RU2822476C1 - Способ длительного сохранения (консервирования) облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния - Google Patents
Способ длительного сохранения (консервирования) облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния Download PDFInfo
- Publication number
- RU2822476C1 RU2822476C1 RU2023130000A RU2023130000A RU2822476C1 RU 2822476 C1 RU2822476 C1 RU 2822476C1 RU 2023130000 A RU2023130000 A RU 2023130000A RU 2023130000 A RU2023130000 A RU 2023130000A RU 2822476 C1 RU2822476 C1 RU 2822476C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- obligate anaerobic
- drying
- anaerobic bacteria
- bottles
- medium
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000001035 drying Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000007774 longterm Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 37
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 32
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims abstract description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 3
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 abstract 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 abstract 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 3
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 208000034784 Tularaemia Diseases 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 2
- -1 protective media Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010006741 lactobacterin Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен способ длительного сохранения облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния. Используют поверхностное культивирование штаммов облигатно анаэробных бактерий на плотной питательной среде, соответствующей их физиологическим потребностям, в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси N2 - 80%, СО2 - 10%, Н2 - 10%). Биомассу выросших колоний облигатно анаэробных бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста, снимают тупфером с поверхности плотной среды и смешивают с защитной стабилизирующей средой, в качестве которой используют обезжиренное молоко или сахарозо-желатиновую среду в количестве 20% от объема бактериальной суспензии, в соотношении 2 чашек монослоя чистой бактериальной культуры, таким образом, чтобы исходное число клеток составляло 109-1012 клеток в 3 мл защитной стабилизирующей среды, разлитой во флаконы для лиофилизации в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80% N2, 10% СО2, 10% Н2, затем флаконы закрывают ватными пробками и проводят их предварительную заморозку в защитной стабилизирующей среде в течение 16 часов при температуре минус 70°С путем перемещения в течение 5 минут из анаэробных условий в низкотемпературный морозильник. По истечении 16 часов флаконы с бактериальной суспензии облигатно анаэробных бактерий помещают в лиофильную сушку, которую предварительного охладили до минус 50°С, затем проводят вакуумирование камеры лиофильной сушки до 20000 Па (0,02 бар) в течение 60 минут с последующим нагревом полок лиофильной сушки до минус 15°С со скоростью 30 град/час и продолжением нагрева полок до 30°С со скоростью 3 град/час и выдерживают при данной температуре в течение 48-72 часов. Перед отключением и изъятием из лиофильной сушки флаконов с высушенными бактериальными клетками облигатно анаэробных микроорганизмов камеру лиофильной сушки наполняют через штуцер на крышке газообразным азотом, затем через 15 минут флаконы с лиофилизированными облигатно анаэробными бактериями помещают в условия анаэробной атмосферы из трехкомпонентной газовой смеси 80% N2, 10% СО2, 10% Н2, заменяют ватные пробки на резиновые и укупоривают металлической крышкой. Способ позволяет унифицировать процесс подготовки жизнеспособных бактериальных культур к лиофилизации, унифицировать защитные среды и процесс лиофилизации, минимизировать потери бактериальных облигатно анаэробных микроорганизмов при проведении процесса лиофилизации до 0,01-0,02%. 3 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, микробиологии и микробной экологии, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, биологии, научных исследованиях.
Длительное хранение жизнеспособных микроорганизмов является необходимым элементом многих технологий в области медицины, биологии, сельского хозяйства. В настоящее время разработаны достаточно эффективные методы долгосрочного хранения большого количества микроорганизмов, обеспечивающие у них сохранение жизнеспособности, генетической и фенотипической стабильности. Во всех случаях выбор способа сохранения (консервирования) конкретного объекта основывается на сохранении микроорганизмами жизнеспособности, морфологических, физиологических, биохимических и генетических характеристик с учетом максимально возможного времени их хранения, а также надежности реализации используемого метода при хранении микроорганизмов в течение длительного времени. В последние годы в большинстве коллекций микроорганизмов используют методы пересева, лиофилизации, низкотемпературного замораживания и криоконсервации (Методики клинических лабораторных исследований. Справочное пособие, Том 3, Клиническая микробиология под редакцией В.В. Меньшикова. М.: Лабора, 2009. - 879 с).
Наиболее надежными, удобными и обеспечивающими длительные сроки хранения микроорганизмов и биологического материала методами являются криоконсервация и лиофилизация, а также эти методы обеспечивают возможность сохранения высокой биохимической активности и генетической стабильности микроорганизмов (В. Д. Похиленко. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития / В.Д. Похиленко, A.M. Баранов, К.В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - №4 (12). - С.99-121).
Сохранение жизнеспособности микроорганизмов в течение длительного периода времени является сложной задачей, особенно в случае облигатно анаэробных бактерий.
Из уровня техники известно несколько направлений повышения эффективности сохранения жизнеспособных культур бактерий, входящих в состав иммунобиологических и пробиотических препаратов. Известны технические решения, которые с этой целью используют различные способы культивирования микроорганизмов, их хранения и консервирования с применением различных стабилизирующих растворов, защитных сред, гелей с использованием охлаждения при высоком давлении, а также устройства для реализации способа позволяющего осуществлять криоконсервацию с высоким процентом выживаемости микроорганизмов.
Известно, что при периодических пересевах используют свежие питательные среды и пересевы проводят один-два раза в месяц, что приводит к снижению активности продуцентов биологически важных веществ. Существенными недостатками метода считаются возможность заражения, краткосрочность хранения, а также трудоемкость работы и расход реактивов, входящих в состав питательных сред, в больших количествах (Промышленная микробиология. /Под ред. Н. С. Егорова. М., 1989, с. 149-167).
Известен способ хранения микроорганизмов на питательных средах под слоем вазелинового масла. Для этого микроорганизмы выращивают на физиологически соответствующей питательной среде и заливают стерильным вазелиновым маслом. Слой масла при этом способствует замедлению скорости обменных процессов микроорганизмов и предохраняет поверхность среды от высыхания. Недостаток этого способа заключается в том, что хранение под маслом вызывает задержку роста микробов (1,5-2 раза по сравнению с периодическими пересевами культур) и снижает скорость использования ими питательных субстратов, также в качестве недостатка можно отметить разбрызгивание масла при обжигании петли (Промышленная микробиология. /Под ред. Н. С.Егорова. М., 1989, с. 149-167 Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф Герхардта. М., 1983, т.16 с. 535.)
Лиофилизация является известным способом, рутинно применяемым в фармацевтической отрасли, в том числе в производстве вакцин, и применяется с целью удаления воды, содержащейся в материале, чтобы сделать материал более устойчивым при температуре окружающей среды и облегчить его сохранение. Лиофилизация обеспечивает большую стабильность для широкого круга микроорганизмов, в отличие от методов периодических пересевов. Метод лиофилизации удобен для практических целей, однако титр жизнеспособных клеток микроорганизмов после лиофилизации оказывается низким в результате применения защитных сред, и продолжает снижаться при хранении даже при +4°С, а также в результате процесса лиофилизации остаются жизнеспособными наиболее устойчивые клетки в культуре, которые могут и не обладать желаемыми свойствами. Консервация микроорганизмов считается успешной в том случае, когда микроорганизмы восстанавливают свою жизнеспособность с минимальной потерей в титре. Однако отклонение температуры от физиологических условий до субфизиологических условий и обратно может привести к повреждению клеток путем разнообразных механизмов, поэтому преодоление повреждений является основной задачей заявленного способа.
Для лиофилизации бактерий необходимы защитные среды, которые содержат сахара и белковые соединения (A.M. Белоус Криоконсерванты / A.M. Белоус, М.И. Шраго, Н.С. Пушкарь. - Киев: Наукова думка, 1979. -198 с. ). Без добавления таких веществ бактерии обычно лиофилизации не выдерживают.При использовании для лиофилизации суспензий клеток в воде или солевом растворе бактерии гибнут [5]. Известно, что находящиеся в защитных средах сахара, проникая в клетку и создавая там высокое осмотическое давление, препятствуют образованию кристаллов льда и разрушению клетки в процессе замораживания. Белковые компоненты защитной среды не проникают в клетку, но заставляют клеточную оболочку плотнее прилегать к цитоплазме, что важно при размораживании. Для предотвращения образования кристаллов льда проводят быстрое замораживание ампул. В немецкой национальной коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) в качестве защитной среды при лиофилизации бактерий используют снятое молоко. Относительно времени сохранения жизнеспособности лиофилизированных бактерий можно отметить, что в различных публикациях указаны сроки от 5 до 35 лет (Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения: пер. с англ. / О. Смит.- М., 1963. - 430).
Известен способ получения лиофилизата живой туляремийной вакцины RU 2716505 C1 20200312. Для этого используют в необходимой концентрации клетки F. tularensis штамма 15 НИИЭГ и вспомогательные вещества, в качестве консервантов используют трегалозу и декстран со средней молекулярной массой 30000-40000, полученную смесь разливают по 2 мл во флаконы, замораживают на полках сублимационной сушильной установки до температуры полного замерзания минус 35-45°С, выдерживают при ней 2-3 ч, осуществляют сублимационное высушивание при глубине вакуума (0,1±0,01) мбар со скоростью повышения температуры полок не более 5°С в час до температуры препарата 24-26°С, выдерживают при ней 1-2 ч, после чего герметизируют в условиях вакуума. Изобретение обеспечивает получение лиофилизата живой туляремийной вакцины, обеспечивающее требуемое качество вакцины и отличается от заявленного способа микроорганизмами, для которых предназначен способ консервации, условиями культивирования микроорганизмов, условиями и параметрами лиофилизации.
Известен патент США № US 4559298, в котором описан способ улучшенной криоконсервации биологических материалов, заключающийся в охлаждении биологического материала до стеклообразного состояния под давлением в присутствии водного раствора, содержащего криоконсервирующие агенты. Способ улучшения включает: (а) применение достаточного количества проникающих криоконсервантов с эквивалентным количеством непроникающих криоконсервантов для уменьшения повреждения биологического материала при криоконсервации, (б) обработку биологического материала раствором, криоконсервантов, со скоростью и продолжительностью до остекловывания, (в) воздействие давления, достаточного для остекловывания биологического материала при охлаждении без существенного зарождения или роста кристаллов льда и без значительного повреждения биологического материала.
Известен способ длительного хранения прихотливых бактерий (патент РФ 2535984), в частности, таких как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, в консервированной крови путем замораживания, с использованием 18-24-часовой культуры, в стерильных пробирках из полипропилена с плотными крышками, отличающийся тем, что используют стерильную консервированную донорскую человеческую цельную кровь, бактериальные культуры замораживают в морозильной камере холодильника при -20°С, культуры для замораживания выращивают на физиологически соответствующих каждому микроорганизму питательных средах, культивирования бактерий с инкубацией в обычной атмосфере и в СО2-инкубаторе.
Известны факты изменения структуры и физико-химических свойств микроорганизмов в результате замораживания-высушивания, уменьшение размеров лиофилизированных клеток, у отдельных штаммов микроорганизмов происходят задержка скорости роста и пигментообразования, снижение уровня антибиотической активностей или даже потеря отдельных признаков (Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф Герхардта. М., 1983, т.16 с. 535).
Известен способ получения сухой лиофилизированной биомассы лакто- и бифидобактерий RU(11) 2272837. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве пробиотических препаратов: лактобактерина, бифидумбактерина, ацилакта и др. Изобретение предусматривает комплексное использование нативного дрожжевого аутолизата в составе питательных и защитных сред для лиофилизации в количестве 5-25% от объема бактериальной суспензии. Защитная среда содержит обезжиренное молоко и нативный дрожжевой аутолизат, взятые в соотношении 1:(0,5-1). Изобретение обеспечивает унификацию сырья и процесса приготовления питательных и защитных сред, удешевление способа получения пробиотиков, повышает эффективность их производства. Изобретение отличается составом питательных и защитных сред, способом культивирования и процессом лиофилизации.
Ни один из приведенных выше аналогов не показал высокой эффективности длительного сохранения (консервирования) облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния.
Достигаемый технический результат заявленного способа заключается в унификации процесса подготовки жизнеспособных бактериальных культур к лиофилизации, унификации защитных сред, самом процессе лиофилизации, минимизация потери бактериальных облигатно анаэробных микроорганизмов при проведении процесса лиофилизации до 0,01-0,02% за счет соблюдения анаэробных условий, что позволяет сохранить жизнеспособность (выживаемость) прихотливых микроорганизмов при консервации в течение длительного времени и повысить эффективность применения заявленного способа для научных и медицинских целей.
Указанный технический результат достигается тем, что способ длительного сохранения (консервирования) облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния заключается в поверхностном культивировании штаммов облигатно анаэробных бактерий на плотной питательной среде, соответствующей их физиологическим потребностям в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80% N2, 10% СО2, 10% Н2. Затем биомассу выросших колоний облигатно анаэробных бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста снимают тупфером с поверхности плотной среды и смешивают с защитной стабилизирующей средой в соотношении биомассы, снятой с 2 чашек монослоя чистой бактериальной культуры, таким образом, чтобы исходное число клеток составляло 109-1012 клеток в 3 мл защитной стабилизирующей среды, в качестве которой используют 20% обезжиренное молоко, разлитое во флаконы для лиофилизации в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80% N2, 10% СО2, 10% Н2. Затем флаконы закрывают ватными пробками и далее проводят предварительную заморозку биомассы облигатно анаэробных бактериальных культур в защитной стабилизирующей среде в течении 16 часов при температуре минус 70°С, затем флаконы с бактериальной суспензии облигатно анаэробных бактерий помещают в предварительно охлажденную до минус 50°С лиофильную сушку, проводят вакуумирование камеры лиофильной сушки до 20000 Па (0,02 бар) в течение 60 минут с последующим нагревом полок лиофильной сушки до минус 15°С со скоростью 30°С в час и продолжением нагрева полок до 30°С со скоростью 3°С в час и выдерживают при данной температуре в течении 48-72 часов, перед отключением и изъятием из лиофильной сушки флаконов с высушенными бактериальными клетками облигатно анаэробных микроорганизмов камеру лиофильной сушки наполняют через штуцер на крышке газообразным азотом, затем через 15 минут флаконы с лиофилизированными облигатно анаэробными бактериями помещают в условия анаэробной атмосферы из трехкомпонентной газовой смеси 80% N2, 10% СО2, 10% Н2, заменяют ватные пробки на резиновые и укупоривают металлической крышкой. В качестве защитной среды используют сахарозо-желатиновую среду, в количестве 20% от объема бактериальной суспензии.
Предлагаемый способ позволяет обеспечить сохранение жизнеспособных микроорганизмов, обеспечить высокий уровень их выживаемости, в том числе сохранить физиолого-биохимические свойства и исходный титр микроорганизмов в культуре, в течение 5 лет хранения.
Предлагаемое изобретение поясняется примерами.
Пример 1
Было протестировано хранение культур микроорганизмов 34 штаммов облигатно анаэробных бактерий, полученных предлагаемым способом, с исследованием титра до проведения лиофилизации, после лиофилизации, через год хранения лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий и через 5 лет хранения с применением в качестве защитной среды 20% обезжиренного молока. Хранение лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий осуществляли при температуре (2-4)°С. Результаты исследований, приведенные в таблице 1, показали, что все 34 культуры сохранили свою жизнеспособность в течение 5 лет хранения при использовании заявленного способа.
Пример 2
Протестировано хранение культур микроорганизмов 34 штаммов облигатно анаэробных бактерий, полученных предлагаемым способом, с исследованием титра до проведения лиофилизации, после лиофилизации, через год хранения лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий и через 5 лет хранения с применением в качестве защитной среды сахарозо-желатиновой среды. Хранение лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий осуществляли при температуре (2-4)°С. Результаты исследований, приведенные в таблице 2, показали, что все 34 культуры сохранили свою жизнеспособность в течение 5 лет хранения при использовании заявленного способа.
Пример 3
Протестировано хранение культур микроорганизмов 34 штаммов облигатно анаэробных бактерий, полученных предлагаемым способом, с исследованием титра до проведения лиофилизации, после лиофилизации, через год хранения лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий и через 5 лет хранения с применением в качестве защитной среды 5% водный раствор диметилсульфоксида (ДМСО). Хранение лиофилизатов облигатно анаэробных бактерий осуществляли при температуре (2-4)°С. Результаты исследований, приведенные в таблице 3, показали, что культуры не сохранили жизнеспособность при использовании заявленного способа.
Claims (1)
- Способ длительного сохранения и консервирования облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния, заключающийся в поверхностном культивировании штаммов облигатно анаэробных бактерий на плотной питательной среде, соответствующей их физиологическим потребностям, в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80% N2, 10% СО2, 10% Н2, затем биомассу выросших колоний облигатно анаэробных бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста, снимают тупфером с поверхности плотной среды и смешивают с защитной стабилизирующей средой в соотношении биомассы, снятой с 2 чашек монослоя чистой бактериальной культуры, таким образом, чтобы исходное число клеток составляло 109-1012 клеток в 3 мл защитной стабилизирующей среды, в качестве которой используют обезжиренное молоко или сахарозо-желатиновую среду, в количестве 20% от объема бактериальной суспензии, разлитые во флаконы для лиофилизации в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80% N2, 10% СО2, 10% Н2, после чего флаконы закрывают ватными пробками и далее проводят предварительную заморозку биомассы облигатно анаэробных бактериальных культур в защитной стабилизирующей среде в течение 16 часов при температуре минус 70°С, затем флаконы с бактериальной суспензией облигатно анаэробных бактерий помещают в предварительно охлажденную до минус 50°С лиофильную сушку, затем проводят вакуумирование камеры лиофильной сушки до 20000 Па (0,02 бар) в течение 60 минут с последующим нагревом полок лиофильной сушки до минус 15°С со скоростью 30°С в час и продолжением нагрева полок до 30°С со скоростью 3°С в час и выдерживают при данной температуре в течение 48-72 часов, перед отключением и изъятием из лиофильной сушки флаконов с высушенными бактериальными клетками облигатно анаэробных микроорганизмов камеру лиофильной сушки наполняют через штуцер на крышке газообразным азотом, а через 15 минут флаконы с лиофилизированными облигатно анаэробными бактериями помещают в условия анаэробной атмосферы из трехкомпонентной газовой смеси 80% N2, 10% СО2, 10% Н2, заменяют ватные пробки на резиновые и укупоривают металлической крышкой.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2822476C1 true RU2822476C1 (ru) | 2024-07-05 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2272837C2 (ru) * | 2004-02-25 | 2006-03-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения Российской Федерации" | Способ получения сухой лиофилизированной биомассы лакто- и бифидобактерий |
| RU2535984C2 (ru) * | 2013-01-10 | 2014-12-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации" (ГБОУ ВПО УГМА Минздрава России) | Способ длительного хранения прихотливых бактерий в консервированной цельной донорской крови путем замораживания |
| CN103937725B (zh) * | 2014-04-25 | 2016-08-24 | 陕西科技大学 | 一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法 |
| RU2600883C1 (ru) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "КАНЦЕРНЕТ" | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации |
| RU2661117C1 (ru) * | 2017-05-31 | 2018-07-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2272837C2 (ru) * | 2004-02-25 | 2006-03-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения Российской Федерации" | Способ получения сухой лиофилизированной биомассы лакто- и бифидобактерий |
| RU2535984C2 (ru) * | 2013-01-10 | 2014-12-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации" (ГБОУ ВПО УГМА Минздрава России) | Способ длительного хранения прихотливых бактерий в консервированной цельной донорской крови путем замораживания |
| CN103937725B (zh) * | 2014-04-25 | 2016-08-24 | 陕西科技大学 | 一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法 |
| RU2600883C1 (ru) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "КАНЦЕРНЕТ" | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации |
| RU2661117C1 (ru) * | 2017-05-31 | 2018-07-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| В.А. Шмыленко и др. Методические подходы к решению проблемы сохранения прихотливых микроорганизмов, Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии, N34, 2018 г, с. 78-82. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Uzunova-Doneva et al. | Anabiosis and conservation of microorganisms | |
| US4672037A (en) | Method of culturing freeze-dried microorganisms | |
| US6610531B1 (en) | Viable dried bacteria produced by drying in the presence of trehalose and divalent cation | |
| Mahony et al. | Stable L-forms of Clostridium perfringens and their growth on glass surfaces | |
| EA004131B1 (ru) | Способ сохранения вирусов и микоплазмы | |
| Yang et al. | Collapse temperature of solutions important for lyopreservation of living cells at ambient temperature | |
| CN108102982A (zh) | 麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂及其保藏方法 | |
| US4879239A (en) | Method of culturing freeze-dried microorganisms and resultant preparation | |
| CN109182129B (zh) | 一种细菌保护剂及其应用 | |
| Coriell et al. | Historical development of cell and tissue culture freezing | |
| CN111286469B (zh) | 一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法 | |
| RU2822476C1 (ru) | Способ длительного сохранения (консервирования) облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния | |
| US20140193456A1 (en) | Method for Drying-Conservation of Natural Substances | |
| Acker et al. | Engineering desiccation tolerance in mammalian cells: tools and techniques | |
| RU2737321C1 (ru) | Способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур с использованием составной среды для заморозки | |
| RU2661117C1 (ru) | Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов | |
| NO117986B (ru) | ||
| US20030044965A1 (en) | Long term preservation and storage of viable dried bacteria | |
| Malik | Preservation of unicellular gree algae by a liquid-drying method | |
| Boianovskyi et al. | Effectiveness of nutrient media for the recovery of lyophilisates of fastidious microorganisms: evidence from Streptococcus spp. | |
| RU2726299C1 (ru) | Защитная среда для криохранения для анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в фекальной микробиоте | |
| Moon et al. | Progression of epiphytic microflora in wheat and alfalfa silages as observed by scanning electron microscopy | |
| SU1671682A1 (ru) | Способ хранени микроорганизмов | |
| Sherman et al. | Ageing without reproduction and the viability of young bacterial cells at low temperatures | |
| RU2650786C1 (ru) | Способ криоконсервации клеток цианобактерий |