CN106479868B - 一种基于多级透析法清除细胞低温保护剂的微装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于多级透析法清除细胞低温保护剂的微装置，包括带有第一通道的上层芯片、带有第二通道的下层芯片和设置在上、下层芯片透析单元之间的多孔膜。第一通道包括细胞悬液通道和4个透析单元；第二通道包括透析液产生区、4个透析单元和透析液收集区；其中，第一和第二通道的透析单元以及多孔膜构成透析执行区。微装置运行时，第二通道的透析液产生区产生梯度浓度和变化流量的透析液，之后流入透析执行区，对所述第一通道透析单元中的细胞悬浮液进行透析。这种清除细胞低温保护剂的微装置能够更有效地去除细胞悬浮液中低温保护剂，减少细胞的机械损伤和渗透压损伤，提高细胞的存活率和回收率。

Description

一种基于多级透析法清除细胞低温保护剂的微装置

技术领域

本发明涉及医疗器械技术领域，尤其涉及一种基于多级透析法去除细胞低温保护剂的微装置，其可用于细胞低温保护剂清除，也可拓展用于红细胞载药或细胞标记。

背景技术

低温保存是用于生殖医学、组织再生和细胞治疗等领域珍贵细胞保存的重要技术。低温保护剂能够使细胞在低温保存过程中避免低温损伤，但是因其负面效应，使用前需将其清除。一些临床治疗(如：干细胞/免疫细胞治疗等)和基础研究(如片上细胞实验室、组织工程等)过程中所需细胞样品大部分为冷冻细胞液且细胞样品量较少，如果使用样品前不将其中的低温保护剂去除则会影响临床治疗效果和基础研究的结果。因此，有效地去除低温保存的微量珍贵细胞样品中的低温保护剂对于临床治疗和基础研究极为重要。

目前，主要通过离心的方法去除细胞悬浮液中的低温保护剂。虽然此方法能在一定程度上去除低温保护剂，但其过程中渗透压的变化、机械应力、细胞聚集以及去除甘油时间不可控性均会对细胞造成损伤，同时其开放环境会造成细胞污染。基于中空纤维的透析和过滤法无法实现低温保护剂的自动清除。更为重要的是，这些方法仅用于大体积细胞悬液，并不适用于微量细胞样品。因此，发展快速、有效、安全的去除微量细胞中低温保护剂的方法非常必要。

近年来，随着微流控技术、软刻蚀技术和光刻技术的发展，可以实现对细胞以及其周围的微环境可控精准操作，如细胞分离、细胞分析以及细胞载体介质的交换等。因此，微流控芯片能用于有效的控制去除低温保护剂过程中细胞的行为以及细胞所处的溶液环境，从而可解决传统法去除低温保护剂过程中所遇到的问题。目前虽已有微流控技术用于低温保护剂的去除，但是现有低温保护剂清除微装置清除效率低、细胞损伤大、细胞回收率低以及流体条件的不可控性依然限制其推广和应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于透析法连续性地清除细胞低温保护剂的微装置，本发明提供的微装置能够安全、有效地去除低温保护剂，减少细胞的机械损伤和渗透压损伤，提高细胞的存活率和回收率。

本发明提供了一种基于透析法连续地清除细胞低温保护剂的微装置，其包括：

带有第一通道的上层芯片，所述第一通道的深度小于上层芯片的厚度，所述第一通道位于上层芯片的下表面；

所述第一通道包括细胞悬液通道和4个透析单元；

带有第二通道的下层芯片，所述第二通道的深度小于下层芯片的厚度，所述第二通道位于下层芯片的上表面；

所述第二通道包括透析液产生区、透析液收集区和4个透析单元，其中透析液产生区中设置4个混合器；

所述上层芯片和下层芯片从上到下依次排列；在改变上层芯片和下层芯片入、出口的情况下，其位置顺序相应颠倒；

设置在所述第一通道的透析单元和第二通道的透析单元之间的多孔膜，所述多孔膜的一面覆盖于所述第一通道的透析单元，另一面覆盖所述第二通道的透析单元；

所述第一通道的入口和出口与第二通道的入口和出口相互之间独立。

所述第一通道的透析单元、第二通道的透析单元和多孔膜构成透析执行单元。

优选的，所述上层芯片和下层芯片的材质独立地选自有机玻璃或者聚二甲基硅氧烷。

优选的，所述上层芯片和下层芯片的面积独立地在64平方厘米～225平方厘米的范围内，厚度独立地在0.5～1cm的范围内。

优选的，所述第二通道的设计方式为级联式网络。

优选的，所述第一通道和第二通道独立地为矩形凹槽，所述凹槽的深度可变，宽度可变，装置尺寸可变。

优选的，所述第二通道中设置有混合器，所述混合器独立地为改进的特斯拉混合器。

优选的，所述第一通道和第二通道的透析单元为嵌有高低交错排列的微型圆柱阵列的矩形凹槽，所述矩形凹槽的宽度远大于凹槽的深度。

优选的，所述第一通道和第二通道每一级透析单元中心的压力相同。

优选的，所述多孔膜为聚偏氟乙烯微孔滤膜。

在本发明的另一方面，所述基于透析法连续地清除细胞低温保护剂的微装置可用于连续地清除细胞低温保护剂，也可拓展用于红细胞载药和细胞标记。

在本发明提供的一种清除细胞低温保护剂的微装置中，所述第二通道透析液产生区产生变浓度和变流量的透析液，随后透析液和细胞悬浮液流入透析执行区，逐级地在透析执行区中实现低温保护剂的清除，这种去除低温保护剂的微装置能安全、有效地去除细胞悬浮液中的低温保护剂，具有较高的细胞存活率和回收率。

附图说明

为了更清楚详细地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中提供的一种清除细胞低温保护剂的微装置的上下层芯片概念图与装置的结构示意图，其中(a)为带有第一通道的上层芯片概念图，(b)为带有第二通道的下层芯片概念图，(c)为装置结构图，(1)为下层芯片结构图，(2)为上层芯片结构图，(3)为中间过滤膜结构图；

图2为本发明实施例中提供的一种清除细胞低温保护剂的微装置中透析液产生区的结构示意图，其中T为改进的特斯拉混合器；

图3为本发明实施例中提供的一种清除细胞低温保护剂的微装置中透析单元结构示意图，其中A是透析单元的横切面示意图，B是A中沿虚线a的切面，C是A中沿虚线b的切面，D是A中沿虚线c的切面，E是A中沿虚线d的切面，F是A中沿虚线e的切面，f为低柱子，g为高柱子。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种清除细胞低温保护剂的微装置，包括：

带有第一通道的上层芯片，所述第一通道的深度小于上层芯片的厚度，所述第一通道位于上层芯片的下表面；

所述第一通道包括细胞悬液驱动单元，其中设置4个透析单元；

带有第二通道的下层芯片，所述第二通道的深度小于下层芯片的厚度，所述第二通道位于下层芯片的上表面；

所述第二通道包括透析液产生区、透析液收集区和4个透析单元，其中4透析液产生区中设置4个混合器；

所述上层芯片和下层芯片从上到下依次排列，如果改变上层芯片和下层芯片入、出口，其位置顺序相应颠倒；

设置在所述第一通道和第二通道的透析单元之间的多孔膜，所述多孔膜的一面覆盖于所述上层芯片的透析单元，另一面覆盖所述下层芯片的透析单元；

所述第一通道的入口和出口与第二通道的入口和出口相互之间独立。

所述第一通道的透析单元、第二通道的透析单元和多孔膜构成透析执行单元。

以下以清除细胞低温保护剂为例说明本发明的装置。

本发明提供的一种清除细胞低温保护剂的微装置，其包括带有第一通道的上层芯片和第二通道的下层芯片，所述通道的深度小于芯片的厚度，所述第一通道位于上层芯片的下表面，所述第二通道位于下层芯片的上表面。如图1所示，图1为本发明实施例提供去除细胞悬浮液中低温保护剂工作平台的上下层芯片概念图与装置的结构示意图。本发明对所述上、下层芯片的形状、材料没有特殊的限制，满足实际操作条件即可。在本发明的实施例中，所述上、下层芯片的形状为正方形，材料为有机玻璃(PMMA)，长宽高为12.8cm×12.8cm×0.6cm；在其他的实施例中，芯片的形状可为圆形或方形，材料可为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，可通过改变通道深度和宽度调节芯片的尺寸大小，芯片的面积可为64～225平方厘米，芯片的厚度可为0.5～1cm。

本发明提供的一种清除细胞低温保护剂的微装置包括带有第一通道的上层芯片，所述第一通道位于芯片下表面且其深度小于芯片的厚度。所述第一通道包括细胞悬液通道和4个透析单元，透析单元如图3所示，图3为本发明实施例提供的连续性去除细胞悬浮液中低温保护剂工作平台中透析单元的结构示意图。在本发明的实施例中，所述透析单元的设计方式为在矩形凹槽中嵌入高低交错、有序排列的微型圆柱阵列，圆柱阵列高度不同。矩形凹槽的长为5.0cm，宽为1.5cm，深度为0.5mm。本发明中透析单元凹槽的宽度远大于深度时，会增强传输物质的传质面积，减少传输物质流动的阻力，进而有利于细胞外低温保护剂的清除以及较少工作平台动力损耗。所述微型圆柱阵列(直径均为1mm)由0.5mm和0.25mm两种高度(或深度)的圆柱组成，高低柱按照垂直于流体流向的波浪式方式分布，一组波浪式的高柱子，一组波浪式的低柱子，圆柱中心间隔为2mm；采用这种有序高低交错的方法可以使溶液充分混合和速度均匀分布，实现透析执行区的充分传质，进而能够实现快速高效地去除低温保护剂；所述圆柱阵列对细胞阻力较小，大幅度地提高细胞回收率。微型圆柱高柱高度与矩形凹槽的深度相同，低柱高度小于矩形凹槽的深度0.25mm。在其他实施例中，圆柱阵列高度可变范围为0.1～0.5mm，排列方式可变。

本发明提供的一种清除细胞低温保护剂的微装置包括带有第二通道的下层芯片，所述第二通道位于芯片上表面且其深度小于芯片的厚度。所述第二通道由级联式网络构成，包括透析液产生区、透析液收集区和4个透析单元，如图1所示。所述的透析液产生区中设置4个改进的特斯拉混合器，去离子水和浓缩的透析液以一定的流量比在透析液产生区的通道中汇合且在混合器均匀混合，之后产生的稀释的透析液一条支路进入透析执行区进行透析，另一支路与去离子水再以一定的流量比进行下一级的混合，依次逐级实现四个或更多梯度式浓度和变化流量的透析液，如图2所示，图2为本发明实施例提供第二通道中的透析液产生区的结构示意图，T透析液产生区中混合器的结构示意图。所述第一通道和第二通道的透析单元的形状、尺寸、大小以及其中微圆柱阵列的排布一致，在此不再赘述；所述的透析液废液经透析液收集区流出去除细胞悬浮液中低温保护剂工作平台。在本发明的实施例中，采用这种逐级实现4个变浓度和流量溶液通过微膜透析洗涤细胞悬浮液能够更有效地去除低温保护剂，减少细胞的机械损伤和渗透压损伤，提高细胞的存活率和回收率。在其他实施例中，可采用依次逐级实现更多梯度式浓度和变化流量的透析液。

在本发明的实施例中，除透析单元外，所述第一、二通道横截面的形状为矩形凹槽，所述凹槽的深度固定，宽度可变。在本发明的实施例中，所述矩形凹槽通道的宽度可以为0.3～2mm，深度可以为0.5mm；在其他的实施例中，所述通道的宽度可以为0.1mm～2mm，深度可以为0.1mm～0.5mm。本发明中除去透析单元，其他采用尺寸较小通道能够有利于自驱动传质，利用细胞膜内外的压力差作为驱动力驱动物质进行流动，有利于细胞内低温保护剂的去除。

在本发明的实施例中，所述第一通道的透析单元、第二通道的透析单元和透析单元间的过滤膜构成透析执行单元；所述下层和上层芯片的透析单元能够完全重合，进而确保高柱子支撑过滤膜且获得最大的透析面积，使本发明提供的去除细胞悬浮液中低温保护剂工作平台具有较高的清除率；所述第一通道和第二通道每一级透析单元中心的压力相同，使细胞悬浮液不被稀释或浓缩。在本发明的实施例中，所述上层芯片中的细胞悬浮液与四级或更多级透析执行单元中梯度式透析液实现连续性透析，级联式变浓度和流量的透析溶液和细胞悬浮液通过膜透析作用下清除低温保护剂，此过程中通过膜透析去除细胞中的低温保护剂，达到快速、安全、高效地去除低温保护剂的效果。

本发明提供的一种清除细胞低温保护剂的微装置包括设置在所述上层芯片的透析单元和下层芯片的透析单元之间的多孔膜，如图1c(3)所示。在本发明中，所述多孔膜的形状没有特殊的限制，采用尺寸略大于透析单元能够将所述透析单元覆盖，可以有效地避免细胞悬浮液外渗，达到增加去除低温保护剂的效果和减少去除过程中的细胞损失的目的；所述孔膜可以为亲水性的聚醚砜膜(PES)或者聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，其中PES多孔膜具有高流率、低溶出物、良好的强度、生物相容性高、可高温灭菌、抗收缩性能好、稳定性好、不吸附蛋白和提取物和无污染的特点，可避免微透析过程中发生膜撕裂、流速降低和过滤量减少的问题；所述多孔膜的孔径一般为0.1微米，0.22微米，0.45微米、0.6微米、0.8微米、1.0微米，1.2微米和2微米等，同时也可以根据要求定制。在本发明的优选实施例中，所述多孔膜为上海海宁市中立过滤设备有限公司提供的膜孔径为1.2微米的亲水性PVDF膜。在其他实施例中，常用血液透析膜种类和膜孔径均可用，来源没有特殊的限制，可由市场购买获得即可。

在本发明中，所述第一通道的入口和第二通道的入、出口是互相独立的，如图1所示，所述第一通道包括所述细胞悬浮液的入口(3)和细胞悬液的出口(5)；所述第二通道中包括低渗透析液的入口(1和7)、高渗透析液的入口(2和6)和废液出口(4和8)。1、2、3、4和5均是穿透上层芯片的通孔，6、7和8为下层芯片的非通孔且其深度为0.5mm。去离子水经孔1和孔7流进第一通道低渗入口，浓缩的透析液经孔2和孔6流进第一通道高渗入口，去离子水和浓缩的透析液在第二通道的透析液产生区(图1)中逐级汇合、混合均匀后产生梯度式浓度和变化流量的透析液，随后加载低温保护剂的细胞悬液流进第一通道的细胞悬浮液的入口3逐级地实现微透析，最终细胞悬液经细胞悬液的出口5、废液经废液出口4和8流出连续性去除细胞悬浮液中低温保护剂的工作平台，进而实现安全、有效地去除细胞中的低温保护剂。

在本发明的另一方面，所述微装置还可以拓展用于红细胞载药或细胞标记。

在本发明的实施例中，微装置的制备方法可以为：

在本发明中，所述带有第一通道的上层芯片、多孔膜、带有第二通道的下层芯片和透析执行单元与上述技术方案所述的带有第一通道的上层芯片、多孔膜、带有第二通道的下层芯片和透析执行单元一致，在此不再赘述。在本发明的实施例中，可以通过螺丝钉将所述上层芯片和下层芯片紧固连接。

实施例1

具有图1所示结构的一种清除细胞低温保护剂的微装置上、下板芯片概念图和装置的结构示意图，包括：

所述清除细胞低温保护剂的微装置的上下层芯片的长宽高为12.8cm×12.8cm×0.6cm的正方形上、下层芯片；所述上层和下层芯片的材质为有机玻璃(PMMA)。所述上层芯片下表面的第一通道包括细胞悬液通道和4个透析单元，其中透析单元是嵌入高低交错排列的微型圆柱阵列(直径均为1mm，高柱子高度0.5mm，低柱子高度0.25mm)的矩形凹槽(长宽高为5.0cm×1.5cm×0.5mm)，高低柱按照垂直于流体流向的波浪式方式分布，一组波浪式的高柱子，一组波浪式的低柱子，圆柱中心间隔为2mm。孔1是去离子水的入口，孔2是浓缩透析液的入口，孔3是细胞悬浮液的入口，孔4是废液出口，孔5是流经所述第一通道清除低温保护剂后的细胞悬浮液的出口，孔1-5均是穿透所述上层芯片的通孔。

所述下层芯片上表面的第二通道包括透析液产生区、4个透析单元和透析液收集区。第二通道按照级联式分布的方式进行，包括连通的两条垂直的通道，透析液产生区产生的透析液按分支一条支路进入透析执行单元，另一条支路进入下一级透析液产生区与去离子水按一定的流量比汇合并进入特斯拉混合器(长度均为17.0cm，深度为0.5mm)混合，依次逐级形成变浓度和流量的透析液；所述透析单元与所述下层芯片的透析单元的形状、大小、深度和微圆柱阵列的排布是一致的；所述的透析液废液经透析液收集区流出去除细胞悬浮液中低温保护剂工作平台。孔6是经入口2进入的浓缩透析液的入口，孔7是经入口1进入的去离子水的入口，孔8是废液出口，孔6-8为非通孔，高度为0.5mm。

所述设置在上下层芯片间的多孔膜为膜孔径为1.2μm的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，且其尺寸稍大于所述透析单元的尺寸。

所述上层芯片和下层芯片通过螺丝钉紧固。

实施例2

采用实施例1提供的一种清除细胞低温保护剂的微装置进行甘油的去除，具体过程为：

将质量体积比为57％的复方甘油溶液逐滴滴入红细胞溶液中，混合均匀，得到含有10～40％甘油的红细胞悬浮液，其压积比为6±5％～24±5％；

将所述细胞悬浮液从实施例1提供的连续性去除细胞悬浮液中低温保护剂工作平台的所述第一通道入口3处通入，细胞悬浮液沿着第一通道逐次流入所述透析执行区；

将去离子水从所述第一通道的横向低渗通道入口1处通入，同时将浓度为20％的Nacl溶液(质量/体积比)从所述第一通道的横向高渗通道入口2处灌入，去离子水和Nacl溶液以一定的流量比沿着第二通道的透析液产生区的通道流动，到达混合器处时混合均匀，逐级形成变浓度和流量的透析液，并最终流入所述第二通道的透析单元，通过多孔膜对第一通道透析单元的细胞悬浮液进行透析；变浓度透析液能够减少细胞的渗透性损伤，确保细胞体积在安全的范围内变化，同时，第一通道和第二通道透析单元间的透析膜等够减少流体间剪切力对细胞的损伤，为细胞存活和低温保护剂的去除提供了安全的微环境；

流至所述第一通道的末端5处的细胞悬浮液和4处的透析液通过医用橡胶软管经过通孔5和通孔4流出去除低温保护剂工作平台。

将红细胞悬浮液在本发明实施例1提供的去除低温保护剂工作平台中运行稳定后，在出口4和5处用EP管取出样品，用全自动生化分析仪分析血红蛋白和甘油的浓度，分别测试细胞的存活率和回收率以及去除甘油的效率；测试结果为，采用本发明实施例1提供的去除低温保护剂工作平台进行细胞悬浮液中低温保护剂的去除，细胞存活率为90％以上，回收率为80％以上和去除甘油的效率为60％以上。

由以上实施例可知，本发明提供了一种连续地去除细胞悬浮液中低温保护剂工作平台，包括：带有第一通道的上层芯片，所述上层芯片下表面的第一通道的深度小于上层芯片的厚度，包括细胞悬液通道和4个透析单元；带有第二通道的下层芯片，所述下层芯片上表面的第二通道的深度小于下层芯片的厚度，包括透析液产生区、透析液收集区和4个透析区单元，其中透析液产生区中设置4个混合器；设置在所述上层芯片的透析单元和下层芯片的透析单元之间的多孔膜；第一通道的透析单元、第二通道的透析单元和多孔膜都成透析执行区；所述上层芯片用于细胞悬液通过；所述下层芯片的透析液产生区产生变浓度和变流量的透析液；所述透析执行区完成低温保护剂的清除；所述下层芯片的透析液收集区收集含低温保护剂的透析废液。本发明提供的连续性清除细胞低温保护剂的微装置，在所述第二通道的下层芯片中，通过去离子水和浓缩的透析液按一定流量比逐级混合，形成变浓度和流量透析液，之后对所述第一通道细胞悬浮液进行透析，经过所述透析区实现快速去除低温保护剂的目的，采用这种逐级变浓度和流量溶液通过微膜透析洗涤细胞悬浮液能够更有效地去除低温保护剂，减少细胞的机械损伤和渗透压损伤，提高细胞的存活率和回收率。使这种工作平台具有去除低温保护剂、血浆分离等多种功能，具有较好的便利性。

Claims (8)

1.一种清除细胞低温保护剂的微装置，包括：

带有第一通道的上层芯片，所述第一通道的深度小于上层芯片的厚度，所述第一通道位于上层芯片的下表面；

所述第一通道包括细胞悬液通道和4个透析单元；

带有第二通道的下层芯片，所述第二通道的深度小于下层芯片的厚度，所述第二通道位于下层芯片的上表面；

所述第二通道包括透析液产生区、透析液收集区和4个透析单元，其中透析液产生区中设置4个改进的特斯拉混合器；

所述上层芯片和下层芯片从上到下依次排列；

设置在所述第一通道的透析单元和第二通道的透析单元之间的多孔膜，所述多孔膜的一面覆盖于所述第一通道的透析单元，另一面覆盖所述第二通道的透析单元；

所述第一通道的入口和出口与第二通道的入口和出口相互之间独立；

所述第一通道的透析单元、第二通道的透析单元和多孔膜构成透析执行单元；

在所述第二通道中，去离子水和浓缩的透析液以一定的流量比在所述透析液产生区的通道中汇合且在所述混合器均匀混合，之后产生的稀释的透析液一条支路进入透析执行区进行透析，另一支路与去离子水再以一定的流量比进行下一级的混合，依次逐级实现四个或更多梯度式浓度和变化流量的透析液；

所述上层芯片中的细胞悬浮液与四级或更多级透析执行单元中梯度式透析液实现连续性透析，级联式变浓度和流量的透析溶液和细胞悬浮液通过膜透析作用下清除低温保护剂；并且

所述去离子水和浓缩的透析液在第二通道的透析液产生区中逐级汇合、混合均匀后产生梯度式浓度和变化流量的透析液，随后加载低温保护剂的细胞悬液流进第一通道的细胞悬浮液的入口(3)逐级地实现微透析，最终细胞悬液经细胞悬液的出口(5)、废液经废液出口(4和8)流出连续性去除细胞悬浮液中低温保护剂的工作平台。

2.根据权利要求1所述的清除细胞低温保护剂的所述的微装置，其特征在于，所述上层芯片和下层芯片的材质独立地选自有机玻璃或聚二甲基硅氧烷。

3.根据权利要求1所述的清除细胞低温保护剂的微装置，其特征在于，所述上层芯片和下层芯片的面积独立地在64平方厘米～225平方厘米的范围内，厚度独立地在0.5～1cm的范围内。

4.根据权利要求1所述的清除细胞低温保护剂的微装置，其特征在于，所述第二通道的设计方式为级联式网络。

5.根据权利要求1所述的清除细胞低温保护剂的微装置，其特征在于，所述第一通道和第二通道独立地为矩形凹槽。

6.根据权利要求1所述的清除细胞低温保护剂的微装置，其特征在于，所述第一通道和第二通道的透析单元为嵌有高低交错排列的微型圆柱阵列的矩形凹槽，所述矩形凹槽的宽度远大于凹槽的深度。

7.根据权利要求1所述的清除细胞低温保护剂的微装置，其特征在于，所述第一通道和第二通道每一级透析单元中心的压力相同。

8.根据权利要求1所述的清除细胞低温保护剂的微装置，其特征在于，所述多孔膜为聚偏氟乙烯微孔滤膜。