CN105831105A - 微流体细胞处理芯片及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微流体细胞处理芯片，包括底层、顶层，所述顶层中设有蛇形管道和细胞操作腔，蛇形管道的溶液流入口上设有两个流入通道，两个流入通道的入口管道上分别设有保护剂入口和缓冲溶液入口，蛇形管道的溶液流出通道连接细胞操作腔，所述细胞操作腔设有溶液出口、废液流出通道和细胞进出通道，所述细胞操作腔内左右两侧各设有一排圆柱型障碍物,用以将细胞限制于操作腔中，不被保护剂冲走。实际应用时，操作人员使用改装后的细胞口吸器将细胞直接吹入或吸出芯片细胞操作腔。本发明的微流体细胞处理芯片及应用方法可以在对体积较大的动物细胞冷冻保护剂加载或去除时，使保护剂浓度连续变化，具有操作直接简便、对细胞损伤较小等优点。

Description

微流体细胞处理芯片及其应用方法

技术领域

本发明涉及一种微流体细胞处理芯片，尤其涉及一种以对细胞损伤小，操作简便显著，在低温保护剂的加载和去除过程中，能使低温保护剂浓度连续改变的微流体芯片及其应用方法。

背景技术

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％~15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

卵母细胞作为一种体积较大的动物生殖细胞，它的低温保存技术是人类辅助生殖领域的重要工具。通过对健康的卵母细胞进行低温保存，将能够为需要的人提供更多的生育机会。在低温保存过程中不可避免的要使用低温保护剂，低温保护剂的使用也会带来许多副作用：一方面低温保护剂添加和去除过程中，由于渗透压的急剧变化，大量水或低温保护剂快速流出或流入细胞，从而引起细胞体积的膨胀或收缩，造成细胞膜结构和细胞骨架系统的损伤；另一方面低温保护剂对细胞有化学毒性损伤，并且其毒性大小随作用时间和作用浓度的增加而增大。目前通常采用分步添加和分步去除保护剂的方法。这种方法操作步骤繁琐，要求在很短的时间内在显微镜下准确找到细胞，并完成细胞在溶液间的转移，非常容易造成细胞的丢失，对操作人员的熟练程度要求很高；而且分步添加和分步去除的次数也不可能增加太多，这就使卵母细胞仍然会受到几次由于保护剂浓度突然变化造成的体积突然变化，且在高浓度低温保护剂中的暴露时间长。

针对现有技术存在的上述问题，中国专利公开号CN103451090A公开了一种微流体细胞处理芯片及其应用方法，提供一种使低温保护剂浓度连续变化的微流体细胞处理芯片，在保护剂加载/去除过程中，低温保护剂经蛇形通道混合后，流入细胞操作腔，细胞通过细胞进出口通道上方的转矩控制微阀加载或吸出芯片，并依靠操作腔左右两侧的半隔断将细胞限制于细胞腔中，该中芯片及细胞处理方法虽然可以完成大体积动物细胞冷冻保护剂的连续性加载与去除，但在制作与应用方面仍然存在诸多问题：（1）芯片中蛇形通道、细胞操作腔、半隔断三处重要结构的高度不统一，因此在加工的光刻阶段，需要分层多次制作光刻掩膜，再于封接阶段将不同的层键合起来，既不能很好的保证通道及腔体的加工精度又增加了制作成本；（2）细胞通过转矩控制微阀的开闭控制细胞进出细胞操作腔，阀的开关状态通过固定于PDMS芯片通道上方的螺丝来控制，螺丝末端与流体通道间的形变部件为聚氨酯材质的薄层，这一设计要求在芯片上耦合PDMS和聚氨酯两种材料，增加了芯片加工的复杂性，虽然这种微阀结构简单，不需要复杂的控制系统，但后期较难实现自动化，仅适用于简单的微流控系统及实验室操作；（3）操作腔左右两侧使用半隔断限制细胞，半隔断处的通道的高度可以根据细胞类型进行调节，但半隔断处通道的高度较蛇形通道的高度明显较小，液体流经此处的阻力增大，系统压降值将有所升高，容易造成微流体芯片的损坏，缩短芯片使用寿命。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明设计了两排圆柱型障碍物用以代替原细胞操作腔左右两侧的半隔断，统一了用于混合低温保护剂的蛇形通道、细胞操作腔布以及圆柱型障碍物的高度，既能保证细胞在加载/去除低温保护剂时始终处在细胞操作腔中，又简化了芯片的加工工艺，同时圆柱型障碍物的设计避免了液体流入细胞操作腔前阻力的大幅增大，可以较好的维持系统压降值，使芯片不易损坏。本发明还简化了原有的细胞注入芯片的方式，用改进后的细胞口吸器代替转矩控制微阀，在芯片加工上避免了耦合多种材料的工艺，消除芯片加工的复杂性，并且使用细胞口吸器人工控制细胞进出细胞操作腔，既可以在实验阶段精确控制细胞的进出，消除转矩微阀调节细胞进出时产生的滞后性，又可以在应用阶段被微型气泵替代，提高整个装置的自动化程度。

本发明的目的之一是提供一种使低温保护剂浓度连续变化的微流体细胞处理芯片。

本发明的目的之二是提供一种将微流体细胞处理芯片在卵母细胞低温保护剂加载和去除中的应用方法。

本发明的技术方案：一种微流体细胞处理芯片，包括底层、顶层，所述顶层中设有蛇形管道和细胞操作腔，蛇形管道的溶液流入口上设有两个流入通道，两个流入通道的入口管道上分别设有保护剂入口和缓冲溶液入口，蛇形管道的溶液流出通道连接细胞操作腔，所述细胞操作腔设有溶液出口、废液流出通道和细胞进出通道，所述细胞操作腔内左右两侧各设有一排圆柱型障碍物。

所述保护剂入口和缓冲溶液入口对称于蛇形管道的溶液流入口，保护剂入口和缓冲溶液入口的开口直径相同；并且分别通过第一微流体芯片毛细管与一个双通道微注射泵的微量进样器连接。

细胞操作腔为上凹的长方体，其容积为0.12~0.2 mm³。

所述细胞进出通道连接第二微流体芯片毛细管，第二微流体芯片毛细管末端设有用于吹入及吸出细胞的口吸器，所述细胞口吸器最前端由注射器18G针头代替传统口吸器用于吸取细胞的玻璃管，并通过第二微流体芯片毛细管与细胞进出通道连通。

蛇形管道的横截面为正方形，其边长d=0.05~0.2 mm，相邻管道间距=1~3 mm，蛇形管道的总长度为135~250 mm。

圆柱型障碍物为凸形圆柱体，其底面直径为100~120 μm，高度与芯片通道深度相同。

底层材质为玻璃基片或聚二甲基硅氧烷基片，顶层材质为聚二甲基硅氧烷；细胞进出通道横截面为不规则梯形，且靠近蛇形通道一侧。

一种微流体细胞处理芯片的应用方法，包括低温保护剂加载方法和低温保护剂去除的方法：

低温保护剂加载方法的步骤为：

a) 利用细胞口吸器将细胞从培养液中吸入第二微流体芯片毛细管前端后，迅速将第二微流体芯片毛细管前端插入芯片细胞进出通道入口，再将细胞经由细胞进出通道匀速吹入细胞操作腔，并保证细胞不受操作腔内圆柱型障碍物的挤压；

b) 利用细胞口吸器维持第二微流体芯片毛细管出口处的气压，打开双通道微注射泵，通过设置低温保护剂微量进样器和缓冲溶液微量进样器的推进速度，缓慢增加低温保护剂的流速，缓慢减小缓冲溶液的流速，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续增加；

c) 在对细胞低温保护剂加载的同时，用显微镜观察细胞体积的变化；

d) 当细胞达到处理要求后，关闭双通道注射泵，使用细胞口吸器改变第二微流体芯片毛细管出口处的气压，将细胞从细胞操作腔中，经细胞进出通道吸出芯片，并吹入相应细胞培养液中，加载过程完毕。

低温保护剂去除的方法步骤为：

a) 利用细胞口吸器将细胞从培养液中吸入第二微流体芯片毛细管前端后，迅速将第二微流体芯片毛细管前端插入芯片细胞进出通道入口，再将细胞经由细胞进出通道匀速吹入细胞操作腔，并保证细胞不受操作腔内圆柱型障碍物的挤压；

b) 利用细胞口吸器维持第二微流体芯片毛细管出口处的气压，打开双通道微注射泵，通过设置解冻溶液微量进样器和缓冲溶液微量进样器的推进速度，缓慢减小解冻溶液的流速，缓慢增加缓冲溶液的流速，使得混合后的溶液中解冻溶液的浓度连续减小；

c) 在对细胞低温保护剂去除的同时，用显微镜观察细胞体积的变化；

d) 当细胞达到处理要求后，关闭双通道注射泵，使用细胞口吸器改变第二微流体芯片毛细管出口处的气压，将细胞从细胞操作腔中，经细胞进出口吸出芯片，并吹入相应细胞培养液中，去除过程完毕。

本发明的有益效果是：

本发明的微流体细胞处理芯片将微流体结构与细胞处理集成一种微型细胞处理、分析系统，该芯片可以在对体积较大的动物细胞冷冻保护剂加载或去除时，使保护剂浓度连续变化，克服了原有芯片加工工艺复杂、芯片内部压降值大、容易损坏等诸多缺点，具有加工工艺简单、系统压降值稳定、操作直接简便、对细胞的损伤较小等优点。

本发明提供的一种将微流体细胞处理芯片在卵母细胞低温保护剂加载和去除中的应用，此应用方法配合改进后的细胞口吸器使用，克服了现有的体积较大的动物细胞，尤其是体积较大的动物生殖细胞低温保存过程中低温保护剂加载和去除方法的诸多缺点。

本发明的体积较大的动物细胞低温保护剂加载和去除的微流体方法是基于在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的微流体技术，保护剂溶液和缓冲溶液在微流体通道内以层流方式流动，两流体通过扩散方式混合，实现沿着通道方向保护剂浓度的连续改变，从而减小保护剂浓度的突然改变对细胞造成的渗透冲击以及细胞在高浓度保护剂中的毒性损伤。

附图说明

图1 是本发明的微流体细胞处理芯片的顶层结构立体示意图；

图2 是本发明微流体细胞处理芯片横截面示意图；

图3 是本发明各管道通路连接示意图；

图4 是细胞口吸器组成示意图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。

如图1至图3所示，本发明的微流体细胞处理芯片，由底层14和顶层15构成。该芯片本体与两个双通道微注射泵通过微流体芯片毛细管连接，并加装在共聚焦显微镜3的自动载物台上。

如图1，2所示，顶层15中设有蛇形管道6和细胞操作腔9，蛇形管道6的溶液流入口上设有两个连接有入口管道的流入通道2，两个流入通道2的入口管道上分别设有保护剂入口4和缓冲溶液入口5，蛇形管道6的溶液流出通道连接细胞操作腔9，细胞操作腔9内左右两侧分别设有一排第一、二圆柱型障碍物8、10，且设有溶液出口11、废液流出通道17和细胞进出通道7，细胞进出通道7通过第二微流体芯片毛细管16，与细胞口吸器12连通。

如图2所示，微流体芯片本体与微注射泵通过第一微流体芯片毛细管13连接，该微注射泵的型号为Pump 11 Pico Plus Elite(Harvard,USA)；

芯片本体上表面设置的限定开口的保护剂入口4和缓冲溶液入口5，分别用于通入缓冲溶液和低温保护剂溶液；两个入口对称于蛇形管道6的溶液流入口，两个入口的开口直径相同；并且分别通过第一微流体芯片毛细管13与两个双通道微注射泵1的两个微量进样器连接；

细胞进出通道7通过第三微流体芯片毛细管16与细胞口吸器12的18G针头相连；

两个溶液入口通过流入通道与蛇形管道6相连通，该蛇形管道6用于混合缓冲溶液与低温保护剂溶液，使混合溶液浓度连续变化；

蛇形管道6在芯片内同一平面，蜿蜒蛇形，横截面为正方形，其边长d=0.05~0.2 mm，相邻管道间距=1~3 mm，蛇形管道的总长度为135~250 mm。

蛇形管道6的另一端连接有至少一个细胞操作腔9，细胞操作腔9为上凹的长方体，容积大小约为0.12~0.2 mm³，腔的三面分别与蛇形通道6、细胞进出通道7和溶液出口11相通。

细胞操作腔9内左右两侧各设有一排圆柱型障碍物，该障碍物从上表面看去是下凸的，其高度与细胞操作腔相同，底面积为100~120 μm,相邻两个柱状物的距离约20 μm，具有精确控制细胞的作用，由于该间隙仅为卵母细胞直径的1/6~1/5，可保证细胞不被冲走，防止细胞在保护剂加载和去除过程中丢失；

芯片本体上还设置有一个细胞进出通道7，该通道横截面为不规则梯形，较为靠近蛇形通道一侧，这种设计可以保证，在保护剂加载和去除过程中，已吹入细胞操作腔9的细胞不会由于第二微流体芯片毛细管16出口处气压不稳而返回细胞进出通道7。使保护剂浓度形成连续变化的蛇形管道6、细胞操作腔9、细胞进出通道7、溶液出口11相连通；

芯片外部大小应该与带有自动载物台的共聚焦显微镜3及其载物台相匹配；

如图2所示，芯片本体主要分为两层：底层14材质为玻璃基片或聚二甲基硅氧烷基片（polydimethylsiloxane, PDMS），顶层15材质为PDMS层；在细胞操作腔9内圆柱形障碍物材质为PDMS。

为保证光线通过，微流体装置以SU-8 2000光刻胶制备模具，用透光率较好的聚二甲基硅氧烷（PDMS）注塑成型；为增强微流体管道的亲水性，PDMS芯片需经过氧等离子体处理，处理后的芯片与玻璃基片或PDMS基片键合制作完成微流体浓度连续变化细胞操作芯片。

微流体细胞处理芯片在卵母细胞低温保护剂加载和去除中的应用方法，包括低温保护剂加载方法和低温保护剂去除的方法。

本发明在进行卵母细胞低温保护剂的加载应用方法的步骤如下：

1）将微流体细胞处理芯片安放固定在显微镜的自动载物台上；

2）分别推动装有低温保护剂{30% DMSO}和缓冲溶液{组织培养液（TCM）199}的微量进样器，使两溶液沿第一微流体芯片毛细管13到达芯片Y型入口处，节省流体流经毛细管需要的时间，从而减少保护剂加载需要的总时间。

3）如图4所示，将细胞口吸器12的18G针头18部分与第二微流体芯片毛细管16相连，18G针头18后端用橡皮管19连接滤嘴20，橡皮管19中间接过滤器21。运用虹吸原理，使用细胞口吸器12将处理好的卵母细胞从培养液中吸取到第二微流体芯片毛细管16前端，迅速将第二微流体芯片毛细管前端与芯片细胞进出通道7入口相连，再将细胞经由细胞进出通道7匀速吹入细胞操作腔9，并保证细胞不受操作腔内圆柱型障碍物8、10的挤压；

4）调整显微镜聚光镜和物镜镜头，获得细胞操作腔9内卵母细胞的清晰图像；

5）人工维持第二微流体芯片毛细管16出口处的气压，使细胞处于芯片操作腔9且不被腔内的第一、二圆柱型障碍物8、10挤压；

6）打开双通道微注射泵1，使两种溶液分别从相应入口进入芯片本体内的流入通道，然后在蛇形管道6中进行混合；低温保护剂的流量从0缓慢增加至5 μl/min，缓冲溶液的流量从5 μl/min缓慢减小至0，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续增加,控制两种流体的流速以实现保护剂浓度的连续变化，混合好的溶液经细胞操作腔9，从溶液出口11及废液流出通道17流出；

7）当保护剂流量增至5 μl/min，缓冲溶液的流量减至0，即可认为保护剂加载完毕（不同细胞和不同浓度的低温保护剂，加载方案不同），关闭注射泵1；

8）利用细胞口吸器12，改变第二微流体芯片毛细管16出口处的气压，将细胞从细胞操作腔9经细胞进出通道7，从与细胞进出通道7相连接的第二微流体芯片毛细管16吸出；吸出的细胞放在cryotop片上投入液氮，进行低温保存。

本发明进行卵母细胞低温保护剂的去除应用方法的步骤如下：

1）将微流体细胞处理芯片安放固定在显微镜的自动载物台上；

2）分别推动装有解冻溶液{基础液[组织培养液（TCM）199 +0.5 mol/L蔗糖}和缓冲溶液{组织培养液（TCM）199}的微量进样器，使两溶液沿第一微流体芯片毛细管13到达芯片Y型入口处，节省流体流经毛细管需要的时间，从而减少保护剂去除需要的总时间；

3）将细胞口吸器12的18G针头部分与第二微流体芯片毛细管16相连，运用虹吸原理，使用细胞口吸器12将解冻后的卵母细胞从培养液中吸取第二微流体芯片毛细管16前端，迅速将第二微流体芯片毛细管前端与芯片细胞进出通道7入口相连，再将细胞经由细胞进出通道7匀速吹入细胞操作腔9，并保证细胞不受操作腔内第一、二圆柱型障碍物8、10的挤压；

4）调整显微镜聚光镜3和物镜镜头，获得细胞操作腔9内卵母细胞的清晰图像；

5）人工维持第二微流体芯片毛细管16出口处的气压，使细胞处于芯片操作腔9且不被腔内的第一、二圆柱型障碍物8、10挤压；

6）打开双通道注射泵1，使两种溶液分别从相应入口进入芯片本体内的流入通道，然后在蛇形管道6中进行混合；解冻溶液的流量从5 μl/min缓慢减小至0，缓冲溶液的流量从0缓慢增加至5 μl/min，使得混合后的溶液中解冻溶液的浓度连续减小，控制流速以实现解冻溶液浓度的连续变化，混合好的溶液经细胞操作腔9，从溶液出口11及废液流出通道17流出；

7）当缓冲溶液的流量增至5 μl/min，解冻溶液流量减至0，即可认为细胞内的保护剂去除完毕（不同细胞和不同浓度的低温保护剂，去除方案不同），关闭注射泵1；

8）利用细胞口吸器12，将细胞从细胞操作腔9经细胞进出通道7，从与细胞进出通道7相连接的第二微流体芯片毛细管16吸出。

Claims (8)

1.一种微流体细胞处理芯片，包括底层（14）、顶层（15），所述顶层（15）中设有蛇形管道（6）和细胞操作腔（9），蛇形管道（6）的溶液流入口上设有两个流入通道（2），两个流入通道（2）的入口管道上分别设有保护剂入口（4）和缓冲溶液入口（5），蛇形管道（6）的溶液流出通道连接细胞操作腔（9），其特征在于：所述细胞操作腔（9）设有溶液出口（11）、废液流出通道（17）和细胞进出通道（7），所述细胞操作腔（9）内左右两侧各设有一排圆柱型障碍物。

2.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于：所述保护剂入口（4）和缓冲溶液入口（5）对称于蛇形管道（6）的溶液流入口，保护剂入口（4）和缓冲溶液入口（5）的开口直径相同；并且分别通过第一微流体芯片毛细管（13）与一个双通道微注射泵（1）的微量进样器连接。

3.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于：所述细胞操作腔（9）为上凹的长方体，其有效容积为0.12~0.2 mm³。

4.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于：所述细胞进出通道（7）连接第二微流体芯片毛细管（16），第二微流体芯片毛细管（16）末端设有用于吹入及吸出细胞的口吸器（12），所述细胞口吸器（12）最前端由注射器18G针头代替传统口吸器用于吸取细胞的玻璃管，并通过第二微流体芯片毛细管（16）与细胞进出通道（7）连通。

5.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于：所述蛇形管道（6）的横截面为正方形，其边长d=0.05~0.2 mm，相邻管道间距=1~3 mm，总长度为135~250 mm。

6.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于：所述圆柱型障碍物为凸形圆柱体，其底面直径为100~120 μm，高度与芯片通道深度相同。

7.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于：所述底层（14）材质为玻璃基片或聚二甲基硅氧烷，顶层（15）材质为聚二甲基硅氧烷；细胞进出通道（7）横截面为不规则梯形，且靠近蛇形通道（6）一侧。

8.一种权利要求1至7任一项所述的微流体细胞处理芯片的应用方法，包括低温保护剂加载方法和低温保护剂去除的方法，其特征在于：

所述低温保护剂加载方法的步骤为：

a) 将第二微流体芯片毛细管（16）与细胞口吸器（12）的18G针头相连，利用细胞口吸器（12），将细胞从培养液中吸入第二微流体芯片毛细管（16）前端后，迅速将第二微流体芯片毛细管（16）前端插入芯片细胞进出通道（7）入口，再将细胞经由细胞进出通道（7）匀速吹入细胞操作腔（9），并保证细胞不受操作腔内圆柱型障碍物的挤压；

b)利用细胞口吸器（12）维持第二微流体芯片毛细管（16）出口处的气压，保证细胞始终处于细胞操作腔（9）中，打开双通道微注射泵（1），通过设置低温保护剂微量进样器和缓冲溶液微量进样器的推进速度，缓慢增加低温保护剂的流速，缓慢减小缓冲溶液的流速，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续增加；

c) 在对细胞低温保护剂加载的同时，用显微镜观察细胞体积的变化；

d) 当细胞达到处理要求后，关闭双通道注射泵（1），使用细胞口吸器（12）改变第二微流体芯片毛细管（16）出口处的气压，将细胞从细胞操作腔（9）中，经细胞进出通道（7）吸出芯片，并吹入相应细胞培养液中，加载过程完毕；

所述低温保护剂去除的方法步骤为：

a)将第二微流体芯片毛细管（16）与细胞口吸器（12）的18G针头相连，利用细胞口吸器（12）将细胞从培养液中吸入第二微流体芯片毛细管（16）前端后，迅速将第二微流体芯片毛细管（16）前端插入芯片细胞进出通道（7）入口，再将细胞经由细胞进出通道（7）匀速吹入细胞操作腔（9），并保证细胞不受操作腔内圆柱型障碍物的挤压；

b) 利用细胞口吸器（12）维持第二微流体芯片毛细管（16）出口处的气压，保证细胞始终处于细胞操作腔（9）中，打开双通道微注射泵（1），通过设置解冻溶液微量进样器和缓冲溶液微量进样器的推进速度，缓慢减小解冻溶液的流速，缓慢增加缓冲溶液的流速，使得混合后的溶液中解冻溶液的浓度连续减小；

c) 在对细胞低温保护剂去除的同时，用显微镜观察细胞体积的变化；

d) 当细胞达到处理要求后，关闭双通道注射泵（1），使用细胞口吸器（12）改变第二微流体芯片毛细管（16）出口处的气压，将细胞从细胞操作腔（9）中，经细胞进出通道（7）吸出芯片，并吹入相应细胞培养液中，去除过程完毕。