CN107488582A - 微流控装置 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种用于富集和分离循环肿瘤细胞的微流控装置，采用PDMS柔性微管，通过设置出入口使之能与普通商业器件相连，将PDMS微管设置成特定的结构，利用流体力学原理控制流动参数实现目标颗粒、细胞的富集或者分离。

Description

微流控装置

技术领域

本申请涉及医疗器械领域，尤其涉及一种用于富集和分离循环肿瘤细胞的微流控装置。

背景技术

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells)简称CTCs，是由原发肿瘤组织脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞，是肿瘤经由血液循环系统发生转移的核心途径。随着对肿瘤的深入研究和治疗水平的提高，CTCs作为关键的肿瘤诊断标志物和病理分析的重要介质，具有重要的学术价值和临床医疗前景。

循环肿瘤细胞的特点是数量稀少(在近10亿血细胞中只有数十个)，其分离与富集极具挑战性。目前用于分离CTCs主要有物理过滤，流控芯片黏附，密度梯度分离，电场分离和流体力学分离等方式。其中，基于微流控芯片的流体力学分离是目前的主要方法。

目前的弯曲微流道分离法是基于传统的微流控芯片工艺，制作高度约50微米，宽度约100微米的弯曲流道，依据多相流体力学原理，微小弯曲管中随流体流动的颗粒在一定的流速下，在流体粘性拖曳力、惯性升力、趋壁力等的共同作用下，依据尺寸大小在管壁附近聚集的原理，分离比红细胞、白细胞和血小板尺寸大的CTCs。

当前的弯曲流道微流控芯片制作基于昂贵的硅板超净光刻技术，并且只能制作矩形的管道。矩形流道内二次流动受边界非轴对称性影响，分离效果对血液粘性和流量敏感，对患者血样采用同一分离程序容易造成误判；在相同的流动驱动压力下，矩形流道的有效面积小于横截面周长相同的圆形流道，受壁面边界的影响易于在四个角形成缓慢的流动缓滞区(流动边界)，流动边界层分布不均匀因而易于产生血液凝固。

因此，当前的矩形弯曲流道微流控芯片CTCs富集技术需要对患者的血样进行前处理，将红细胞采用物理化学方法裂解。这带来两个问题：

1)首先，这种方法无法处理全血，失去了将红细胞和适量的白细胞、血小板回输给患者的可能性很小；

2)在红细胞裂解的过程中还可能对CTCs的细胞膜产生影响，造成CTCs细胞膜的变性和CTCs丢失。尽管此方法能获得带有生物活性的CTCs，对细胞膜的物理化学处理仍然存在影响细胞基因变化的可能性。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了一种用于分离循环肿瘤细胞的微流控装置，用以解决现有分离技术中存在的成本高、效果差、应用场合受限的技术问题。

本发明提供一种用于分离循环肿瘤细胞的微流控装置，其使用截面是圆形的PDMS微管作为微流控元件，其特征在于，所述PDMS微管设置成直管、平面螺旋弯曲、三维螺旋弯曲、三维自扭曲双螺旋或平面周期性弯曲的形态。

优选所述PDMS微管至少一端设置成可连接普通仪器设备管道的扩张口。

优选所述PDMS微管设置成三维螺旋弯曲形态。

本发明还提供一种分离循环肿瘤细胞的方法，其采用上述的微控流装置作为富集分离设备。

上述的PDMS微管一端的扩张口的制备方法，包括：制备锥形的接头模具；将锥形模具插入微管一端；在模具的存在下浇筑PDMS并固化；去除模具，形成扩张口。

本发明还提供一种可用于复杂分离或者细胞富集的装置，其采用两个或两个以上上述的微流控装置连接而成。

本发明微流控装置采用内径5-500微米之间的圆形截面的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微管作为微流控元件，相对于现有技术微流控芯片，具有如下特点：

PDMS微管制作组装的细胞分离微流控装置无需依赖超净光刻技术，芯片制作成本和技术壁垒降低，更加节能、绿色、环保；

管道为柔性，因而具有自持性，使得设备可以随身穿带，更有利于复杂临床条件下的使用；

圆形通道与血管生理几何条件更为近似，流动横截面内的流动特征和应力分布沿径向均匀，从生物流体力学角度极大的缓解了患者全血处理过程中的凝血风险，使得循环肿瘤细胞的血液物理透析成为可能；

柔性元件可以形成三维结构，使弯曲管道流动特性能在极小的流道弯曲半径下达到高效、稳定的效果。并且，弯曲几何结构恒定，易于形成稳定迪恩(Dean)流动，细胞分离效果更为稳定，装置的鲁棒性好。

圆形通道便于有效的利用多种血液流变学基本原理，完成多目的性分离，使得集成设计复杂紧凑的多功能分离芯片成为可能。

圆形通道的有效流动面积更大，在相同条件下比传统微流控芯片处理血液量更大，更为高效。能够实现分离核心部件的微小化，便于移动和携带。

本发明同时还提供了，在装置组装时，通过设计制作符合微管直径的专用接头，形成微管的进口和出口，与普通的商业器件接口相通，组合弯曲管道形成分离芯片整体，实现入口处颗粒混合，经过弯曲管道芯片，在出口颗粒依据直径大小差异，从不同的收集口流出，进行分类收集。

本发明基于PDMS微管的颗粒分离和富集装置，采用带有渐扩接头的PDMS微管，根据分离和富集的目的不同，可分别组装形成：直管近壁迁移效应分离装置(图3A)；以及如图3所示的平面螺旋弯曲管道分离装置(图3B)；三维螺旋弯曲管道分离装置(图3C)；三维自扭曲双螺旋分离装置(图3D)；平面周期性弯曲管道颗粒聚集装置(图3E)。

这些不同形态的装置分别特点为：

(1)直管近壁迁移效应分离装置：基于PDMS微管的直管分离装置可以模拟人体血管内血液的流动环境，从含有大量红细胞的血流中分离变形能力远小于红细胞的白细胞和其它球状细胞。为了实现这一分离，从血流动力学角度，需要维持足够大的红细胞体积比。采用PDMS微管的直管分离装置，可以模拟直径小于100微米的毛细血管，易于在小血量情况下维持使其他产生细胞近壁迁移效应的红细胞体积比，从而在出口处的近壁区获得白细胞和其它较红细胞硬的细胞(如CTCs、血小板)，本发明直管优选参数为直径小于150微米，长度为50-150毫米。

(2)平面螺旋弯曲管道分离装置：平面螺旋管道分离装置的基本原理与使用传统的超净光刻微流控芯片技术制作的矩形螺旋通道微流控芯片技术类似，但是圆形界面通道的采用消除了矩形流体通道内四个角落近壁区域的流动缓滞区，使得截面内流动更为均匀，不易形成凝血；并且相同横截面边界周长包裹的有效流动面积更大，流动阻力更小，分离更为有效；同时轴对称的壁面边界使内部流场均匀，在弯曲管道内，更易于形成较低雷诺数下的稳定迪恩涡，结合合适的管道直径，可以在较大的流量范围内实现目标直径细胞的分离，分离的鲁棒性大大增强；而且PDMS管道不需借用其它面辅助，自成封闭通路，使得采用PDMS微管制作的芯片总体尺寸更小而且紧凑，本发明平面螺旋弯曲管道分离装置优选参数为：起始弯曲半径为0.5-2毫米，长度为20-100毫米。

(3)三维螺旋弯曲管道分离装置：三维螺旋弯曲管道装置是基于PDMS微管的分离装置的最优选的方案。传统的超净光刻微流控芯片技术制作的芯片都只能在二维平面内实现功能，PDMS管道不需借用其它面辅助，自成封闭通路，这样可以形成如螺旋状的三维立体结构。如此，芯片的优势和分离能力大大增强：沿平面二维螺旋形成的渐开线，流动横截面内的二次流动迪恩涡随弯曲半径的增大逐渐减弱，不利于弯曲管道的分离。而三维立体螺旋管道弯曲半径沿螺纹前进方向始终一致，而且不受光刻技术限制，管道弯曲半径可达到远小于1mm的情况，与平面二维弯曲流道相同的流量下产生更大的二次流动迪恩涡，使得小流量下的分离也变得有效。而且三维的立体螺旋结构使得分离装置平面内的面积减小，而高效的二次流使得颗粒分离的效率提高，不需要很长的管道。整个分离装置的结构变革和效率提升使得分离装置可以做成紧凑的微小器件，比如总尺寸甚至可以达到5立方毫米左右，这样的分离装置不仅便于随身携带，分离系统的效率也大大提升，本发明三维螺旋弯曲管道分离装置优选参数为：长度为30-300毫米，弯曲半径为0.5-2毫米，螺距为0.05-0.2毫米。

(4)三维自扭曲双螺旋分离装置：三维自扭曲装置是基于三维螺旋弯曲管道芯片的鲁棒性，在紧急情况下，简单对折PDMS微管，然后扭转，使得它们以自身为轴形成双螺旋线，达到引发二次流动迪恩涡，实现分离的目的，本发明三维自扭曲双螺旋分离装置优选参数为：扭曲半径为100-500微米。

(5)平面周期性弯曲管道颗粒聚集装置：平面周期性弯曲管道芯片是利用颗粒随流体运动过程中的惯性，在不断地弯折流动中聚集到一条流线的规律。利用二维平面矩形管道微流控芯片能够实现不同密度颗粒聚集成线，目前采用PDMS微管能更简便高效的实现这一目的，本发明平面周期性弯曲管道颗粒聚集装置优选参数为：长度为20-200毫米，弯曲半径为0.5-2毫米。

本发明还提供包括微流控装置、观测装置和动力装置的微流控系统。

所述动力装置可以使得液体以一定的流速通过微流控装置。

本发明微流控系统还可以包括循环装置，所述循环装置可以使液体反复通过同一个微流控装置。

上述微流控系统可以实现在流量为200微升每分钟至2000微升每分钟的大范围内，区分直径差别在5微米的细胞。性能指标以及适用性均明显优于现有的微流控系统。

附图说明

图1是PDMS微管制作步骤和示意图；

图2是PDMS微管接头制作示意图；

图3是本申请的PDMS微管为核心器件的富集和分离装置的器件形态示意图(A直管分离装置；B平面二维弯曲管道分离装置；C立体三维螺旋管道分离装置；D三维自扭曲分离装置；E周期性弯曲富集装置)

图4是采用直微管分离全血中的大直径细胞示意图；

图5是采用直微管分离全血中的大直径细胞示效果示意图；

图6是三维螺旋装置实例图；

图7是三维螺旋装置分离聚乙烯颗效果图；

图8是往复分离系统图；

图9是三维螺旋装置分离上皮细胞效果图；

具体实施方式

以下基于实施例对本申请进行描述，但是本申请并不仅仅限于这些实施例。在下文对本申请的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本申请。为了避免混淆本申请的实质，公知的方法、过程、流程和元件并没有详细叙述。

此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的附图都是为了说明的目的，并且附图不一定是按比例绘制的。

1.PDMS微管的制备

参照附图1，对穿过PDMS池的金属导线通电，导线产生的热量使得导线邻近区域的PDMS从液态转变为固态。然后将导线从PDMS容器池中抽出，已在金属线周围固化的PDMS将随导线一起被抽出PDMS容器池，附在金属导线上的PDMS经过导线移动上方的加热线圈，进一步受热固化。受PDMS粘性和表面张力的影响，附着在金属线的PDMS外将形成以金属线直径为内径的PDMS管状结构，然后将金属线从固化的PDMS中抽出，形成PDMS微管。

2.PDMS微管端口扩张部的制备

参照附图2，利用毛细玻璃吸管，通过拉针器和锻针仪制作成前端可细达2微米的PDMS接头模具如图2A。将毛细微针插入PDMS微管如图2B，在模具的辅助下浇筑PDMS并固化，然后抽出毛细微针，形成渐扩的管道如图2C。PDMS微管两端分别以此方法处理，形成如图2D所示的两端能与常用商业设备相接的内径较大的器件。

3.直管分离装置

如图4所示，在直径100微米的PDMS微管两端，采用毛细微管建立光滑渐扩流道作为装置进口和出口，将全血从入口处采用柱塞泵泵入，在出口处以45度增加上下两个通道，收集红细胞以及白细胞和CTCs。

以分离装置为核心，采用普通实验室用商业柱塞泵作为流体动力来源，显微镜和高速摄像仪作为观测和实验结果记录设备，离心管收集分离后细胞。

正常生理条件下，全血的血细胞体积比在45％左右。在本分离芯片中，维持管道中血流的红细胞体积比在24％以上时，从全血中分离CTCs效果已经非常明显。红细胞体积比越大，CTCs、白细胞等近壁效应越明显。

如图5所示，在本发明中，采用内径为100微米的PDMS微管构成的直管分离器，管内流量达到100微升每分钟时即可形成连续分离，并可实现长时相分离并不产生凝血现象。随着流量的增大，分离效率更高凝血可能性更低。

考虑到白细胞、CTCs等在圆形截面管中沿轴线360度分布，我们还设计了往复分离系统，如图8所示。每次分离出口处大直径细胞在血流中的比例都会大幅度提高，这部分血流被重新抽吸到分离芯片中，经过几轮循环，能够实现血液和CTCs的完全分离。

相比于传统的采用超净光刻技术制作的矩形微流控芯片通道，采用圆形通道从全血中分离细胞技术简单直接，制造成本大大降低，而且血流环境与人体相当，不易形成凝血。全血分离后的血细胞和血清还可以直接或者经过进一步处理后，返回给患者。

4.三维螺旋分离装置分离富集聚乙烯颗粒

本实施例采用三维立体螺旋分离装置将25微米的聚乙烯球形颗粒从海量的6微米颗粒中的分离富集。

此应用实例以从人体血液红细胞中分离白细胞和循环肿瘤细胞为应用参照，实例中大直径颗粒的数目极少，6微米和25微米两种颗粒的数密度比约为3000：1，与人体血液中红细胞和白细胞的比例相当。两种颗粒的直径比也与红细胞和循环肿瘤细胞的比例大体相当。

采用内径为75微米的PDMS微管，长度大于10厘米，采用毛细玻璃微管制作PDMS微管与常用商业实验室设备的接头，并将PDMS微管部分围绕直径约为3毫米的立柱形成3维螺旋结构，出口处以45度增加上下两个通道，如图6所示。

如图7所示，在分离前25微米颗粒均匀分布在数密度为3000倍的6微米颗粒中。分离后，25微米颗粒仅位于螺旋弯道内圈附近的出口近壁区，而6微米的颗粒在每一个出口都散布存在。

为了进一步提高分离后目标颗粒的纯度，我们设计了能够对富集目标颗粒的混合液往复富集的系统如图8所示。初次分离的某处出口汇集了目标颗粒，但可能还混杂其他颗粒，此时，采用两个单向过滤阀，一次分离结束后，采用柱塞泵复吸初步富集的混合液，再推进分离芯片中进行再次分离。如此往复多次，达到彻底分离的目的。

实验证明，采用内径75微米的PDMS微管三维螺旋分离装置，能够在200微升每分钟至1000微升每分钟的流量范围内从海量的小尺寸6微米颗粒中分离25微米颗粒。分离精度和分离能力均远远高于现有的微流控芯片。

5.三维螺旋分离装置分离富集上皮MDCK细胞

本实施例采用三维立体螺旋分离装置将直径约为12～16微米的上皮MDCK细胞进行分离富集。

采用内径为75微米的PDMS微管，长度大于10厘米，采用毛细玻璃微管制作PDMS微管与常用商业实验室设备的接头，并将PDMS微管部分围绕直径约为3毫米的立柱形成3维螺旋结构，出口处以45度增加上下两个通道。如图6所示。

采用同样的分离系统，在流量为600微升每分钟至1000微升每分钟的流量范围内对直径约为18微米的上皮MDCK细胞进行了富集。

如图9所示，细胞富集后处于弯曲管道内侧。

上述实例显示本发明的微流控装置，尤其是采用了三维螺旋结构微流控装置具有优异的分离效果，并且很小的体积。

以上所述仅为本申请的优选实施例，并不用于限制本申请，对于本领域技术人员而言，本申请可以有各种改动和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于富集和分离循环肿瘤细胞的微流控装置，其特征在于，使用截面是圆形的PDMS微管作为微流控元件。

2.权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述PDMS微管设置成直管、平面螺旋弯曲、三维螺旋弯曲、三维自扭曲或平面周期性弯曲的形态。

3.根据权利要求2所述的微流控装置，其特征在于，所述PDMS微管设置成三维螺旋弯曲形态。

4.权利要求3所述的微流控装置，其特征在于，所述三维螺旋微管的长度为30-80毫米，弯曲半径为0.5-2毫米，螺距为0.05-0.2毫米。

5.权利要求1-3任意一项所述的微流控装置，其特征在于所述PDMS微管至少一端设置成可连接通用仪器设备管道的扩张口。

6.一种微流控系统，包含如权利要求1-4中任一项所述的微流控装置、观测装置和动力装置，所述动力装置可以使得液体以一定的流速通过微流控装置。

7.权利要求5所述的微流控系统，其特征在于，还包含循环装置，所述循环装置可以使液体反复通过同一个微流控装置。

8.一种PDMS微管一端的扩张口的制备方法，用于制备如权利要求4所述的PDMS微管扩张口，包括：提供锥形的接头模具；将锥形模具插入微管一端；在模具的存在下包覆PDMS并固化；去除模具，形成扩张口。

9.一种分离循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，采用一个或多个如权利要求1-4中任意一项所述的微控流装置。