CN117264896A - 多细胞球与细胞共培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多细胞球与细胞共培养的方法，所述方法是在超疏水微阵列芯片上进行半开放式共培养，通过倒悬的方式将多细胞球置于基质胶表面，之后所述多细胞球保持在基质胶表面；同时将包含有待培养细胞的培养基添加至所述芯片的微坑上方，此时多细胞球与待培养细胞在胶液界面进行了充分地接触和相互作用，实现多细胞球与所述待培养细胞的共培养。本发明培养方法不仅极大地提高了类器官与免疫细胞的接触及浸润效率，且具有较强的可操作性和可回收性，共培养过程中超疏水微阵列芯片的使用使得此方式对活检样本友好，为肿瘤患者临床前免疫疗效评估以及免疫新药开发带来了巨大的帮助。
Description
技术领域
本发明涉及细胞学技术领域，特别涉及多细胞球与细胞共培养的方法。
背景技术
近年来，一些细胞和药物相关的免疫疗法已在临床上逐渐展开应用，包括免疫检查点抑制剂比如anti-PD1单克隆抗体以及过继细胞疗法。这些免疫疗法在一些上皮恶性肿瘤包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌等表现出明显的疗效。然而迄今为止仍缺乏能够为肿瘤患者准确预测免疫疗效的肿瘤标志物。随着类器官模型的兴起，建立能够准确辅助患者预测免疫疗效的类器官模型是必要的。
肿瘤免疫治疗的本质是通过重新启动并维持肿瘤—免疫循环，增强机体的免疫监视功能或局部改善肿瘤免疫微环境，进而恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，最终控制并清除肿瘤，整个过程中肿瘤细胞与免疫细胞发生着密切的相互作用。因此，通过类器官模拟这两种细胞的相互作用进而实现免疫疗效评估的过程就是共培养。
到目前为止，大多数共培养都采用基于孔板的浸没式共培养、气液界面式共培养以及基质胶上共培养等方式。然而，这些方法首先需要获得大量的类器官，这对于活检尤其是穿刺样本是具有挑战性的；其次，这些共培养方式由于类器官和免疫细胞无法获得充分接触导致共培养的过程中免疫细胞无法接触及浸润至类器官内部，这就大大降低了评估效率及准确性；这些方式由于可操作性较差导致无法局部回收已经与免疫细胞形成稳定相互作用的类器官，进而无法进行后续分析，比如单细胞测序等。因此，建立一种高接触效率的易操作式共培养平台辅助肿瘤患者评估免疫疗效是非常有必要的。
微流控式共培养法，使用PDMS制备3D微流控培养装置，将包含一定数量免疫细胞的肿瘤类器官与基质胶混合后注射至3D微流控培养装置的中间腔室内，37℃孵育30min后基质胶凝固，在两侧腔室中注入培养基或药物，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。此技术由于免疫细胞被包裹至基质胶中，而被基质胶包裹的免疫细胞无法进行运动和迁移，因此降低了免疫细胞与类器官的接触效率；管道式的微流控芯片中间腔室由于封闭状态进而无法回收，难以进行后续研究。
微阵列式共培养法，使用PDMS制备微肿瘤芯片，每个芯片包含3个样本入口和1000个微坑，微肿瘤芯片整体大小为400μm×400μm×320μm。将新鲜的肿瘤组织消化成单细胞，以合适的密度将单细胞悬液通入微阵列芯片中，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。此技术由于芯片中可容纳的培养基体积有限且无法换液导致细胞仅能存活3天；由于缺乏基质胶导致无法稳定肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用；封闭式的芯片使得清洗和回收都存在较大困难因而无法完成后续分析。
微流控技术的结合改变了共培养的方式，通量高、灵活性强的微型腔室大大减少了参与每个反应条件的类器官数量，这为初始数量少的珍贵类器官样本带来了福音，然而目前基于微流控芯片的共培养方式虽相比孔板来说存在明显优势，却也有细胞之间接触效率低、无法回收等诸多缺陷，是一种封闭式培养方法，因此亟需开发一种高效率且可操作性强的共培养模式。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种多细胞球与细胞共培养的方法，所述方法是在超疏水微阵列芯片上进行半开放式共培养，通过倒悬的方式将多细胞球置于基质胶表面，之后所述多细胞球保持在基质胶表面；同时将包含有待培养细胞的培养基添加至所述芯片的微坑上方，此时多细胞球与待培养细胞在胶液界面进行了充分地接触和相互作用，实现多细胞球与所述待培养细胞的共培养；所述半开放式共培养指的是与封闭式共培养不同，参与共培养的细胞可与空气中的氧气进行交换，从而更好地在共培养过程中促进细胞生长。
在一种实施方式中，所述多细胞球是类器官。
在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
步骤1：将所述类器官悬液与所述基质胶混匀，使得所述类器官悬浮在所述基质胶中，与此同时将所述超疏水微阵列芯片置于预冷，防止接种过程中所述基质胶遇到所述超疏水微阵列芯片会迅速凝固；
步骤2：将步骤1中混有类器官的基质胶接种至所述芯片的每个微坑中，此接种过程中保持所述类器官在所述基质胶中不凝固的温度下进行；
步骤3：在步骤2之后，随即将所述芯片倒置，该过程中保持所述基质胶不凝固，类器官会在重力的作用下沉降至基质胶表面即微坑顶部；
步骤4：将所述倒置的芯片转至所述基质胶凝固的温度，静置一段时间，这个过程中所述基质胶凝固；
步骤5：将含有所述待培养细胞的培养基加入到凝固的所述基质胶表面。
在一种实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在步骤5中，将含有所述待培养细胞的培养基使用自动点样仪在玻片上点样；然后再次翻转所述芯片，将所述玻片与所述芯片对准，完成共培养。
在一种实施方式中，在步骤2中，在所述芯片周围加入无菌水营造湿润的环境。
在一种实施方式中，所述类器官是肿瘤类器官，所述待培养细胞是免疫细胞。
在一种实施方式中，所述基质胶是matrigel、组织去细胞化的基质胶、植物来源的基质胶或人工合成的大分子聚合物基质胶。
类器官除了应用于研究发育，肿瘤药筛等热门领域之外，组织再生和修复等再生医学应用中广泛使用。
Matrigel是EHS小鼠肉瘤提取物，广泛的用于类器官的培养，但是基质胶并非只有matrigel一种选择，除了matrigel常见的BME基底膜提取物，还有lammin，I、II、IV胶原等，也广泛的应用于类器官的培养。
组织去细胞化的基质胶，Giobbe et al.,2019等用猪小肠脱细胞制备水凝胶基质，与matrigel相比，可以更好的支持内胚层类器官的生长与扩增，例如胃，肠道，肝脏，胰腺等类器官。猪小肠来源的水凝胶用来培养肠道类器官，想想都非常有道理。虽然也是动物来源，但是猪小肠材料容易获得，产量高，而且不是肿瘤来源，自然有很大的优势。Zafeiriou et al.,2020等用I型collagen胶原作为基质制备了脑类器官。
植物来源的基质胶，Curvello et al.,2021等用0.1％的植物纳米纤维素的基质胶成功的培养了小肠类器官。人工合成的大分子聚合物基质胶，Sorrentino et al.,2020等用PEG作为骨架，整合肝脏中发现的关键ECM蛋白，如laminin-111，IV型胶原，纤连蛋白，制备了完全化学合成的基质，并且成功的用于肝脏类器官的培养。
在一种实施方式中，所述大分子聚合物基质胶是大分子PEG人工合成的基质胶。Jowett et al.,2021，等利用了人工合成PEG基质胶可以调节硬度stiffness的优势，利用ILC1和小鼠肠道类器官共培养体系，研究了稀有细胞ILC1对细胞外基质的重塑，以及对微环境的影响。这种成分明确的简单体系，可以排除很多干扰和扰动，让ILC1或者其他细胞对肠道上皮的作用明确的显现出来，不至于被淹没在噪声之中。
在类器官三维培养的过程中，Matrigel并不是唯一可使用的基质胶，Matrigel是EHS小鼠肉瘤提取物，然而这种动物来源的基质胶由于成分较多因此存在较大的批次差异且成本较高，这对于未来大规模的药物筛选以及转化医学是不利的。随着越来越多的其他种类的基质胶逐渐涌现，研究人员发现人工合成的大分子聚合物基质胶如PEG胶和各种水凝胶也可以维持类器官的正常生长，大分子PEG人工合成的基质胶，成分完全可控，硬度和软度也完全可控。因此在研究机械性能对类器官的影响有独特的优势；且具有稳定、成本低等优势。诸如此类的基质胶也可通过调控浓度以及凝固条件形成GLI共培养模式，与位于培养基中的第二种细胞发生高效率接触。
在三维培养的过程中，类器官并不是唯一一类多细胞球，它是自发形成的，由干细胞分化或者组织来源的包含多种类型细胞的多细胞球，除类器官外还有人为干预形成的多细胞球，比如将永生化的细胞系或与其他细胞混合进行低粘附性培养也可形成多细胞球，这种多细胞球也可以在基质胶中参与共培养。因此，我们基于超疏水微阵列芯片的胶液界面式共培养模型具有广泛的适用性。
在一种实施方式中，当所述基质胶是matrigel时，步骤1中所述类器官悬液与所述基质胶混匀，所述matrigel的体积浓度为70-90％，优选的体积浓度为80-90％，更优选的体积浓度为是80％。
在一种实施方式中，所述步骤3中，类器官在重力的作用下沉降至基质胶表面的时间为5-15分钟，优选的是10-15分钟，更优选的是10分钟。
现有的基于孔板的几种类器官共培养方式均存在着两种细胞接触效率低，无法准确回收，以及类器官数量需求量大等问题，然而目前在临床上往往新辅助阶段使用免疫治疗频率高于辅助阶段，新辅助治疗前仅通过穿刺的方式进行采样，无法获得大量的类器官，因此严重影响了临床前治疗评估；目前基于芯片的共培养技术操作步骤繁琐，体系封闭，可操作性和可回收性都较差，这也阻碍了免疫疗法评估以及免疫相关药物的开发。
本发明通过在超疏水微阵列芯片上进行半开放式共培养，通过倒悬的方式将类器官置于基质胶表面，同时将包含免疫细胞的培养基添加至微坑上方，此时类器官与免疫细胞在胶液界面(GLI-Liquid Interface,GLI)进行了充分地接触和相互作用。这种GLI共培养方式不仅极大地提高了类器官与免疫细胞的接触及浸润效率，且具有较强的可操作性和可回收性，共培养过程中超疏水微阵列芯片的使用使得此方式对活检样本友好，为肿瘤患者临床前免疫疗效评估以及免疫新药开发带来了巨大的帮助。
本发明中使用的GLI共培养模式通过优化Matrigel浓度以及冰上倒置时间将类器官置于Matrigel表面，与培养基中的PBMCs在GLI发生充分地接触，相比于其他的共培养方式，极大提高了两种细胞相互作用的效率。同时基于超疏水微阵列芯片的GLI共培养模式不仅具有良好的可操作性和可回收性，还可以实现少量样本(主要针对穿刺样本)的免疫疗效评估以及药理研究，有利于辅助肿瘤患者进行临床前疗效评估以及新药开发。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是基于超疏水微阵列芯片的GLI共培养模式示意图；
图2是类器官与PBMCs在GLI共培养模式下相互作用图；
图3是通过GLI共培养模式进行anti-PD1药敏评估结果图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例一.超疏水微坑阵列芯片的制备
具体超疏水微坑阵列芯片的制备参见申请人在先申请的中国专利，“超疏水微坑阵列芯片及其制备方法和装置”，中国专利号为202010636603.6。在上述专利中通过一体注塑形成包括微坑阵列和超疏水涂层池的芯片，将超疏水涂料加入到超疏水涂层池中，所述超疏水涂料溶液挥发后在所述微坑阵列的微坑之间形成超疏水层，所述超疏水层是指其表面与水或水溶液的接触角大于150°、滚动角小于10°的疏水层，所述超疏水层使得各个微坑中水溶液之间有效的物理隔绝。芯片中微坑阵列的排列方式、微坑尺寸、深度等均可调节，并可以实现微坑阵列间的完全隔离继而能够避免微坑之间的交叉污染并保持很好的生物相容性。具体制备过程申请人在此不再赘述。
实施例二.肺癌类器官与外周血单个核细胞细胞(PBMCs)的共培养
培养的整体流程如图1所示。以在超疏水微阵列芯片上共培养肺癌类器官与PBMCs为例，具体操作方法如下：(1)将离心后的肿瘤类器官悬液与一定体积的Matrigel混匀，致使Matrigel最终浓度达到80％，与此同时将超疏水微阵列芯片置于冰上预冷，防止接种过程中Matrigel遇到芯片会迅速凝固；(2)将类器官悬液、与培养基混匀的PBMCs、无菌水、预冷的无菌芯片和封口膜转移至无菌湿箱中，按每孔400nL体系将混有类器官的Matrigel接种至芯片每个微坑中，并在芯片周围加入1mL左右的无菌水营造湿润的环境，此接种过程在冰上完成，防止类器官在接种过程中Matrigel凝固；(3)迅速将芯片倒置，冰上静置10min，这个过程中由于Matrigel未凝固，类器官会在重力的作用下沉降至基质胶表面即微坑顶部；(4)将倒置的芯片从冰上转至室温，静置5-10min，这个过程中室温致使Matrigel凝固；(5)将含有PBMCs的培养基使用自动点样仪在玻片上点样，每个液滴2μL；(6)再次翻转芯片，使用微型对准仪将玻片与芯片对准，完成共培养，用封口膜将芯片封住，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
实施例三.GLI共培养模式Matrigel浓度以及在冰上倒置时间的优化
GLI共培养模式的成功实现有两个关键因素，即Matrigel的浓度以及芯片在冰上的倒置时间，Matrigel浓度太高或冰上倒置时间太短则阻碍类器官在重力作用下沉降至芯片微坑表面，而Matrigel浓度太低则使芯片在再次翻转后类器官又回落至微坑底部，冰上倒置时间太长则影响类器官生长活性。因此需要优化共培养过程中的Matrigel浓度以及芯片在冰上的倒置时间。首先对Matrigel浓度进行梯度优化，由于芯片厚度为180μm左右，因此我们统计了Z轴方向170-210μm之内即微坑表面类器官的个数占0-210μm之间即整个微孔中类器官个数的百分比，结果如表1所示，当Matrigel浓度达到70％时，有一半以上的类器官可到达微坑表面，当Matrigel浓度为80％及90％时，大多数类器官可到达微坑表面，由于Matrigel浓度为80％时到达微坑表面的类器官多于浓度为90％时，因此Matrigel浓度为80％最合适，而Matrigel浓度为70-80％以及80-90％也在可接受的范围内；其次对冰上沉降时间进行优化，结果如表2所示，当分别在冰上沉降5min，10min和15min，且类器官在80％Matrigel中时均有一半以上的类器官可到达微坑表面，其中10min时效果最为理想，其他两个Matrigel浓度结果相似，表明冰上沉降10min效果最佳，而5-10min以及10-15min也在可接受的范围中，若沉降时间长于15min可能由于细胞活性变差而影响药物评估结果。我们又对沉降10min时5个浓度下类器官在微坑中的位置进行持续7天的追踪，结果如表3所示，对于50％和60％浓度来说，类器官在微孔中的位置会随着时间推移逐渐下降，对于80％浓度来说，大多数类器官在处于微坑顶部的同时还维持稳定，而对于70％和90％这两个浓度来说，类器官虽并未完全达到微坑顶部，但也可以保持相对稳定。因此，将80％的Matrigel浓度以及冰上倒置10min作为GLI共培养模式的两个接种条件是最合适的，与此同时，70-90％的Matrigel浓度以及5-15min的倒置时间均是可接受的。那么GLI共培养模式是否会影响类器官的生长，我们还持续追踪了GLI共培养模式与一般培养模式(General Culture Mode，GCM)下两株类器官系4853和4841的面积大小变化率即生长速率，即连续7天内追踪同一个类器官，计算出其面积大小，由于类器官初始面积有所差异，因此我们将第0天视作初始值1，第1天至第7天均除以第0天，具体数值如表4所示。在表5中我们还计算了4853和4841在GLI和GCM两种培养模式下面积差，结果显示两株类器官系在这两种培养模式下面积相差20％以内，基本上是一致的，说明GLI共培养模式下类器官仍可正常生长。
表1：
表2：
表3：
表4：
表5：
实施例四.GLI共培养模式下PBMCs对肺癌类器官的浸润以及杀伤
按照上述方法进行同一患者来源的肺癌类器官与PBMCs共培养，结果如表6所示，以芯片微坑和类器官为单位分别进行统计，发现随着时间推移与类器官接触及浸润的PBMCs数量都是逐渐增多的，说明在GLI共培养模式下培养基中的PBMCs可与Matrigel中的肺癌类器官发生高效率的相互作用。再给免疫检查点抑制剂anti-PD1后，我们用Calcein-AM/PI对芯片微坑中的类器官进行染色并统计了微坑中活细胞和死细胞体积，Calcein-AM在488激发下呈现绿色荧光信号，PI在561激发下呈现红色荧光信号，因此绿色荧光体积表示活细胞体积，红色荧光体积表示死细胞体积，具体数值如表7表示。与对照组相比，给药组的活细胞体积小于对照组，死细胞体积大于对照组，活细胞与死细胞荧光体积比与对照组相比具有显著差异，说明给药组中有部分肿瘤细胞在PBMCs及药物作用下被杀死，与临床疗效一致，进一步证明了GLI共培养模式可以进行肺癌肿瘤类器官免疫检查点抑制剂敏感性评估，辅助临床患者进行疗效预测。具体参见图2-3。
表6：
表7：对照组与给药组绿色荧光与红色荧光统计值
本发明中使用的GLI共培养模式通过优化Matrigel浓度以及冰上倒置时间将类器官置于Matrigel表面，与培养基中的PBMCs在GLI发生充分地接触，相比于其他的共培养方式，极大提高了两种细胞相互作用的效率。同时基于超疏水微阵列芯片的GLI共培养模式不仅具有良好的可操作性和可回收性，还可以实现少量样本(主要针对穿刺样本)的免疫疗效评估以及药理研究，有利于辅助肿瘤患者进行临床前疗效评估以及新药开发。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (10)
1.一种多细胞球与细胞共培养的方法，其特征在于，所述方法是在超疏水微阵列芯片上进行半开放式共培养，通过倒悬的方式将多细胞球置于基质胶表面，之后所述多细胞球保持在基质胶表面；同时将包含有待培养细胞的培养基添加至所述芯片的微坑上方，此时多细胞球与待培养细胞在胶液界面进行了充分地接触和相互作用，实现多细胞球与所述待培养细胞的共培养；所述半开放式共培养指的是与封闭式共培养不同，参与共培养的细胞可与空气中的氧气进行交换，从而更好地在共培养过程中促进细胞生长。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多细胞球是类器官。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：将所述类器官悬液与所述基质胶混匀，使得所述类器官悬浮在所述基质胶中，与此同时将所述超疏水微阵列芯片预冷，防止接种过程中所述基质胶遇到所述超疏水微阵列芯片会迅速凝固；
步骤2：将步骤1中混有类器官的基质胶接种至所述芯片的每个微坑中，此接种过程中保持所述类器官在所述基质胶中不凝固的温度下进行；
步骤3：在步骤2之后，随即将所述芯片倒置，该过程中保持所述基质胶不凝固，类器官会在重力的作用下沉降至基质胶表面即微坑顶部；
步骤4：将所述倒置的芯片转至所述基质胶凝固的温度，静置一段时间，这个过程中所述基质胶凝固；
步骤5：将含有所述待培养细胞的培养基加入到凝固的所述基质胶表面。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：在步骤5中，将含有所述待培养细胞的培养基使用自动点样仪在玻片上点样；然后再次翻转所述芯片，将所述玻片与所述芯片对准，完成共培养。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2中，在所述芯片周围加入无菌水营造湿润的环境。
6.根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于，所述类器官是肿瘤类器官，所述待培养细胞是免疫细胞。
7.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述基质胶是matrigel、组织去细胞化的基质胶、植物来源的基质胶或人工合成的大分子聚合物基质胶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述大分子聚合物基质胶是大分子PEG人工合成的基质胶。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述基质胶是matrigel时，步骤1中所述类器官悬液与所述基质胶混匀，所述matrigel的体积浓度为70-90％，优选的体积浓度为80-90％，更优选的体积浓度为是80％。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤3中，类器官在重力的作用下沉降至基质胶表面的时间为5-15分钟，优选的是10-15分钟，更优选的是10分钟。
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