RU2650786C1 - Способ криоконсервации клеток цианобактерий - Google Patents
Способ криоконсервации клеток цианобактерий Download PDFInfo
- Publication number
- RU2650786C1 RU2650786C1 RU2017132385A RU2017132385A RU2650786C1 RU 2650786 C1 RU2650786 C1 RU 2650786C1 RU 2017132385 A RU2017132385 A RU 2017132385A RU 2017132385 A RU2017132385 A RU 2017132385A RU 2650786 C1 RU2650786 C1 RU 2650786C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- freezing
- carried out
- cyanobacteria
- cryopreservation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 241001464430 Cyanobacterium Species 0.000 title 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 17
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims abstract description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000530636 Spirulina subsalsa Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 1
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 1
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- -1 essential ones Chemical class 0.000 description 1
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 1
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000007539 photo-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологиям. Способ криоконсервации клеток цианобактерий предусматривает приготовление специфичной питательной среды для выращивания конкретного фототропного микроорганизма, выращивание его на этой питательной среде. Для выращивания клеток цианобактерий - Spirulina subsalsa используют питательную среду Заррука, на которой осуществляют размножение клеток цианобактерий в течение 25 суток с последующим суспендированием выращенных клеток до концентрации биомассы 0,6±0,12 г с помощью 100% изопропилового спирта. Замораживание осуществляют в присутствии 10% стерильного раствора глюкозы. Полученную суспензию объемом 0,5-0,7 см3 выдерживают 25 минут в темноте при постоянном перемешивании со скоростью 20 об/мин и помещают в криофлаконы. Криофлаконы с клетками цианобактерий помещают в предварительно охлажденный до 4°С полимерный контейнер для замораживания. Процесс замораживания осуществляют со скоростью охлаждения -1°С в минуту до достижения -80°С и выдерживают в течение пяти часов. Изобретение позволяет повысить выживаемость цианобактерий в процессе их замораживания-оттаивания. 3 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологиям и предназначено для хранения клеток цианобактерий в замороженном состоянии, обеспечивающем в наибольшей степени длительное сохранение ими жизнеспособности и пролиферативной способности.
Известен метод лиофилизации, который заключается в высушивании культур под вакуумом при низких температурах (-20°С, -40°С). Лиофилизированные культуры могут храниться при пониженных температурах в течение длительного времени без доступа кислорода, влаги и света (Corbett, Parker 1976). Лиофилизация обеспечивает для широкого круга микроорганизмов большую стабильность, чем общеизвестные способы высушивания и периодических пересевов. Этот метод удобен для практических целей, т.к. дает возможность иметь большое число ампул каждой культуры (Kordowska-Wiater, 
etc. 2011). Однако титр жизнеспособных клеток микроорганизмов в результате лиофилизации часто оказывается низким и довольно быстро падает при хранении даже при 4°С. Кроме того, многие неспорообразующие микроорганизмы не переносят обычно используемые режимы лиофилизации. Установлено также, что процесс лиофилизации приводит к отбору наиболее устойчивых клеток в культуре, которые могут и не обладать желаемыми свойствами.
Используется также метод низкотемпературного замораживания на носителях, что позволяет увеличить срок хранения микроорганизмов до 5 и более лет (Pasch,2000), а также способ длительного хранения микроорганизмов при температурах от -20 до -130°С с сохранением высокого титра клеток. Однако в коллекциях микроорганизмов, в том числе международных, последний прием используется как один из этапов лиофилизации культур.
Таким образом, традиционные способы сохранения культур цианобактерий с использованием процедуры последовательного пересева субкультур не способны обеспечить долговременное сохранение этих штаммов ввиду трудоемкости, высоких рисков загрязнения по причине человеческого фактора, генетического дрейфа и мутаций, что приводит к потере исследовательских видов. В данной ситуации вполне реальным представляется долговременное хранение цианобактерий путем низкотемпературного консервирования, что позволяет обойти проблемы, связанные с содержанием коллекции культур. Несомненным преимуществом низкотемпературного консервирования является использование температур существенно выше температуры жидкого азота, позволяющих применять более простое и дешевое оборудование.
Известен способ долгосрочного хранения фототропных микроорганизмов с помощью криоконсервации. Этот способ осуществляется путем замораживания клеток в различных условиях с последующим их хранением в замороженном состоянии. Но при быстром охлаждении вода не успевает покинуть клетку и образовавшиеся внутриклеточные кристаллы льда способны нарушить целостность мембран и цитоскелета. Тодрин, А.Ф. «Теплофизические свойства криопротекторов». А.Ф. Тодрин, Л.И. Попивненко, С.Е. Коваленко // Проблемы криобиологии. - 2009. -Т. 19, №2. - С. 163-176. (Day, 2007; Тодрин, 2009). Происходит увеличение объема мембранных структур, что, в свою очередь, приводит к лизису клетки после размораживания (Volk, 2006). Известны работы по криоконсервации Spirulina platensis с использованием в качестве криопротектора аминокислот (0,1-5,0%) и альбумина яичного белка (2-4%), гуммиарабика (2-10%), желатины (2-10%), гидролизата казеина (2-4%) (Takano, Sado and etc., 1973), глицерина (5 и 10%), телячьей сыворотки (10%) (Day, 2007; Motham, 2012). Имеются данные о том, что использование в качестве криопротекторов глицерина (Muhling, 2000), сахарозы и лактозы (Takano, Sado and etc., 1973) не способствовали успешной криоконсервации.
Известен «Способ культивирования термофильных цианобактерий», включающий насыщение субстрата углекислотой, регулирование освещенности, температуры и химического состава субстрата, при этом регулирование температуры и химического состава субстрата осуществляют путем подачи термальных вод природных источников при обеспечении ее проточности.
Патент РФ на изобретение №2292389, МКИ: C12N 1/12; опубл. 2007.01.27. Известен «Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации», включающий получение стабилизированных микробных суспензий из нативных концентрированных культур штаммов бледных трепонем путем добавления сахарозо-глицериновой криозащитной среды с последующим замораживанием и хранением стабилизированных микробных суспензий при температуре минус 40±2°С.
Патент РФ на изобретение №2600883, МКИ: C12N 1/04; опубл. 2015.04.24.
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является «Способ криоконсервации клеток фототропных микроорганизмов», включающий суспензирование биомассы клеток до концентрации 15-30 мас. % в растворе поливинилового спирта с концентрацией 6-9 мас. %, приготовленном на питательной среде, специфичной для выращивания конкретного фототропного микроорганизма, замораживание и хранение аликвот полученной суспензии объемом 0,1-0,5 см3 при температуре -80°С.
Патент РФ на изобретение №2508397, MKИ: C12N 01/04, опубл. 2014.02.27.
Задачей настоящего изобретения является расширение функциональных возможностей криоконсервации культуры цианобактерий.
К техническому результату относится повышение эффективности сохранения культуры цианобактерий без нарушения их биотехнологических свойств путем криоконсервации с использованием 10% раствора глюкозы в качестве проникающего криопротектора.
Технический результат достигается путем того, что способ криоконсервации клеток цианобактерий включает приготовление питательной среды, специфичной для выращивания конкретного фототропного микроорганизма, выращивание его на этой питательной среде. Затем суспендирование биомассы клеток в растворе поливинилового спирта, замораживание и хранение аликвот полученной суспензии при температуре -80°С. При этом для выращивания клеток цианобактерий используют питательную среду Заррука, на которой осуществляют размножение клеток цианобактерий рода Spirulina subsalsa в течение 25 суток. Суспендирование выращенных клеток до концентрации биомассы 0,6±0,12 г (см. таблицу 1) проводят с помощью 100% изопропилового спирта. При этом замораживание осуществляют в присутствии 10% стерильного раствора глюкозы, а полученную суспензию объемом 0,5-0,7 см3 выдерживают 25 минут в темноте при постоянном перемешивании на ротаторе со скоростью 20 об/мин. Затем криофлаконы с клетками цианобактерий рода Spirulina subsalsa помещают в предварительно охлажденный до 4°С полимерный контейнер для замораживания. Процесс замораживания осуществляют со скоростью охлаждения -1°С в минуту до достижения -80°С и выдерживают в течение пяти часов.
Пример конкретного выполнения способа криоконсервации цианобактерий: для выращивания клеток фототропного микроорганизма используют питательную среду Заррука, на которой осуществляют размножение Spirulina subsalsa в течение 25 суток. Затем биомассу цианобактерий Spirulina subsalsa смешивали со стерильным 10% раствором глюкозы и выдерживали 20-25 минут в темноте при постоянном перемешивании на ротаторе со скоростью 20 об/мин. После инкубирования с криопротектором в темноте криофлаконы с Spirulina subsalsa помещали в полимерный контейнер для замораживания, который был предварительно охлажден до 4±0,1°С в течение минимум 5-ти часов со скоростью охлаждения -1°С в минуту.
Для размораживания криофлаконы с Spirulina subsalsa извлекали из морозильной камеры и переносили на водяную баню с температурой воды 37±0,2°С, где выдерживали до исчезновения льда. После размораживания Spirulina subsalsa в стерильных условиях удаляли из криофлакона и переносили в стерильную питательную среды Заррука. Для предотвращения фотоокисления цианобактерий культивировали в течение первых 40 минут при комнатной температуре в темноте. Последующее культивирование проводили в течение 2 часов при освещении 10-12 мкмоль фотонов/(м2с). Выживаемость клеток Spirulina subsalsa после размораживания составляет 90-95% и сохраняется на этом уровне в течение не менее 6 месяцев. Величина биомассы в конце ростового цикла и удельная скорость роста(μ) также соответствуют параметрам исходной культуры (табл. 1). Хранение более 6 месяцев несколько снижает скорость роста, однако Spirulina subsalsa и в этом случае пригодна для дальнейшего выращивания с сохранением биосинтеза основных технологических продуктов (табл. 2 и 3). Остальные примеры приведены в таблицах 1, 2 и 3. Анализ данных, сведенных в таблицы 1, 2 и 3, показал оптимальность предложенного в качестве изобретения способа криоконсервации клеток цианобактерий.
Предлагаемый способ позволяет эффективно сохранять культуры цианобактерий без нарушения биотехнологических свойств, что представляет коммерческий интерес, так как Spirulina subsalsa характеризуется уникальным сочетанием биологически активных соединений, таких как провитамин А, витамины группы В (B1, В2, В6, В12), С, Е, полиненасыщенные жирные кислоты (с высоким содержанием гамма-линоленовой кислоты), каротиноиды, хлорофилл и фикоцианин, низкомолекулярные протеины, полисахариды, макро- и микроэлементы (фосфор, кальций, калий, магний, цинк, железо, марганец), а также минеральные соли, аминокислоты, в том числе незаменимые, а также позволяет увеличить выживаемость клеток различных фототрофных микроорганизмов в процессе их замораживания-оттаивания до 90-95% в течение не менее 6 месяцев с сохранением биотехнологических свойств, т.е. способности синтезировать биологически активные вещества.
Claims (1)
- Способ криоконсервации клеток цианобактерий, включающий приготовление питательной среды, специфичной для выращивания конкретного фототропного микроорганизма, выращивание его на этой питательной среде, суспендирование биомассы клеток в растворе криопротектора, замораживание и хранение аликвот полученной суспензии при температуре -80°C, отличающийся тем, что для выращивания клеток цианобактерий используют питательную среду Заррука, на которой осуществляют размножение клеток цианобактерий рода Spirulina subsalsa в течение 25 суток, а суспендирование выращенных клеток до концентрации биомассы 0,6±0,12 г проводят с помощью 100% изопропилового спирта, при этом замораживание осуществляют в присутствии 10% стерильного раствора глюкозы, а полученную суспензию объемом 0,5-0,7 см3 выдерживают 25 минут в темноте при постоянном перемешивании на ротаторе со скоростью 20 об/мин, затем криофлаконы с клетками цианобактерий рода Spirulina subsalsa помещают в предварительно охлажденный до 4°C полимерный контейнер для замораживания, процесс замораживания осуществляют со скоростью охлаждения -1°C в минуту до достижения -80°C и выдерживают в течение пяти часов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017132385A RU2650786C1 (ru) | 2017-09-15 | 2017-09-15 | Способ криоконсервации клеток цианобактерий |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017132385A RU2650786C1 (ru) | 2017-09-15 | 2017-09-15 | Способ криоконсервации клеток цианобактерий |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2650786C1 true RU2650786C1 (ru) | 2018-04-17 |
Family
ID=61977079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017132385A RU2650786C1 (ru) | 2017-09-15 | 2017-09-15 | Способ криоконсервации клеток цианобактерий |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2650786C1 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2236466C2 (ru) * | 2002-11-25 | 2004-09-20 | Государственное унитарное предприятие Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства | Способ подбора криопротекторов для криоконсервации биологических образцов (варианты) |
| RU2292388C1 (ru) * | 2005-06-06 | 2007-01-27 | Федеральное государственное учреждение "Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГУ "ЦНИКВИ Росздрава") | Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем |
| RU2508397C1 (ru) * | 2012-10-04 | 2014-02-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Биохимической Физики Им. Н.М. Эмануэля Российской Академии Наук (Ибхф Ран) | Способ криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов |
| RU2600883C1 (ru) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "КАНЦЕРНЕТ" | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации |
-
2017
- 2017-09-15 RU RU2017132385A patent/RU2650786C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2236466C2 (ru) * | 2002-11-25 | 2004-09-20 | Государственное унитарное предприятие Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства | Способ подбора криопротекторов для криоконсервации биологических образцов (варианты) |
| RU2292388C1 (ru) * | 2005-06-06 | 2007-01-27 | Федеральное государственное учреждение "Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГУ "ЦНИКВИ Росздрава") | Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем |
| RU2508397C1 (ru) * | 2012-10-04 | 2014-02-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Биохимической Физики Им. Н.М. Эмануэля Российской Академии Наук (Ибхф Ран) | Способ криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов |
| RU2600883C1 (ru) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "КАНЦЕРНЕТ" | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hunt | Cryopreservation: vitrification and controlled rate cooling | |
| CN106755250B (zh) | 一种雨生红球藻绿色细胞保藏以及虾青素诱导的规模化生产方法 | |
| Ben-Amotz et al. | Cryopreservation of marine unicellular algae. I. A survey of algae with regard to size, culture age, photosynthetic activity and chlorophyll-to-cell ratio | |
| US6610531B1 (en) | Viable dried bacteria produced by drying in the presence of trehalose and divalent cation | |
| US4672037A (en) | Method of culturing freeze-dried microorganisms | |
| CN104145943A (zh) | 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用 | |
| CN108102982A (zh) | 麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂及其保藏方法 | |
| US4879239A (en) | Method of culturing freeze-dried microorganisms and resultant preparation | |
| CN107325971A (zh) | 一种淡水微藻常温液态保存配方和制作方法 | |
| RU2650786C1 (ru) | Способ криоконсервации клеток цианобактерий | |
| Saks | The preservation of salt marsh algae by controlled liquid nitrogen freezing | |
| Kuwano et al. | Cryopreservation of the conchocelis of the marine alga Porphyra yezoensis Ueda (Rhodophyta) in liquid nitrogen | |
| RU2522811C2 (ru) | СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СИМБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ РОДА Xenorhabdus, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НЕМАТОД ВИДА Steinernema feltiae protense, К ХРАНЕНИЮ | |
| CN107058110B (zh) | 一种雨生红球藻细胞的保存及复苏方法 | |
| Aizdaicher et al. | The development of Porphyridium purpureum (Bory de Saint-Vincent) Drew et Ross, 1965 (Rhodophyta) from Amursky Bay, sea of Japan, in a laboratory culture | |
| CN116254184A (zh) | 沙漠小球藻冷冻保存的方法 | |
| Motham et al. | High subzero temperature preservation of spirulina platensis (Arthrospira fusiformis) and its ultrastucture | |
| RU2508397C1 (ru) | Способ криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов | |
| CN107254446A (zh) | 一种人原代肿瘤细胞的分离制备方法 | |
| Morichi | Preservation of lactic acid bacteria by freeze-drying | |
| US20030044965A1 (en) | Long term preservation and storage of viable dried bacteria | |
| Hong et al. | A Modified Cryopreservation Method of Psychrophilic Chlorophyta Pyramimonas sp. from Antarctica | |
| CN103103143A (zh) | 一种硝化菌保藏方法 | |
| RU2822476C1 (ru) | Способ длительного сохранения (консервирования) облигатно анаэробных бактерий высушиванием из замороженного состояния | |
| RU2160992C1 (ru) | Сухой биопрепарат и способ его получения |