PT2267024E - Produção de proteína de ligação a il-18 recombinante - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PRODUÇÃO DE PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A IL-18 RECOMBINANTE"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção situa-se no campo da produção de proteínas. Mais especificamente, refere-se a um processo para a produção de proteína de ligação a IL-18 recombinante (IL-18BP). A divulgação refere-se ainda a uma composição de IL-18BP caracterizada por um perfil de glicosilação específico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As proteínas tornaram-se comercialmente importantes como fármacos que também são geralmente designados como "produtos biológicos". Um dos maiores desafios é o desenvolvimento de processos rentáveis e eficazes para a produção de proteínas recombinantes à escala comercial. A indústria de biotecnologia faz uma utilização exaustiva de células de mamífero para o fabrico de glicoproteínas recombinantes para terapia humana.

Hoje em dia, as culturas descontínua alimentada e em perfusão são os dois modos dominantes de operação industrial para os processos de cultura de células de mamífero que requerem grandes quantidades de proteínas (Hu e Aunins 1997). Qualquer que seja a tecnologia de produção escolhida, os esforços de desenvolvimento têm como objetivo obter processos de produção que garantam alta produtividade volumétrica, consistência de lote para lote, qualidade de produto homogénea a baixo custo. 2 A decisão entre o modo de produção descontínua alimentada ou em perfusão é principalmente ditada pela biologia do clone e pela propriedade do produto e é feita numa base caso a caso durante o decorrer do desenvolvimento de um novo produto farmacológico (Kadouri e Spier 1997).

Quando a escolha é um processo em perfusão, um dos sistema de cultura de eleição é um biorreator de leito fixo estacionário no qual as células são imobilizadas em veículos sólidos. Este sistema é fácil de operar e com veículos e condições de cultura apropriados pode ser conseguida uma densidade celular muito alta (de ~ 107-108 células-mL-1) .

Uma consequência desta densidade celular alta é a necessidade de uma velocidade de perfusão do meio intensa (alimentação e colheita) que deveria ser utilizada para manter as células viáveis e produtivas. Torna-se evidente que a velocidade de perfusão é um dos parâmetros centrais de um processo desse tipo: ela condiciona a produtividade volumétrica da proteína, a qualidade do produto proteico e tem um impacto muito forte no custo global do processo.

Por conseguinte, à escala industrial o processo de biorreator de leito fixo estacionário ótimo deveria funcionar com uma velocidade de perfusão tão baixa quanto possível sem comprometer a quantidade e qualidade do produto.

No decorrer da redução da velocidade de perfusão foram realizados vários estudos nos quais a concentração de glucose (Wang et al. 2002) (Dowd et al. 2001) é utilizada como um indicador do nível dos outros nutrientes no meio de alimentação para operar o biorreator a uma velocidade de 3 perfusão baixa sem acumular na cultura níveis elevados de produtos secundários tóxicos tais como o lactato e a amónia (Sugiura e Kakuzaki 1998) (Racher et al. 1993). A modificação de parâmetros de cultura como o pH ou temperatura (Chuppa et al. 1997) também é uma estratégia comum para otimizar condições de cultura e reduzir a necessidade de perfusão do meio. A fim de conseguir uma velocidade de perfusão do meio ótima, podem ser consideradas três abordagens: a) Fixar a velocidade de perfusão a um valor constante durante toda a série de produção. Esta abordagem é geralmente preferida em processos de produção industrial, uma vez gue é mais fácil de operar de uma maneira robusta e consistente. Também tem a vantagem de definir os custos do meio do processo já gue não há gualquer variação na velocidade de perfusão de série para série. b) Ajustar a velocidade de perfusão em resposta ao número de células e/ou consumo de nutrientes tais como glucose (Oh et al. 1994) (Dowd et al. 2001) (Gorenflo et al. 2003), glutamina (Gorenflo et al. 2002) ou oxigénio (Kyung et al. 1994) . Embora esta abordagem proporcione uma base racional mais científica para ajustar a velocidade de perfusão, pode levar a uma cultura excessivamente populada e um aumento "fora de controlo" da velocidade de perfusão. Quando as células são cultivadas no modo de suspensão, é efetuado um "sangramento da cultura" para evitar o crescimento excessivo da cultura, mas isto não é possível quando as células estão imobilizadas num veículo. Assim, em geral, esta abordagem não é preferida para operações de fabrico já que é difícil de operar de uma maneira robusta e 4 consistente e a velocidade de perfusão do meio precisa de ser reajustada numa base diária. c) Combinar ambas as estratégias a) e b) com uma fase de propagação celular inicial (ou "fase de crescimento") em que a velocidade de perfusão é progressivamente aumentada de acordo com os requisitos de crescimento das células durante a fase de crescimento seguida de uma mudança das condições de cultura tais como temperatura e/ou pH para estabilizar e manter o metabolismo celular a um nivel relativamente baixo e constante. Nesta fase, a velocidade de perfusão pode ser reduzida para um valor fixo, condizente com a necessidade reduzida das células ao longo da fase de produção.

Sabe-se que a modificação da velocidade de perfusão durante um processo em perfusão, bem como a modificação de outros fatores do bioprocesso, pode influenciar a qualidade da proteina recombinante e em particular o seu padrão de glicosilação (Jenkins et al. 1996) (Andersen et al. 2000). A glicosilação é geralmente reconhecida como uma função importante na solubilidade, imunogenicidade e propriedades farmacocinéticas de glicoproteinas humanas e estes são parâmetros chave na segurança e eficácia clinica de um produto (Goochee et al. 1991). Em particular, a glicosilação afeta a dobragem e secreção de muitas glicoproteinas, bem como a sua semivida no plasma, possuindo deste modo um impacto importante na biologia e atividade in vivo de proteínas glicosiladas.

Em geral, o termo "glicosilação" de uma proteína refere-se à formação da ligação açúcar-aminoácido. A glicosilação é um evento crucial na biossíntese das unidades de hidrato de carbono de glicoproteinas (segregadas). Coloca em movimento 5 uma série complexa de passos enzimáticos pós-tradução que levam à formação de um grande número de oligossacáridos ligados a proteína com diversas funções biológicas.

As glicoproteínas de mamífero contêm geralmente três tipos de glicanos constituintes; os glicanos ligados por N os quais estão ligados a asparagina via um resíduo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) num motivo Asn-Xxx-(Ser, Thr) , em que Xxx pode ser qualquer aminoácido exceto prolina, aqueles ligados a serina ou treonina, referidos como glicanos ligados por O e as componentes de hidrato de carbono de glicosilfosfatidilinositol. Embora sejam possíveis muitas variações, as antenas de glicanos maduros consistem geralmente de uma ou mais unidades de IV-acetil-lactosamina com as cadeias a terminar em ácido siálico ou galactose ligada em posição a. É frequentemente encontrada fucose ligada ao resíduo de GlcNAc ligado a asparagina e, frequentemente, de modo adicional nas antenas. Outras modificações comuns à estrutura básica incluem um resíduo de GlcNAc ligado na posição 4 do resíduo de manose de ramificação central, referido como um resíduo de GlcNAc "bissetor" e grupos sulfato que podem ser encontrados numa variedade de localizações, tanto no núcleo como nas antenas. A biossíntese destes compostos envolve a ligação à asparagina de um glicano contendo o núcleo de trimanosil-quitobiose em conjunto com mais seis resíduos de manose e três de glucose seguida da remoção da glucose e de quatro resíduos de manose. Várias outras glicosil-transferases e glicosidases convertem em seguida a estrutura de (GlcNAc)2(Man)5 no glicano maduro. Este processo resulta em três tipos gerais de glicano ligado por N dependendo da extensão do processamento; os glicanos com "alto teor de 6 manose" nos quais reside apenas manose nas duas antenas, os "glicanos híbridos" nos quais uma antena está convertida e os glicanos "complexos" em que são modificadas ambas as antenas. Os glicanos ligados por 0, por outro lado, são muito mais diversos, variando desde os monossacáridos até polissacáridos sulfatados grandes sem estrutura central comum ou sequência consenso de aminoácidos no sítio de ligação (Harvey, 2001).

Uma tal proteína glicosilada de interesse terapêutico é a proteína de ligação a interleucina-18. A proteína de ligação a interleucina-18 (IL-18BP) é uma proteína solúvel natural que foi inicialmente purificada por afinidade, numa coluna de IL-18, a partir de urina (Novick et al. 1999). A IL-18BP anula a indução de IFN-γ pela IL-18 e a ativação de NF-κΒ pela IL-18 in vitro. Além disso, a IL-18BP inibe a indução de IFN-γ em ratinhos injetados com LPS. O gene da IL-18BP foi circunscrito ao cromossoma 11 humano, e não pôde ser encontrado qualquer exão que codifique um domínio transmembranar na sequência genómica de 8,3 kb compreendendo o gene da IL-18BP. Até à data foram encontradas quatro isoformas de IL-18BP geradas por excisão-união alternativa de ARNm em humanos. Estas foram designadas por IL-18BP a, b, c e d, partilhando todas da mesma extremidade de N e diferindo na extremidade C-terminal (Novick et al 1999). Estas isoformas diferem quanto à sua aptidão para ligar a IL-18 (Kim et al. 2000). Das quatro isoformas humanas da IL-18BP (hIL-18BP), sabe-se que as isoformas a e c têm uma capacidade de neutralização da IL-18. A isoforma mais abundante da IL-18BP, a isoforma a, exibe uma afinidade alta para a IL-18 com uma ativação 7 rápida e desativação lenta, e uma constante de dissociação (Kd) de aproximadamente 0,4 nM (Kim et al. 2000) . A IL-18BP pertence à superfamilia de imunoglobulina.

Os resíduo envolvidos na interação da IL-18 com a IL-18BP foram descritos através da utilização de modulação por computador (Kim et al. 2000) e com base na interação entre a proteína semelhante IL-Ιβ com o IL-1R de tipo I (Vigers et al. 1997). A IL-18BP está constitutivamente presente em muitas células (Puren et al. 1999) e circula em humanos saudáveis, representando um fenómeno único na biologia de citocinas. Devido à alta afinidade da IL-18BP para a IL-18 (Kd = 0,4 nM) bem como à alta concentração de IL-18BP encontrada na circulação (excesso molar de 20 vezes em relação à IL-18), tem-se especulado que a maioria, se não todas as moléculas de IL-18 na circulação estão ligadas a IL-18BP. Assim, a IL-18BP na circulação que compete com os recetores da superfície celular para a IL-18 podem atuar com um anti-inflamatório natural e uma molécula imunossupressora. A IL-18BP tem sido sugerida como uma proteína terapêutica num número de doenças e distúrbios, tais como psoríase, doença de Crohn, artrite reumatoide, artrite psoriática, lesão hepática, septicemia, aterosclerose, doenças cardíacas isquémicas, alergias, etc., ver por exemplo, W09909063, W00107480, WO0162285, W00185201, W002060479, WO02096456, W003080104, W002092008, W002101049, WO03013577. A técnica antecedente não descreve um processo para a produção de IL-18BP recombinante em células CHO, nem 8 composições de IL-18BP caracterizadas por um perfil de glicosilação especifico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um processo para a produção de proteína de ligação a Interleucina-18 recombinante (IL-18BP) em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) num biorreator sob condições de cultura isentas de soro compreendendo uma fase de propagação celular a 37°C e uma fase de produção a 29°C.

Foi desenvolvido um processo descontínuo alimentado eficiente para a produção de IL-18BP em células CHO, sob condições de cultura isentas de soro, compreendendo: a. Uma fase de propagação celular a 37°C; b. Opcionalmente, uma fase intermediária a 33°C; c. Uma fase de produção a 29°C.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1: Velocidade de perfusão do meio durante culturas contínuas de células CHO num biorreator de leito fixo de acordo com o exemplo 1, com níveis de perfusão de 2,6 vvd (·) , 2,0 vvd (o) e 1,3 vvd (A). As séries do biorreator foram identificadas como run—100 para 100% de perfusão (·), run-75 para 75% de perfusão (o) e run—50 para 50% de perfusão (A). A velocidade de perfusão máxima de 100% corresponde a 2,6 vvd que foram utilizadas como as condições de referência.

Fig. 2: Perfis de concentração de glucose (A) e lactato (B) durante culturas contínuas de células CHO num biorreator de leito fixo de acordo com o exemplo 1, para velocidades de perfusão do meio de 100% (·) 75% (o) e 50% (A). 9

Fig. 3: Perfil de Velocidade de Consumo de Glucose (GCR) durante culturas continuas de células CHO num biorreator de leito fixo de acordo com o exemplo 1, para velocidades de perfusão do meio de 100% (·) 75% (o) e 50% (A) . A GCR é exprimida em grama de glucose consumida por dia e por kg de veiculo Fibra-Cel.

Fig. 4: Perfil de velocidade de conversão molar aparente de glucose em lactato durante culturas continuas de células CHO num biorreator de leito fixo de acordo com o exemplo 1, para velocidades de perfusão do meio de 100% (·) 75% (o) e 50% (A).

Fig. 5: Dados de produtividade normalizados (A) produtividade volumétrica em unidades de produto por volume total de cultura por dia, (B) produto acumulado em unidades de produto, (C) titulo em unidades de produto por volume total de cultura, para a r-IL-18BP que é produzida durante culturas continuas de células CHO num biorreator de leito fixo de acordo com o exemplo 1, para velocidades de perfusão do meio de 100% (·) 75% (o) e 50% (A) . Para normalizar os dados, o valor médio obtido a 100% de velocidade de perfusão ao longo da fase de produção de 60 dias foi tomado como 100% de produtividade (linha ponteada).

Fig. 6: Mapeamento da sialilação de N-glicano (perfis de RP-HPLC) em amostras de intermediário a granel no dia de produção 47-48 do run-50, run-75 e run-100.

Fig. 7: Desempenho de processo do processo descontinuo alimentado de acordo com o exemplo 2 em termos de (A) 10 densidade celular total, (B) viabilidade, (C) concentração residual de glucose e (D) titulo de r-hIL-18BP.

Fig. 8: Mapeamento da sialilação de N-glicano (perfis de RP-HPLC) em IL-18BP purificada preparada num processo em perfusão (painel superior) ou processo descontinuo alimentado (painel inferior).

Fig. 9: Comparação dos perfis de Eletroforese de Zona Capilar (CZE) obtidos a partir de duas sequências analíticas separadas, para: uma amostra colhida em bruto (pré-tratada) do processo descontínuo alimentado (cimo) e uma amostra colhida (pré-tratada) do processo em perfusão (fundo).

Fig-10: Distribuição de isoformas (dadas como % de todas as formas da molécula alvo) por Eletroforese de Zona Capilar (CZE) em amostras colhidas em bruto pré-tratadas (ponteado e cinzento) e amostras purificadas (sombreado e preto) de IL-18BP para as séries de perfusão (ponteado e sombreado) e séries descontínuas alimentadas (cinzento e preto). As barras de erro correspondem a ±10% de variabilidade do método de CZE.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se no desenvolvimento de processos eficientes para a produção de IL-18BP recombinante num biorreator sob condições de cultura de células isentas de soro. Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um processo de produção de proteína de ligação a interleucina-18 recombinante (IL-18BP) em células CHO num biorreator sob condições de cultura isentas de soro compreendendo uma fase de propagação celular a 37°C e uma fase de produção a 29°C. 11

Qualquer temperatura entre aproximadamente 29 até aproximadamente 34°C será adequada no contexto da presente divulgação tal como, por exemplo, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 30,5, 31, 31,5, 32, 32,5, 33, 33,5, 34, 34,5, 35°C. É divulgado um processo em perfusão para produzir proteína de ligação a interleucina-18 recombinante (IL-18BP) em células de mamífero num biorreator sob condições de cultura isentas de soro compreendendo: a) Uma fase de propagação celular a 37 °C com uma dada velocidade de perfusão (100%); b) Uma fase de produção I a 33,5°C a uma velocidade de perfusão que vai desde cerca de 85 até cerca de 65% ou cerca de 80 até cerca de 70% ou cerca de 75 % da velocidade de perfusão da velocidade de perfusão do passo (a); c) Uma fase de produção II a 32,5°C a uma velocidade de perfusão que vai desde cerca de 85 até cerca de 65% ou cerca de 80 até cerca de 70% ou cerca de 75 % da velocidade de perfusão da velocidade de perfusão do passo (a). O especialista na técnica compreenderá que a velocidade de perfusão da fase de produção (quer da I, quer da II ou de ambas) pode ser, por exemplo, a cerca de 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66 ou 65, ou 64 % da velocidade de perfusão inicial no passo (a).

Como se mostra nos exemplos abaixo, constatou-se surpreendentemente que apesar da velocidade de perfusão 12 reduzida, a produtividade celular de IL-18BP era substancialmente conservada. 0 especialista na técnica também compreenderá que a temperatura pode variar dentro de certos limites, de modo a ser, por exemplo, de cerca de 37,5 °C no passo (a) ou 34-33 °C no passo (b) ou 32-33 °C no passo (c).

Tipicamente, a concentração de Oxigénio Dissolvido (DO) de uma cultura de células é mantida a cerca de 50 a 70% de saturação de ar e os valores de pH variam entre 6,5 e 7,5, de um modo preferido a cerca de 7,0. O termo "biorreator", como aqui utilizado, refere-se a um equipamento ou recipiente fechado que é utilizado para gerar biomoléculas tais como proteínas segregadas utilizando a capacidade de conversão sintética ou química de uma célula. Os biorreatores incluem fermentadores clássicos e sistemas de cultura de células em perfusão. Os biorreatores permitem controlar vários parâmetros durante o processo de cultura de células tais como, por exemplo, o caudal da ansa de circulação, a temperatura, a sobrepressão e/ou a velocidade de perfusão do meio.

O termo "meio isento de soro", como aqui utilizado, refere-se a qualquer meio que esteja isento de componentes derivados de soro animal tais como, por exemplo, soro fetal de vitelo. Exemplos de meios isentos de soro comercialmente disponíveis que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, SFM 90 (JRH, 67350), SFM 90.1 (JRH, 67350), Supmed300 ou Supmed300 modificado (JRH, 67350), DMEM (Gibco, 7490571), DMEM/F12 (Gibco, 99.5043), SFM CHO 3a (BioWhittaker), CHO PFM (Sigma, C6970), ProCHO 5, meios EX-CELL tais como EX-CELL 13 302 (JRH, N° de Catálogo 14312-1000M) ou EX-CELL 325 (JRH,

N° de Catálogo 14335-1000M), CHO-CD3 (Sigma, N° de Catálogo C-1490), CHO III PFM (Gibco, N° de Catálogo 96-0334SA) , CHO-S-SFM II (Gibco, N° de Catálogo 12052-098), CHO-DHFR (Sigma, N° de Catálogo C-8862), ProCHO 5 (Cambrex, N° de Catálogo BE12-766Q), SFM4CHO (HyClone, N° de Catálogo SH30549.01), Ultra CHO (Cambrex, N° de Catálogo 12-724Q), HyQ PF CHO (HyClone, N° de Catálogo SH30220.01), HyQ SFX CHO (HyClone, N° de Catálogo SH30187.01), HyQ CDM4CHO

(HyClone, N° de Catálogo SH30558.01), IS CHO-CD (Irvine Scientific, N° de Catálogo #91119), IS CHO-V (Irvine Scientific, N° de Catálogo #9197) e seus derivados. A composição de SFM 90, SFM 90.1, SupMed300, DMEM, DMEM/F12, SFM CHO 3a e CHP PFM é mostrada na Tabela I abaixo. O meio isento de soro pode ser preferencialmente um meio quimicamente definido, isto é, um meio preparado a partir de ingredientes purificados e cuja composição exata é consequentemente conhecida. Especificamente, os meios quimicamente definidos não contêm componentes de origem animal nem hidrolisados indefinidos.

De acordo com o processo em perfusão da invenção, numa forma de realização preferida a velocidade de perfusão do passo (a) tem uma taxa de diluição na gama de cerca de 2 a 3 vvd, preferencialmente de cerca de 2,5 vvd. O termo "taxa de diluição", como aqui definido, refere-se à taxa de diluição D exprimida em vvd, calculada como litros de meio por litro do volume total do sistema de trabalho por dia (volume total=volume do leito fixo + tanque de condicionamento). 14 0 especialista na técnica compreenderá que a velocidade de perfusão do passo (a) pode ser, por exemplo, cerca de 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0 ou 3,1 vvd.

Velocidades de perfusão inicial de cerca de 2,6 ou 2,5 ou 2,75 vvd demonstraram ser particularmente vantajosas. A duração da fase de propagação celular do passo (a) , da fase de produção I do passo (b) e da fase de produção II do passo (c) será facilmente determinada pelo especialista na técnica com base em parâmetros tais como a carga inicial de células, o tipo de células utilizado, a velocidade de consumo de glucose medida diariamente, a taxa de diluição, e tempo do processo. De acordo com a presente invenção, prefere-se que as células estejam associadas a veículos no biorreator, e que a fase de produção I do passo (b) seja iniciada a uma velocidade de consumo de glucose de cerca de 250 a 350 g de Glucose por quilograma de veículo. O veículo que pode ser utilizado de acordo com os processos da presente invenção pode ser, por exemplo, um microveículo. Os microveículos são partículas sólidas pequenas sobre as quais se podem fazer crescer células em cultura em suspensão. As células são capazes de aderir e propagar na superfície de microveículos. Tipicamente, os microveículos consistem de esferas, cujo diâmetro está compreendido entre 90 ym e 300 ym. Os microveículos podem ser feitos de vários materiais que demonstraram ter sucesso na fixação e propagação de células tais como, por exemplo, vidro, polistireno, polietileno, dextrano, gelatina e celulose. Além disso, a superfície dos microveículos pode ser revestida com um material que promove a fixação e crescimento de células tais como, por exemplo, N,N- 15 dietilaminoetilo, vidro, colagénio ou proteínas recombinantes. Existem microveículos macroporosos e não porosos. As superfícies macroporosas proporcionam às células um acesso fácil ao interior do microveiculo após inoculação, e uma vez no interior do microveiculo, as células estão protegidas das forças de cisalhamento geradas por agitação mecânica e arejamento no biorreator.

Um outro veículo sólido que pode ser utilizado de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um disco de Fibra-Cel®. Os discos de Fibra-Cel® são discos de 6 mm de diâmetro que são constituídos por fibras de poliéster não tecidas ligadas a uma lâmina de malha de polipropileno (ver, por exemplo, Patente U.S. n° 5,266,476 e as páginas da world wide web nbsc.com/products/miscellaneous/fibracel/ e nbsc.com/support/faqs/#fibra). Os discos de Fibra-Cel® são geralmente tratados eletrostaticamente para facilitar a adesão das células em suspensão aos discos e à sua retenção no sistema de fibras, onde permanecem ao longo do processo de cultura. A densidade celular e produtividade conseguidas com células cultivadas em discos de Fibra-Cel® podem ser até dez vezes superiores do que com células cultivadas em microveículos.

As células que expressam IL-18BP, que podem ser cultivadas no biorreator de acordo com os processos aqui divulgados podem ser qualquer célula de mamifero, incluindo células animais ou humanas, tais como por exemplo, células 3T3, células COS, células osteossarcoma humano, células MRC-5, células BHK, células VERO, células CHO, células rCHO-tPA, células rCHO - Antigénio da Superfície de Hep B, células CHO-S, células HEK 293, células rHEK 293, células rC127 -Antigénio da Superfície de Hep B, células de fibroblasto 16 humanas normais, células de Estroma, células de Hepatócitos e células PER.C6. São utilizadas células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) para a expressão de IL-18BP num processo de acordo com a invenção.

Os processos de produção de IL-18BP da invenção compreendem ainda preferencialmente um passo de colheita do sobrenadante da cultura de células (colheita).

Numa outra forma de realização preferida, os processos compreendem ainda um ou mais passos de purificação da IL-18BP. Pode ser utilizado qualquer método adequado para a purificação de IL-18BP tais como, por exemplo, os processos de purificação descritos para IL-18BP na WO 2006/003134 ou W02005/049649. O produto IL-18PB purificado pode ser então preferencialmente formulado numa composição farmacêutica. A divulgação também se refere a uma composição de IL-18BP caracterizada por um perfil de sialilação compreendendo cerca de 15 até cerca de 25%, preferencialmente cerca de 19 até cerca de 21% de N-glicanos não sialilados, cerca de 15 até cerca de 30%, preferencialmente cerca de 20 até cerca de 25% de glicanos monossialilados, cerca de 35 até cerca de 55%, preferencialmente cerca de 39% até cerca de 44% de N-glicanos dissialilados, cerca de 5 até cerca de 15%, preferencialmente cerca de 7 até cerca de 10% de N-glicanos trissialilados e cerca de 1 até cerca de 5%, preferencialmente cerca de 2% até cerca de 3% de N-glicanos tetrassialilados. 17

Uma tal composição de IL-18BP é preferencialmente obtida pelos processos de produção da invenção. A presente divulgação refere-se a um processo descontinuo alimentado para produzir a proteína de ligação a interleucina-18 recombinante (IL-188P) em células CHO num biorreator sob condições de cultura isentas de soro compreendendo os passos de: a. Uma fase de propagação celular a 37°C; b. Opcionalmente, uma fase intermediária a 33°C; c. Uma fase de produção a 29°C. A duração das fases (a) , opcionalmente (b) e (c) pode ser facilmente determinada pelo especialista na técnica. A fase (a) prosseguirá até ter sido gerado um número adequado de células, tal como por exemplo, na gama de 105 até 106. A fase (b) será preferencialmente curta, já que é uma fase transitória que serve para adaptação das células a temperaturas mais baixas.

Numa forma de realização preferida, a densidade celular total na fase de produção varia entre 4 a 8 x 106 células por mL por dia, preferencialmente ao longo de pelo menos 10 dias de cultura de células.

Numa outra forma de realização preferida, a viabilidade varia entre 100 e 80 %, preferencialmente ao longo de pelo menos 10 dias de cultura de células.

Prefere-se ainda que a produtividade proteica seja maior do que cerca de 150 mg ou cerca de 250 mg ou cerca de 350 por I por dia. 18

As células de mamífero a serem utilizadas no contexto do processo da presente invenção são as células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). 0 processo compreende ainda preferencialmente os passos de colheita do sobrenadante da cultura de células e/ou purificação da IL-18BP e/ou formulação da IL-18BP numa composição farmacêutica. A divulgação também se refere a uma composição de IL-18BP possuindo um perfil de glicoformas compreendendo cerca de 0 até cerca de 15 % de glicoformas básicas, cerca de 15 até cerca de 30 % de glicoformas menos ácidas, cerca de 45 até cerca de 65 % de glicoformas ácidas e cerca de 10 até cerca de 25 % de glicoformas muito ácidas. O perfil de glicoformas é caracterizado por meio de eletroforese de zona capilar (CZE), indicando a extensão de glicoformas básicas, menos ácidas, ácidas e muito ácidas da IL-18BP. O método e a definição de glicoformas básicas, menos ácidas, ácidas e muito ácidas podem ser retirados dos exemplos abaixo. O número de carga hipotética Z é um parâmetro calculado de acordo com uma fórmula conhecida (Hermentin et al., 1996, Gervais et al., 2003, ver também os exemplos abaixo) e caracteriza a extensão de sialilação de glicoproteinas. A composição de IL-18BP é caracterizada por um número Z que varia entre cerca de 130 até cerca de 160, preferencialmente entre cerca de 140 e 155, de um modo mais preferido entre cerca de 145 e cerca de 150. Os números Z preferidos para a IL-18BP são, por exemplo, 139, 140, 141, 19 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155 ou 156.

Embora as composições de IL-18BP possam ser produzidas por qualquer processo tal como, por exemplo, processos em perfusão operados com conjuntos de parâmetros diferentes dos aqui descritos, por exemplo, a maiores velocidades de perfusão, as composições de IL-18BP são preferencialmente, produzidas no processo descontinuo alimentado da presente invenção.

De acordo com a presente invenção, a IL-18BP a ser produzida pode ser qualquer IL-18BP de qualquer espécie. Preferencialmente, aquela é a IL-18BP humana.

Uma vez que a IL-18BP é uma proteína segregada, solúvel, ela é libertada para o sobrenadante da cultura de células, quer por meio do seu péptido sinal natural ou por meio de um péptido sinal heterólogo, isto é um péptido sinal derivado de outra proteína segregada que pode ser mais eficiente no sistema de expressão particular utilizado, tal como por exemplo, o péptido sinal GH. O termo "proteína de ligação a IL-18" é aqui utilizado sinonimamente com "IL-18BP". Este termo refere-se a proteínas de ligação a IL-18 como aquelas definidas na WO 99/09063 ou em Novick et al., 1999. O termo IL-18BP inclui variantes de excisão-união e/ou isoformas das proteínas de ligação a IL-18, como aquelas definidas em Kim et al., 2000, em particular as isoformas humanas a e c da IL-18BP. O termo "IL-18PB", como aqui utilizado, inclui ainda proteínas mutadas, derivados funcionais, frações ativas, 20 proteínas fundidas, proteínas circularmente permutadas e sais de IL-18BP como definidos na WO 99/09063.

Como aqui utilizado o termo "proteínas mutadas" refere-se a análogos de uma IL-18BP, ou análogos de uma IL-18BP virai, nos quais um ou mais dos resíduos de aminoácido da IL-18BP natural ou IL-18BP virai estão substituídos por resíduos de aminoácido diferentes, ou estão suprimidos, ou são adicionados um ou mais resíduos de aminoácido à sequência natural de uma IL-18BP, ou uma IL-18BP virai, sem modificar consideravelmente a atividade dos produtos resultantes em comparação com a IL-18BP de tipo selvagem ou IL-18BP virai. Estas proteínas mutadas são preparadas por técnicas de síntese e/ou de mutagénese específica de um locus conhecidas, ou qualquer outra técnica conhecida adequada para esse fim.

As proteínas mutadas incluem proteínas codificadas por um ácido nucleico, tal como ADN ou ARN, que hibridiza com ADN ou ARN, que codifica uma IL-18BP ou codifica uma IL-18BP virai (WO9909063) sob condições estringentes. O termo "condições estringentes" refere-se às condições de hibridização e lavagem subsequente, as quais os técnicos na matéria referem convencionalmente como "estringente". Ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 e 6.4 (1987, 1992). Sem restrição, os exemplos de condições estringentes incluem condições de lavagem 12-20°C abaixo da Tm calculada para o híbrido em estudo, por exemplo, em 2 x SSC e 0,5% SDS durante 5 minutos, 2 x SSC e 0,1% SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC e 0,5% SDS a 37°C durante 30-60 minutos e em seguida, 0,1 x SSC e 0,5% SDS a 68°C durante 30-60 minutos. Os técnicos na matéria compreendem que as condições de estringência também dependem do comprimento das sequências 21 de ADN, sondas oligonucleotídicas (tal como 10-40 bases) ou sondas oligonucleotídicas mistas. Se forem utilizadas sondas mistas, é preferível utilizar cloreto de tetrametilamónio (TMAC) em vez de SSC. Ver Ausubel, supra. A identidade reflete a relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, determinada comparando as sequências. Em geral, a identidade refere-se a uma correspondência exata de nucleótido para nucleótido ou aminoácido para aminoácido nas duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas, respetivamente, ao longo do comprimento das sequências que estão a ser comparadas.

Para sequências em que não há uma correspondência exata pode determinar-se uma "% de identidade". Em geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as sequências. Isto pode incluir a inserção de "lacunas" em uma ou ambas as sequências, para aumentar o grau de alinhamento. A % de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento de cada uma das sequências a serem comparadas (o chamado alinhamento global), que é particularmente adequado para sequências do mesmo comprimento ou de comprimento muito semelhante, ou ao longo de comprimentos mais curtos, definidos (o chamado alinhamento local), que é mais adequado para sequências de comprimento diferente.

Os métodos para comparar a identidade e homologia de duas ou mais sequências são bem conhecidos na técnica. Assim, por exemplo, podem ser utilizados programas disponíveis no Pacote de Análise de Sequência da Wisconsin, versão 9.1 (Devereux J et al., 1984), por exemplo os programas BESTFIT e GAP, para determinar a % de identidade entre dois 22 polinucleótidos e a % de identidade e a % de homologia entre duas sequências polipeptidicas. 0 BESTFIT utiliza o algoritmo de "homologia local" de Smith e Waterman (1981) e encontra a melhor região simples de semelhança entre duas sequências. Na técnica também são conhecidos outros programas para determinar a identidade e/ou semelhança entre sequências, por exemplo a família de programas BLAST (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, acessível através da página principal do NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson W R, 1990).

Qualquer proteína mutada desse tipo tem preferencialmente uma sequência de aminoácidos suficientemente duplicativa daquela de uma IL-18BP, ou suficientemente duplicativa de uma IL-18BP virai, de modo a ter atividade substancialmente semelhante à IL-18BP. Uma atividade da IL-18BP é a sua capacidade de ligação a IL-18. Desde que a proteína mutada possua uma atividade substancial de ligação à IL-18, aquela pode ser utilizada na purificação de IL-18, tal como por meio de cromatografia de afinidade e pode, desse modo, ser considerada como tendo uma atividade substancialmente semelhante à IL-18BP. Assim, pode determinar-se se uma dada proteína mutada tem substancialmente a mesma atividade que a IL-18BP por meio de experimentação de rotina compreendendo submeter uma tal proteína mutada, por exemplo, a um ensaio de competição em sanduíche simples para determinar se aquela se liga a IL-18 apropriadamente marcada, tal como um radioimunoensaio ou ensaio de ELISA.

Numa forma de realização preferida, qualquer proteína mutada tem pelo menos 40% de identidade ou homologia com a sequência de uma IL-18BP ou um homólogo de IL-18BP viralmente codificado, como definido na WO 99/09063. De um modo mais preferido, aquela tem pelo menos 50%, pelo menos 23 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou, muito preferencialmente, pelo menos 90% de identidade ou homologia.

As proteínas mutadas de polipéptidos de IL-18BP ou proteínas mutadas de IL-18BP virais, que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, ou o ácido nucleico que codifica as mesmas, incluem um conjunto finito de sequências substancialmente correspondentes como péptidos ou polinucleótidos de substituição que podem ser rotineiramente obtidos por um técnico na matéria, sem experimentação excessiva, com base nos ensinamentos e orientações aqui apresentados.

As alterações preferidas para as proteínas mutadas são aquelas que são conhecidas como substituições "conservadoras". As substituições conservadoras de aminoácidos de polipéptidos ou proteínas de IL-18BP ou IL-18BP virais podem incluir aminoácidos sinónimos num grupo que tem propriedades físico-químicas suficientemente semelhantes pelo que a substituição entre membros do grupo conservará a função biológica da molécula (Grantham, 1974). É evidente que também podem ser feitas inserções e supressões de aminoácidos nas sequências acima definidas sem alterar a sua função, em particular se as inserções ou supressões envolverem apenas alguns aminoácidos, por exemplo, menos de trinta, e preferencialmente menos de dez, e não removerem ou substituírem aminoácidos que são críticos para a conformação funcional, por exemplo, resíduos de cisteína. As proteínas e proteínas mutadas produzidas por tais supressões e/ou inserções caem dentro do âmbito da presente divulgação. 24

Preferencialmente, os grupos de aminoácido sinónimos são aqueles definidos na Tabela 4. De um modo mais preferido, os grupos de aminoácido sinónimos são aqueles definidos na Tabela 5; e muito preferencialmente os grupos de aminoácido sinónimos são aqueles definidos na Tabela 6.

TABELA I

Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupo Sinónimo

Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Vai Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Vai Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Ile Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, Ile Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Vai, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Vai, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Gin Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Asn Gin, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gin, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu Met Phe, Ile, Vai, Leu, Met

Trp Trp

TABELA II

Grupo Sinónimo Ser

Grupos Mais Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido

Ser 25

Grupos Mais Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupo Sinónimo

Arg His, Lys, Arg Leu Leu, lie, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Vai Vai, Met, lie Gly Gly lie lie, Met, Phe, Vai, Leu Phe Met, Tyr, lie, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gin, Arg Gin Glu, Gin, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gin Met Met, Phe, lie, Vai, Leu Trp Trp

TABELA III

Grupos Muito Aminoácido Ser Arg Leu Pro Thr Ala Vai Gly

Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Grupo Sinónimo Ser Arg

Leu, lie, Met

Pro

Thr

Ala

Vai

Gly 26 26 Grupos Muito Aminoácido Ile Phe Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp

Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Grupo Sinónimo Ile, Met, Leu Phe Tyr

Cys, Ser

His

Gin

Asn

Lys

Asp

Glu

Met, Ile, Leu Met

Exemplos de produção de substituições de aminoácidos em proteinas que podem ser utilizados para obter proteínas mutadas de polipéptidos ou proteínas de IL-18BP, ou proteínas mutadas de IL-18BP virais, incluem quaisquer passos metodológicos conhecidos, tais como apresentados nas patentes US 4,959,314, 4,588,585 e 4,737,462, de Mark et al; 5, 116, 943 de Koths et al., 4, 965, 195 de Namen et al; 4,879,111 de Chong et al; e 5,017,691 de Lee et al; e as proteínas substituídas com lisina apresentadas na patente US n° 4,904,584 (Shaw et al). O termo "proteína fundida" refere-se a um polipéptido compreendendo uma IL-18BP ou uma IL-18BP virai, ou uma proteína mutada ou fragmento daquele, fundido com outra proteína, a qual, por exemplo, tem um tempo de residência prolongado nos fluidos corporais. Assim, uma IL-18BP ou uma IL-18BP virai pode ser fundida com outra proteína, polipéptido ou semelhantes, por exemplo, uma imunoglobulina ou um fragmento desta. 27 "Derivados funcionais" como aqui utilizado cobre derivados de IL-18BPs ou uma IL-18BP virai, e suas proteínas mutadas e proteínas fundidas, que podem ser preparados a partir dos grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduo ou nos grupos N- ou C-terminais, por meios conhecidos na técnica, e estão incluídos na divulgação desde que permaneçam farmaceuticamente aceitáveis, isto é não destruam a atividade da proteína a qual é substancialmente semelhante à atividade da IL-18BP ou IL-18BP virais, e não confiram propriedades tóxicas às composições que os contenham.

Por exemplo, estes derivados podem incluir cadeias laterais de polietileno glicol, as quais podem mascarar sítios antigénicos e prolongar a residência de uma IL-18BP ou uma IL-18BP virai nos fluidos corporais. Outros derivados incluem ésteres alifáticos de grupos carboxílicos, amidas de grupos carboxílicos por reação com amónia ou com aminas primárias ou secundárias, derivados N-acilo de grupos amino livres dos resíduos de aminoácido preparados com unidades acilo (por exemplo, grupo alcanoílo ou aroílo carbocíclico) ou derivados O-acilo de grupos hidroxilo livres (por exemplo os de resíduos de serilo ou treonilo) preparados com unidades acilo.

Como "frações ativas" de uma IL-18BP ou uma IL-18BP virai, proteínas mutadas e proteínas fundidas, a presente divulgação cobre qualquer fragmento ou precursores da cadeia polipeptídica de uma molécula de proteína sozinhos ou em conjunto com moléculas ou resíduos associados ligados aos mesmos, por exemplo, resíduos de açúcar ou fosfato, ou agregados da molécula de proteína ou dos resíduos de açúcar 28 por si só, desde que a referida fração possua atividade substancialmente semelhante à IL-18BP. 0 termo "sais" refere-se aqui a sais de grupos carboxilo e sais de adição de ácido de grupos amino da molécula inibidora de IL-18, ou seus análogos. Os sais de um grupo carboxilo podem ser preparados por meios conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio, amónio, ferro ou zinco, e semelhantes, e sais com bases orgânicas como as preparadas, por exemplo, com aminas, tais como trietanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaina e semelhantes. Os sais de adição de ácido incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Evidentemente, quaisquer destes sais têm de reter a atividade biológica do inibidor de IL-18, tal como a indução de IFN-gama em células sanguíneas.

As sequências de IL-18BP e suas variantes de excisão-união/isoformas podem ser retiradas de W099/09063 ou de Novick et al., 1999, bem como de Kim et al., 2000.

Os derivados funcionais de IL-18BP podem ser conjugados com polímeros para melhorar as propriedades da proteína, tais como a estabilidade, semivida, biodisponibilidade, tolerância pelo corpo humano ou imunogenicidade. Para alcançar este objetivo, a IL18-BP pode ser ligada, por exemplo, a Polietileno glicol (PEG). A PEGilação pode ser realizada por métodos conhecidos, descritos por exemplo em WO 92/13095.

Uma proteína de fusão de IL-18BP pode compreender, por exemplo, uma fusão com imunoglobulina, isto é o inibidor de 29 IL-18 é uma proteína fundida compreendendo toda ou parte de uma proteína de ligação a IL-18, que está fundida com toda ou uma porção de uma imunoglobulina. Os métodos para preparar proteínas de fusão com imunoglobulina são bem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, os descritos em WO 01/03737. O especialista na técnica compreenderá que a proteína de fusão resultante retém substancialmente a atividade biológica da IL-18BP tal como, por exemplo, a ligação a IL-18, a qual pode ser medida em ensaios in vitro descritos na técnica antecedente tal como, por exemplo, em WO 99/09063. A fusão pode ser direta, ou via um péptido de ligação curto, o qual pode ser tão curto quanto 1 a 3 resíduos de aminoácido de comprimento ou mais comprido, por exemplo, 13 resíduos de aminoácido de comprimento. O referido grupo de ligação pode ser um tripéptido da sequência E-F-M (Glu-Phe-Met), por exemplo, ou uma sequência de ligação de 13 aminoácidos compreendendo Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introduzida entre a sequência de IL-18BP e a sequência de imunoglobulina. A proteína de fusão resultante tem propriedades melhoradas, tais como um tempo de residência prolongado nos fluidos corporais (semivida), maior atividade específica, maior nível de expressão ou a purificação da proteína de fusão está facilitada.

Numa forma de realização preferida, a IL-18BP é fundida com a região constante de uma molécula de Ig, por exemplo, uma porção Fc de uma Imunoglobulina. Preferencialmente, é fundida com regiões da cadeia pesada, como os domínios CH2 e CH3, opcionalmente, por exemplo, com a região charneira de IgGl humana. Por exemplo, a parte Fc pode estar mutada para evitar atividades indesejadas, tais como ligação ao complemento, ligação a recetores de Fc ou semelhantes. 30 A geração de proteínas de fusão específicas compreendendo IL-18BP e uma porção de uma imunoglobulina é, por exemplo, descrita no exemplo 11 da WO 99/09063. Outras isoformas de moléculas de Ig também são adequadas para a geração de proteínas de fusão, tais como as isoformas IgG2 ou IgG4, ou outras classes de Ig, como, por exemplo, IgM ou IgA. As proteínas de fusão podem ser monoméricas ou multiméricas, hetero- ou homomultiméricas.

Outras proteínas de fusão de IL-18BP podem ser preparadas fundindo domínios isolados de outras proteínas permitindo a formação de dímeros, trímeros, etc. Exemplos de sequências proteicas que permitem a multimerização dos polipéptidos são os domínios isolados de proteínas tais como hCG (WO 97/30161), colagénio X (WO 04/33486), C4BP (WO 04/20639), proteínas de Erb (WO 98/02540) ou péptidos em dupla espiral (WO 01/00814). A IL-18BP produzida de acordo com o processo da invenção, ou a composição como aqui divulgada, pode destinar-se a utilização terapêutica, isto é para administração em doentes. Se a IL-18BP é administrada em doentes, esta é preferencialmente administrada por via sistémica, e preferencialmente por via subcutânea ou por via intramuscular, ou por via tópica, isto é localmente. A administração retal ou intratecal também pode ser adequada, dependendo da utilização específica da IL-18BP.

Para este fim, a IL-18BP produzida pode ser formulada como uma composição farmacêutica, isto é em conjunto com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, ou semelhantes. 31 A definição de "farmaceuticamente aceitável" destina-se a abranger qualquer veiculo, que não interfira com a eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo e que não seja tóxico para o hospedeiro ao qual é administrado. Por exemplo, para administração parentérica, a(s) proteína (s) ativa(s) pode(m) ser formulada(s) numa forma de dosagem unitária para injeção em veículos tais como soro fisiológico, solução de dextrose, albumina de soro e solução de Ringer.

Os ingredientes ativos da composição farmacêutica podem ser administrados a um indivíduo de uma variedade de formas. As vias de administração incluem as vias intradérmica, transdérmica (por exemplo, em formulações de libertação lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral, intracraniana, epidural, tópica, retal e intranasal. Pode ser utilizada qualquer outra via de administração terapeuticamente eficaz, por exemplo absorção através dos tecidos epiteliais ou endoteliais ou por terapia de genes em que a molécula de ADN que codifica o agente ativo é administrada ao doente (por exemplo, via um vetor), o que faz com que o agente ativo seja expressado e segregado in vivo. Além disso, a(s) proteína(s) pode(m) ser administrada(s) em conjunto com outros componentes de agentes biologicamente ativos tais como tensioativos, excipientes, transportadores, diluentes e veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Para administração parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular), a(s) proteína (s) ativa(s) pode(m) ser formuladas como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água, soro fisiológico, solução de dextrose) e aditivos que mantêm a 32 isotonicidade (por exemplo, manitol) ou a estabilidade química (por exemplo, conservantes e tampões) . A formulação é esterilizada por técnicas geralmente utilizadas.

As quantidades terapeuticamente eficazes da(s) proteína (s) ativa(s) serão uma função de muitas variáveis, incluindo o tipo de antagonista, a afinidade do antagonista para a IL-18, qualquer atividade citotóxica residual exibida pelos antagonistas, a via de administração, a condição clínica do doente (incluindo a conveniência de manter um nível não tóxico de atividade de IL-18 endógena).

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é tal que quando administrada, o inibidor de IL-18 resulta na inibição da atividade biológica da IL-18. A dosagem administrada, como doses simples ou múltiplas, a um indivíduo variará dependendo de uma variedade de fatores, incluindo as propriedades farmacocinéticas do inibidor de IL-18, a via de administração, condições e características do doente (género, idade, peso corporal, saúde, tamanho), extensão dos sintomas, tratamentos concorrentes, frequência de tratamento e o efeito desejado. 0 ajuste e manipulação de gamas de dosagens estabelecidas encontra-se bem dentro da aptidão dos especialistas na técnica, assim como os métodos in vitro e in vivo para determinar a inibição de IL-18 num indivíduo. A IL-18BP pode ser utilizada em quantidades nas gamas de cerca de 0,001 a 100 mg/kg ou cerca de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal, ou cerca de 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal ou cerca de 1 a 3 mg/kg de peso corporal ou cerca de 2 mg/kg de peso corporal. 33 A IL-18BP pode ser administrada diariamente ou dia sim, dia não ou três vezes por semana ou uma vez por semana, em doses semelhantes, ou em doses crescentes ou decrescentes com o tempo.

As doses diárias são geralmente dadas em doses divididas ou em formas de libertação prolongada eficazes para obter os resultados desejados. A segunda ou administrações subsequentes podem ser realizadas a uma dosagem que é igual, menor ou maior do que a dose inicial ou anterior administrada ao indivíduo. Uma segunda administração ou administração subsequente pode ser administrada durante ou antes do início da doença. A IL-18BP pode ser administrada profilaticamente ou terapeuticamente a um indivíduo antes, simultaneamente ou sequencialmente com outros regímenes ou agentes terapêuticos (por exemplo, regímenes de múltiplos fármacos), em quantidades terapeuticamente eficazes. A IL-18BP produzida de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para a preparação de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de um número de doenças ou distúrbios. Tais doenças ou distúrbios podem ser, por exemplo, distúrbios mediados pela IL-18. Por exemplo, a IL-18BP pode ser utilizada para tratamento e/ou prevenção de psoríase, artrite psoriática, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, artrite reumatoide, lesão hepática tal como cirrose hepática alcoólica, septicemia, aterosclerose, doenças cardíacas isquémicas, alergias, em particular hipersensibilidade de tipo retardado e lesão craniana fechada. 34 A referência a passos metodológicos conhecidos, passos metodológicos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é de modo algum um reconhecimento de que qualquer aspeto, descrição ou forma de realização da presente invenção é divulgado, ensinado ou sugerido na técnica relevante.

Entender-se-á que a fraseologia ou terminologia aqui é para efeitos de descrição e não de restrição, pelo que a terminologia ou fraseologia da presente especificação é para ser interpretada pelo especialista à luz dos ensinamentos e orientação aqui apresentados, em associação com o conhecimento de um técnico na matéria. EXEMPLOS (referência)

Exemplo 1: Processo em perfusão para a produção de IL-18BP humana, recombinante a partir de colheita de células CHO isentas de soro em biorreator de leito fixo

Este exemplo descreve um processo com base na cultura de alta densidade celular de células CHO recombinantes num biorreator de leito fixo, no qual a velocidade de perfusão foi ajustada de acordo com os requisitos de crescimento das células durante a fase de crescimento e em seguida reduzida acentuadamente durante a fase de produção sem comprometer a produtividade do processo ou qualidade da proteína. 0 produto proteico produzido por este processo, IL-18BP, foi caracterizado e constatou-se que tem um perfil de N-glicanos vantajoso.

Inicialmente foi concebido um processo de primeira geração com o objetivo de produzir rapidamente material para ensaios pré-clinicos e clinicos iniciais. 35

Este processo foi concebido com uma velocidade de perfusão alta de 2,6 vvd para fornecer a densidade celular alta (-2,5-107 célula-mL_1 de leito fixo) com meio fresco durante a fase de produção. Neste processo de primeira geração, a degradação do produto não constituiu qualquer preocupação uma vez que a elevada taxa de diluição imposta à cultura mantinha um tempo de residência baixo do produto, IL-18BP, no ambiente do biorreator.

Numa fase posterior do desenvolvimento, foi testada uma redução da velocidade de perfusão do meio em -25% e -50% para melhorar o processo. Foi utilizado um sistema de pequena escala para realizar os testes e as condições selecionadas foram em seguida implementadas à escala piloto para produzir mais material para os ensaios clínicos com um processo de segunda geração melhorado.

Materiais e métodos

Cultura de células - sistema experimental

Foi utilizado um biorreator de leito fixo (Ducommun et al. 2002a; Ducommun et al. 2002b) com veículo Fibra-Cel® (Bibby Sterilin, U.K.) para cultivar células CHO (Laboratoires Serono S.A., Corsier-sur-Vevey, Suíça) que expressam e segregam IL-18BP num meio isento de soro (Sigma C-9486). No sistema de pequena escala que foi utilizado para investigar a redução da velocidade de perfusão, o biorreator e o leito fixo tinham um volume de trabalho de 15 e 5 litros, respetivamente. O biorreator foi perfundido com 2,6 vvd (como definido na Tabela 1) durante a fase de crescimento e produção. Esta 36 velocidade de perfusão básica é escolhida como a referência de 100%, especificada como run-100.

Tabela 1: Velocidades de perfusão testadas durante a fase de produção para os run-100, run-75 e run-50. Média de n repetições (± 2 desvios padrão para o run-100).

Velocidade de perfusão (L ·kgFlbra_Cel_1 -dia-1) Taxa de diluição (vvd*) Repetições (n) run-100 100 ± 3,5 2,6 ± 0,1 8 run-75 75 2,0 3 run-50 50 1,3 2 * A taxa de diluição D exprimida em vvd é calculada como litros de meio por litro de volume total do sistema de trabalho por dia (volume total = volume do leito fixo + tanque de condicionamento).

Estas condições foram aplicadas a todos os conjuntos de experiências no biorreator: o meio foi perfundido a 100% durante a fase de crescimento a 37°C. A temperatura foi regulada a 37,0°C durante a fase de crescimento e em seguida reduzida em dois passos até 32,5°C. O pH foi regulado a 7,00 e a concentração de Oxigénio Dissolvido (DO) foi mantida a 70% de saturação de ar ao longo da cultura.

Devido ao facto de a contagem de células e a determinação do número de células num biorreator de leito fixo ser uma análise complexa e inexata, nós utilizamos a Velocidade de Consumo de Glucose (GCR) como um método indireto para estimar o crescimento de células e a densidade no biorreator de leito fixo. No nosso sistema, nós determinámos por contagens diretas de células num número de culturas de leitos fixos gue um GCR de 300 grama de glucose por guilograma de discos Fibra-Cel® por dia corresponde a aproximadamente 2,5-107 células por mL de volume do biorreator de leito fixo (dados não apresentados).

Esta etapa foi definida como o final da fase de propagação celular a 37°C e quando a GCR atingiu um nivel de 300 grama 37 de glucose por quilograma de discos de Fibra-Cel® por dia, as culturas foram transferidas de 37,0°C para o modo de produção reduzindo a temperatura até 33,5°C. Nesta etapa, num conjunto de biorreatores a perfusão foi mantida a 100% (run-100) e os outros dois conjuntos foram realizados com uma velocidade de perfusão do meio de 75% (run-75) e 50%

(run-50) do nivel máximo, como resumido na Tabela 1. A temperatura foi ainda diminuída até 32,5°C numa etapa posterior da fase de produção para impedir mais crescimento celular e promover a produção.

Na secção de resultados, as barras apresentadas nas figuras representam um intervalo de 4 desvios padrão (±2 desvios padrão) medido para as 8 repetições realizadas nas condições do run-100.

Ensaios

Foram retiradas amostras diariamente durante a cultura. As concentrações de glucose e lactato foram quantificadas com um analisador EML 105 (Radiometer Medicai A/S, Br0nsh0j, Dinamarca). A IL18BP recombinante produzida foi quantificada com um teste de ELISA. A qualidade da proteína recombinante foi avaliada com um método de RP-HPLC, em associação com métodos SDS-PAGE (SDS Homogéneo ExcelGel a 12,5% (Cat# 80-1261-01, Pharmacia). Os geles foram especificamente revelados por Transferência de Western para detetar variantes de peso molecular alto (isto é dímeros, agregados) ou peso molecular baixo da IL-18BP. Também foi realizada uma revelação não específica com Revelador de Prata para avaliar a intensidade relativa da IL-18BP em comparação com impurezas após varrimento 38 (Scanner ARCUS 2, Afga) de bandas específicas para determinar a sua intensidade relativa. A sialilação de proteínas, e em particular a abundância de N-glicanos neutros, mono-, di-, tri- e tetrassialilados foi analisada por separação dos N-glicanos de acordo com a sua carga, como descrito em Gervais et al. 2003. Os N-glicanos foram especificamente dissociados da IL-18BP por hidrazinólise (N-glicanase E-5006B ou E-5006C, Glyko Inc.), marcados com o corante fluorescente 2-Aminobenzamida (Signal 2-AB labelling kit K404, Glyko Inc.) e separados por uma coluna de cromatografia antes de passar através de um detetor fluorescente. As proporções das espécies de N-glicanos puderam ser depois determinadas após integração dos picos de HPLC correspondentes às formas neutra, mono-, di-, tri- e tetrassialiladas.

Resultados

Redução da velocidade de perfusão A primeira tentativa foi reduzir a velocidade de perfusão de 2,6 vvd para 2,0 vvd e 1,3 vvd durante uma fase de produção (Fig. 1) e seguir o seu efeito no metabolismo celular, produtividade volumétrica e qualidade do produto. A concentração de glucose e lactato foram medidas para todas as três velocidades de perfusão (Fig. 2A e B) e o nível de glucose residual permaneceu acima de 0,5 g/L.

Os resultados na Fig. 3 mostram os níveis da velocidade de consumo de glucose (GCR) para os três conjuntos de velocidade de perfusão do meio testados. Estes resultados indicam que uma velocidade de perfusão reduzida induz uma GCR menor da cultura. No entanto, este efeito foi muito pouco significativo e quando a velocidade de perfusão do 39 meio foi reduzida para -25% e -50%, a GCR média medida ao longo da fase de produção de 60 dias foi reduzida em -8% e -15% respetivamente (Fig. 3).

Em paralelo, a proporção molar aparente (Fig. 4) de conversão de glucose em lactato Yiac/gic diminuiu ligeiramente em resposta a uma velocidade de perfusão menor mas permaneceu numa gama de 1,55 a 1,65 moles de lactato produzidas por mole de glucose consumida. As diferenças observadas para a relação Yiac/gic não foram estatisticamente significativas uma vez que todos os pontos de dados medidos para os ensaios a velocidade de perfusão reduzida estão compreendidos dentro de ±2 desvios padrão dos valores obtidos com os ensaios de referência.

Produtividade do processo

Os resultados apresentados na Fig. 5 A, B e C mostram uma comparação da proteina recombinante produzida (produtividade volumétrica, produção total e título) no run-100 de referência e nas séries com perfusão de meio reduzida.

Quando a velocidade de perfusão do meio foi reduzida em -25% e -50%, a produtividade volumétrica média foi reduzida em -3% e -30% respetivamente (Fig. 5A) . O resultado de produtividade mais baixa obtido para o run-50 é estatisticamente diferente das condições de referência.

Outra diferença observada na Fig. 5 A é o declínio da produtividade volumétrica ao longo do tempo na fase de produção. Foi observada uma produtividade volumétrica estável para os run-100 e run-75, mas no run-50 a produtividade diminuiu ao longo da duração da fase de produção de 60 dias. Mais especificamente, o nível de 40 produtividade do run-50 foi 60% do valor de referência no final da fase de produção de 60 dias. A menor produtividade do run-50 também é mostrada na Fig. 5B, a qual representa a quantidade acumulada de produto feito ao longo da fase de produção de 60 dias.

Os titulos correspondentes medidos para as diferentes velocidades de perfusão são apresentados na Fig. 5C, a qual mostra que os titulos de proteína recombinante foram aumentados em +25% e +50% respetivamente em contraste com o controlo quando a perfusão foi diminuída em -25% e -50%.

Qualidade do produto

Com a redução da velocidade de perfusão de 2,6 vvd, para 2,0 vvd e 1,3 vvd que foi testada para os run-100, run-75 e run-50, o tempo de residência (t) da proteína recombinante foi aumentado de 0,4 para 0,5 para 0,8 dias, respetivamente (t=l/D).

Uma vez que uma exposição mais prolongada ao ambiente no biorreator poderia potencialmente levar à degradação da proteína recombinante, foi efetuado um estudo de estabilidade antes de se começar os testes nos biorreatores. A amostra de IL-18BP foi aplicada em meio de cultura de células e os atributos de qualidade da IL-18BP foram acompanhados após 1, 2 e 5 dias de incubação a 37°C. Uma vez que não foi detetado qualquer sinal de degradação do produto pelo método de indicação da estabilidade (dados não apresentados), decidiu-se prosseguir com as experiências no biorreator.

Durante os ensaios nos biorreatores, a proteína recombinante foi purificada até à homogeneidade em três 41 pontos das séries de biorreator (dia 20, 40 e 60) para verificar se a qualidade do produto era mantida durante cada velocidade de perfusão investigada. As condições do run-50 foram consideradas como o pior caso para a degradação da proteina uma vez que esta série tinha a velocidade de perfusão mais baixa e o tempo de residência mais longo do produto no biorreator. A fim de avaliar se a qualidade do produto era afetada pela velocidade de perfusão reduzida, produtos finais a granel do run-50 foram analisados por SDS-PAGE com Revelador de Prata e SDS-PAGE de Transferência de Western, e comparado com o perfil obtido nas condições de referência do run-100. Os dados correspondentes obtidos para um produto a granel produzido com IL-18BP colhido aos 47-48 dias da fase de produção do run-50 resultou nas bandas simples esperadas a um peso molecular de cerca de 40 kDa (não mostradas) . Não foi detetada qualquer modificação dos atributos de qualidade da IL-18BP para o run-50 em comparação com o run-100. A pureza eletroforética medida por SDS-PAGE com Revelador de Prata foi superior a 99% de pureza para todas as faixas, e não pôde ser detetada a presença de agregados ou formas truncadas como mostrado na SDS-PAGE de transferência de Western (não mostrada). O elevado nível de pureza (-100%) da IL-18BP produzida foi confirmado por RP-HPLC para os run-100, run-75 e run-50.

Finalmente, a quantidade de impurezas provenientes das células CHO hospedeiras (Proteínas da Célula Hospedeira, HCP) na proteína produzida foi quantificada por HCP-ELISA (dados não apresentados) e foi coerente entre os run-50, run-75 e run-100. 42

Perfil N-glicanos

Amostras da IL-18BP recombinante produzida foram submetidas a mapeamento de N-glicanos de acordo com o método relatado acima, para quantificar a proporção das diferentes formas sialiladas da proteina de interesse. Os resultados de mapeamento de N-Glicanos resumidos na Tabela 2 mostram que são obtidas proporções comparáveis de N-glicanos para todas as velocidades de perfusão testadas. Isto também é ilustrado pelos correspondentes perfis de HPLC expostos na Fig. 6.

Tabela 2: Fração de moléculas de N-Glicano sialiladas de modo diferente (dada como % dos grupos de N-glicano) em amostras semiproduzidas de substância farmacológica para os run-100, run-75 e run-50.

Fração de moléculas de N-Glicano sialiladas de modo diferente Neutra (%) Monossialilada (%) Dissialilada (%) Trissialilada (%) Tetrassialilada (%) run- 100 19-21 21-29 39-44 7-11 2-4 run- 75 18-22 20-23 44-50 8-9 3-4 run- 50 19-21 20-25 45-48 8-10 2-4

Uma comparação destes dados demonstra que a sialilação do produto não é alterada pela velocidade de perfusão reduzida e os dados obtidos para os run-75 e run-50 estão claramente na gama obtida nas condições padrão do run-100.

Sumário e Conclusões

No presente estudo foi determinada a velocidade de perfusão ótima do meio a ser utilizada para a cultura continua de uma linha de células CHO recombinante num biorreator de leito fixo feito de veiculos de disco de Fibra-Cel®.

Foi inicialmente concebido um processo de primeira geração com uma velocidade de perfusão alta, originariamente 43 operado com uma perfusão de 2,6 vvd durante a fase de produção para proporcionar a densidade celular alta (-2,5-107 célula-mL-1 de leito fixo) com meio fresco suficiente. A fim de melhorar a economia deste processo foi investigada uma redução da velocidade de perfusão do meio em -25% e -50% em pequena escala. A melhor opção foi então implementada à escala piloto para produzir mais material para os ensaios clínicos com um processo de segunda geração melhorado.

Com uma redução de -25% da velocidade de perfusão, a produtividade volumétrica foi mantida em comparação com o processo de primeira geração, mas foi obtida uma perda de -30% de produtividade quando a velocidade de perfusão do meio foi adicionalmente reduzida para -50% do seu nível original. A qualidade da proteína sob condições de velocidade de perfusão reduzida foi analisada quanto à pureza, nível de sialilação de N-glicanos, abundância de dímeros ou agregados, e mostrou que a qualidade da substância farmacológica final era comparável à obtida em condições de perfusão elevada.

Neste estudo ficou estabelecido que a qualidade do produto era mantida após redução da velocidade de perfusão do meio. A série com a perfusão mais baixa, run-50, tem o tempo de residência mais comprido (t=0,8 dias) e este é o pior caso para a estabilidade da proteína uma vez que deixa o produto exposto a todas as atividades potencialmente degradadoras presentes no ambiente do biorreator durante o período de tempo mais longo. Nestas condições podemos considerar que 44 99% da proteína terá um tempo de residência no sistema biorreator inferior a 4 dias (5t = 4 dias para o run-50).

Uma vez que um estudo de estabilidade demonstrou que a IL-18BP podia ser conservada até 4 dias a 37°C na colheita em bruto sem alterações significativas, antecipou-se que na gama de velocidades de perfusão testadas o produto não seria degradado. Isto foi confirmado pelos resultados obtidos nas séries do biorreator, já que todos os lotes de proteína produzida gerados nos dias de produção 20, 40 e 60 de cada uma das condições de perfusão testadas satisfizeram as especificações estabelecidas com o material de referência do run-100. Assim, no estudo aqui relatado, não pôde ser detetado qualquer sinal de degradação do produto. A escassez de glucose é uma causa típica de sialilação incorreta do produto (Goochee e Monica 1990). Este efeito foi estudado para o IFN-g produzido a partir de células CHO e foi constatado que a glicosilação do produto era afetada a níveis residuais de glucose baixos inferiores a 0,1 g/L (Hayter et al. 1993), (Hooker et al. 1995).

Nas condições aqui descritas, a sialilação da IL-18BP não foi afetada pelas concentrações mais baixas de glucose alcançadas durante a fase de produção dos run-75 e run-50. Sem se pretender ficar restringido a uma explicação específica, isto poderia ser explicado pelo facto da gama de concentrações de glucose residual (2,6 g/L a 0,5 g/L) aqui relatada ser muito maior do que o valor de nível de glucose inferior a 0,1 g/L (induzindo provavelmente algum efeito de escassez de glucose) para o qual foi observada sialilação incompleta de IFN-g. 45

Com base nos resultados obtidos em pequena escala foi implementada uma redução de -25% de perfusão do meio à escala piloto no processo de segunda geração, a qual permitiu manter a mesma produtividade e a mesma qualidade da molécula, enquanto reduzia os custos dos meios, material e mão-de-obra do processo de produção. A redução de -25% no meio traduziu-se diretamente numa poupança de -25%: no meio em pó e ingredientes secundários, nos pré-filtros e filtros de esterilização, nos sacos estéreis utilizados para conservação dos meios após filtração e nos custos de mão-de-obra associados à preparação do meio já que foram necessários menos lotes de meio.

Como o titulo da IL-18BP na colheita em bruto aumentou em +25% no processo de segunda geração, o processamento a jusante beneficiou de poupanças semelhantes: menor necessidade de mão-de-obra devido aos menores volumes manuseados, menor ciclo de produção, otimização do equipamento, etc. (dados não apresentados).

Conclusão

Dos resultados obtidos à pequena escala é evidente que a redução de -25% na velocidade de perfusao combinou ambos os benefícios de maximizar a produtividade com uma poupança de -25% no consumo de meio. A redução adicional da velocidade de perfusão para -50% levou a uma menor produtividade do processo, a qual diminuiu -30% em tais condições. Com as condições de velocidade de perfusão de -50%, a produtividade volumétrica diminuiu ao longo da duração da fase de produção de 60 dias, enquanto foi mantida uma produtividade estável com as 46 velocidades de perfusão mais elevadas testadas. A estabilidade do produto permaneceu comparável, independentemente da velocidade de perfusão utilizada no processo.

Exemplo 2: Processo descontínuo alimentado para a produção de IL-18BP humana, recombinante a partir de cultura de células CHO isentas de soro

Também foi desenvolvido um processo descontinuo alimentado com células que expressam IL-18BP humana recombinante em cultura em suspensão. No total foram realizadas três séries, utilizando biorreatores de 5 L (n=2) ou 300 L (n=l) de volume nominal.

Em resumo, os valores de referência da cultura foram: concentração de oxigénio de 50% de saturação de ar, pH 7,0 e 6,90, temperatura de 37,0°C durante a fase de crescimento e em seguida reduzida em dois passos até 29,0°C. Durante o decorrer da cultura descontinua alimentada, o meio de base isento de soro (Sigma, S-9942) foi gradualmente suplementado com a solução de alimentação concentrada.

Os parâmetros do processo descontinuo alimentado estão resumidos na Tabela 3. 47

Tabela 3: Esquema do processo de Produção Descontinuo Alimentado

Tempo/WD* [dia] T [°C] PH [pHU ] Alimentação Alimentação-1 Comentários -3 Transferir a mistura de inoculo do saco de cultura para o biorreator de reprodução1) com um VCs alvo de: VCs** = 0,20 ± 0,05 mioCs/mL 0 Transferir a mistura de inoculo do biorreator de reprodução para o biorreator de produção2) com um VCs alvo de: VCs = 0,60 ± 0,10 mioCs/mL 0 37 6,90 4 N/A N/A + 80 Çf/kg^obrenadante c(glucose) < 1,0 g/L3) 4 - 33 N/A 4 N/A N/A + 30 Çj/kg^obrenadante c(glucose) < 5,5 g/L4) 6 - 29 N/A i N/A N/A 20 Clarificação da colheita em bruto 11 biorreator de 5L e 75L para operação em pequena escala (5L) e à escala piloto (300L), respetivamente 2) biorreator de 5L e 300L para operação em pequena escala (5L) e à escala piloto (300L), respetivamente 3) A primeira adição de Alimentação-1 ocorre quando c(glucose) <1,0 g/L (+80 g/kg) 4) As adições subsequente de Alimentação-1 ocorre de cada vez quando c (glucose) <5,5 g/L (+30 g/kg) * WD = dias de trabalho ** VCs = células viáveis

Foram analisados os indicadores de desempenho importantes, nomeadamente a densidade celular total, viabilidade, concentração residual de glucose e título de proteína. Como se mostra na Fig. 7 (A) a (D), o processo descontínuo alimentado final permitiu multiplicar o clone até uma densidade celular total máxima de aproximadamente 7,0 mioCs/mL e manter a viabilidade celular acima de 80% até ao dia de trabalho 19, quando a cultura de 300L foi colhida, clarificada e capturada. A Fig. 7 (C) corresponde aos perfis de concentração de glucose residual, com base em medições fora de linha diárias. Estes perfis ilustram a estratégia de alimentação aplicada. Por exemplo, a primeira adição bolus de 80 g/kg de sobrenadante ocorreu em todos os três lotes no dia de trabalho 4 para aumentar a concentração de glucose residual até mais do que 5,5 g/L. De um modo semelhante, pode ser facilmente identificada 48 cada adição subsequente de 30 g/kg de sobrenadante. Além disso, a produtividade do processo é mostrada na Fig. 7 (D) , com um titulo final de r-hIL-18BP consistente de 400 mg/L no dia de trabalho 19. A qualidade da proteina foi avaliada em todos os três lotes no dia de trabalho 19.

Exemplo 3: Perfil de sialilação de rhIL-18BP produzida em perfusão e no processo descontínuo alimentado para cultura de células CHO

Foi criado um outro processo em perfusão para produção de IL-18BP. Foram realizadas séries de perfusão com uma velocidade de perfusão 2,75 vvd num biorreator contendo um volume total de 160 L (incluindo a coluna externa de 40 L) empacotado com 4,4 kg de discos Fibracel®, a temperaturas de produção de 33,5 ou 32,5°C. A IL-18BP produzida neste processo em perfusão foi comparada com o material proveniente do processo descontinuo alimentado descrito no exemplo 2. O sobrenadante de perfusão ou descontinuo alimentado foram submetidos a um passo de captura utilizando cromatografia de afinidade. O material de IL-18BP pós-captura foi analisado quanto à N-glicanação como descrito no Exemplo 1 acima. O número de carga hipotética, o chamado número Z, foi calculado como descrito em Gervais et al. (2003). Resumidamente, o número Z é definido como a soma dos produtos das respetivas áreas (A) na região neutra, mono-, di-, tri-, tetra- e pentassialilada da espécie de N-glicano, cada uma multiplicada pela carga correspondente: 49 Ζ = A (neutra) X 0+ A (mono) x 1 + A m x2 + A (tf) x 3 + A (1βϋ3) x 4 + A (penta) x 5.

Os resultados estão representados na Fig. 8, mostrando que apesar de algumas diferenças qualitativas, principalmente nos grupos dissialilados, os dados de mapeamento de N-glicano indicam que a sialilação do produto era comparável para as condições do processo em perfusão (Z = 149) e descontinuo alimentado (Z = 145) em termos de quantidade. O material de IL-18BP ("material de colheita em bruto"), proveniente do processo descontinuo alimentado ou em perfusão também foi analisado por Eletroforese de Zona Capilar (CZE) em relação às isoformas glicosiladas diferencialmente ("glicoformas") de acordo com o protocolo descrito em pormenor abaixo. A distribuição de isoformas foi ainda comparada com a IL-18BP purificada, proveniente do processo descontinuo alimentado ou em perfusão. 0 material da colheita em bruto sofreu um passo de microcaptura num cartucho Sep-Pak® tC2 (Waters) seguido de um passo de dessalinização por ultrafiltração com Centricon® 10 (Millipore) antes de ser injetado no capilar. A IL-18BP purificada foi obtida essencialmente como descrito no pedido de patente WO 2005/049649, embora com um passo de captura diferente com base em cromatografia de afinidade. Resumidamente, os passos de purificação incluíram cromatografia de afinidade metal-ião (em Sepharose FF Quelante), cromatografia de indução de carga hidrófoba (em Mep Hypercel), cromatografia de troca iónica (em CM-Sepharose FF, utilizando o fluxo contínuo), cromatografia de interação hidrófoba (em Phenyl Sepharose 50

Fast Flow HS) e cromatografia de fase inversa (em Reverse Phase-Source 30 RPC) . O material finalmente purificado foi aplicado diretamente no capilar sem qualquer passo adicional de dessalinização. Método:

Soluções para CZE - tampão de fosfato 5 mM para lavagem/ensaio em CZE:

Preparar por diluição 1:10 da solução-mãe de fosfato 50 mM pH 7,0. Filtrar através de filtro de 0,22 ym. Preparar de fresco. - NaOH 0,5 M (solução de lavagem de CZE):

Adicionar 26,2 yL de NaOH 50% a água, volume total de 1 mL. Preparar de fresco. - NaOH 1 M (Solução de regeneração de CZE):

Adicionar 52,4 yL de NaOH 50% a água, volume total de 1 mL. Preparar de fresco. - Marcador Neutro (diluição 1:10000)

Adicionar 10 yL de solução-mãe de marcador neutro a água, volume total de 1 mL.

Adicionar 10 yL desta diluição a 1:100 de marcador neutro a água, volume total de 1 mL. Conservar durante três meses a 4 °C.

Análise por CZE 51

Transfere-se h20 yL de amostra/referência para frascos de PCR contendo 1/10 de volume de marcador neutro e mistura-se por pipetagem inversa, evitando gerar bolhas.

Parâmetros eletroforéticos:

Os seguintes reagentes são adicionados em suportes de frascos separados, evitando gerar bolhas.

Tabela 4: Parâmetros eletroforéticos para CZE

Reagentes de entrada Volume de reagente Reagentes de saída Volume de reagente Tampão de lavagem 1,2 mL Tampão de ensaio 1,2 mL Tampão de ensaio (3.3.1) 1,2 mL Água purificada 1,2 mL Água purificada 1,2 mL Solução de lavagem de CZE 1,0 mL Solução de regeneração de CZE* 1,0 mL Amostra > 22 pL/ Frasco de PCR Esgoto (água purificada) 1 0,2 mL Esgoto (água purificada) 2 0,2 mL Ar * Frasco Vazio *utilizar apenas se necessário 52

Tabela 5: Tabela de tempos da Análise por CZE

Evento Valor Duração Frasco de Entrada Volume de reagente Frasco de Saída Pressão de lavagem 20, 0 psi 2, 00 min Tampão de lavagem 1,2 mL Esgoto 1 (0,2 mL) Pressão de inj eção 0,5 psi 5, 0 s Amostra > 22 pL Tampão de ensaio (3.3.1) Tensão de separação 2 5 KV 30, 00 min Tampão de ensaio 1,2 mL Tampão de ensaio (3.3.1) Pressão de lavagem 20, 0 psi 1, 00 min Tampão de lavagem 1,2 mL Esgoto 1 (0,2 mL) Pressão de lavagem 20, 0 psi 1, 00 min Água purificada 1,2 mL Esgoto 1 (0,2 mL) Pressão de lavagem 20, 0 psi 1, 00 min Solução de lavagem de CZE 1, 0 mL Esgoto 2 (0,2 mL) Pressão de lavagem 40, 0 psi 2, 00 min Água purificada 1,2 mL Esgoto 2 (0,2 mL) Pressão de lavagem 40, 0 psi 2, 00 min Tampão de lavagem 1,2 mL Esgoto 2 (0,2 mL) Espera Tampão de lavagem 1,2 mL Tampão de ensaio (3.3.1)

Tabela 6: Tabela de tempos de regeneração do capilar de CZE

Evento Valor Duração Frasco de Entrada Volume de reagente Frasco de Saída Pressão de lavagem 40, 0 psi 1, 00 min Água purificada 1,2 mL Esgoto 2 (0,2 mL) Pressão de lavagem 40, 0 psi 10, 00 min Solução de regeneração de CZE 1, 0 mL Esgoto 2 (0,2 mL) Pressão de lavagem 40, 0 psi 4, 00 min Água purificada 1,2 mL Esgoto 2 (0,2 mL) Pressão de lavagem 40, 0 psi 1, 00 min Tampão de lavagem 1,2 mL Esgoto 2 (0,2 mL) Pressão de lavagem 0,5 psi 30, 00 min Tampão de lavagem 1,2 mL Esgoto 2 (0,2 mL) Espera Tampão de ensaio 1,2 mL Tampão de ensaio (3.3.1) 53

Comprimento do capilar até ao detetor/comprimento total Polaridade

Temperatura do capilar Tabuleiro de amostras Deteção 50/60 cm positiva para negativa (direta) = 25±2°C = 10±2°C 214 nm

Protocolos de injeção

Devem existir pelo menos três injeções do material de Referência Padrão para efeitos de condicionamento do capilar.

Referência Padrão 1 (inicio)

Injeção simples da amostra 1 Injeção simples da amostra 2 Injeção simples da amostra 3 Injeção simples da amostra 4 Referência Padrão 2 (fim) NOTA: Para aumentar a reprodutibilidade, pode ser analisado um máximo de 4 amostras numa sequência entre a referência 1 e a referência 2 utilizando o mesmo tampão de ensaio de CZE.

Alternativamente podem ser utilizadas duas referências intercaladas para cada amostra como descrito abaixo. São feitas pelo menos três injeções do material de Referência Padrão para efeitos de condicionamento do capilar.

Referência Padrão (inicio 1)

Injeção simples da amostra 1 Referência Padrão (fiml/início2) 54

Injeção simples da amostra 2

Repetição da Referência Padrão (fim2/inicio3)

Injeção simples da amostra 3 Repetição da Referência Padrão (fim3)

Análise de Dados 0 Material de Referência Padrão é utilizado para comparação de dados da amostra.

Os eletroferogramas sobrepostos e empilhados de amostra(s) e de ambos os padrões de Referência intercalares (inicio/fim) são imprimidos e arquivados.

Determinação dos tempos de migração TM2 e TM3 São determinados os tempos de migração TM2 e TM3 nos vales esquerdo e direito de -3 e + 3 picos do Padrão de

Referência (Inicio). 0 pico 0 é o pico principal da referência.

Classificação da isoforma

Devido à acidez elevada do perfil de glicoproteínas da IL-18BP, as isoformas entre TM2 e TM3 são chamadas "isoformas ácidas". As isoformas com tempos de migração maior do que TM3 são chamadas "isoformas muito ácidas". As isoformas com tempos de migração menores do que TM2 são chamadas "isoformas menos ácidas".

Nalgumas circunstâncias, pode ser necessário adicionar a classe de "isoformas básicas" definida como as isoformas com tempos de migração menores do que TM1.

Estimativa da abundância das isoformas A referência e cada amostra são analisadas utilizando as funções: pico manual entre TM1-M2, TM2-TM3 e TM3-TM4; a 55 linha de base manual entre 5 e 28 minutos e integração DESLIGADA entre 0 e TM1 e entre TM4 e 30 minutos. Modificar manualmente as funções Largura e Limiar para obter uma integração de três grupos de picos entre TM1-M2 (isoformas menos ácidas), TM2-TM3 (isoformas ácidas) e TM3-TM4 (isoformas muito ácidas) semelhante à mostrada acima para o Padrão de Referência. % abundância da isoforma = área (TM1-TM2 ou TM2-TM3 ou TM3-TM4) Área total (TM1-TM4)

Quando necessário é adicionado o grupo de picos correspondente às "isoformas básicas" definidas como as isoformas com tempos de migração menores do que TM1 e a fórmula acima corrigida em conformidade.

Resultados:

Este método de CZE foi aplicado a amostras de colheitas em bruto (Fig. 9) e a amostras purificadas do processo de perfusão e descontinuo alimentado. Apesar de algumas diferenças observadas para as amostras de colheitas pré-tratadas (por exemplo, maior proporção de isoformas básicas com o processo em perfusão), estas isoformas básicas foram removidas com sucesso por cromatografia de troca iónica durante o processo de purificação (dados não apresentados). Assim, para o produto purificado, foi obtido um perfil de isoformas comparável para ambos os processos (Fig. 10).

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Lisboa, 25 de Maio de 2012

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para produzir a proteína de ligação a interleucina-18 recombinante (IL-18BP) em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) num biorreator sob condições de cultura isentas de soro, em que o processo é um processo descontínuo alimentado compreendendo os passos de: a. uma fase de propagação celular a 37°C; b. opcionalmente, uma fase intermediária a 33°C; c. uma fase de produção a 29°C.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a densidade celular total na fase de produção varia entre 4 a 8 x 101 células por mL por dia.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a densidade celular total na fase de produção varia entre 4 a 8 x 101 células por mL por dia ao longo de pelo menos 10 dias de cultura de células.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a viabilidade varia entre 100 e 80%.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a viabilidade varia entre 100 e 80% ao longo de pelo menos 10 dias de cultura de células. 1 Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a produtividade de proteína é maior do que cerca de 150 mg ou cerca de 350 mg por L por dia. 2

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, compreendendo ainda o passo de colheita do sobrenadante da cultura de células.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, compreendendo ainda o passo de purificação da IL-18BP.

9. Processo de acordo com quaisquer reivindicações 1 a 8, compreendendo ainda o passo de formulação da IL-18BP numa composição farmacêutica. Lisboa, 25 de Maio de 2012