CN114901794A - 用于生产接种物的过程和系统 - Google Patents

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Abstract

公开了一种生产用于下游细胞生产的接种物的过程和系统。所述接种物在灌注生物反应器中生产，其中营养介质进料随着所述生物反应器内生物质浓度增加而增加。生物质传感器可以用于周期性地或连续地监测生物质浓度。可以将该信息供应给控制器，用于以与生产具有增加的细胞密度的接种物成正比的方式自动增加营养介质进料速率。所述过程和系统还可以包括用于在所述过程期间在所述灌注生物反应器内维持恒定容积水平的自动子系统。

Description

用于生产接种物的过程和系统
背景技术
生物反应器广泛用于生物制药工业内，所述生物反应器是可以在实验室或工业规模上进行生物反应或过程的设备。生物反应器可以用于生产所有不同类型的生物产物。生物产物可以包括例如细胞培养物和衍生自细胞培养物的材料，包括饮料、生物燃料、生物能、生物化学品、抗生素、氨基酸、酶、单克隆抗体、单体、蛋白质、食品培养物、生物聚合物、醇、调味剂、香料等。在一些实施例中，细胞培养物可以生长用于细胞疗法。细胞疗法是通过施用已经离体操作或改变的自体、同种异体或异种细胞来预防、治疗、治愈或减轻人的疾病或损伤。细胞疗法的一个目标是修复、替换或恢复受损组织或器官。
细胞培养物通常以分批过程生长，其中生物材料保持在生物反应器中直到反应时间结束。在这些过程的某些中，含在生物反应器内的流体培养基可以被周期性地或连续地去除和再进料，以便补充含在流体培养基内的营养物和可能去除在该过程期间产生的有害副产物。
在如以上所描述的分批反应器中使细胞培养物生长之前，首先进行接种过程。例如，需要微生物的接种物以提供具有期望的微生物活细胞计数的群体，其适合于按比例放大到适于商业规模生产的水平。目前，接种过程以分批模式进行。由于营养物限制和抑制性代谢物的积累，与这些常规过程相比，对最大细胞密度存在限制。在接种过程期间较低的细胞密度可以导致商业分批反应器中所需的时间周期延长。例如，进料到具有较低的细胞密度的分批反应器的接种物需要下游生产生物反应器首先花费大量的时间产生细胞团，而不是生产所期望的生物产物，诸如蛋白质。最终，在较大的商业分批反应器内需要较长的温育时间，这直接影响总体过程的效率。
鉴于以上所述，需要存在改进的方法和系统，用于生产微生物的接种物，以便随后转移到更大的生产生物反应器中。还需要存在取得接种物的方法和系统，其可以在接种过程期间达到更高的活细胞计数并且产生更高的细胞密度。还需要存在生产接种物的接种过程，该接种物可以被进料到生产生物反应器中并且减少生产生物反应器中生产生物产物所需的时间量。
发明内容
通常，本公开涉及在培养过程中产生快速增加的细胞密度和活细胞计数的接种过程。本公开的接种过程和系统通常包括灌注生物反应器，其中灌注速率随着细胞培养物生物质的增加而变化和增加，而不是保持恒定。事实上，可以使用自动的方法基于实时生物质测量来调节到灌注生物反应器的营养物进料速率。通过该过程，可以生产具有显著增加的细胞密度和/或活细胞计数的接种物。然后可以将接种物进料到更大的生产生物反应器用于生产生物产物，诸如蛋白质。通过本公开的接种过程和系统，生产生物反应器中所需的时间量可以显著减少，这可以显著增加该过程的生产量。我们已经发现，当基于活细胞容积/生物容积(biovolume)的测量时，灌注速率的控制得到改进，这与基于活细胞密度的先前方法形成对比。
因此，在第一方面，本公开涉及生产用于后续细胞培养生产过程的接种物的过程，其包含：
将细胞培养物引入灌注生物反应器；
以一定流速向灌注生物反应器进料营养介质并且从灌注生物反应器中取出流体介质；
使用生物质传感器确定灌注生物反应器内随时间推移的生物质浓度，该生物质传感器与控制器连通；以及
基于由生物质传感器感测的生物质浓度调节进入灌注生物反应器的营养介质流速，该控制器被配置成基于从生物质传感器接收的信息调节该介质流速，
其中基于以下关系调节该营养介质流速：
Figure BDA0003724384370000021
其中K是生物容积比灌注速率(mL进料/mL生物容积/天)；
Figure BDA0003724384370000022
是生物容积分数并且是在细胞的细胞膜内部的灌注生物反应器的容积，表示为百分比或分数(mL生物容积/mL生物反应器)；以及
P是以m进料/m生物反应器/天表示的灌注速率。
在相关的实施例中，本发明还涉及生产用于后续细胞培养物生产过程的接种物的过程，其包含：
将细胞培养物引入灌注生物反应器；
以一定流速向灌注生物反应器进料营养介质并且从灌注生物反应器中取出流体介质；
使用生物质传感器确定灌注生物反应器内随时间推移的生物容积分数，该生物质传感器与控制器连通；以及
基于生物容积分数调节进入灌注生物反应器的营养介质流速，控制器被配置成基于从生物质传感器接收的信息调节介质流速，
其中基于以下关系调节该营养介质流速：
Figure BDA0003724384370000033
如以上所描述的。
该过程可以用于生产用于后续细胞培养物生产方法的接种物，诸如生产感兴趣的生物产物。该过程可以包括将细胞培养物引入灌注生物反应器。营养介质可以以一定流速进料到灌注生物反应器。同时，流体介质可以从灌注生物反应器中抽取。从灌注生物反应器抽取的流体介质也可以被过滤以防止细胞损失。在灌注生物反应器中的细胞培养物生长期间，使用与灌注生物反应器中的细胞培养物流体连通的生物质传感器随时间确定生物质浓度。生物质传感器还可以与控制器连通。然后可以基于由生物质传感器发送的生物质浓度调节营养介质流速。控制器可以被配置成基于从生物质传感器接收的信息调节介质流速。
例如，生物质传感器可以包含适合于放置在灌注生物反应器内的电容传感器。可替代地，生物质传感器可以包含光学细胞计数器。在一个实施例中，例如，灌注生物反应器可以与自动采样系统流体连通。自动采样系统可以连续地或周期性地从灌注生物反应器中去除样品以使用生物质传感器进行测试。在一个实施例中，生物质传感器可以至少每6小时，诸如至少每4小时，诸如至少每30分钟，诸如至少每10分钟获取生物质浓度读数。可以将生物质浓度测量值供应给控制器，该控制器可以包括用于确定营养介质流速的算法。例如，可以基于以下关系调节该营养介质流速：
Figure BDA0003724384370000031
其中K是生物容积比灌注速率(mL进料/mL生物容积/天)；
Figure BDA0003724384370000032
是生物容积分数并且是在细胞的细胞膜内部的灌注生物反应器的容积，表示为百分比或分数(mL生物容积/mL生物反应器)；以及
P是以mL进料/mL生物反应器/天表示的灌注速率。
通常，控制器可以被配置成当生物反应器内的细胞密度增加时增加进入灌注生物反应器的营养介质流速。
除了控制进料到灌注生物反应器中的营养介质流速之外，还可以控制从灌注生物反应器中抽取的流体介质流速。例如，在一个实施例中，可以确定灌注生物反应器内的生物质和流体介质的量。基于该量，可以选择性地增加或减少从灌注生物反应器抽取流体介质的速率。在一个实施例中，例如，灌注生物反应器内的生物质和流体介质的量可以使用称重装置来确定。该称重装置可以与控制器连通。基于来自称重装置的重量信息，控制器可以被配置成控制与灌注生物反应器流体连通的泵送装置以选择性地增加或减少流体介质的抽取速率。例如，抽取流体介质的速率可以以这样的方式进行，使得在灌注生物反应器中含有流体介质和细胞培养物的容积在该过程期间保持恒定。
代替称重装置，该过程和系统还可以使用容积水平指示器来确定灌注生物反应器内的流体介质的量。容积指示器还可以与控制器连通以自动控制流体介质从灌注生物反应器的取出速率。
灌注生物反应器通常可以具有约10升至约4000升，或约1000升至约4000升的容积。在接种过程期间，细胞培养物在灌注生物反应器内可以达到大于约10×106细胞/mL，诸如大于约30×106细胞/mL，诸如大于约50×106细胞/mL，诸如大于约70×106细胞/mL的细胞密度。在一个实施例中，细胞培养物可以达到100×106细胞/mL或更大的细胞密度。细胞密度通常小于约1000×106细胞/mL。细胞培养物可以在灌注生物反应器中保持约3天至约12天。
本公开的过程可以进一步包括在已经达到期望的细胞密度之后将细胞培养物从灌注生物反应器转移到第二生物反应器的步骤。例如，第二生物反应器可以是分批进料反应器，并且可以具有约10L至约30,000L的容积。例如，第二生物反应器的容积可以具有大于灌注生物反应器的容积。例如，灌注生物反应器的容积与第二生物反应器的容积之间的比率可以为约1:3至约1:40，诸如约1:4至约1:10。细胞培养物可以在第二生物反应器中保持少于约12天，诸如少于约11天，诸如少于约10天的时间周期，并且仍然能够生产所期望的量的生物产物。
本公开还涉及生产用于后续细胞培养物生产过程的接种物的系统。因此，在第二方面，本发明还涉及生产用于后续细胞培养物生产过程的接种物的系统，其包含：
灌注生物反应器；
与灌注生物反应器流体连通的营养介质进料，营养介质进料用于将营养介质进料到灌注生物反应器以使细胞培养物生长；
用于从灌注生物反应器取出流体介质的流出物；
泵送装置，其与灌注生物反应器的流出物流体连通以从灌注生物反应器取出受控量的流体介质；
用于监测灌注生物反应器的重量的称重装置；
生物质传感器，诸如电容传感器，其与灌注生物反应器流体连通以确定灌注生物反应器内的生物质浓度；以及
与生物质传感器和称重装置连通的控制器，该控制器被配置成基于从生物质传感器接收的信息控制营养介质进料以增加或减少被进料到灌注生物反应器的营养介质的流速，该控制器还被配置成基于从称重装置接收的信息控制该泵送装置以增加或减少从灌注生物反应器抽取流体介质的流速，
其中该控制器基于以下关系控制进入灌注生物反应器的营养介质的流量：
Figure BDA0003724384370000051
Figure BDA0003724384370000052
如以上所描述的。
该系统包括与灌注生物反应器流体连通的营养介质进料。营养介质进料用于将营养介质进料到灌注生物反应器以使细胞培养物生长。灌注生物反应器还可以包括用于从灌注生物反应器取出流体介质的流出物。泵送装置可以与流出物流体连通以控制流体介质流出灌注生物反应器。该系统可以进一步包括用于监测灌注生物反应器的重量的称重装置和与灌注生物反应器连通的用于确定灌注生物反应器内的生物质浓度的生物质传感器。控制器可以与生物质传感器和称重装置连通。该控制器可以被配置成基于从生物质传感器接收的信息来控制营养介质进料以增加或减少进料到灌注生物反应器的营养介质的流速。控制器还可以被配置成基于从称重装置接收的信息来控制泵送装置以增加或减少来自灌注生物反应器的流体介质的流速。例如，控制器可以包含一个或多个微处理器。
如以上所描述的，本公开的过程和系统特别适用于生产用于后续细胞培养物生产过程的接种物。
因此，在第三方面，本发明涉及细胞培养物生产过程，其包含：
通过本发明第一方面的方法生产包含表达生物产物的宿主细胞的接种物；
将接种物引入生产生物反应器中，将细胞培养物引入灌注生物反应器中；
培养宿主细胞以生产生物产物；
从细胞培养物中收获生物产物；以及
任选地对生物产物进行一个或多个纯化步骤。
然而，可替代地，本公开的过程和系统可以用于生产生物产物而无需转移至后续分批生物反应器。例如，在一个实施例中，细胞培养物可以在灌注生物反应器中温育以达到所期望的细胞密度。然后可以将细胞培养物进料到纯化过程和/或进料到从细胞培养物收获生物产物的过程。
下面更详细地讨论本公开的其它特征和方面。
附图说明
在说明书的剩余部分(包括参考附图)，更具体地阐述了本公开的完整和可实现的公开，其中：
图1是根据本公开的用于生产用于下游细胞生产的接种物的灌注生物反应器系统的一个实施例；
图2是用于生产接种物并且将接种物转移到用于生产生物产物的大规模生物反应器的系统的一个实施例；以及
图3是绘示本公开的各种益处和优点的图形表示。
图4A至4B示出了根据本文的实施例的可变进料的说明性实例。
图5示出了根据每生物容积标准化的灌注培养基进料速率的函数的浓缩营养物进料速率。
图6示出了根据每细胞标准化的灌注培养基进料速率的函数的浓缩营养物进料速率。
图7示出了根据每生物容积标准化的灌注培养基进料速率的函数的浓缩营养物进料速率。
图8示出了根据每细胞标准化的灌注培养基进料速率的函数的浓缩营养物进料速率。
图9示出了根据本文中实施例的基于恒定每生物容积的进料策略。
图10示出了用于检查生物容积比灌注速率对细胞培养物性能的条件选择。
图11A至11B示出了四种BVSPR条件下的介质消耗和细胞密度。
图12示出了用7mL/mL/天的BVSPR条件培养的五个细胞克隆的细胞密度。
图13示出了N-1过程从实验室规模按比例放大到50L生物反应器。
具体实施方式
本领域普通技术人员应当理解，本讨论仅是对示范性实施例的描述，并不旨在限制本公开的更广泛的方面。
通常，本公开涉及用于生产生物产物的过程和系统。更具体地，本公开涉及用于生产接种物的过程和系统，该接种物将被转移到用于生产生物产物的大规模生物反应器中。接种物在灌注生物反应器中生长，其中该过程的目的是在培养过程中生产快速增加的生物质。使用过程控制以小心地控制进料到灌注生物反应器的营养介质速率和从灌注生物反应器的流体介质取出速率。根据本公开，周期性地和/或恒定地调节营养介质流速和取出流速，以便在维持恒定容积或恒定质量条件的同时维持灌注生物反应器内每生物质的最佳进料速率。在一个实施例中，该过程可以是完全自动的，以基于实时进行的生物质浓度测量调节营养介质进料速率。例如，可以调节营养介质进料速率，使得该速率与反应器中的当前生物质成正比。
除了生产接种物之外，本公开的过程和系统还可以用于生产不需要进一步温育时间的细胞培养物。例如，本公开的灌注生物反应器可以生产具有细胞密度的细胞培养物，其中生物产物可以直接从灌注生物反应器收获。可替代地，可以将灌注生物反应器中温育的细胞培养物进料到纯化过程以随后收获生物产物。
本公开的方法和系统可以应用于任何合适的细胞培养物产物。例如，本公开的方法特别适用于生产生物药品诸如生物治疗性蛋白质。例如，生物治疗性蛋白质产生自遗传修饰的哺乳动物细胞。在一个实施例中，细胞培养物可以经由在细胞宿主中的重组基因表达产生。此类生产可以来自已建立的培养物的细胞系，诸如例如CHO、NSO或PER.C6。这些细胞可以表达感兴趣的蛋白质并且后续将该蛋白质分泌到介质中。然而，应当理解，本公开的过程和技术不限于蛋白质的生产，并且任何合适的细胞培养物可以经受本文中所描述的控制。
如以上所描述的，在一个实施例中，本公开通常涉及用于生产接种物的系统和过程，该接种物可以转移到较大的生物反应器中，诸如商业规模的生物反应器。根据本公开，可以制备含有微生物的接种物，该微生物处于相容的状态并且非常适合于在生产生物反应器中以相对高的细胞密度和活细胞计数进一步生长。例如，本公开的过程和系统可以在用作接种物的合适的生理状态下实现高水平的活生物质。除了生产蛋白质之外，本公开的过程和系统可以用于生产抗微生物剂、酶、饮料、药物、毒素、维生素、氨基酸等。
参考图1，绘示了根据本公开可以用于生成接种物的灌注生物反应器系统的一个实施例。图1所绘示的图仅用于示范性目的，并且绝不限制可以用于生成质量属性信息的灌注生物反应器系统的类型。通常，灌注生物反应器系统可以被配置成高度自动的过程开发平台。使用灌注生物反应器系统，可以生产具有非常高的细胞密度和/或活细胞计数的接种物。
如图1所示，灌注生物反应器系统包括灌注生物反应器10。灌注生物反应器10可以包含任何合适的生物反应器，这取决于正在繁殖的细胞培养物。例如，灌注生物反应器10可以包含发酵罐、搅拌釜反应器、波型生物反应器、摇动反应器等。图1所绘示的实施例中的灌注生物反应器10包含中空的器皿或容器，其包括用于接收流体生长培养基内的细胞培养物的生物反应器容积12。灌注生物反应器10可以与联接到搅拌器13的旋转轴相关联地放置以搅拌含在生物反应器容积12内的细胞培养物。
灌注生物反应器10可以由各种材料制成。例如，生物反应器10可以由金属制成，诸如不锈钢，并且可以被设计成重复使用。可替代地，灌注生物反应器10可以包含由刚性聚合物或柔性聚合物膜制成的单次使用的生物反应器。例如，当由刚性聚合物制成时，生物反应器壁可以是自立式的。可替代地，生物反应器10可以由柔性聚合物膜或适形材料制成，该柔性聚合物膜或适形材料可以是液体不可渗透的并且可以具有内部亲水性表面。在一个实施例中，灌注生物反应器10可以由柔性聚合物膜制成，该柔性聚合物膜被设计成插入刚性结构中，诸如金属容器，以呈现所期望的形状。
灌注生物反应器10可以具有任何合适的容积。例如，灌注生物反应器10的容积通常可以大于约1L，诸如大于约5L，诸如大于约10L。在实施例中，灌注生物反应器10的容积通常小于约400L，诸如小于约250L，诸如小于约100L。可替代地，灌注生物反应器10可以具有相对大的容积。例如，灌注生物反应器可以具有大于250L，诸如大于500L，诸如大于750L，诸如大于1000L，诸如大于1500L，并且通常小于约4000L，诸如小于约3000L，并且例如为约10L至约4000L的容积。
灌注生物反应器10还可以包括允许培养和繁殖生物细胞的各种其它部件和装备，诸如挡板、喷射器、气体供应，热交换器等。此外，灌注生物反应器10可以与各种传感器连通，诸如pH传感器、气体传感器、温度传感器等。
灌注生物反应器10被设计成以便连续接收各种输入，诸如营养介质，并且连续去除用过的介质，以便在生物反应器10内含有的细胞培养物内维持伪稳态条件。例如，在一个实施例中，操作灌注生物反应器10以便维持细胞培养物和介质的容积相对恒定。例如，可以操作灌注生物反应器10，使得生物反应器内的容积变化不超过10％，诸如不超过约8％，诸如不超过约5％，诸如不超过约3％。
存在各种不同的方法从灌注生物反应器10中去除用过的介质而不消耗生物细胞。例如，在一个实施例中，灌注生物反应器可以包括附着装置，诸如毛细管纤维或膜，细胞结合到其上，从而防止它们的释放。在其它实施例中，灌注生物反应器10可以包括过滤装置15，该过滤装置与生物反应器一起维持所期望的细胞密度。通过连续从灌注生物反应器10中去除用过的介质并且用新的介质替换它，可以控制和维持营养物水平以改变生物反应器内的生长条件。此外，可以以受控的方式去除细胞废物以避免毒性。
灌注生物反应器10可以包括多个端口。所述端口可以允许供应管线和进料管线进出生物反应器10以用于添加和去除流体和其它材料。另外，一个或多个端口可以连接到一个或多个探针以监测灌注生物反应器10内的条件。
例如，在图1所绘示的实施例中，灌注生物反应器10包括流出端口14和流入端口18。流出端口14用于连续地或周期性地从灌注生物反应器10中去除液体介质。流出端口14可以与用于控制流速的泵22流体连通。另一方面，流入端口18可以与营养介质供应源16和泵20流体连通。泵20可以被设计成通过流入端口18将受控量的营养介质进料泵送到灌注生物反应器10中。在一个实施例中，仅需要单个流入端口18来向灌注生物反应器10供应营养介质。然而，在其它实施例中，可以使用多个端口以进料营养介质、基础介质和/或任何其它组分，诸如pH调节剂、气体诸如氧气、氮气和二氧化碳等。
如本文中所使用的，营养介质或营养物是指可以增加生物产物的质量的任何流体、化合物、分子或物质，诸如有机体可以用于存活、生长或以其它方式添加生物质的任何物质。例如，营养物进料可以包括用于呼吸或任何类型代谢的气体，例如氧气或二氧化碳。其它营养介质可包括碳水化合物源。碳水化合物源包括复合糖和单糖，例如葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖及其混合物。营养介质还可以包括氨基酸。氨基酸可以包含：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、其单一立体异构体及其外消旋混合物。在一些实施例中，氨基酸是谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、酪氨酸或缬氨酸。
营养介质还可以含有一种或多种维生素。可以包含在营养介质中的维生素包括B族维生素，例如B12。其它维生素包括维生素A、维生素E、核黄素、硫胺素、生物素及其混合物。营养介质还可以含有一种或多种脂肪酸和一种或多种脂质。例如，营养介质进料可包括胆固醇、类固醇及其混合物。营养介质也可以向生物反应器提供蛋白质和肽。蛋白质和肽包括例如白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白、胎球蛋白及其混合物。本公开中的生长培养基还可以包括生长因子和生长抑制剂、微量元素、无机盐、水解产物及其混合物。可以包括在生长培养基中的微量元素包括微量金属。微量金属的实例包括钴、镍等。
如图1所示，该系统进一步包括生物质传感器24。生物质传感器24可以用于测定灌注生物反应器10内的生物质浓度。如本文中所使用的，“生物质浓度”是指含在生物反应器中的细胞(通常是活细胞)内的容积，相对于生物反应器10的总容积(mL/mL)，其是指生物反应器的总填充容积(液体容积)，即含有液体培养基、细胞、细胞碎片等。例如，生物质传感器24可以是电容探针。含有完整质膜的灌注生物反应器10内的细胞在电场的影响下充当电容器。质膜的非导电性质允许电荷累积。然后可以测量得到的电容。例如，生物质传感器24可以使用射频阻抗周期性地或连续地测量灌注生物反应器10内的生物质。例如，RF阻抗允许测量细胞悬液的介电特性。得到的测量值可以用于推导灌注生物反应器10中存在的生物质含量(诸如活细胞容积)以及其它细胞特性诸如细胞直径(参见例如美国专利第9,568,449号，其公开内容以全文引用的方式并入本文中，包括生物质含量测量值的公开)。生物质传感器24可以是重复使用的装置或可以是单次使用的装置。在一个实施例中，例如，生物传感器可以是可以使用一次并且安置的贴片传感器。
当使用电容探针时，电容探针可以在约500KHz至约20,000KHz的频率范围内操作。电容测量范围可以从约0至约400pF/cm。电导率可以为约1至约40mS/cm的范围。在实例中提供了使用电容探针测量生物质浓度的合适的方法。合适的电容探针包括例如用于单次使用的应用的赛多利斯斯泰帝(Sartorius Stedim Biotech)的
Figure BDA0003724384370000101
ViaMass和例如用于多次使用应用的Aber仪器公司的Futura 12mm探针。
除了电容探针之外，生物质质量传感器24可以是能够监测或确定生物质浓度或细胞计数的任何其它合适的仪器。例如，在可替代实施例中，生物质传感器24可以是光学细胞计数器。例如，光学细胞计数器商品名为COUNTESS II或COUNTESS II FL自动细胞计数器可商购自赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)。光学细胞计数器包括自动聚焦和计数器算法，其识别群体内的细胞以确定生物质浓度。利用光学细胞计数器确定生物质浓度(生物容积)的方法是本领域已知的，并且利用来自光学装置的与细胞直径结合的细胞计数的测量值来计算生物质浓度。确定生物质浓度的附加方法包括例如基于显微镜的方法。
如图1所示，生物质传感器24可以含在灌注生物反应器10的容积12内以与含在生物反应器内的细胞培养物密切接触。在图1所绘示的实施例中，例如，生物质传感器24可以是如以上所描述的电容探针。
可替代地，该系统可以包括至少一个样品收集子系统，其从灌注生物反应器获得生物质样品并且分析样品的生物质浓度和/或其它组分。例如，在一个实施例中，灌注生物反应器10可以与自动采样和测试系统流体连通。可以将生物质样品进料到无菌自动进样器中以将样品递送到液体处理机器人，如果必要，该液体处理机器人使样品制备自动化。采样和测试系统可以测量和监测细胞培养物内的任何参数，包括细胞计数和生物质浓度。模块化自动采样系统的一个实例由龙沙公司(Lonza Ltd.)以名称MAST出售。在美国专利公开第2014/0087413号、美国专利第9,389,151号、美国专利第9,322,749号、美国专利公开第2015/0019140号和美国专利公开第2016/0025601号中描述了自动采样系统，该专利以引用的方式全部并入本文中。
当使用自动采样系统进行生物质浓度测量时，生物质传感器可以包含电容探针或光学细胞计数器。
生物质传感器24可以至少每6小时，诸如至少每4小时，诸如至少每2小时，诸如至少每小时，诸如至少每30分钟，诸如至少每15分钟，诸如至少每10分钟获取读数。在一个实施例中，生物质传感器24可以连续监测灌注生物反应器10内的生物质浓度。
生物质传感器24可以与控制器26和泵20连通。例如，控制器26可以包含一个或多个可编程装置，诸如一个或多个微处理器。控制器26可以被配置成从生物质传感器24接收生物质浓度测量值。基于从生物质传感器24接收的信息，控制器26可以被配置成通过控制泵20来控制进入灌注生物反应器10的营养介质流速。
在常规灌注生物反应器中，灌注速率通常保持在相对窄的范围内。然而，在本公开的过程中，为了生产具有显著改进的细胞密度和活细胞计数的接种物，灌注速率或营养介质进料到灌注生物反应器10的速率随着灌注生物反应器10内的生物质或细胞培养物快速增加而不断变化。
例如，根据本公开，来自营养介质供应源16的营养介质的流速以与灌注生物反应器10内含有的生物质的当前量成定向比例的方式变化，这是由生物质传感器24所确定的。生物质传感器24可以实时地进行生物质浓度测量，其被进料到控制器26，该控制器允许通过生物反应器的营养介质流速完全自动化。在该过程期间，例如，营养介质流速根据活生物质浓度而逐渐上升。例如，在一个实施例中，控制器26可以用基于从生物质传感器24接收的信息确定营养物流速的算法编程。在一个实施例中，该算法可以基于以下：
Figure BDA0003724384370000111
其中K是生物容积比进料速率，并且具有单位mL/％生物容积/天；
生物容积(示出为
Figure BDA0003724384370000112
)是在细胞的细胞膜内部的反应器容积(填充容积)的百分比，表示为a％；
V是以mL计的器皿容积；以及
P是以器皿容积/天计的总生物反应器灌注进料速率。
该关系还可以表示为：
Figure BDA0003724384370000113
其中K是生物容积比灌注速率(mL进料/mL生物容积/天)；
Figure BDA0003724384370000114
是生物容积分数并且是在细胞的细胞膜内部的灌注生物反应器的容积(填充容积)，表示为百分比或分数(mL生物容积/mL生物反应器)；以及
P是以mL进料/mL生物反应器/天表示的灌注速率。表示这个的另一种方式，特别是在使用电容来获得生物质的情况下，是基于活细胞细胞的细胞膜内的容积(VCV)除以生物反应器的总填充容积(即，被介质和细胞/碎片等占据)的百分比。
以上关系可以为了灌注生物反应器10中生长的任何特定细胞培养物以及基于其它各种过程条件来确定。通过实验或理论计算，可以确定以上等式中的K。例如，在一个实施例中，K可以从约1×10-9至约250×10-9，合适地约1×10-9至约50×10-9，或约1×10-9至约20×10-9，包括约1×10-9至约10×10-9、约4×10-9至约9×10-9，或约7×10-9不等。如本文中所描述的，已令人惊讶地发现，与使用活细胞密度(VCD)(即，细胞计数)进行的测量相比，使用生物容积(在细胞的细胞膜内部的反应器容积的百分比)提供所需营养介质流量的更好预测。VCD假设每细胞的营养物消耗速率是恒定的，并且因此重要的只是细胞数量。然而，当较大的细胞比较小的细胞消耗更多的营养物时，营养物的使用的更精确预测是基于生物容积的，如本文中所描述的。
除了控制进入灌注生物反应器10的营养介质进料速率之外，如图1所示的本公开的过程和系统还可以被配置成控制使用泵22通过流出物14从生物反应器10中抽取液体介质的速率。例如，在一个实施例中，该系统可以包括称重装置28，诸如载荷传感器。称重装置28可以监测含在灌注生物反应器10内的液体介质和生物质的重量。如图1所示，称重装置28可以与控制器26和泵22连通。基于从称重装置28接收的信息，控制器26可以被配置成控制使用泵22从灌注生物反应器10抽取的液体介质的量。除了依赖于从称重装置28接收的信息之外，当确定流体介质从生物反应器中抽取的速率时，控制器26还可以考虑增加进入生物反应器的营养介质流速。
除了称重装置28之外，该系统还可以包括用于确定灌注生物反应器10内的液体介质的量的其它装置。例如，在可替代实施例中，系统可以包括监测生物反应器10内液体介质容积的容积水平指示器。容积水平指示器也可以与控制器26连通放置。
在一个实施例中，控制器26可以被配置成操作灌注生物反应器10以便维持相对恒定的容积。例如，在该过程期间，容积可以变化不超过约20％，诸如不超过约15％，诸如不超过约10％，诸如不超过约5％，诸如不超过约2％。
通过本公开的过程和系统，可以生产具有极高细胞密度和活细胞计数的用于下游细胞生产的接种物。例如，灌注生物反应器中的细胞培养物的细胞密度或生物质浓度可以以大于约30天％，诸如大于约40天％，诸如大于约50天％，诸如大于约60天％，诸如大于约70天％，诸如大于约80天％，诸如大于约90天％，诸如大于约100天％，诸如大于约110天％，诸如大于约120天％的量增加。例如，生物质浓度可以增加超过150天％，诸如超过200天％，诸如超过250天％。
在灌注生物反应器内生长所期望的量后，将接种物或细胞培养物转移到下游较大的生物反应器中以继续生长和收获生物产物。细胞培养物可以在灌注生物反应器中保持足以实现所期望的细胞密度或生物质浓度的时间。例如，根据本公开，细胞培养物或接种物可以具有大于约10×106个细胞/mL，诸如大于约30×106个细胞/mL，诸如大于约50×106个细胞/mL，诸如甚至大于70×106个细胞/mL的细胞密度。在实施例中，在灌注生物反应器内实现的细胞密度可以是100×106个细胞/mL、200×106个细胞/mL、220×106个细胞/mL、250×106个细胞/mL或更大。然而，所期望的细胞密度可以取决于各种过程条件和所生产的细胞培养物的类型。
通常，可以使用本公开的过程和系统生产任何合适的接种物。在一个实施例中，例如，接种物可以含有哺乳动物细胞。
增加接种物的细胞密度和/或活细胞计数可以在下游生产期间产生许多益处和优点。例如，具有高细胞密度的接种物可以缩短细胞培养物保持在下游较大的生产生物反应器中的时间量。减少生产生物反应器中的温育时间量直接影响过程效率。例如，大型商业规模的生物反应器占据了生产设施中的大部分占地面积。因此，在生产生物反应器中的温育时间是生产效率的限制事件。然而，通过本公开的过程和系统，在下游生产生物反应器中温育时间可以显著减少，导致时空产率增加。事实上，即使在灌注生物反应器中接种物温育时间增加，也能实现这些益处和优点。
参考图2，绘示了用于生产生物产物的生产过程的一个实施例。如图所示，在一个实施例中，可以首先将接种物40进料到小细胞培养器皿50。例如，细胞培养器皿50可以是摇瓶膨胀装置。接种物可以在这些专用培养箱器皿中有限程度地生长。例如，细胞培养器皿50通常可以具有大于约0.5L，诸如大于约1L，诸如大于约2L，并且通常小于约5L，诸如小于约4L，诸如小于约3L的容积。
然后将接种物从细胞培养器皿50进料到本公开的灌注生物反应器10。如图2所示，灌注生物反应器10可以是摇动生物反应器或波形生物反应器或搅拌釜生物反应器。在一个实施例中，灌注生物反应器10可以具有约5L至约4000L，诸如约10L至约3000L，诸如约50L至约2000L的容积。灌注生物反应器10可以是不锈钢器皿或可以是用作保持器皿中的衬里的一次性袋型生物反应器。
灌注生物反应器10内的温育时间可以根据所生产的接种物和所期望的最终细胞密度而变化。例如，接种物与灌注生物反应器10的温育时间通常可以大于约3天，诸如大于约5天，诸如大于约7天，诸如大于约9天，并且通常小于约15天，诸如小于约12天，诸如小于约11天。如以上所描述的，灌注生物反应器10特别适于生产具有显著改进的细胞密度和活细胞计数的接种物。
然后将接种物从灌注生物反应器10进料到生产生物反应器60以生产生物产物。在一个实施例中，生产生物反应器60例如可以具有大于约500L，诸如大于约600L，诸如大于约700L，并且通常小于约30,000L，诸如小于约20,000L，诸如小于约10,000L的容积。通常，生产生物反应器60具有比灌注生物反应器10更大的容积。例如，灌注生物反应器与生产生物反应器之间的容积比率可以为约1:3至1:40，诸如约1:4至约1:10(例如，4,000L灌注生物反应器和20,000L生产(例如，分批进料)生物反应器)。
由于进料到生产生物反应器60中的接种物的细胞密度增加，生物反应器60内的温育时间可以大大减少。例如，常规系统通常需要15天或更长的温育时间。然而，在根据本公开的生产生物反应器60内的温育时间可以少于约13天，诸如少于约12天，诸如少于约11天，诸如少于约10天，诸如少于约9天，诸如甚至少于约8天。温育时间通常大于约3天，诸如大于约5天。生产生物反应器60内温育时间的任何减少对提高总体过程的效率具有显著影响。
通过生产具有更大细胞密度的接种物，通过消除生产生物反应器内的非生产性启动天数，可以在更短的时间周期内在生产生物反应器中产生更高的滴度。为了绘示该效果，图3是本公开的过程的一些益处的图示。图3中的曲线图绘示了生产生物反应器中随时间变化的活细胞密度和滴度。第1样品代表常规过程，其中进料到生产生物反应器的接种物具有5×105个细胞/mL的细胞密度。然而，根据本公开制备的第2样品代表以10×106个细胞/mL的细胞密度将接种物进料到生产生物反应器。如图所示，第2样品产生显著更好的生长速率和总体更高的滴度。例如，15天后样品第1样品达到4.95g/L的滴度，而第2样品仅在12天内达到6.13g/L的滴度。滴度除以温育时间得到时空产率。第1样品产生0.3g/L/天的时空产率，而第2样品产生0.51g/L/天的时空产率。因此，根据本公开的过程产生的时空产率增加了50％。
如以上所描述的，与许多常规过程相比，本公开的灌注生物反应器可以产生显著和急剧的细胞密度增加。事实上，通过实验程序，本公开的灌注生物反应器可以生产具有80×106个细胞/mL，诸如90×106个细胞/mL的细胞密度的细胞培养物。事实上，本公开的灌注生物反应器已经证明能够产生100×106个细胞/mL或更大的细胞密度。
由于增加的细胞密度，除了生产接种物之外，本公开的灌注生物反应器还可以用于生产最终产物。例如，在一个实施例中，本公开的灌注生物反应器可以用于温育细胞培养物，并且生物产物可以直接从细胞培养物收获。在一个实施例中，可以将灌注生物反应器中生产的细胞培养物进料到下游纯化过程，用于然后收获生物产物。因此，本发明还涉及细胞培养物生产过程，其包含：
通过本发明第一方面的方法生产包含表达生物产物的宿主细胞的接种物；
将接种物引入生产生物反应器中，将细胞培养物引入灌注生物反应器中；
培养宿主细胞以生产生物产物；
从细胞培养物中收获生物产物；以及
任选地对生物产物进行一个或多个纯化步骤。
在一个实施例中，将接种物引入生产生物反应器中至最终密度为至少5×106个细胞/mL，诸如至少8或10×106个细胞/mL。例如，这可以代表来自本发明N-1过程的接种物的4至10倍稀释。
在实施例中，细胞表达或生产产物，诸如重组治疗或诊断产物。由细胞产生的产物的实例包括但不限于抗体分子(例如单克隆抗体、双特异性抗体)、抗体模拟物(特异性结合抗原但在结构上不与抗体相关的多肽分子，诸如重复蛋白(DARPins)、亲和体(affibodies)、adnectins或IgNARs)、融合蛋白(例如Fc融合蛋白、嵌合细胞因子)、其它重组蛋白(例如糖基化蛋白、酶、激素)、病毒治疗剂(例如抗癌溶瘤病毒、用于基因治疗和病毒免疫治疗的病毒载体)、细胞治疗剂(例如多能干细胞、间充质干细胞和成体干细胞)、疫苗或脂质包封的颗粒(例如，外来体、病毒样颗粒)、RNA(诸如例如，siRNA)或DNA(诸如例如，质粒DNA)、抗生素或氨基酸。在实施例中，装置、设施和方法可以用于生产生物类似物。
如所提及的，在实施例中，装置、设施和方法允许生产真核细胞，例如哺乳动物细胞或低等真核细胞，诸如例如酵母细胞或丝状真菌细胞，或原核细胞，诸如革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞和/或真核或原核细胞的产物，例如蛋白质、肽、抗生素、氨基酸、核酸(诸如DNA或RNA)，由真核细胞以大规模方式合成。除非本文另有说明，装置、设施和方法可以包括任何所期望的容积或生产能力，包括但不限于实验室规模、中试规模和全生产规模能力。
此外，以及除非本文另有说明，装置、设施和方法可以包括任何合适的反应器，包括但不限于搅拌釜、气升式、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基、流化床、固定床和/或喷动床生物反应器。如本文所使用的，“反应器”可以包含发酵罐或发酵单元或任何其它反应容器，并且术语“反应器”与“发酵罐”可互换地使用。例如，在一些方面，示例性生物反应器单元可以执行以下各项中的一项或多项或全部：营养物和/或碳源的进料、合适气体(例如氧气)的注入、发酵或细胞培养基的入口和出口流、气相和液相的分离、温度的维持、氧气和CO2水平的维持、pH水平的维持、搅动(例如搅拌)和/或清洁/灭菌。示例反应器单元，如发酵单元可以含有在单元内的多个反应器，例如所述单元可以具有在每个单元中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个或更多个生物反应器和/或设施可以含有多个单元，所述多个单元具有在所述设施内的单个或多个反应器。在各个实施例中，生物反应器可以适用于分批、半补料分批、补料分批、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施例中，生物反应器可以具有在约100mL与约50,000L之间的容积。非限制性实例包括100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升、30,000升、40,000升和/或50,000升。此外，合适的反应器可以是多次使用的、单次使用的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，包含金属合金，如不锈钢(例如，316L或任何其它合适的不锈钢)和Inconel、塑料和/或玻璃。
一旦生产细胞对产物的生物合成已经进展到令人满意的点，可以收获产物，例如取出培养基并且将上清液与细胞和细胞碎片分离。可以对该产物进行一个或多个如亲和层析、离子交换层析、过滤和/或病毒灭活等纯化/处理步骤以获得纯化产物。该产物还可以与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合以产生组合物，如含有缓冲剂、表面活性剂、稳定剂(如海藻糖、蔗糖、甘油)、氨基酸(如甘氨酸、组氨酸、精氨酸)、金属离子/螯合剂、盐和/或防腐剂中的一者或多者的配制药物组合物。
本文中所描述的装置、设备和方法适合于培养任何期望的细胞系，包括原核和/或真核细胞系。此外，在实施例中，该装置、设备和方法适合于培养悬浮细胞或贴壁依赖性(粘附)细胞，并且适合于被配置用于生产药物和生物制药产物—诸如多肽产物、核酸产物(例如DNA或RNA)，或细胞和/或病毒，诸如用于细胞和/或病毒治疗的那些的生产操作。在一个实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞。可以衍生宿主细胞的示例性物种包括人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴子、猿、狗、马、雪貂和猫。在实施例中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施例中，宿主细胞是CHO-K1细胞、
Figure BDA0003724384370000161
细胞、DG44CHO细胞、DUXB11 CHO细胞、CHO-S细胞、CHO-GS敲除细胞(谷胱甘肽合成酶(GS)基因的所有内源性拷贝均已失活的CHO细胞)、
Figure BDA0003724384370000162
FUT8敲除细胞、CHOZN细胞或CHO衍生细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GS-KO细胞)是例如
Figure BDA0003724384370000163
GS敲除细胞(如GS
Figure BDA0003724384370000164
细胞-CHOK1SV
Figure BDA0003724384370000165
龙沙生物制剂公司(Lonza Biologics,Inc.))。CHO FUT8敲除细胞是例如
Figure BDA0003724384370000166
FUT8敲除细胞(龙沙生物制剂公司)。
在实施例中并且除非本文另有说明，本文中所描述的装置、设施和方法还可以包括未另外提及的任何合适的单元操作和/或装备，诸如用于分离、纯化和离析此类产物的操作和/或装备。可以使用任何合适的设施和环境，如传统的构件式建造设施、模块化、移动和临时设施，或任何其他合适的建筑、设施和/或布局。例如，在一些实施例中，可以使用模块化洁净室。另外并且除非另有说明，否则本文中所描述的装置、系统和方法可以容纳在单个位置或设施中和/或在单个位置或设施中执行，或可替代地容纳在单独或多个位置和/或设施中和/或在单独或多个位置和/或设施中执行。
实例
实例1：基于生物容积的灌注反应器进料预测阳性培养物性能并且优于基于细胞计数的进料
生物质浓度(生物容积)的电容测量
使用Aber Futura电容探针(英国阿伯里斯特威斯的Aber仪器公司(AberInstruments Ltd,Aberystwyth,UK))进行培养物生物质浓度(生物容积)。在1000kHz下每30秒测量电容。使用30个样品移动平均滤波器对电容信号进行滤波，并且不对信号施加电极极化。在校准实验中，电容值与生物容积(生物质浓度)相关，其中在不同活细胞浓度下从生长的生物反应器培养物中提取每日样品。使用Nova Bioprofile Flex(马萨诸塞州沃尔瑟姆的诺瓦生物医学公司(Nova Biomedical,Waltham,MA))确定每个样品的活细胞浓度和平均细胞直径。通过假设球形细胞几何形状，由前述来自Flex的测量值确定活生物容积：
Figure BDA0003724384370000171
其中
Figure BDA0003724384370000172
是以mL/mL计的活生物容积分数，vCC是以细胞/mL计的活细胞浓度，以及D是以μm计的平均细胞直径。
校准实验得到
Figure BDA0003724384370000173
与电容之间线性相关。
φ＝m*C+b
其中
Figure BDA0003724384370000174
是以mL/mL计的活生物容积，m是校准曲线的斜率(mL*cm/(mL*pF))，C是电容(pF/cm)，以及b是校准曲线的截距(mL/mL)。
关于生物容量的特别注释：类似于浓度(mL/mL)的生物容积分数是VCC(细胞/mL)的类似物。活的生物容积mL是总生物容积，并且是总细胞计数(细胞)的类似物。也就是说，生物容积分数和VCC都是浓度，并且活生物容积和总细胞计数是反应器的整个容积的总和。
用于进料操作空间实验的灌注培养的操作
用表达单克隆抗体的单个CHO细胞系进行灌注培养。将培养物以0.5×106个细胞/mL活细胞浓度接种到pH 6.9的以化学方法限定的基础培养基(基础培养基+1.9vol％SF102(浓缩的营养物进料))中。溶解氧浓度维持在>＝40％空气饱和度。用补充进料使细胞允许扩增直至第6天，此时以1器皿容积(vv)/天开始灌注(灌注培养基–基础培养基+4.21vol％SF102)。随着细胞继续扩增，灌注速率每天增加至最大2vv/天。一旦培养物实现所期望的细胞浓度(或生物容积分数，取决于该特定操作的控制策略)，开始通过电容测量控制的细胞渗出，以将培养物维持在恒定细胞浓度或生物容积分数。再次根据该实验，手动调节灌注进料速率以实现所期望的细胞比灌注速率或生物容积比灌注速率。
灌注N-1培养物的操作
将灌注的N-1培养物以0.5×106个细胞/mL活细胞浓度接种到以化学方法限定的基础培养基中。使细胞允许扩增直至灌注开始的第4天。灌注进料速率由生物容积分数确定，如由电容读数预测的如下：
Figure BDA0003724384370000181
其中P是以vv/天为单位的灌注进料速率，K是生物容积比灌注速率(mL进料/mL生物容积/天)，以及
Figure BDA0003724384370000182
是生物容积分数(mL生物容积/mL生物反应器)。
允许细胞分裂，并且相应地控制灌注速率直至100×106个细胞/mL。在图4A至4B中示出了这种可变进料的说明性实例，用于三个CHO细胞克隆(C1至C3)。
进料操作空间的创建
对于灌注介质进料，探索了两种介质进料注意事项：补充足够的营养物以满足细胞的需要而不过度进料，并且通过稀释从培养物中去除废弃产物。将灌注介质分成两个组分：基础介质和浓缩营养补充剂。通过改变添加到基础介质中的营养补充剂(SF102)的量获得不同营养丰富程度的灌注介质。更多的营养补充剂导致更丰富的灌注培养基。
利用加入不同量的营养补充剂制备灌注介质。然后改变每种培养基组合物的细胞比灌注速率或生物容积比灌注速率，并且观察每种培养物的稳态行为。导致至少5天稳定稳态的培养物被认为是可接受的表现，而导致生存能力降低或细胞凋亡(以及通常培养物崩溃)的培养物被认为是不可接受的表现。
对于每种灌注培养条件，将细胞比灌注速率或生物容积比灌注速率对细胞比浓缩营养物进料速率或生物容积比浓缩营养物进料速率作图。生物容积比浓缩营养物进料补充速率或细胞比浓缩营养物进料补充速率被确定为生物容积比灌注速率或细胞比灌注速率乘以添加到该特定介质的基础灌注介质的浓缩营养物进料的量(表示为容积分数)。
灌注的N-1培养物中进料操作空间学习的实施方案
一旦建立了操作空间，该操作空间指定了导致可接受的(和不可接受的)培养物性能的灌注速率和浓缩营养物进料补充速率的范围(参见图5中的上部和下部虚线)，该操作空间用于指定在非稳态或N-1扩增培养中导致可接受的培养物性能的灌注进料条件。为了实现这个，在预定进料操作空间的中间附近选择条件(参见图5中的菱形)。
结果
在可接受的培养物性能范围的边缘上，以不同营养物补充速率进行的一组初始灌注培养物支持每细胞恒定的营养物消耗的假设，其中在过高和过低的SF102营养物进料/细胞速率下获得不稳定的培养物(参见X标记)(图6)。
基于对提出的每细胞的高和低营养物进料速率限制的初始观察，以及限制将是恒定的假设，尝试了更强化的培养条件，其预测将使用更少的介质(更低的CSPR)，但仍在每细胞营养物进料最佳窗口内操作(+符号，图6)。令人惊讶的是，在新的条件(+)下观察到不稳定的培养物，以及营养物过度进料的迹象，包括细胞大小的变化。
确定每细胞的恒定营养物需求的假设是不准确的，并且相反，所需的营养物应在每生物容积的基础上预测进料。这解释了由于更大的细胞具有更多的细胞机制而需要更多的营养物的事实，并且相反，更小的细胞需要更少的营养物。当在每生物容积的基础上观察相同的灌注条件时，所选择的灌注条件(+)实际上被预测为在过度进料侧，与所观察到的相关联(被圈起的+符号，图7，位于上部虚线，即，可接受的培养物性能范围的上限)。
基于对恒定的每生物容积的假设的进料限制的更新解释，选择位于生物容积比进料空间的预测理想进料范围内的新条件(图7中的三角形)。这种条件产生性能良好的灌注培养物。
然而，作为CSPR的函数，使用恒定的细胞比营养物进料速率假设，该成功条件会被预测为进料不足。(图8，被圈起的三角形，在较低的虚线以下，并且因此在“可接受的培养物性能范围”之外)。
基于该意外发现，实施了基于恒定的每生物容积的进料策略(参见图9)。如所指示的，如果细胞在“营养物太丰富的环境”中生长，则它们不能证明可接受的生长特性(上部图像)。然而，以“可接受的培养物性能范围”生长的细胞示出了合适细胞形状和密度的所期望的细胞特征。
将进料操作空间实施到灌注N-1过程优化中
评价生物容积比灌注进料速率范围对培养物性能的影响。以四种生物容积比灌注速率完成灌注的N-1培养物：5、6.2、7和8.4mL/mL/天。选择这些条件，使得对于单个灌注培养基组合物，预测中间条件以提供良好的培养物性能，并且预测侧翼条件以接近可接受的操作空间的边缘，但仍在边界内(参见图10)。
如操作空间所预测的，每个培养物成功地达到至少75x10^6个细胞/mL的细胞密度。然而，更接近空间边缘的条件导致较慢的生长，并且对应地介质消耗的量(8.4和5BVSPR)比空间中心的那些(和6.2BVSPR)更高(参见图11A)。图11B示出了CHO细胞克隆L1的所选择的条件中的每一个的细胞密度(VCC)。
最后，将图11B中指定的单个细胞克隆(7mL/mL/天)(C1)的最佳条件应用于四个其它克隆(C2至L5)，所有这些都示出了有利的生长特征。这支持了生物容积比进料方法是平台方法，并且不限于仅1个细胞系(图12)。
总之，令人惊讶地发现使用基于生物容积-反应器容积的百分比(即，液体容积：液体介质、细胞、细胞碎片等)的模型，其在细胞的细胞膜内-更准确地预测提供期望的灌注培养物所需的进料条件。
按比例放大的过程
图13示出了将N-1过程从台式规模成功按比例放大到50L单次使用的搅拌釜反应器(中试规模)。在大约相同的培养持续时间(约9天)内实现50×106个细胞/mL的VCC的限定目标。事实上超过了该目标要求，并且在第11天达到了7千万个细胞/mL的VCC。这些结果证明包括自动化的过程能够转化为不同规模和不同反应器形式。
示范性实施例
实施例1是用于后续细胞培养物生产过程的接种物的生产过程，其包含：将细胞培养物引入灌注生物反应器；以一定流速向灌注生物反应器进料营养介质并且从灌注生物反应器中取出流体介质；使用诸如电容传感器的生物质传感器确定灌注生物反应器内随时间推移的生物质浓度，该生物质传感器与控制器连通；以及基于由生物质传感器感测的生物质浓度调节进入灌注生物反应器的营养介质流速，该控制器被配置成基于从生物质传感器接收的信息调节该介质流速，其中该营养介质流速基于以下关系调节：
Figure BDA0003724384370000201
其中K是生物容积比灌注速率(mL进料/mL生物容积/天)；
Figure BDA0003724384370000202
是生物容积分数并且是在细胞的细胞膜内部的灌注生物反应器的容积，表示为百分比或分数(mL生物容积/mL生物反应器)；以及
P是以mL进料/mL生物反应器/天表示的灌注速率。
实施例2包括如实施例1中所限定的过程，其中控制器被配置成随着生物质浓度增加而增加营养介质的流速。
实施例3包括如前述实施例中任一项所限定的过程，其进一步包含以下步骤：确定灌注生物反应器内的流体介质的量，并且基于该量，选择性地增加或降低从灌注生物反应器中抽取流体介质的速率。
实施例4包括如实施例3中所限定的过程，其中通过使用称重装置称重灌注生物反应器来确定灌注生物反应器内的流体介质的量。
实施例5包括如实施例4中所限定的过程，其中称重装置与控制器连通，并且基于来自称重装置的重量信息，控制器被配置成控制与灌注生物反应器流体连通的泵送装置以选择性地增加或减少抽取流体介质的速率。
实施例6包括如实施例5中所限定的过程，其中将从灌注生物反应器抽取的流体介质过滤以防止生物质与流体介质一起从生物反应器抽取。
实施例7包括如实施例3中所限定的过程，其中通过测量容积来确定灌注生物反应器内的流体介质的量。
实施例8包括如前述实施例中任一项所限定的过程，其中细胞培养物具有细胞密度，并且该细胞密度在灌注生物反应器中随时间增加。
实施例9包括如实施例8中所限定的过程，其中含有流体介质和细胞培养物的容积在该过程期间保持恒定。
实施例10包括如前述权利要求中任一项所限定的过程，其中细胞培养物包含哺乳动物细胞。
实施例11包括如前述实施例中任一项所限定的过程，其中生物质传感器至少每6小时确定灌注反应器内的生物质浓度。
实施例12包括如前述实施例中任一项所限定的过程，其中灌注生物反应器具有约10升至约4000L的容积。
实施例13包括如前述实施例中任一项所限定的过程，其中在温育期后，该过程进一步包括将细胞培养物从灌注生物反应器转移到第二生物反应器，该第二生物反应器具有大于灌注生物反应器容积的容积，灌注生物反应器与第二生物反应器之间的容积比率为1:3至1:40，诸如约1:4至约1:10。
实施例14包括如实施例13中所限定的过程，其中细胞培养物以分批进料方式在第二生物反应器中继续生长。
实施例15包括如实施例13或14中所限定的过程，其中细胞培养物在灌注生物反应器中保持约3天至约12天，并且在第二生物反应器中保持少于约12天，诸如少于约10天。
实施例16包括如前述实施例中任一项所限定的过程，其中细胞培养物在灌注生物反应器内达到大于约10×106个细胞/mL，诸如大于约30×106个细胞/mL，诸如大于约50×106个细胞/mL，诸如大于约70×106个细胞/mL的细胞密度。
实施例17包括如前述实施例中任一项所限定的过程，其中细胞培养物在灌注生物反应器内达到100×106个细胞/mL或更大的细胞密度。
实施例18包括如前述实施例中任一项所限定的过程，其中细胞培养物具有细胞密度，并且其中该细胞密度在灌注生物反应器内每天增加至少60％。
实施例19是用于生产用于后续细胞培养物生产过程的接种物的系统，其包含：灌注生物反应器；与灌注生物反应器流体连通的营养介质进料，营养介质进料用于将营养介质进料到灌注生物反应器以使细胞培养物生长；用于从灌注生物反应器取出流体介质的流出物；泵送装置，其与灌注生物反应器的流出物流体连通以从灌注生物反应器取出受控量的流体介质；用于监测灌注生物反应器的重量的称重装置；生物质传感器，诸如电容传感器，其与灌注生物反应器流体连通以确定灌注生物反应器内的生物质浓度；以及与生物质传感器和称重装置连通的控制器，该控制器被配置成基于从生物质传感器接收的信息控制营养介质进料以增加或减少被进料到灌注生物反应器的营养介质的流速，该控制器还被配置成基于从称重装置接收的信息控制该泵送装置以增加或减少从灌注生物反应器抽取流体介质的流速，其中该控制器基于以下关系控制进入灌注生物反应器的营养介质的流量：
Figure BDA0003724384370000221
其中K是生物容积比灌注速率(mL进料/mL生物容积/天)；
Figure BDA0003724384370000222
是生物容积分数并且是在细胞的细胞膜内部的灌注生物反应器的容积，表示为百分比或分数(mL生物容积/mL生物反应器)；以及
P是以mL进料/mL生物反应器/天表示的灌注速率。
实施例20如实施例19中所限定的系统，其中该控制器包含一个或多个微处理器。
实施例21是如实施例19至20中任一项所限定的系统，其中该灌注生物反应器具有从约10升至约250升的容积。
实施例22是如实施例19至21中任一项所限定的系统，其进一步包含与该灌注生物反应器流体连通的第二生物反应器，该第二生物反应器被配置成用于接收来自灌注生物反应器的细胞培养物，该第二生物反应器具有大于该灌注生物反应器容积的容积，灌注生物反应器与第二生物反应器之间的容积比率是从1:3至1:40，诸如从约1:4至约1:10。
实施例23是一种细胞培养物生产过程，其包含：将细胞培养物引入灌注生物反应器；以一定流速向灌注生物反应器进料营养介质并且从灌注生物反应器中取出流体介质；使用生物质传感器确定灌注生物反应器内随时间推移的生物质浓度，该生物质传感器与控制器连通；以及基于由生物质传感器感测的生物质浓度调节进入灌注生物反应器的营养介质流速，该控制器被配置成基于从生物质传感器接收的信息调节该介质流速，其中该营养介质流速基于以下关系调节：
Figure BDA0003724384370000231
其中K是生物容积比灌注速率(mL进料/mL生物容积/天)；
Figure BDA0003724384370000232
是生物容积分数并且是在细胞的细胞膜内部的灌注生物反应器的容积，表示为百分比或分数(mL生物容积/mL生物反应器)；以及
P是以mL进料/mL生物反应器/天表示的灌注速率。
实施例24包括如实施例23中所限定的过程，其中在温育期后，将细胞培养物进料到纯化过程。
实施例25包括如实施例23中所限定的过程，其中在温育期后，从细胞培养物中收获生物产物。
实施例26包括一种细胞培养物生产过程，其包含：通过实施例1至18中任一项的方法生产接种物，该接种物包含表达生物产物的宿主细胞；
将接种物引入生产生物反应器；
培养宿主细胞以生产生物产物；
从细胞培养物中收获生物产物；以及
任选地对生物产物进行一个或多个纯化步骤。
在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以实施对本发明的这些和其他修改和变化，本发明的精神和范围在所附权利要求中更具体地阐述。此外，应当理解，各种实施例的方面可以整体或部分互换。此外，本领域普通技术人员将会理解，前面的描述仅仅是示例性的，并不旨在限制在所附权利要求中进一步描述的本发明。

Claims (18)

1.一种用于生产用于后续细胞培养物生产过程的接种物的过程，其包含：
将细胞培养物引入灌注生物反应器；
以一定流速向所述灌注生物反应器进料营养介质并且从所述灌注生物反应器中取出流体介质；
使用生物质传感器确定所述灌注生物反应器内随时间推移的生物质浓度，所述生物质传感器与控制器连通；以及
基于由所述生物质传感器感测的生物质浓度调节进入所述灌注生物反应器的所述营养介质流速，所述控制器被配置成基于从所述生物质传感器接收的信息调节所述介质流速，
其中基于以下关系调节所述营养介质流速：
Figure FDA0003724384360000011
其中K是生物容积比灌注速率(mL进料/mL生物容积/天)；
Figure FDA0003724384360000012
是生物容积分数并且是在细胞的细胞膜内部的所述灌注生物反应器的容积，表示为百分比或分数(mL生物容积/mL生物反应器)；以及
P是以mL进料/mL生物反应器/天表示的所述灌注速率。
2.根据权利要求1所述的过程，其中所述生物质传感器是电容传感器。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的过程，其中所述控制器被配置成随着所述生物质浓度增加而增加所述营养介质的所述流速。
4.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其进一步包含以下步骤：确定所述灌注生物反应器内的流体介质的量，并且基于所述量，选择性地增加或降低从所述灌注生物反应器抽取所述流体介质的速率。
5.根据权利要求4所述的过程，其中通过使用称重装置称重所述灌注生物反应器来确定所述灌注生物反应器内的所述流体介质的所述量。
6.根据权利要求5所述的过程，其中所述称重装置与所述控制器连通，并且基于来自所述称重装置的重量信息，所述控制器被配置成控制与所述灌注生物反应器流体连通的泵送装置以选择性地增加或减少抽取流体介质的速率。
7.根据权利要求4所述的过程，其中通过测量容积来确定所述灌注生物反应器内的所述流体介质的所述量。
8.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中所述灌注生物反应器中所述细胞培养物中的细胞密度随时间增加，诸如每天增加至少60％。
9.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中所述生物质传感器至少每6小时确定所述灌注反应器内的所述生物质浓度。
10.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中所述灌注生物反应器具有约10L至约4000L的容积。
11.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中在温育期后，所述过程进一步包括将所述细胞培养物从所述灌注生物反应器转移到第二生物反应器，所述第二生物反应器具有大于所述灌注生物反应器容积的容积，所述灌注生物反应器与所述第二生物反应器之间的容积比率为1:3至1:40，诸如约1:4至约1:10。
12.根据权利要求11所述的过程，其中所述细胞培养物以分批进料方式在所述第二生物反应器中继续生长。
13.根据权利要求11或12所述的过程，其中所述细胞培养物在所述灌注生物反应器中保持约3天至约12天，并且在所述第二生物反应器中保持少于约12天，诸如少于约10天。
14.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中所述细胞培养物在所述灌注生物反应器内达到大于约10×106个细胞/mL，诸如大于约30×106个细胞/mL，诸如大于约50×106个细胞/mL，诸如大于约70×106个细胞/mL的细胞密度。
15.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中所述细胞培养物在所述灌注生物反应器内达到100×106个细胞/mL或更大的细胞密度。
16.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中所述细胞培养物包含哺乳动物细胞。
17.一种用于生产用于后续细胞培养物生产过程的接种物的系统，其包含：
灌注生物反应器；
与所述灌注生物反应器流体连通的营养介质进料，所述营养介质进料用于将营养介质进料到所述灌注生物反应器以使细胞培养物生长；
用于从所述灌注生物反应器取出流体介质的流出物；
泵送装置，其与所述灌注生物反应器的流出物流体连通以从所述灌注生物反应器取出受控量的流体介质；
用于监测所述灌注生物反应器的重量的称重装置；
生物质传感器，诸如电容传感器，其与所述灌注生物反应器流体连通以确定所述灌注生物反应器内的生物质浓度；以及
与所述生物质传感器和所述称重装置连通的控制器，所述控制器被配置成基于从所述生物质传感器接收的信息控制所述营养介质进料以增加或减少被进料到所述灌注生物反应器的营养介质的流速，所述控制器还被配置成基于从所述称重装置接收的信息控制所述泵送装置以增加或减少从所述灌注生物反应器抽取流体介质的流速，
其中所述控制器基于以下关系控制进入所述灌注生物反应器的所述营养介质的流量：
Figure FDA0003724384360000031
其中K是生物容积比灌注速率(mL进料/mL生物容积/天)；
Figure FDA0003724384360000032
是生物容积分数并且是在细胞的细胞膜内部的所述灌注生物反应器的容积，表示为百分比或分数(mL生物容积/mL生物反应器)；以及
P是以mL进料/mL生物反应器/天表示的所述灌注速率。
18.一种细胞培养物生产过程，其包含：
通过权利要求1至15中任一项所述的方法产生包含表达生物产物的宿主细胞的接种物；
将所述接种物引入生产生物反应器；
培养所述宿主细胞以生产所述生物产物；
从所述细胞培养物中收获所述生物产物；以及
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