物质，还可以为细胞表层整合蛋白所识别和贴附，增强纤维环源干细胞与三维凝胶支架的粘附能力，充分保障三维状态下的纤维环源干细胞组织水分、营养交换、细胞粘附能力；尤其在生理环境的不同应力状态下以及模拟体内不同生物力学作用下，三维凝胶支架可保持稳固的三维结构，细胞不易于脱落，仍可维持细胞的三维生长状态，易于细胞形成合理的生理形态和结构，展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势，促进细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用，促进纤维环源干细胞生长、增殖、粘附、等生物学功能，更好的发挥生理功能，更适用于椎间盘组织修复和纤维环组织再生等医学组织工程领域以及生物力学领域的研究。
本发明所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，选用的Collagel凝胶支架本身免疫排斥反应小，而且其交联过程不需其他化学试剂的引入，即可自我交联形成凝胶三维支架，且可维持稳定的pH值范围，制备工艺相对简单，有助于简化传统培养方法及降低成本；而且，Collagel凝胶支架可塑性高，并具有一定的机械强度，生物相容性也更为突出，不仅可以促进纤维环源干细胞的生长、增殖等生物学功能，还可促进其更好的粘附于三维凝胶支架、向特定的纤维环组织定向，更好的模拟体内不同生理性生物力学作用下细胞生长的微环境，污染率低、临床应用方便，可广泛应用于医药组织工程等领域。
本发明所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，联合生理性动态压力作用，在细胞的三维培养环境中，给予动态的20-90kPa压力刺激、作用时间3-12h，可模拟纤维环组织在体内的生物力学作用环境，细胞受力更均匀，更适宜于模拟外周纤维环组织承受的拉伸应力微环境，可有效促进纤维环源干细胞生长、增殖、粘附、等生物学功能，以及分泌细胞外基质的功能及向纤维环原始细胞的作用，更适用于椎间盘组织修复和纤维环组织再生等医学组织工程领域，还可应用于生物力学领域的研究。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为实施例1中进行培养细胞的显微镜照片图；
图2为实施例2中进行培养细胞的显微镜照片图；
图3为对比例1中进行培养细胞的显微镜照片图；
图4为对比例2中培养细胞的显微镜照片图；
图5为对比例3中培养细胞的显微镜照片图；
图6为对比例4中培养细胞的显微镜照片图；
图7为实施例1及对比例3中培养细胞的增殖曲线图。
具体实施方式
实施例1
本实施例所述Collagel培养基基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM，288μl；
试剂B：FBS，144μl；
试剂C：Hepes(1M)，36μl；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM混合液，72μl；
Collagel：3mg/mlCOL1与0.01M HCl混合液，1260μl。
取288μl试剂A(5×MEM)、144μl试剂B(FBS)和36μl试剂C(Hepes，1M)置于试管1中进行充分混匀，备用；另取1260μlCollagel(3mg/ml COL1与0.01M HCl混合液)和72μl试剂D(0.1M NaOH与5×MEM混合液)置于试管2中进行充分混合，调节混合液的pH为7.0-7.2，备用；将试管1和试管2中混合液混匀，得到所需Collagel培养基质，备用。需要注意的是，上述所有试剂的保存和操作需要保持在4℃或冰上进行。
选取生长状态良好的纤维环源干细胞，待细胞达到90％融合时，加入0.25wt％胰蛋白酶(以细胞量计)进行消化、离心，收集细胞并计数；将细胞加入至所述Collagel培养基质中，调节细胞浓度，使平均Collagel培养基质中细胞浓度约2.0×105细胞/mL；离心并收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1.8ml Collagel培养基质中，经上下吹打混合均匀。取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h。
将上述6孔板培养的纤维环源干细胞放入细胞组织压力加载培养与分析系统(美国Flexcell，型号FX-5000C)，给予纤维环源干细胞动态的60kPa压力刺激，作用时间6h。
取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h。培养结束后，在显微镜下观察细胞生长状态，通过MTT法检测细胞增殖情况。
本实施例培养所得细胞的显微镜照片图见附图1所示，本实施例培养所得细胞在显微镜下可看到细胞均匀分布在凝胶中，呈立体生长状态，不同凝胶层面的细胞粘附凝胶基质状态良好，相比于二维贴壁生长的细胞，可看到明显的细胞伪足突出并相互交联，细胞胞浆饱满，折光性好。继续培养后，与对照组相比，细胞生长速度明显加快。
实施例2
本实施例所述Collagel培养基基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM，288μl；
试剂B：FBS，144μl；
试剂C：Hepes(1M)，36μl；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM混合液，72μl；
Collagel：3mg/mlCOL1与0.01M HCl混合液，1260μl。
取288μl试剂A(5×MEM)、144μl试剂B(FBS)和36μl试剂C(Hepes，1M)置于试管1中进行充分混匀，备用；另取1260μlCollagel(3mg/ml COL1与0.01M HCl混合液)和72μl试剂D(0.1M NaOH与5×MEM混合液)置于试管2中进行充分混合，调节混合液的pH为7.0-7.2，备用；将试管1和试管2中混合液混匀，得到所需Collagel培养基质，备用。需要注意的是，上述所有试剂的保存和操作需要保持在4℃或冰上进行。
选取生长状态良好的纤维环源干细胞，待细胞达到90％融合时，加入0.25wt％胰蛋白酶(以细胞量计)进行消化、离心，收集细胞并计数；将细胞加入至所述Collagel培养基质中，调节细胞浓度，使平均Collagel培养基质中细胞浓度约2.0×105细胞/mL；离心并收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1.8ml Collagel培养基质中，经上下吹打混合均匀。取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h。
将上述6孔板培养的纤维环源干细胞放入细胞组织压力加载培养与分析系统(美国Flexcell，型号FX-5000C)，给予纤维环源干细胞动态的50kPa压力刺激，作用时间12h。
取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h。培养结束后，在显微镜下观察细胞生长状态，通过MTT法检测细胞增殖情况。
本实施例培养所得细胞的显微镜照片图见附图2所示，本实施例培养所得细胞在显微镜下可看到细胞均匀分布在凝胶中，呈立体生长状态，不同凝胶层面的细胞粘附凝胶基质状态良好。
实施例3
本实施例所述Collagel培养基基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM，288μl；
试剂B：FBS，144μl；
试剂C：Hepes(1M)，36μl；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM混合液，72μl；
Collagel：3mg/mlCOL1与0.01M HCl混合液，1260μl。
取288μl试剂A(5×MEM)、144μl试剂B(FBS)和36μl试剂C(Hepes，1M)置于试管1中进行充分混匀，备用；另取1260μlCollagel(3mg/ml COL1与0.01M HCl混合液)和72μl试剂D(0.1M NaOH与5×MEM混合液)置于试管2中进行充分混合，调节混合液的pH为7.0-7.2，备用；将试管1和试管2中混合液混匀，得到所需Collagel培养基质，备用。需要注意的是，上述所有试剂的保存和操作需要保持在4℃或冰上进行。
选取生长状态良好的纤维环源干细胞，待细胞达到90％融合时，加入0.25wt％胰蛋白酶(以细胞量计)进行消化、离心，收集细胞并计数；将细胞加入至所述Collagel培养基质中，调节细胞浓度，使平均Collagel培养基质中细胞浓度约2.0×105细胞/mL；离心并收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1.8ml Collagel培养基质中，经上下吹打混合均匀。取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h。
将上述6孔板培养的纤维环源干细胞放入细胞组织压力加载培养与分析系统(美国Flexcell，型号FX-5000C)，给予纤维环源干细胞动态的60kPa压力刺激，作用时间10h。
取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h。培养结束后，在显微镜下观察细胞生长状态，通过MTT法检测细胞增殖情况。
实施例4
本实施例所述Collagel培养基基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM，216μl；
试剂B：FBS，288μl；
试剂C：Hepes(1M)，18μl；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM混合液，108μl；
Collagel：2mg/mlCOL1与0.01M HCl混合液，1080μl。
取选定量试剂A(5×MEM)、试剂B(FBS)和试剂C(Hepes，1M)置于试管1中进行充分混匀，备用；另取选定量Collagel(2mg/ml COL1与0.01M HCl混合液)和试剂D(0.1MNaOH与5×MEM混合液)置于试管2中进行充分混合，调节混合液的pH为7.0-7.2，备用；将试管1和试管2中混合液混匀，得到所需Collagel培养基质，备用。需要注意的是，上述所有试剂的保存和操作需要保持在4℃或冰上进行。
选取生长状态良好的纤维环源干细胞，待细胞达到90％融合时，加入0.25wt％胰蛋白酶(以细胞量计)进行消化、离心，收集细胞并计数；将细胞加入至所述Collagel培养基质中，调节细胞浓度，使平均Collagel培养基质中细胞浓度约2.0×105细胞/mL；离心并收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1.8ml Collagel培养基质中，经上下吹打混合均匀。取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板中，于37℃、3％CO2培养箱内培养24h。
将上述6孔板培养的纤维环源干细胞放入细胞组织压力加载培养与分析系统(美国Flexcell，型号FX-5000C)，给予纤维环源干细胞动态的70kPa压力刺激，作用时间8h。
取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板中，于37℃、3％CO2培养箱内培养24h。培养结束后，在显微镜下观察细胞生长状态，通过MTT法检测细胞增殖情况。
实施例5
本实施例所述Collagel培养基基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM，360μl；
试剂B：FBS，72μl；
试剂C：Hepes(1M)，72μl；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM混合液，36μl；
Collagel：10mg/mlCOL1与0.01M HCl混合液，1440μl。
取选定量试剂A(5×MEM)、试剂B(FBS)和试剂C(Hepes，1M)置于试管1中进行充分混匀，备用；另取选定量Collagel(10mg/ml COL1与0.01M HCl混合液)和试剂D(0.1M NaOH与5×MEM混合液)置于试管2中进行充分混合，调节混合液的pH为7.0-7.2，备用；将试管1和试管2中混合液混匀，得到所需Collagel培养基质，备用。需要注意的是，上述所有试剂的保存和操作需要保持在4℃或冰上进行。
选取生长状态良好的纤维环源干细胞，待细胞达到90％融合时，加入0.25wt％胰蛋白酶(以细胞量计)进行消化、离心，收集细胞并计数；将细胞加入至所述Collagel培养基质中，调节细胞浓度，使平均Collagel培养基质中细胞浓度约2.0×105细胞/mL；离心并收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1.8ml Collagel培养基质中，经上下吹打混合均匀。取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板中，于37℃、8％CO2培养箱内培养24h。
将上述6孔板培养的纤维环源干细胞放入细胞组织压力加载培养与分析系统(美国Flexcell，型号FX-5000C)，给予纤维环源干细胞动态的60kPa压力刺激，作用时间20h。
取上述得到的细胞-Colagel悬液加入6孔细胞培养板中，于37℃、8％CO2培养箱内培养24h。培养结束后，在显微镜下观察细胞生长状态，通过MTT法检测细胞增殖情况。
对比例1
本对比例所述促进纤维环源干细胞增殖的方法同实施例1，其区别仅在于，不进行相应的动态压力刺激步骤。
本对比例培养所得细胞的显微镜照片图见附图3所示，可见，对比例1中培养的纤维环源干细胞在传代次数较多后，细胞逐渐出现凋亡现象，细胞数量较少，增殖缓慢；而本发明方案中，通过动态的生理性压力刺激，细胞饱满、折光性好、生长状态较好，增殖较快。
对比例2
本对比例所述促进纤维环源干细胞增殖的方法同实施例1，其区别仅在于，所述纤维环源干细胞培养未经Collagel凝胶支架法三维培养，即将细胞与普通培养液混合后直接加入到培养板中进行传统的细胞贴壁培养。
本对比例培养所得细胞的显微镜照片图见附图4所示，可见，普通贴壁培养方式获得的细胞，细胞处于贴壁生长状态，未形成三维的交联网状结构，细胞之间重叠较多，细胞各部位受力不均匀，在后续施加动态压力刺激时，细胞受力不均匀，会影响细胞的增殖和分化等功能；而本发明方案采用三维培养的细胞，由于处于三维生长环境中，如同体内生长的生理环境，当受到外界动态的压力刺激时，细胞各部位受力均匀，可更好的促进细胞的生长和增殖、分化。
对比例3
本对比例所述促进纤维环源干细胞增殖的方法同实施例1，其区别仅在于，所述纤维环源干细胞培养未经Collagel凝胶支架法三维培养，即将细胞与普通培养液混合后直接加入到培养板中进行传统的细胞贴壁培养，且不进行相应的动态压力刺激步骤。
本对比例培养所得细胞的显微镜照片图见附图5所示，可见，普通贴壁培养的软骨细胞，细胞呈贴壁生长状态，细胞之间生长密集、较少形成细胞伪足、未相互交联成网状。
对比例4
本对比例所述促进纤维环源干细胞增殖的方法同实施例1，其区别仅在于，所述三维培养步骤为采用传统的琼脂糖凝胶方法，具体包括：将生长状态较好的纤维环源干细胞消化后制成单细胞悬液，用PBS液配制低熔点琼脂糖，将单细胞悬液与琼脂糖液混合，使形成细胞终浓度为2×105细胞/ml的3％琼脂糖细胞悬液，置于6孔培养板中，放于4℃冰箱内凝胶25min，加入2mL的DMEM(内含10％的FBS)，放于37℃，5％CO2培养箱内培养。
本对比例培养所得细胞的显微镜照片图见附图6所示，可见，传统的琼脂糖凝胶三维培养细胞，仅仅给细胞提供三维的凝胶网状结构，且网状结构较大，不能提供类似于细胞外基质成分的三维生理环境，细胞粘附程度较差，生长后期不易形成三维细胞交联网，不利于细胞的增殖和细胞间的通讯。而由于人体内细胞外基质的主要成分是胶原蛋白、粘连蛋白、蛋白多糖等，Collagel凝胶支架法培养细胞时，可以更好的模拟体内的三维生理环境，细胞可以更好的粘附于三维凝胶网，生长后期更容易形成细胞交联网，利于细胞的增殖和细胞间的通讯。
实验例
分别以上述实施例1及对比实施例1-4中培养后的细胞进行增殖实验，具体操作包括：
(1)收集细胞，调整浓度至2500细胞/ml，接种于96孔培养板，每孔200μl，每组每天5个重复；
(2)贴壁培养12h后，于第一天更换新鲜的200μl培养液，并向细胞内加入20μlCellTiter
AQueous One Solution Reagent，37℃、5％CO2培养箱培养4h；空白对照为200μl不含细胞的培养液，直接加入20μl CellTiter
AQueous One SolutionReagent；
(3)用酶标仪于490nm读取吸光值(OD490)；
(4)按照(2)和(3)的操作，每24h重复测定一次，连续检测7天，根据OD490绘制细胞增殖曲线。
实施例1及对比例3中培养细胞的增殖曲线图见附图7。可见，实验组的增殖速度显著高于对照组，本发明所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，通过对细胞进行凝胶三维培养的方式，并进一步以动态压力刺激细胞培养，有效提高了纤维环源干细胞的增殖性能，在保持纤维环源干细胞原有特性的基础上，能够促进纤维环源干细胞增殖。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制Collagel凝胶培养基质，备用；
所述Collagel凝胶培养基质包括如下成分：
试剂A：5×MEM；
试剂B：FBS(胎牛血清)；
试剂C：1M Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)；
试剂D：0.1M NaOH与5×MEM的混合液；
Collagel凝胶：2-10mg/ml COL1(Ⅰ型胶原蛋白)与0.01M HCl的混合液；
(2)取分离的纤维环源干细胞，制成单细胞悬液，并计数；
(3)将所述细胞与所述Collagel凝胶培养基质混合均匀，得到细胞-Colagel悬液；
(4)取步骤(3)得到的细胞-Colagel悬液加入至细胞培养板中，置于CO2培养箱中进行细胞培养；
(5)将步骤(4)培养后的细胞置于细胞组织力学加载培养与分析系统，对所述纤维环源干细胞进行动态压力刺激，并继续细胞培养，即得。
2.根据权利要求1所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述Collagel凝胶培养基质的配置步骤具体包括：
(a)取所述试剂A、试剂B和试剂C进行混合，备用；
(b)另取试剂D和Collagel，并调节混合液pH7.0-7.2，备用；
(c)分别将上述步骤(a)和(b)制备的混合液混匀，即得。
3.根据权利要求1或2所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，其特征在于，所述试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和Collagel的体积比为(6-10)：(2-8)：(0.5-2)：(1-3)：(30-40)。
4.根据权利要求1-3任一项所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，还包括调节细胞浓度，使平均Collagel培养基基质中细胞浓度为2.0×105细胞/mL的步骤。
5.根据权利要求4所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，还包括将所述细胞-Colagel悬液进行固液分离并收集细胞以所述Collagel培养基质进行重悬的步骤。
6.根据权利要求1-5任一项所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述细胞培养步骤为置于35-40℃、3-8％CO2恒温培养。
7.根据权利要求1-6任一项所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述动态压力刺激步骤中，控制压力为20-90kPa。
8.根据权利要求7所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，控制所述动态压力刺激步骤的作用时间为3-12h。
9.根据权利要求1-8任一项所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述细胞培养步骤为置于35-40℃、3-8％CO2恒温培养。
10.由权利要求1-9任一项所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法培养的纤维环源干细胞。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN114350591A (zh) * | 2022-01-13 | 2022-04-15 | 中山大学附属第一医院 | 一种在压力条件下培养细胞的方法 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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