CN115747055A - 一种细胞灌流培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞灌流培养的方法，采用细胞灌流培养装置，将细胞接种于生物反应器进行分批培养数天，开始灌流培养数天；控制灌流培养的灌流速率。本发明属于生物工程的细胞培养技术领域。本发明的细胞的灌流培养的方法，通过调整灌流速率，可快速提高活细胞密度同时维持高细胞活率。
Description
技术领域
本发明属于生物工程的细胞培养技术领域。本发明涉及一种细胞灌流培养的方法，尤其是涉及一种悬浮哺乳动物细胞灌流培养的方法。
背景技术
哺乳动物细胞培养始于20世纪初，目前广泛应用于单克隆抗体制备及基因治疗领域。常用的动物细胞培养工艺分为batch、Fed-batch、灌流培养等。细胞灌流培养作为当前细胞培养的重要工艺之一，已被生物制药公司广泛采用。细胞灌流培养通过不断移出副产物，同时添加营养物质，从而提供对细胞稳定且有利的生长环境。Batch是指将细胞和培养基一次性转入搅拌式反应器内进行培养，整个培养过程中培养体积不变，不添加任何营养成分，只控制pH、温度、搅拌及溶氧等参数至培养结束。因营养物质的消耗，代谢副产物的积累等，细胞所处环境也随培养时间的增加而发生变化。灌流培养与Batch或Fed-batch工艺相比，其可以不断补充新鲜培养基的同时排除细胞碎片、乳酸等有害物质，可有效地维持高活细胞密度、高细胞活率。针对单克隆抗体制备等领域，灌流培养的优势还在于目的产物在生物反应器内更短的滞留时间，更高的每日单位体积产量。
应用于灌流培养的设备主要有ATF（交替式切向流）系统和Biosep细胞声学截留系统等。ATF可以将细胞截留在培养体系内，而同时去除耗竭的培养基。ATF可最大限度地降低细胞剪切，并保持细胞与生物反应器内容物的恒定平衡，从而获得更快的细胞生长，达到更高的密度和产量。BioSep分离的原理完全是基于温和的声频引起的松的细胞积聚，然后再沉淀。与其他的细胞分离技术相比，BioSep内的声频能量网构成一个“虚拟网”，因而是更好的，无接触、无污染、不移动的过滤模式。这个技术可以进行长达数千小时的连续培养，因而大大提高稳态的活细胞密度、生产率并获得高的产品质量。然而，ATF系统设备昂贵，且其中空纤维柱长时间工作容易破裂，需定期更换，进一步增加使用成本。Biosep细胞声学截留系统截留效率较低，维持最高活细胞密度有限。
目前，对于哺乳动物灌流培养的研究内容包括细胞截留装置和灌流工艺的优化，以减缓中空纤维滤膜堵塞的速率、减少对细胞的损伤、降低培养基用量、延长灌流培养周期及目的产物的单位体积产量等。因此，需要提供一种避免细胞聚集在过滤装置表面，减少堵塞风险，避免细胞损伤、设备简单、成本低、耗材少、可放大性强的灌流培养装置，以及一种高效的细胞灌流培养方法，实现长时间维持高活细胞密度、高细胞活率、高目的产物产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞灌流培养装置以及细胞灌流培养方法，细胞灌流培养装置可以避免细胞聚集在过滤装置表面，减少堵塞风险，避免细胞损伤、设备简单、成本低、耗材少、可放大性强；还提供一种细胞灌流培养方法可以实现长时间维持高活细胞密度、高细胞活率、高目的产物产量。
为了实现本发明的上述目的及其他相关目的，本发明提供一种细胞灌流培养装置，所述细胞灌流培养装置包括：
生物反应装置；
过滤装置；
调压装置；
负压装置；
连接管道。
所述的生物反应装置、过滤装置、调压装置可以是一个或多个，并通过管道相连接。优选的，所述的生物反应装置、过滤装置、调压装置通过管道依次相连接。
所述的过滤装置的侧面与负压装置相连接，所述的过滤装置的侧面可以截留细胞，发挥过滤作用。
优选的，所述的细胞灌流培养装置还可以含有废液收集装置。
采用调压装置反复交替切换正负压，带动管道的细胞培养液往复运动。当调压装置为负压时，生物反应装置中的细胞培养液被压到过滤装置里；当调压装置正压时，过滤装置里的细胞培养液部分回流至生物反应装置。细胞培养液连续不断地进入过滤装置，而废液连续不断从过滤装置的侧面，通过负压装置，进入废液收集装置。
优选的，所述生物反应装置与至少一个过滤装置的一端相连。
优选的，所述过滤装置的另一端与调压装置相连。
优选的，所述过滤装置含有一个或多个纤维过滤装置。
优选的，所述负压装置与废液收集装置相连。
优选的，所述的生物反应装置包括发酵罐、搅拌釜反应器、粘附式生物反应器、一次性生物反应器等；优选的，所述的生物反应装置可以含有一个或多个搅拌装置。
优选的，所述的纤维过滤装置包括中空纤维；优选的，所述中空纤维包括纤维膜、纤维块、纤维束、纤维柱其中的一种或多种；优选的，所述的过滤装置是中空纤维柱。
优选的，所述的中空纤维柱由中空纤维滤膜、滤壳等组成。细胞培养液在中空纤维柱中交替往复的流动，可在截留细胞的同时分离细胞代谢废物、目的产品等。采用往复式切向流技术可在一定程度上减慢中空纤维柱堵塞的速度，减少灌流系统对细胞的剪切力。优选的，所述的调压装置包括但不限于调压泵、压缩机；优选的，所述的调压泵是空气泵，所述压缩机是真空压缩机；优选的，所述的空气泵是高压空气泵。优选的所述的调压装置还可以是空压机和真空发生器组成。
所述的调压装置可以根据设定的时间，依次反复的切换为负压和正压。
优选的，所述的负压装置是负压泵；更优选的，所述的负压泵是蠕动泵。
在另外一个实施方案中，一种细胞灌流培养装置，其包括：
生物反应装置；
过滤装置；
液位传感装置；
调压装置；
负压装置；连接管道。
所述的生物反应装置、过滤装置、液位传感装置、调压装置可以是一个或多个，并通过管道相连接。优选的，所述的生物反应装置、过滤装置、液位传感装置、调压装置通过管道依次相连接。
所述的过滤装置的侧面与负压装置相连接，所述的过滤装置的侧面可以截留细胞，发挥过滤作用。
优选的，所述负压装置与废液收集装置相连。
采用调压装置反复交替切换正负压，带动管道的细胞培养液往复运动。当调压装置为负压时，生物反应装置中的细胞培养液被压到过滤装置里；当调压装置正压时，过滤装置里的细胞培养液部分回流至生物反应装置。细胞培养液连续不断地进入过滤装置，而废液连续不断从过滤装置的侧面，通过负压装置，进入废液收集装置。
优选的，所述生物反应装置与至少一个过滤装置的一端相连。
优选的，所述过滤装置的另一端与调压装置相连。
优选的，所述过滤装置含有一个或多个纤维过滤装置。
优选的，所述的生物反应装置包括发酵罐、搅拌釜反应器、粘附式生物反应器、一次性生物反应器等；优选的，所述的生物反应装置可以含有一个或多个搅拌装置。
优选的，所述的纤维过滤装置包括中空纤维；优选的，所述中空纤维包括纤维膜、纤维块、纤维束、纤维柱其中的一种或多种；优选的，所述的过滤装置是中空纤维柱。
优选的，所述的中空纤维柱由中空纤维滤膜、滤壳等组成。细胞培养液在中空纤维柱中交替往复的流动，可在截留细胞的同时分离细胞代谢废物、目的产品等。采用往复式切向流技术可在一定程度上减慢中空纤维柱堵塞的速度，减少灌流系统对细胞的剪切力。
优选的，所述的液位传感装置包括但不限于光电液位开关、液位传感器（电容式液位传感器、超声波液位传感器）、微波或雷达传感器、振动或音叉传感器、导电性或电阻浮球开关。优选的，所述的液位传感装置为液位传感器，其包含高液位传感器和低液位传感器。
优选的，所述的调压装置包括但不限于调压泵、压缩机；优选的，所述的调压泵是空气泵，所述压缩机是真空压缩机；优选的，所述的空气泵是高压空气泵。优选的所述的调压装置还可以是空压机和真空发生器组成。
所述的调压装置可以根据设定的时间，或根据液位传感装置的感应，依次反复的切换为负压和正压。
优选的，所述的负压装置是负压泵；更优选的，所述的负压泵包括蠕动泵。
在另外一个实施方案中，一种细胞灌流培养装置，其包括：
生物反应装置；
过滤装置；
液位传感装置；
调压装置；
负压装置；
连接管道；
空气过滤装置。
所述的生物反应装置、过滤装置、液位传感装置、调压装置可以是一个或多个，并通过管道相连接。优选的，所述的生物反应装置、过滤装置、液位传感装置、调压装置通过管道依次相连接。
所述的过滤装置的侧面与负压装置相连接，所述的过滤装置的侧面可以截留细胞，发挥过滤作用。
优选的，所述的细胞灌流培养装置还可以含有废液收集装置。
采用调压装置反复交替切换正负压，带动管道的细胞培养液往复运动。当调压装置为负压时，生物反应装置中的细胞培养液被压到过滤装置里；当调压装置正压时，过滤装置里的细胞培养液部分回流至生物反应装置。细胞培养液连续不断地进入过滤装置，而废液连续不断从过滤装置的侧面，通过负压装置，进入废液收集装置。
优选的，所述生物反应装置与至少一个过滤装置的一端相连。
优选的，所述过滤装置的另一端与调压装置相连。
优选的，所述过滤装置含有一个或多个纤维过滤装置。
优选的，所述负压装置与废液收集装置相连。
优选的，所述的生物反应装置包括发酵罐、搅拌釜反应器、粘附式生物反应器、一次性生物反应器等；
优选的，所述的纤维过滤装置包括中空纤维；优选的，所述中空纤维包括纤维膜、纤维块、纤维束、纤维柱其中的一种或多种；优选的，所述的过滤装置是中空纤维柱。
优选的，所述的中空纤维柱由中空纤维滤膜、滤壳等组成。细胞培养液在中空纤维柱中交替往复的流动，可在截留细胞的同时分离细胞代谢废物、目的产品等。采用往复式切向流技术可在一定程度上减慢中空纤维柱堵塞的速度，减少灌流系统对细胞的剪切力。
优选的，所述的液位传感装置包括但不限于光电液位开关、液位传感器（电容式液位传感器、超声波液位传感器）、微波或雷达传感器、振动或音叉传感器、导电性或电阻浮球开关。优选的，所述的液位传感装置为液位传感器，其包含高液位传感器和低液位传感器。
优选的，所述的调压装置包括但不限于调压泵、压缩机；优选的，所述的调压泵是空气泵，所述压缩机是真空压缩机；优选的，所述的空气泵是高压空气泵。优选的所述的调压装置还可以是空压机和真空发生器组成。
所述的调压装置可以根据设定的时间，或根据液位传感装置的感应，依次反复的切换为负压和正压。
优选的，所述的负压装置是负压泵；更优选的，所述的负压泵包括蠕动泵。
所述的空气过滤装置包括但不限于滤网、滤膜。所述的空气过滤装置用于滤除空气中的微粒或微生物，避免了外界空气内的微粒或微生物因为负压抽取进入，污染细胞培养液的问题。
在另外一个实施方案中，一种细胞灌流培养装置，其包括：
生物反应装置；
过滤装置；
液位传感装置；
调压装置；
负压装置；
连接管道；
空气过滤装置；
开关或阀门。
所述的生物反应装置、过滤装置、液位传感装置、调压装置可以是一个或多个，并通过管道相连接。优选的，所述的生物反应装置、过滤装置、液位传感装置、调压装置通过管道依次相连接。
所述的过滤装置的侧面与负压装置相连接，所述的过滤装置的侧面可以截留细胞，发挥过滤作用。
优选的，所述的细胞灌流培养装置还可以含有废液收集装置。
采用调压装置反复交替切换正负压，带动管道的细胞培养液往复运动。当调压装置为负压时，生物反应装置中的细胞培养液被压到过滤装置里；当调压装置正压时，过滤装置里的细胞培养液部分回流至生物反应装置。细胞培养液连续不断地进入过滤装置，而废液连续不断从过滤装置的侧面，通过负压装置，进入废液收集装置。
优选的，所述生物反应装置与至少一个过滤装置的一端相连。
优选的，所述过滤装置的另一端与调压装置相连。
优选的，所述过滤装置含有一个或多个纤维过滤装置。
优选的，所述负压装置与废液收集装置相连。
优选的，所述的生物反应装置包括发酵罐、搅拌釜反应器、粘附式生物反应器、一次性生物反应器等；
优选的，所述的纤维过滤装置包括中空纤维；优选的，所述中空纤维包括纤维膜、纤维块、纤维束、纤维柱其中的一种或多种；优选的，所述的过滤装置是中空纤维柱。
优选的，所述的中空纤维柱由中空纤维滤膜、滤壳等组成。细胞培养液在中空纤维柱中交替往复的流动，可在截留细胞的同时分离细胞代谢废物、目的产品等。采用往复式切向流技术可在一定程度上减慢中空纤维柱堵塞的速度，减少灌流系统对细胞的剪切力。
优选的，所述的液位传感装置包括但不限于光电液位开关、液位传感器（电容式液位传感器、超声波液位传感器）、微波或雷达传感器、振动或音叉传感器、导电性或电阻浮球开关。优选的，所述的液位传感装置为液位传感器，其包含高液位传感器和低液位传感器。
优选的，所述的调压装置包括但不限于调压泵、压缩机；优选的，所述的调压泵是空气泵，所述压缩机是真空压缩机；优选的，所述的空气泵是高压空气泵。优选的所述的调压装置还可以是空压机和真空发生器组成。
所述的调压装置可以根据设定的时间，或根据液位传感装置的感应，依次反复的切换为负压和正压。
优选的，所述的负压装置是负压泵；更优选的，所述的负压泵包括蠕动泵。
优选的，所述的细胞灌流培养装置还可以含有废液收集装置。
所述的空气过滤装置包括但不限于滤网、滤膜。所述的空气过滤装置用于滤除空气中的微粒或微生物，避免了外界空气内的微粒或微生物因为负压抽取进入，污染细胞培养液的问题。
所述的开关或阀门安装于管道不同位置，根据需要控制液体流动或停止。优选的，所述的开关或阀门安装于过滤装置和负压装置之间。
本发明的细胞灌流培养装置，可以是细胞反复快速的进出过滤装置，从而避免细胞聚集在过滤装置的表面，减少堵塞的风险；还可以避免使用蠕动泵对细胞造成损伤。此外，所述的细胞灌流培养装置设备简单、耗材少、成本低、适合工业化扩大生产。
本发明采用的部分实验材料信息如下：
HEK293 SFM 615培养基：甘肃健顺生物科技有限公司；
L-谷氨酰胺：Sigma公司；
D-葡萄糖：Amresco公司；
3L反应器及控制器：Applikon公司；
生化分析仪：深圳西尔曼公司。
在一个实施方案中，本发明提供了一种细胞灌流培养方法，该方法能够促进活细胞密度的增加，保持细胞的高活率。
所述的细胞灌流培养方法包括以下步骤：
采用上述的细胞灌流培养装置，将细胞接种于生物反应器进行分批培养数天，开始灌流培养数天；控制灌流培养的灌流速率；本发明的哺乳动物细胞的灌流培养的方法，通过调整灌流速率，可快速提高活细胞密度同时维持高细胞活率。
优选地，所述的灌流培养过程中，可以根据活细胞密度、细胞活率、葡萄糖、乳酸的浓度调整灌流速率；
优选地，所述动物活细胞密度可以是（0.1～1.0）×106 cells/mL，优选为（0.3～0.7）×106 cells/mL。
优选地，所述批量培养的时间为1～7天，优选为2～3天。
优选地，所述开始灌流培养总天数为7～20，优选为9～15天。
优选地，所述灌流培养的灌流速率为0.2～8个培养体积/天(RV/day)，优选为0.3～4RV/day。
优选地，所述起始谷氨酰胺的浓度为1～5mM，优选2～4mM。
优选地，所述起始葡萄糖的浓度为2～15g/L，优选4～10g/L。
优选地，当所述活细胞密度为（1～6）×106 cells/mL，调整所述灌流速率至0.2～1.5 RV/day；更优选地，当所述活细胞密度为（2～5）×106 cells/mL，调整所述灌流速率至0.3～1 RV/day。
优选地，当所述活细胞密度为（5～10）×106 cells/mL时，调整所述灌流速率至1～2 RV/day；
优选地，当所述哺乳动物活细胞密度为（10～60）×106 cells/mL调整所述灌流速率至2～4 RV/day。
所述的分批培养的基础培养基为HEK293 SFM 615培养基。
所述的细胞为动物细胞，优选为哺乳动物细胞，优选脊椎动物细胞，例如来自小鼠、大鼠、猴或人类细胞系的细胞。细胞可选自上皮细胞、肌细胞、神经元细胞和腺细胞。优选的真核宿主细胞包括人胚肾(HEK)细胞、HEK 293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、中国仓鼠卵巢细胞的CHO-K1细胞、中国仓鼠卵巢细胞的CHO-S细胞、CHO-K1细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、HeLa S3细胞。
优选地，所述的HEK 293细胞最高活细胞密度为(40～60)×106cells/mL。
采用上述的细胞灌流培养装置，可以调节负压泵的速率控制细胞培养上清排除的速率，同时间接控制新鲜培养基的流加速率，可确保活细胞密度大于45×106 cells/mL，细胞活率大于95%。
同时采用上述灌流工艺，使得培养过程中，葡萄糖浓度大于1g/L，乳酸浓度小于2～4g/L。
在一个实施方案中，本发明提供了一种细胞灌流培养方法，该方法能够促进活细胞密度的增加，保持高细胞活率。
所述的细胞灌流培养方法包括以下步骤：
采用上述的细胞灌流培养装置，设置培养参数，将细胞接种于生物反应器进行分批培养数天，开始灌流培养数天；通过控制调压装置和负压装置调整灌流培养的灌流速率。本发明的哺乳动物细胞的灌流培养的方法，通过调整灌流速率，可快速提高活细胞密度同时维持高细胞活率。
优选地，所述的调整灌流培养的灌流速率是通过取样检测活细胞密度、细胞活率、离线pH、葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、铵离子，渗透压的信息，根据测定的信息的变化进行调整。
优选地，所述的调整灌流培养的灌流速率是通过取样检测活细胞密度、细胞活率、葡萄糖、乳酸的变化进行调整。
优选地，当所述活细胞密度为（2～5）×106 cells/mL和/或葡萄糖的浓度小于1～3g/L时，调整所述灌流速率至0.3～1 RV/day；更优选的灌流速率为0.4～0.6 RV/day；
优选地，当所述活细胞密度为（5～10）×106 cells/mL调整所述灌流速率至1～2RV/day, 更优选的灌流速率为1～1.8 RV/day；
优选地，当所述活细胞密度为（10～60）×106 cells/mL调整所述灌流速率至2～4RV/day，更优选的灌流速率为3～4 RV/day。
优选地，所述细胞的接种密度为（0.3～0.7）×106 cells/mL，更优选为0.5×106cells/mL。
所述细胞灌流培养方法采用往复式切向流培养方式，采用无血清悬浮培养HEK293细胞。
优选地，所述细胞灌流培养方法，其中的生物反应装置的温度维持在30～40℃，pH值为6.0～8.0，溶氧浓度即空气饱和度为10%～90%，控制搅拌速度为100～600rpm。
优选地，所述细胞灌流培养方法，其中的生物反应装置的温度维持在36～37℃，pH值为6.5～7.5，溶氧浓度即空气饱和度为20%～70%，控制搅拌速度为130～500rpm。
更优选地，所述的生物反应装置温度维持在36.5℃，pH值为6.8～7.4，溶氧浓度为30%～50%，搅拌速度为150～400rpm。
本发明的细胞培养方法与现有技术相比，可以达到以下有益的技术效果：
（1）采用的设备简单、减少过滤装置堵塞风险，避免细胞损伤、成本低、耗材少、可放大性强。
（2）可以根据细胞代谢情况，改变灌流培养基比例，结合调控培养基灌流速率，降低副产物积累，以适合动物细胞连续灌流培养，具有可控性强、过程控制简单，方便操作等特点，可以实现高密度、高产率的细胞培养灌流。
（3）采用本发明的灌流培养的方法，可确保活细胞密度大于45×106 cells/mL，细胞活率大于94%。
附图说明
图1是本发明的细胞灌流培养装置实施方案1的示意图。
部件标号说明：
| 1 | 发酵罐 |
| 2 | 中空纤维柱 |
| 4 | 调压泵 |
| 5 | 蠕动泵 |
图2是本发明的细胞灌流培养装置实施方案2的示意图。
部件标号说明：
| 1 | 发酵罐 |
| 2 | 中空纤维柱 |
| 3 | 液位传感器 |
| 4 | 调压泵 |
| 5 | 蠕动泵 |
图3是本发明的细胞灌流培养装置实施方案3的示意图。
部件标号说明：
| 1 | 发酵罐 |
| 2 | 中空纤维柱 |
| 3 | 液位传感器 |
| 4 | 调压泵 |
| 5 | 蠕动泵 |
| 6 | 废液收集装置 |
图4是本发明的细胞灌流培养装置实施方案4的示意图。
部件标号说明：
| 1 | 发酵罐 |
| 2 | 中空纤维柱 |
| 4 | 调压泵 |
| 5 | 蠕动泵 |
| 6 | 废液收集装置 |
| 7 | 空气滤膜 |
图5是本发明的细胞灌流培养装置实施方案5的示意图。
部件标号说明：
| 1 | 发酵罐 |
| 2 | 中空纤维柱 |
| 3 | 液位传感器 |
| 4 | 调压泵 |
| 5 | 蠕动泵 |
| 6 | 废液收集装置 |
| 7 | 空气滤膜 |
图6是实施例5的细胞灌流培养的活细胞密度和细胞活率随培养时间变化的曲线。
图7是实施例5的细胞灌流培养的葡萄糖浓度随培养时间变化的曲线。
图8是实施例5的细胞灌流培养的比生长速率随培养时间变化的曲线。其中，所述比生长速率是后一天活细胞密度与前一天的活细胞密度的比值。
具体实施方式
虽然本发明可以以许多不同的实施方案体现，但说明书中仅公开具体的示例性的实施方案，其举例说明了本发明的装置的构造和连接方式。需要强调的是，本发明不限于说明书所记载的特定实施方案。
本说明书附图所示的结构、比例、大小、位置等，均仅用以配合说明书所记载的实施方案，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义。任何结构的修饰、比例关系的改变、大小的调整或位置的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，仍应当是落入本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
术语“灌流细胞培养”是指培养细胞的连续过程。灌流是上游处理，其将细胞保留在生物反应器内，同时不断去除细胞、细胞废物和因细胞代谢而耗尽营养的培养基。向细胞提供新鲜培养基的速率与去除用过的培养基的速率相同。
本文所描述的与细胞培养、蛋白质和微生物等的命名法和技术都是该领域中众所周知和常用的。除非另有说明，本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法所描述的那样进行。此外，本文中使用的任何章节标题仅用于组织目的，不能被解释为限制所描述的主题。
通过参考以下实施例将更容易理解如此概括描述的本发明，这些实施例以说明的方式提供并且不意欲限制本发明。所述实施例并不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。
实施例1
如图1所示，将细胞培养液置于发酵罐1，启动调压泵4为负压，将细胞培养液吸入中空纤维柱2，然后设置固定的时间，调压泵4连续交替的产生正压和负压，与此同时，启动蠕动泵5，其产生的负压远小于调压泵，可在不影响调压泵4产生交替正压和负压的同时，将透过中空纤维柱2的细胞培养液的废液排出。
实施例2
如图2所示，将细胞培养液置于发酵罐1，启动调压泵4为负压，将细胞培养液吸入中空纤维柱2，然后液位传感器3根据测得的液位高度（设定的高位和低位两个位置），控制调压泵4连续交替的产生正压和负压，与此同时，启动蠕动泵5，其产生的负压远小于调压泵，可在不影响调压泵4产生交替正压和负压的同时，将透过中空纤维柱2的细胞培养液的废液排出。
实施例3
如图3所示，将细胞培养液置于发酵罐1，启动调压泵4为负压，将细胞培养液吸入中空纤维柱2，然后液位传感器根据测得的液位高度（设定的高位和低位两个位置），控制调压泵4连续交替的产生正压和负压，与此同时，启动蠕动泵5，其产生的负压远小于调压泵，可在不影响调压泵4产生交替正压和负压的同时，将透过中空纤维柱2的细胞培养液的废液吸入到废液收集装置6。
实施例4
如图4所示，将细胞培养液置于发酵罐1，空气滤膜7在中空纤维柱2和调压泵4之间，启动调压泵4为负压，将细胞培养液吸入中空纤维柱2，然后设置固定的时间，控制调压泵4连续交替的产生正压和负压，与此同时，启动蠕动泵5，其产生的负压远小于调压泵，可在不影响调压泵4产生交替正压和负压的同时，将透过中空纤维柱2的细胞培养液的废液吸入到废液收集装置6。
实施例5
如图5所示，将细胞培养液置于发酵罐1，空气滤膜7在液位传感器3和调压泵4之间，启动调压泵4为负压，将细胞培养液吸入中空纤维柱2，然后液位传感器3根据测得的液位高度（设定的高位和低位两个位置），控制调压泵4连续交替的产生正压和负压，与此同时，启动蠕动泵5，其产生的负压远小于调压泵，可在不影响调压泵4产生交替正压和负压的同时，将透过中空纤维柱2的细胞培养的液废液吸入到废液收集装置6。
实施例6
一种HEK 293细胞灌流培养的方法，包括如下步骤：
采用实施例2的细胞灌流培养装置，设置培养参数：发酵罐温度为36.5℃，pH值为6.8～7.4，溶氧浓度为30%～50%，搅拌速度为150～400rpm；启动调压泵产生交替正负压；启动蠕动泵控制废液排出速率并间接调整灌流培养的灌流速率。
第0天按照0.5×106 cells/mL接种细胞后，每天取样检测活细胞密度、细胞活率、葡萄糖、乳酸等，根据测定的参数变化调整搅拌速度、pH等参数；
第3天开始灌流新鲜的HEK293 SFM 615培养基；灌流速率为0.5 RV/day；第5天开始时，灌流速率为1 RV/day；第7天开始时，灌流速率为2 RV/day。
第9天开始时，灌流速率为3 RV/day至培养结束。
图6-8分别为本发明实施例1提供的连续灌流培养中活细胞密度与细胞活率、残留葡萄糖浓度和代谢生成的乳酸浓度、活细胞比生长速率。
采用本实施例的培养方法，培养至10天时，活细胞密度(VCD)为45×106 cells/mL，细胞活率为93.96%。
实施例7
一种HEK 293细胞灌流培养的方法，包括如下步骤：
采用实施例2的细胞灌流培养装置，设置培养参数：发酵罐温度为36.5℃，pH值为6.8～7.4，溶氧浓度为30%～50%，搅拌速度为150～400rpm；启动调压泵产生交替正负压；启动调压泵控制灌流速率；启动蠕动泵控制废液排出速率并间接调整灌流培养的灌流速率；
第0天按照0.5×106 cells/mL接种细胞后，每天取样检测葡萄糖、谷氨酸浓度，根据测定的参数变化调整搅拌速度、pH、温度等参数；
第3天开始灌流新鲜的HEK293 SFM 615培养基；灌流速率为0.5 RV/day；第5天开始时，灌流速率为1 RV/day；第6天开始时，灌流速率为1.4 RV/day；第7天开始时，灌流速率为2 RV/day；第8天开始时，灌流速率为4 RV/day至培养结束。
采用本实施例的培养方法，培养至第11天时，活细胞密度(VCD)为60×106 cells/mL，细胞活率为95.50%。
Claims (8)
1.一种细胞灌流培养的方法，其包括：
采用一种细胞灌流培养装置进行灌流培养，所述的细胞灌流培养装置包括：生物反应装置、过滤装置、调压装置、负压装置、连接管道；
所述的生物反应装置、过滤装置、调压装置通过管道依次相连接；
所述的过滤装置的侧面与负压装置相连接；
设置灌流培养参数，启动调压装置产生交替正负压，启动负压装置控制废液排放速率并间接调整灌流培养的灌流速率；
将细胞接种于生物反应装置进行分批培养数天，开始灌流培养数天。
2.一种细胞灌流培养的方法，其包括：
采用一种细胞灌流培养装置进行灌流培养，所述的细胞灌流培养装置包括：生物反应装置、过滤装置、液位传感装置、调压装置、负压装置、连接管道；
所述的生物反应装置、过滤装置、液位传感装置、调压装置通过管道依次相连接；
所述的过滤装置的侧面与负压装置相连接；
设置灌流培养参数，启动调压装置产生交替正负压，启动负压装置控制废液排放速率并间接调整灌流培养的灌流速率；
将细胞接种于生物反应装置进行分批培养数天，开始灌流培养数天。
3.如权利要求1或2所述的细胞灌流培养的方法，其中所述的细胞为动物细胞，所述动物细胞包括HEK 293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa S3细胞。
4.如权利要求1或2所述的细胞灌流培养的方法，所述的灌流培养参数为生物反应装置的温度维持在30～40℃，pH值为6.0～8.0，溶氧浓度即空气饱和度为10%～90%，控制搅拌速度为100～600rpm。
5.如权利要求4所述的细胞灌流培养的方法，所述的灌流培养参数为生物反应装置的温度维持在36.5℃，pH值为6.8～7.4，溶氧浓度为30%～50%，搅拌速度为150～400rpm。
6.如权利要求1或2所述的细胞灌流培养的方法，所述的调整灌流培养的灌流速率是通过取样检测活细胞密度、细胞活率、离线pH、葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、铵离子、渗透压的信息，根据测定的信息的变化调整灌流培养的灌流速率。
7.如权利要求6所述的细胞灌流培养的方法，所述的调整灌流培养的灌流速率是通过取样检测活细胞密度、细胞活率、葡萄糖、乳酸的信息变化调整灌流培养的灌流速率。
8.如权利要求7所述的细胞灌流培养的方法，所述的葡萄糖浓度维持在大于1g/L，所述的乳酸浓度维持在小于4g/L。
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|---|---|
| CN (1) | CN115747055A (zh) |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103347595A (zh) * | 2011-02-10 | 2013-10-09 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 气动交变压力膜细胞分离系统 |
| CN109628407A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-04-16 | 哈药集团技术中心 | 高密度长期培养表达抗vegf人源化单克隆抗体重组cho细胞的方法 |
| CN210394394U (zh) * | 2018-12-19 | 2020-04-24 | 比欧联科供应链管理(北京)有限公司 | 一种透气袋正反向灌流细胞培养装置 |
| CN111406105A (zh) * | 2018-11-02 | 2020-07-10 | 上海药明生物技术有限公司 | 具有连续收获而无细胞排出的强化灌流细胞培养方法 |
| US20200399585A1 (en) * | 2018-03-19 | 2020-12-24 | Fujifilm Corporation | Product production method |
| CN113265330A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-17 | 河南大学 | 一种适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统 |
| CN113355242A (zh) * | 2020-03-06 | 2021-09-07 | 尚玉宽 | 灌流模块及灌流培养系统 |
| CN115074243A (zh) * | 2022-05-19 | 2022-09-20 | 泰舸赛迩生命科技(无锡)有限公司 | 高膜柱通量细胞灌流培养膜柱系统及其方法和应用 |
| CN218596388U (zh) * | 2022-11-16 | 2023-03-10 | 四川至善唯新生物科技有限公司 | 一种细胞培养过滤装置 |
| WO2023190829A1 (ja) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | 富士フイルム株式会社 | 生産物の製造方法、及び生産物 |
| US20230313117A1 (en) * | 2020-07-20 | 2023-10-05 | Janssen Biotech, Inc. | Fluid filtration system |
-
2022
- 2022-11-16 CN CN202211459628.9A patent/CN115747055A/zh active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103347595A (zh) * | 2011-02-10 | 2013-10-09 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 气动交变压力膜细胞分离系统 |
| US20200399585A1 (en) * | 2018-03-19 | 2020-12-24 | Fujifilm Corporation | Product production method |
| CN111406105A (zh) * | 2018-11-02 | 2020-07-10 | 上海药明生物技术有限公司 | 具有连续收获而无细胞排出的强化灌流细胞培养方法 |
| CN210394394U (zh) * | 2018-12-19 | 2020-04-24 | 比欧联科供应链管理(北京)有限公司 | 一种透气袋正反向灌流细胞培养装置 |
| CN109628407A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-04-16 | 哈药集团技术中心 | 高密度长期培养表达抗vegf人源化单克隆抗体重组cho细胞的方法 |
| CN113355242A (zh) * | 2020-03-06 | 2021-09-07 | 尚玉宽 | 灌流模块及灌流培养系统 |
| US20230313117A1 (en) * | 2020-07-20 | 2023-10-05 | Janssen Biotech, Inc. | Fluid filtration system |
| CN113265330A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-17 | 河南大学 | 一种适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统 |
| WO2023190829A1 (ja) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | 富士フイルム株式会社 | 生産物の製造方法、及び生産物 |
| CN115074243A (zh) * | 2022-05-19 | 2022-09-20 | 泰舸赛迩生命科技(无锡)有限公司 | 高膜柱通量细胞灌流培养膜柱系统及其方法和应用 |
| CN218596388U (zh) * | 2022-11-16 | 2023-03-10 | 四川至善唯新生物科技有限公司 | 一种细胞培养过滤装置 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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