CN113265330A - 一种适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统，循环泵的转速、正反向转动交替时间由控制器控制，循环泵正反向控制，降低柱堵塞的风险，循环泵反向转动时起到膜反冲效果；纤维柱模块内安装液体分布器使得每根纤维内液体流量一致，充分利用膜面积，提高膜载量；控制器设定进液泵与出液泵的转速，控制器读取进液天平和出液天平数据并进行运算后反馈控制进液泵与出液泵，从而维持系统设定的灌流速度。本发明通过循环泵正反向交替转动、“流量自调整”功能、“体积平衡”功能三个核心功能共同确保了减缓中空纤维模块堵塞、反应器内体积平衡、进液/出液速度精确，从而实现稳定的细胞高密度培养。

Description

一种适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统
技术领域
本专利涉及动物细胞灌流培养技术领域，具体涉及了一种适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统。
背景技术
利用哺乳动物细胞培养生产疫苗、抗体等生物制品时，由于产量往往与细胞密度正相关，在规模化细胞培养时，往往面临着细胞密度低，导致产物产量低。而通过提高细胞密度，是提高产物产量的有效途径。尽管补料批次培养可通过补加浓缩的营养成分促进细胞生长，从而在一定程度提高细胞密度。但随着细胞的生长，乳酸、铵离子等代谢产物的逐渐积累，会抑制细胞的生长。灌流培养通过补加新鲜的培养基提供营养物质，同时去除旧培养基降低代谢副产物，从而获得较高的细胞密度，也进一步提高疫苗、抗体的产量，成为实现细胞高密度培养的主要策略。灌流培养工艺的实现需要借助细胞截留系统，其核心为通过中空纤维对泵出反应器培养基中的细胞进行截留，细胞返回至反应器，而培养基则排放至废液瓶，同时利用一台蠕动泵向反应器中加入等体积的新鲜培养基，维持反应器中培养体积的恒定。
目前的细胞截留系统存在中空纤维柱易堵塞、膜丝内流量不均匀无法充分利用膜面积、无法在线实时监测(反馈)中空纤维膜堵塞等问题，并且由于无法实现进液/出液自动化而导致的进液量与出液量不平衡导致反应器内体积变化、蠕动泵计量不精准导致灌流速度不准确等问题，从而导致细胞灌流工艺的波动，批次间差异较大。
发明内容
哺乳动物细胞培养存在密度低、细胞截留系统的中空纤维柱易堵塞，且需手动控制与调节进液/出液，易导致细胞工艺的波动、膜丝内流量不均匀导致膜面积利用不充分等问题，本申请针对细胞截留系统的中空纤维柱易堵塞的问题设计了一种适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统。
一种适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统，包括中空纤维柱模块、循环泵、进液泵、出液泵、储液袋、废液袋、进液天平、出液天平、压力传感器和控制器。所述循环泵、进液泵、出液泵、进液天平、出液天平通过通讯线与控制器相连，控制器对其进行控制与反馈控制。
所述中空纤维柱模块的进口端与出口端分别通过硅胶管与反应器相连，与反应器构成闭合回路，通过循环泵驱动含细胞培养基在中空纤维柱模块与反应器中循环流动。
所述储液袋内为新鲜培养基，通过硅胶管与反应器连接，通过进液泵泵入到反应器中。进液泵转速(流量)取决于细胞培养工艺。所述储液袋放置于进液天平上，进液天平将测量数据传输至控制器，控制器读取数据并计算实际进液速度(流量)、累计进液量。当实际进液速度(流量)与设定进液速度(流量)产生偏差时，通过修正进液泵转速(流量)实现进液量的精准。
所述废液袋放置于出液天平上，废液袋通过硅胶管与中空纤维柱模块的外腔出口相连，通过出液泵将中空纤维模块外腔的废液泵入到废液袋中。出液泵转速(流量)取决于细胞培养工艺，出液天平将测量数据传输至控制器，控制器读取数据并计算实际出液速度(流量)、累计出液量。当实际出液速度(流量)与设定出液速度(流量)产生偏差时，控制器通过修正出液泵转速(流量)实现出液量的精准。
通过控制器控制并修正进液泵与出液泵的转速，从而达到设定所需的灌流速度。从而避免现有技术中采用蠕动泵长期运作、反应器中培养基粘度增加、中空纤维柱堵塞等，导致进液泵与出液泵实际流量与设定值产生偏差，泵入反应器新鲜培养基的体积(质量)与泵出中空纤维柱模块外腔废液的体积(质量)产生差值，从而导致反应器内培养体积产生变化，导致工艺产生较大波动的难题。
循环泵驱动含细胞培养基在中空纤维柱模块与反应器中循环流动。所述控制器控制循环泵的转速、正反向转动交替时间；控制器可以设定循环泵的转速(流量)、转动方向(正向转动、反向转动)、正反向转动交替周期。
所述循环泵的交替正反向转动可实现中空纤维柱中流向的改变，当反向转动时可起到膜反冲效果，可以有效降低中空纤维堵塞；通过纤维柱模块内安装液体分布器使得每根纤维内液体流量一致，充分利用膜面积，提高膜载量。循环泵的交替正反向转动以及纤维柱模块内的液体分布器的联合作用，大大降低了中空纤维柱堵塞的风险，提高中空纤维载量。
所述循环泵的管路死体积小，且管路为一体式设计，不存在泄露的风险，可以确保全程无菌操作；循环泵可以采用多泵头，将主管路分为多个支管路，从而降低蠕动泵转速，降低管道内的压力以及剪切力，有效降低或消除剪切力对细胞造成的损伤。
中空纤维柱内腔进口、内腔出口和外腔出口处均设置有压力传感器。压力传感器用于检测中空纤维柱模块内腔进口压力、内腔出口压力、外腔出口压力，并计算跨膜压。当压力传感器数值异常、跨膜压异常时，即反馈中空纤维膜堵塞或破损。
控制器可根据出液天平的数值计算出中空纤维柱的水通量，并与出液泵的设定流速(流量)进行比对，进一步反馈中空纤维堵塞情况。
控制器自动对比累计进液量与累计出液量，当两者产生差值时，通过调整进液泵或出液泵的转速(流量)进行补偿差值，从而保证反应器中进出液体积(质量)平衡。
即控制器可对比进液天平、出液天平的累计量，当两者产生偏差时，通过调整进液泵或出液泵的流量，消除进液天平与出液天平差值，从而维持反应器内体积恒定。
进液天平和出液天平不限于传统意义的天平，可以由称重模块、具有称重功能的压力传感器等组成。
所述中空纤维柱分为内腔与外腔。含细胞培养基在中空纤维柱内腔流动。所述中空纤维柱的孔径小于细胞直径，对细胞实现截留，细胞返回至反应器。代谢副产物(乳酸、铵离子)以及细胞碎片等可透过中空纤维到达中空纤维外腔，并通过管路排放至废液袋，废液袋放置于出液天平上。中空纤维柱的中空纤维膜材质可以为PES、PVDF、PE等，中空纤维的内径为0.2-2mm，中空纤维的膜孔径为0.1-0.35μm。优选的，中空纤维柱的不同规格(膜面积)采用相同长度，通过增加中空纤维数量增加膜面积。
进一步的，该培养系统可通过维持中空纤维柱面积/循环泵流速恒定的原则进行线性放大。该培养系统适用于STR反应器、WAVE反应器等形式的反应器，适用于不锈钢反应器和一次性反应器。所述培养系统的中空纤维柱以及管路采用封闭式设计，可进行辐照灭菌、高温高压灭菌。管路可采用焊接管、CPC接头、鲁尔接头、ReadyMate接头等方式进行管路连接，或与反应器、储液袋、废液袋进行无菌连接。
进一步的，该培养系统的适应于悬浮细胞培养、微载体悬浮培养，适用于疫苗、抗体等生物制品的生产。
本发明的高密度培养系统，能够有效地提高细胞密度，降低中空纤维膜堵塞风险，提高中空纤维载量，确保进液/出液速度稳定，维持反应器内进液/出液体积(质量)平衡(反应器内液体体积变化小于1％)，实时监测中空纤维堵塞状况，从而确保细胞高密度培养工艺稳定可靠。
该系统通过控制循环泵的转速、正反向转动交替时间，从而对中空纤维内部的滤饼进行高效冲刷，尤其是反向转动时，可起到膜反冲效果，大大降低了中空纤维柱堵塞的风险；该系统实时读取进液天平、出液天平的累积量并计算流量，并反馈至进液泵与出液泵，对流量进行校正，保证进液/出液速度精准；该系统通过对比进液天平、出液天平累计量的差值，判别反应器内进出液是否平衡，若进出液不平衡，则通过补加一定量的新鲜培养基或抽出一定量的废液，从而维持反应器内培养体积平衡。
该系统集成设计，自动化程度高，可有效提高细胞密度、降低中空纤维膜堵塞风险，提高中空纤维载量，确保细胞高密度培养工艺稳定可靠，易于操作，可线性规模放大，可被广泛用于病毒疫苗及抗体生产过程。
以10L反应器适配的灌流培养系统为例，进液天平、出液天平的精确度可以达到1g，反应器内的液体体积变化控制在1％；控制器的平衡控制功能窗口可视化程度高，仅需设置2个参数(平衡功能触发阈值；平衡功能工作时长)，控制器即可实现自动化调节；针对于动物细胞高密度培养设计，天平的称重不仅用于进液、出液的平衡，也用于进液泵转速(流量)与出液泵转速(流量)的修正。且动物细胞高密度培养周期往往比较长，通常大于7天，此过程中往往需要多次更换储液容器，控制器不仅需要读取天平(称重模块)的实时值，更重要的是进行累计值的精确计算。
本发明通过循环泵正反向交替转动、控制器流量自调整、体积平衡功能三个核心功能共同确保了减缓中空纤维模块堵塞、反应器内体积平衡、进液/出液速度精确，从而实现稳定的细胞高密度培养。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的动物细胞高密度培养系统的示意图；
图2是本发明的中空纤维柱的示意图；
图3是本发明的动物细胞高密度培养系统与反应器接口的示意图；
图4是循环泵的安装方式示意图；
图5是多泵头方式示意图；
图6是循环系统反向转动时膜反冲效果示意图；
图7是纤维柱模块内安装液体分布器及其效果示意图；
图8是“流量自调整”功能逻辑控制流程图；
图9是“体积平衡”功能逻辑控制流程图；
图10是HEK 293细胞生长曲线；
图11是CHO细胞生长曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
如图1所示，一种适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统，包括中空纤维柱模块1、循环泵2、进液泵3、出液泵4、储液袋5、废液袋6、进液天平7、出液天平8、压力传感器9、控制器10和反应器11；
循环泵2、进液泵3、出液泵4、进液天平7、出液天平8、压力传感器9均通过通讯线12与控制器10相连，进行反馈控制。
如图2-4所示，中空纤维柱模块1分为内腔与外腔，内腔的出液口13、进液口14分别通过管路与反应器的进口16与出口17相连接，中空纤维柱模块1与反应器11一并构成循环回路。内腔的进液口14与反应器连接的管路安装在循环泵2上，通过在控制器10设定循环泵的流量(流速)与正反转动交替周期，控制器10控制循环泵2驱动细胞培养基在中空纤维柱模块1与反应器11中循环流动。如图4所示，循环泵2可以采用蠕动泵、低剪切力离心泵或齿轮泵等多种形式，如图4(a)所示，内腔的进液口14处设置蠕动泵驱动内腔内液体的流动，如图4(b)所示；在内腔的进液口14和内腔的出液口13处均设置低剪切力离心泵驱动内腔内液体的流动，或者在内腔的进液口14流动处设置2个低剪切力离心泵；如图4(c)所示：在内腔的进液口14处设置齿轮泵驱动内腔内液体的流动。如图5所示，循环泵采可用多泵头将主管路分为多个支管路。其中图5(a)为单泵头，图5(b)为双泵头，图5(c)采用4个泵头将主管路分成4个支路。
中空纤维柱的外腔出口15通过管路与废液袋6相连接，管路安装在出液泵4上，通过出液泵4将中空纤维柱外腔的废液泵出至废液袋6中。储液袋5通过管路与反应器补料口18相连，管路安装在进液泵3上，通过进液泵3将新鲜培养基泵入反应器11中。通过在控制器10设定进液/出液速度(流量)，控制器10控制进液泵3与出液泵4按照所需速度(流量)进行转动。
储液袋5放置于进液天平7上，进液天平7将称量数值实时传输至控制器10，废液袋6放置于出液天平8上，出液天平8将称量数值实时传输至控制器10。
控制器10实时获取进液天平7与出液天平8的称量数值，并计算实际进液速度(流量)、累计进液量、实际出液速度(流量)、累计出液量。当进液泵3的实际速度(流量)或(与)出液泵4的实际速度(流量)与设定值产生偏差时，控制器10通过修正进液泵3的速度(流量)或(与)出液泵4的速度(流量)，从而保证进液/出液速度(流量)的精准(“流量自调整”功能)。
当累计进液量与累计出液量的数值产生偏差时，即泵入反应器的培养基的体积(质量)与泵出反应器的培养基的体积(质量)产生偏差时，控制器10通过在一定时间内暂停进液泵3(或出液泵4)，并提高出液泵4(或进液泵3)的转速(流量)，消除累计进液量与累计出液量的偏差，从而保证反应器11中进出液体积(质量)平衡(“体积平衡”功能)。
三个压力传感器9分别检测中空纤维柱内腔进液口14、出液口13以及外腔出液口15的压力，并将压力数值传输至控制器10，用于检测中空纤维柱1中的压力变化，并计算跨膜压，用于反馈中空纤维堵塞状况。
如图6所示，当循环系统正向转动时，含细胞培养基自下向上流经中空纤维柱内腔，细胞碎片、代谢废物等小分子物质通过中空纤维膜到达中空纤维柱外腔。当循环系统反向转动时，含细胞培养基自上向下流经中空纤维柱内腔，由于循环泵的抽吸作用，在内腔产生负压，外腔中的部分培养基通过膜孔进入内腔，对膜孔附近的滤饼起到反冲效果(膜反冲)，被反冲脱落的滤饼进一步被内腔流动液体冲出纤维膜柱。
如图7所示，当含细胞培养基从内腔接口19进入到中空纤维柱内腔后，经过液体分布器20的分流，使得含细胞培养基均匀的进入到膜丝内腔21中，从而避免了避免外周膜丝内流量低而导致的膜面积利用不充分，提高纤维膜柱利用效率。
如图8所示，设定进/出液速度(流量)后运行系统，控制器开始计时并读取进/出液天平计量值，控制器计算一个计时周期内进/出液天平的累计值并计算进/出液速度(流量)实际值，并判定与设定值差值，若差值小于阈值，则保持当前进/出液泵转速；如差值大于阈值，则根据实际值与设定值的比值，按照比例修正进/出液泵转速，然后进入下一个运算周期(“流量自调整”功能)。
如图9所示，系统运行后，控制器开始计时并读取进/出液天平计量值，控制器计算一个计时周期内进/出液天平的累计值，并判定与设定值差值，若差值小于阈值，则保持当前进/出液泵转速；若差值大于阈值且>0，则暂定进液，提高出液速度，补偿差值；若差值大于阈值且＜0，则暂定出液，提高进液速度，补偿差值，然后进入下一个运算周期(“体积平衡”功能)。
利用本发明的培养系统进行腺病毒载体疫苗(HEK 293细胞)的生产：
采用HEK 293无血清培养基培养HEK 293悬浮细胞，初始细胞密度为0.5×106cells/mL。采用本发明的细胞高密度培养系统进行细胞培养，经过7d培养，细胞密度达到1.4×107cells/mL，细胞扩增28倍。细胞状态良好，细胞活率高，相对于批次培养，细胞密度提高2.2倍以上。当接种腺病毒载体48小时内，细胞仍能够维持较高的细胞活力，即高密度培养系统产生的剪切力小，对细胞损伤较低。培养结束后，收获培养基中腺病毒载体滴度可以达到1010IFU/mL，相对于批次培养，病毒产量提高5倍以上。HEK 293细胞生长曲线如图10所示。
利用动物细胞高密度培养系统进行抗体(CHO细胞)的生产：
采用本发明的细胞高密度培养系统进行CHO细胞高密度培养用于抗体生产，初始细胞密度为1.0×106cells/mL，经过11d培养，细胞密度最大可达到1.3×108cells/mL，细胞扩增130倍。细胞培养过程中，细胞活率维持在95％以上，CHO细胞无明显的损伤。相对于传统的批次培养，利用本发明的细胞高密度培养系统可实现连续收获抗体蛋白，批次抗体蛋白产量提高10倍以上。CHO细胞生长曲线如图11所示。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统，其特征在于，主要包括中空纤维柱、反应器、循环泵、进液泵、出液泵、储液袋、废液袋、进液天平、出液天平、压力传感器和控制器；
中空纤维柱的进液口与出液口分别通过硅胶管与反应器相连，储液袋通过管路与反应器相连，进液泵将储液袋的培养基泵入到反应器中，废液袋通过管路与中空纤维柱相连，出液泵将中空纤维柱外腔的废液泵出至废液袋中，
循环泵驱动含细胞培养基在中空纤维柱模柱与反应器间循环流动。
储液袋放置于进液天平上，废液袋放置在出液天平上；控制器读取进液天平、出液天平的数值，并计算进液泵泵入反应器新鲜培养基的累计量、出液泵泵出中空纤维外腔培养基的累计量，并控制进液泵与出液泵的转速、循环泵的转速及循环泵的正向转动和反向转动的交替。
2.如权利要求1所述的适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统，循环泵采用多泵头将主管路分为多个支管路。
3.如权利要求1所述的适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统，所述中空纤维柱的中空纤维膜材质为PES、PVDF或PE，中空纤维柱包括内腔与外腔，中空纤维膜丝的内径为0.2-2mm，中空纤维膜的孔径为0.1-0.35μm。
4.如权利要求1所述的适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统，中空纤维柱内腔进口、内腔出口和外腔出口处均设置有压力传感器。
5.如权利要求1所述的适用于疫苗及抗体高效生产的动物细胞高密度培养系统，其通过循环泵反向转动引起的膜反冲效果，进一步减缓中空纤维柱堵塞；通过纤维柱模块内安装液体分布器使得纤维内液体流量一致，充分利用膜面积，提高膜载量。
6.如权利要求1所述的动物细胞高密度培养系统在疫苗和抗体生产中的应用。
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