KR20160145746A - 발효 시스템 - Google Patents

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프라운호퍼-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 안게반텐 포르슝에.파우.
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Abstract

본 발명은 현재 기존의 발효 전략보다 이점을 지닌 신규한 세포 배양 및 세포 및/또는 세포-유래된 생성물 생산 공정에 관한 것이다. 본 발명에 따른 공정 및 방법은 현재 적용되는 공정(배치, 유가 또는 관류 전략)에 비해 이점을 지닌 대안적인 생산 공정으로서, 일시적인 생산 플랫폼에 대한 매우 생육가능하고 대사적으로 활성인 진핵생물 세포의 효율적인 공급을 위해 그리고 일시적인 발현 시스템을 위한 후속 사용 또는 바이러스 또는 슈도바이러스에 의해 또는 세포 비함유 시스템에서 감염을 위한 대사적으로 매우 활성인 바이오매스를 생성하기 위해 이용될 수 있다.

Description

발효 시스템{FERMENTATION SYSTEMS}
본 발명은 현재 기존의 발효 전략보다 이점을 지닌 신규한 세포 배양 및 세포 및/또는 세포-유래된 생성물 생산 공정에 관한 것이다. 본 발명에 따른 공정 및 방법은 현재 적용되는 공정(배치, 유가(fed-batch) 또는 관류 전략)에 비해 이점을 지닌 대안적인 생산 공정으로서, 일시적인 생산 플랫폼에 대한 매우 생육가능하고 대사적으로 활성인 진핵생물 세포의 효율적인 공급을 위해 그리고 일시적인 발현 시스템을 위한 후속 사용 또는 바이러스 또는 슈도바이러스에 의해 또는 세포 비함유 시스템에서 감염을 위한 대사적으로 매우 활성인 바이오매스를 생성하기 위해 이용될 수 있다.
생물약제의 제조는 부피 요구의 상승 및 더욱 엄격한 안전성 요건과 같은 많은 변화를 겪는다. 또한, 제품 품질, 제품 수율, 생산 비용 및 가동율(facility utilization)은 생물약제 산업에 중요한 측면이다. 따라서 종래의 제조 플랫폼을 추가로 최적화 및 개선하고 현행 장애를 해소할 수 있는 신규한 플랫폼을 개발할 뿐만 아니라 신규하고 혁신적인 생산 공정을 가능하게 하는데 관심이 계속되어 왔다.
원칙적으로 생명공학 산업에서 발효기의 이용은 현재 발효 용액의 제조, 바이오매스의 생산 및 발효 생성물의 제조를 위한 배치, 유가 또는 연속 생물반응기 공정을 포함한다. 생물반응기에 공급하는 방식은 생물반응기 또는 발효기가 배치, 유가 또는 연속 생물반응기로 분류되는 지를 결정한다.
생물반응기가 추가 공급 없이 단지 1회 충전되는 경우 (즉, 영양소를 함유하는 배지의 첨가) 생물반응기는 배치 모드로 동작한다. 생물반응기는 완료시까지 실행될 수 있을 것이다. 실행 끝에 발효는 종료되고, 생성물을 수거한 후, 새로운 발효가 다시 시작된다.
이러한 배치 절차는 통상적으로 영양 배지를 요망되는 배양액으로 접종, 신중하게 규정된 조건 하에 특정 시간 동안 배양, 및 미생물의 수거 및/또는 요망되는 대사 생성물의 회수를 포함한다.
상세한 배치 발효:
배치 발효는 배지로 1회 충전되고 접종된다. 접종 후 반응기는 pH를 조절하기 위한 산소 및 염기/산과 같은 몇 가지 첨가제를 제외하고는 밀폐된 시스템이다. 이는 일단 발효가 시작되면 추가 배지 또는 영양소가 반응기에 공급되지 않을 것임을 의미한다. 따라서 반응기 배양 부피는 전체 공정에 걸쳐 일정하다 (증발로 인한 부피 손실 제외). 세포 밀도, 생육성, 용존 산소, 영양소 및 생성물 농도와 같은 여러 중요한 세포 배양 파라미터가 공정 동안 달라진다. 세포 배양은 유도, 지수 및 정상 성장기를 겪는다. 회수 조건에 도달하면 공정을 종료하고 전체 발효 브로쓰를 회수할 것이다. 더 많은 생성물을 생산하기 위해, 공정은 반복되거나 더 큰 용기로 확대된다.
상세한 반복된 배치 발효:
반복된 배치 발효는 접종 후 정상적인 배치 모드로 동작한다. 세포 밀도, 용존 산소, 영양소 및 생성물 농도와 같은 배양 파라미터는 전체 공정 동안 달라진다. 생물반응기는 완료시까지 진행될 수 있을 것이다. 실행의 끝에 발효 브로쓰를 멸균 조건하에 회수하지만 고정된 부피의 발효 브로쓰는 생물반응기에 유지되어 새로운 접종물로서 기능한다. 반응기를 다시 신선 배지로 채우고 새로운 배치 발효 사이클을 시작한다. 그 동작 모드의 세포는 각 사이클에 대한 새로운 순응, 지수 및 정상 성장기를 겪는다. 반복된 배치 발효는 발효기 및 접종물을 준비하는 시간을 절약함으로써 배치 및 유가 공정의 전반적인 공정 효능을 증가시킨다. 이상적으로 반복된 배치는 본질적으로 배치 배양과 동일하지만, 이전 배양으로부터의 메모리 효과 및 캐리오버(carry-over)는 특히 약학적 단백질의 생산에서 우려된다.
그러나, 다수의 단점이 이러한 여러 배치 공정과 관련된다. 배치 발효에서 미생물 및 살아 있는 세포의 성장은 일반적으로 다양하고 때로는 바람직하지 않은 조건 하에 발생한다. 발효 시작에 세포는 배지에 순응하기 위한 시간을 필요로 한다 (유도기). 생육가능한 세포 밀도 (접종물 생육가능한 세포 계수)는 가장 높은 기질 농도의 존재 하에 가장 낮은 수준이고, 이는 심지어 배지의 높은 삼투압으로 인해 기질 저해 또는 성장의 억제를 발생시킬 수 있다.
연속 발효에서 멸균 영양소 용액은 특정 속도로 지속적으로 생물반응기에 공급되고 동등한 부피의 발효 브로쓰는 동시에 생물반응기로부터 제거되어 전체 공정 동안 생물반응기의 배양 부피를 본질적으로 일정하게 유지한다.
유기체의 성장 속도는 배양액의 최대 성장 속도에 따라 배지가 펌핑되는 속도에 의해 조절될 것이다. 신선 배지 속도 (소위 희석 속도)는 유기체의 최대 비성장 속도(specific growth rate)의 90%보다 낮을 필요가 있다. 포유동물 및 식물 세포의 상대적으로 낮은 배가 시간 (대략 1일 1회)은 낮은 희석 속도를 초래하므로 세척된 발효 브로쓰는 장기간에 걸쳐 수집되어야 한다. 이러한 소위 회수 유지 단계는 여러 단점을 갖는다. 먼저, 회수된 세포는 회수 컨테이너가 발효기와 동일한 복잡성 수준을 포함하지 않으므로 불리한 조건 하에 유지된다. 전형적으로 다수의 파라미터가 더 이상 제어되지 않는다. 조건의 변화는 더 낮은 세포 생육성으로 이어지고 세포 붕괴는 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA와 같은 세포내 오염물질의 방출을 초래한다. 생성물 품질은 단백질분해 또는 변경된 번역후 변형을 포함하는 여러 메커니즘을 통해 손상될 수 있다. 규제 관점에서 배치의 정의는 또한 더욱 어렵다. 배치-대-배치 일관성은, 예컨대 배지 배치들에서의 미묘한 차이에 의해 초래될 수 있는 성장 속도의 사소한 변화가 공정에서의 큰 변화를 일으킬 수 있으므로 중요한 문제이다. 생물약제 생성물의 경우 그러한 공정은 그 때 종료되어야 하고 생성물은 버려야 한다.
상세한 연속 발효 (화학조절배양장치/터비도스탯)
둘 모두의 동작 모드는 일정한 세포 밀도를 목표로 하는 고정된 반응기 부피를 지닌 연속 공정이다. 둘 모두의 공정에서 신선 배지는 연속하여 반응기에 공급되는 한편, 동시에 동일한 부피의 발효 브로쓰가 회수된다. 배양 부피는 전체 공정 동안 일정하게 유지되므로, 첨가되는 신선 배지의 양은 제거되는 배양 브로쓰의 양과 동일하여야 한다. 따라서 신선 배지 투입 및 발효 브로쓰 배출은 서로에 의존적이다.
화학조절배양장치 공정에서, 신선 배지를 첨가하고(= 공급 속도) 배양 브로쓰를 제거하기 위한 (= 회수 속도) 고정된 흐름 속도가 이용된다. 흐름 속도는 동일하고 희석 속도로 불리며, 즉, 발효기의 배양 부피는 일정하게 유지된다. 일단 세포 배양액이 외부 조건에 순응하면 공정은 안정한 정상 상태에 있는 것이고 성장 속도는 공급 속도와 일치한다. 예를 들어 배지의 새로운 배치가 이용되는 경우일 수 있거나, 대사 생성물이 시간 경과에 따라 누적되어, 성장 속도에 영향을 받을 정도로 시스템이 붕괴되면, 시스템은 불안정해질 수 있다. 특히 성장 속도가 감소하면, 세포는 유실되고 세포 밀도는 꾸준히 감소한다. 배양액 중 세포 수의 증가는 또한 부피에 의존적이다. 결과적으로, 발효 브로쓰는 공정을 방해하지 않고는 회수될 수 없다. 더욱이, 안정한 화학조절배양장치 공정의 세포 밀도는 외부 조건 (영양소, 온도, 통기…)의 결과이며 작업자에 의해 달리 규정될 수 없다. 터비도스탯 공정에서 희석 속도는 발효기의 세포 밀도 및 배양 부피가 시간 경과에 따라 일정하게 유지되도록 탁도에 의해 제어된다. 배양 브로쓰는 발효기로부터 연속하여 제거되고 수집 용기에 저장된다. 화학조절배양장치/터비도스탯 모드로 동작하는 발효는 용기에서 성장한 배양액의 소 분획을 연속하여 회수함에 의해 배양 브로쓰 및 그 안에 함유된 생성물을 제공한다. 소 분획은 수집되고 장기간 동안 컨테이너에 저장되어야 한다. 특히 생물약제의 경우 그러한 유지 단계는 바람직하지 않은데, 그 이유는 이것이 변이의 원인이고 생성물 품질에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문이다. 예를 들어, 유지 단계 동안 세포 용해가 발생할 수 있거나, 프로테아제가 생성물을 분해할 수 있거나, 번역후 변형이 영향을 받아 다시 변이가 증가하여 생성물 품질에 영향을 줄 수 있다. 유지 단계는 세포 또는 이러한 세포로부터 유래된 조성물이 생성물을 포함하는 경우 훨씬 더 바람직하지 않다. 유지 단계는 세포 생육성, 대사 활성 및 재현성을 감소시킨다.
연속 발효는 이들이 배치 및 유가 공정에 비해 현저하게 높은 공간-시간 수율을 지니기 때문에 유리하다. 따라서, 이들은 요망되는 생산 능력을 달성하기 위해 더 적은 설비 크기를 필요로 하고 이는 또한 생산 설비를 짓기 위한 투자가 적어짐을 의미한다.
연속 생물반응기의 이상적인 특징에도 불구하고, 공정 자체가 민감하고 오염의 위험, 세포 또는 바이오매스 유실, 및 생물반응기의 생물학적 단계의 변화와 같은 다양한 요인으로부터 영향을 받는다.
유가식은 생물반응기 작동의 중간 모델이다. 올바른 부품 구성과 함께 적당한 공급 속도가 공정 동안 요구된다. 유가식은 배치 및 연속 배양에 비해 많은 이점을 제공한다. 그 구현의 개념으로부터, 제어가능한 조건 하에 그리고 발효에 관여하는 미생물의 필수 지식에 의해, 성장에 요구되는 성분의 공급 및/또는 생성물의 생산에 요구되는 다른 기질은 절대 고갈될 수 없고 영양 환경은 발효 과정 동안 거의 일정하거나 필요한 수준으로 유지될 수 있다고 쉽게 결론지을 수 있다. 높은 농도의 기질의 존재와 일반적으로 관련된 부산물의 생산은 또한 그 양을 생화학 생산에만 요구되는 양으로 제한함에 의해 회피될 수 있다. 높은 농도의 기질이 존재하는 경우, 세포는 "오버로딩(overloaded)"되는데, 이는, 세포의 산화 능력을 초과하고, 크랩트리(Crabtree) 효과로 인해, 관심 있는 하나 이외의 생성물이 생성되어, 탄소 플럭스의 효능을 감소시키는 것이다. 더욱이, 이러한 부산물은 제빵사의 효모 생산에서 에탄올 생산과 같이, 관심 생성물을 심지어 "오염"시키고, 세포 성장을 손상시켜 발효 시간 및 이의 관련 생산성을 감소시킴이 입증되었다 (Chmiel 2006).
상세한 유가 발효:
유가 발효는 고전적인 배치상으로 시작한다. 특정 조건에 도달하면, 공급이 시작되고, 즉, 추가의 영양소가 제공된다. 이러한 동작 모드에서 반응기 배양 부피는 배치 단계에서 일정하고 공급 단계에서 부피는 증가한다. 이러한 모드에서 또한 여러 배양 파라미터가 도전과제이고 세포는 고전적인 성장기를 겪는다. 배치 발효에서와 같이 총 반응기 부피는 공정의 끝에 회수될 것이다.
배치 및 유가 발효에서 세포 생육성은 후기 단계에 하락하고, 회수 시점은 높고 일관된 생성물 품질을 확보하기 위해 신중하게 선택되어야 한다. 세포는 대사적 부담으로 인해 높은 스트레스를 경험할 수 있다. 세포가 죽어 파열되면 숙주 세포 단백질 및 DNA 뿐만 아니라 생성물 관련 불순물과 같은 세포내 물질이 배지로 방출되는데, 이것이 또한 우려의 대상이 될 수 있다.
그러나, 거의 모든 치료적 항체는 현재 유가 발효 전략 또는 관류-전략을 이용하여 생산된다. 공정 개발 (기술적 실행, 반복성)에 대한 배치 규정 및 시간 요건과 같은 특정 규제 측면 및 일반적 우려 (유지 단계, 생성물 안정성 및 품질 참조) 뿐만 아니라 새롭거나 상이한 기법에 대한 제약 업계 내의 전형적인 저항은 모두 유가 방법의 거대한 우위에 기여하였다. 비록 여러 문제가 있지만, 이는 특히 N-당화가 중요한 특성인 항체 생성물의 경우, 예컨대 생성물 품질 및 번역후 변형과 같은 문제를 일으킨다. 많은 경우에 유가 배양은 수율을 최대화하기 위해 장시간 인큐베이션되지만, 세포 생육성은 배양 기간의 끝으로 갈수록 현저하게 감소하여, 세포내 생성물, 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA를 유리시킨다. 이의 불리한 면은 낮은 생성물 품질 또는 높은 생성물 이종성 (예컨대, 글리고형)이거나, 낮은 생성물 품질 또는 높은 생성물 이종성 (예컨대, 글리고형)일 수 있어서, 결과적으로 더 높은 실패율 (배치 사양을 벗어남) 또는 낮은 제품 성능 (즉, 임상 효능)을 초래한다.
더욱이, 배치 및 유가 발효의 경우 낮은 실행-대-설정-시간 비는 현재 인력 및 인프라의 투자에 의해 보상된다. 연속 모드로의 전환은 때로 이를 회피할 수 있지만 이것이 항상 가능하고 항상 바람직한 것은 아니다. 배치/ 유가/반복된 배치 발효의 정상기 동안 발생하는 생성물 균질성과 관련된 문제는 정지기에 도달하기 전에 공정을 회수/종료시킴에 의해 해소되거나 회피될 수 있다. 그러나, 그 후에 현저하게 낮은 생성물 수율을 받아들여야 한다. 생성물 품질의 차이는 배치 거부의 빈번한 원인이고, 즉, 전체 물질을 손해보아야 하고 투자 비용은 회수되지 않는다.
최근에 진핵생물 세포에서 일시적인 유전자 발현을 이용한 생산 기법은 상당한 관심을 얻었다 (Derouazi, Girard et al. 2004 Biotechnol Bioeng; Geisse, Jordan et al. 2005 Methods Mol Biol; Hacker, Derow et al. 2005 J Biotechnol). 이는, 유전자이식 시스템 (예컨대, 유전자이식 식물)에 비해 높은 수율, 짧은 생산 주기 (수 일 vs. 개월 또는 심지어 수 년), 특히 응급 상황 (전염병, 맞춤형 의약)에서 빠른 반응 시간 및 빠른 제품 및 임상 개발을 포함하는 여러 이유 때문이다. 일시적인 생산 시스템은 트랜스펙션/형질전환을 위해 다량의 야생형 (즉, 형질전환되지 않음) 세포를 필요로 하는데, 그 이유는 세포가 장기간 동안 배양되지 않고 세포 성장 및 세포 분열이 전형적으로 낮거나 전혀 일어나지 않기 때문이다. 일시적인 유전자 발현에 숙주로서 이용되는 야생형 세포가 생성되는 생성물의 수율 및 품질에 결정적인 영향을 미친다는 것은 명백하다. 더욱이, 높은 재현가능성은 임상 시험될 제품에 매우 중요하다.
일시적인 생산 기법을 위해 고도로 생육가능한 세포 물질의 재현가능한 생산은 가장 중요한 장애물 중 하나이다.
시험관내 전사 및 시험관내 번역을 포함하는 세포 비함유 시스템은 또한, 특히 고처리량 스크리닝 및 합성 생물학 응용을 위해 상당한 관심을 받아 왔다. 특별한 이점은 (무엇보다도) 세포 비함유 시스템이 전체 세포에 적용할 수 없는 방식으로 변형될 수 있고, 핵산이 세포 벽 및 세포 막을 통해 이들을 세포에 전달하는 기법을 요구하지 않고 직접 첨가될 수 있으며, 실험이 표준화될 수 있고, 판독값을 측정하기 위한 다수의 방법이 있다는 것이다. 세포 비함유 시스템은 특히 다운-스케일링 및 자동화가 가능하다. 일시적인 발현 시스템에 관해, 세포 비함유 시스템에 필요한 매우 활성인 성분에 대한 재현가능한 생산 기법은 현재 상당한 장애를 나타낸다.
따라서, 개선된 세포 바이오매스 또는 세포-유래된 생성물을 제공하기 위해 현재 발효 기법의 단점을 극복하는 것이 본 발명의 목적이었다.
발명의 개요
신규한 세포 배양 및 세포 및/또는 세포-유래된 생성물 생산 공정은 현재 기존의 발효 전략보다 여러 이점을 제공한다.
신규한 공정과 연속 화학조절배양장치/터비도스탯(turbidostat) 공정의 주요 차이점은 가변적인 배양 부피 및 공급 속도 및 회수 속도의 독립성이다. 화학조절배양장치/터비도스탯과 달리, 본 발명에 따른 공정에서의 배양 부피는 배치 또는 화학조절배양장치/터비도스탯 공정에서와 같이 전체 공정에 걸쳐 일정하지도 않고 유가 공정에서와 같이 전체 공정에 걸쳐 단순히 상승하는 것만도 아니다. 가변적인 배양 부피 및 분리된 공급 속도 및 회수 속도는 신규한 공정의 주요 특징이다. 배양 부피, 세포 밀도, 공급 속도 및 회수 속도를 비교함에 의해 상이한 공정이 구별될 수 있다 (도 9, 10 및 11을 참조하라).
본 발명의 공정에서 공급 스트림은 세포 밀도에 의해 제어되므로, 세포가 그 최대 성장 속도로 끊임없이 성장하지만 화학조절배양장치 또는 유가 발효에서와 같이 고정되거나 미리 규정되지 않기 때문에 실제로 연속적이다 (도 11).
전체 배양액이 공정의 끝에 회수되는 배치 및 유가 발효, 및 증가량의 배양액이 연속하여 회수되는 화학조절배양장치/터비도스탯 공정과 달리, 본 발명에 따른 공정은 언제든지 작업 범위 내의 임의의 부피를 회수할 수 있다. 작업 범위는 실제 배양 부피에서 유지되는 최소 부피를 뺌에 의해 주어진다.
따라서, 본 발명은 현재 기존의 발효 전략에 비해 이점을 지닌 신규한 세포 배양 및 세포 및/또는 세포-유래된 생성물 생산 공정에 관한 것이다. 본 발명에 따른 공정 및 방법은 현재 적용되는 공정(배치, 유가 또는 관류 전략)에 비해 이점을 지닌 대안적인 생산 공정으로서, 일시적인 생산 플랫폼에 대한 매우 생육가능하고 대사적으로 활성인 진핵생물 세포의 효율적인 공급을 위해 그리고 일시적인 발현 시스템을 위한 후속 사용 또는 바이러스 또는 슈도바이러스에 의해 또는 세포 비함유 시스템에서 감염을 위한 대사적으로 매우 활성인 바이오매스를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명은 가변적인 시점에 가변적인 부피로 재현가능한 발효 브로쓰의 회수를 가능하게 하는 연속/반연속 세포 배양 전략에 관한 것이고, 이는 예를 들어 연속적인 다운스트림 처리 전략에 특별한 이점을 제공한다.
본 발명은 또한 안정한 유전자이식 세포주로부터 유래된 생물약제 생산의 공간-시간 수율을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 공정 및 방법을 이용하여 생산 가동율을 증가시키기에 더욱 효율적인 업스트림 및 다운스트림 공정을 구현할 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 모든 배양 공정은 세포의 성장을 방해하지 않고 언제든지 임의의 부피의 임의적이고 반복적인 회수를 가능하게 하며, 여기서 0 < 회수된 부피 < (실제 부피 - 최소 부피)이다. 본 발명에 따른 공정의 이점 중 하나는 연속 세포 배양 공정이 연장된 기간 동안 발효 브로쓰를 수집하기 위한 용기를 필요로 하지 않고/거나 공급이 조절되고 회수가 임의로 실행될 수 있어서, 세포의 성장이 유지되고 회수 절차에 의해 크게 방해받지 않는다는 것이다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 진핵생물 세포 및/또는 진핵생물 세포-유래된 생성물의 생산을 위한 세포-밀도 조절된 세포 배양 공정에 관한 것이고, 이 때 세포 배양 동안의 세포 밀도는 배양 용기에서 세포 및 영양소 배지를 포함하는 세포 배양액의 부피를 조정함에 의해 조절되며, 상기 공정은,
a) 세포를 가변적인 세포 배양 부피를 갖는 세포 배양액에서 성장시키는 단계로서, 배양 부피는 전체 세포 배양 공정 동안 일정하게 조절되지 않는, 단계,
b) 밀도 센서에 의해 세포 배양액 중 세포 밀도를 측정하는 단계,
c) 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하여 세포를 성장기로 유지함에 의해 세포 배양액에서 세포 밀도를 조절하는 단계,
d) 요망되는 세포 밀도에서 세포 배양액의 분획을 회수하는 단계로서, 회수된 분획이 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 포함하고, 용기의 세포 배양 부피가 상기 분획의 회수 후에 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 연속하여 일정하게 유지되지 않고/거나 회수된 분획의 부피가 즉시 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 보충되지 않는, 단계,
e) 세포 배양 분획의 반복된 회수가 가능하도록 개시된 순서로 상기 단계 중 하나 또는 전부를 반복하는 단계, 및
f) 임의로 회수된 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 처리하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 진핵생물 세포 및/또는 진핵생물 세포-유래된 생성물의 생산을 위한 세포-밀도 조절된 세포 배양 공정에 관한 것이고, 이 때 세포 배양 동안의 세포 밀도는 배양 용기에서 세포 및 영양소 배지를 포함하는 세포 배양액의 부피를 조정함에 의해 조절되며, 상기 공정은,
a) 세포를 가변적인 세포 배양 부피를 갖는 세포 배양액에서 성장시키는 단계로서, 배양 부피는 전체 세포 배양 공정 동안 일정하게 조절되지 않는, 단계,
b) 밀도 센서에 의해 세포 배양액 중 세포 밀도를 측정하는 단계,
c) 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하여 세포를 성장기로 유지함에 의해 세포 배양액에서 세포 밀도를 조절하는 단계,
d) 요망되는 세포 밀도에서 세포 배양액의 분획을 회수하는 단계로서, 회수된 분획이 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 포함하고, 회수된 분획의 부피가 즉시 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 보충되지 않는, 단계,
e) 세포 배양 분획의 반복된 회수가 가능하도록 개시된 순서로 상기 단계 중 하나 또는 전부를 반복하는 단계, 및
f) 임의로 회수된 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 처리하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 진핵생물 세포 및/또는 진핵생물 세포-유래된 생성물의 생산을 위한 세포-밀도 조절된 세포 배양 공정에 관한 것이고, 이 때 세포 배양 동안의 세포 밀도는 배양 용기에서 세포 및 영양소 배지를 포함하는 세포 배양액의 부피를 조정함에 의해 조절되며, 상기 공정은,
a) 세포를 가변적인 세포 배양 부피를 갖는 세포 배양액에서 성장시키는 단계로서, 배양 부피는 전체 세포 배양 공정 동안 일정하게 조절되지 않는, 단계,
b) 밀도 센서에 의해 세포 배양액 중 세포 밀도를 측정하는 단계,
c) 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하여 세포를 성장기로 유지함에 의해 세포 배양액에서 세포 밀도를 조절하는 단계,
d) 요망되는 세포 밀도에서 세포 배양액의 분획을 회수하는 단계로서, 회수된 분획이 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 포함하고, 용기의 세포 배양 부피가 상기 분획의 회수 후에 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 연속하여 일정하게 유지되지 않는, 단계,
e) 세포 배양 분획의 반복된 회수가 가능하도록 개시된 순서로 상기 단계 중 하나 또는 전부를 반복하는 단계, 및
f) 임의로 회수된 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는,
i) 본 발명의 공정에 따라 세포를 배양하고 회수하는 단계,
ii) 회수된 세포에 추출 처리를 사용하여 배양된 세포의 세포 비함유 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 시험관내 번역을 위해 세포 비함유 추출물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명의 구체예는,
i) 본 발명의 공정에 따라 세포를 배양하고 회수하는 단계,
ii) 회수된 세포를 핵산으로 형질전환시켜 안정한 세포주를 수득하는 단계를 포함하는, 안정한 세포주를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.
또한 다른 양태에서, 본 발명의 구체예는,
(i) 세포를 식물 세포 현탁 배양액으로부터 분리함에 의해 다공성 구조를 갖는 세포 팩을 제공하는 단계로서, 이 때 세포는 본 발명에 따른 방법에 의해 배양되고, 세포 팩에 포함된 액체의 함량은 cm3 당 0.1 내지 0.9 g의 습윤 세포 중량의 세포 팩 밀도에 상응하도록 감소되고 조정되어, 상기 세포 팩의 배지-박탈된 다공성 구조 특성을 확립하는 단계, 및
(ii) 상기 배지-박탈된 다공성 구조의 세포 팩을 비-액체 환경에서 50 내지 100%의 상대 습도 하에 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 배지-박탈된 다공성 구조의 비-조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 물질의 생성 및 상기 세포 팩의 후속 유지를 위한 방법을 제공한다.
개시 내용을 상세하기 설명하기 전에, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기재하려는 목적이며, 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 명세서 및 첨부된 청구항에 이용된 단수 형태는 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한 단수 및/또는 복수의 대상물을 포함하는 것에 유의해야 한다. 더욱이, 파라미터 범위가 수치 값으로 한계가 정해져 제공된 경우, 그 범위는 이러한 한계 값을 포함하는 것으로 간주됨이 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명에 따른 배양 시스템의 도식이다.
도 2는 담배 BY-2 세포의 반연속 배양을 위한 온라인 데이터를 도시하는 다이아그램이다.
도 3은 담배 BY-2 세포의 반역속 배양을 위한 오프라인 파라미터를 도시하는 다이아그램이다.
도 4는 아그로박테리움-매개된 유전자 전달 5일 후 일시적인 유전자 발현의 스크리닝을 위한 (항체 누적으로 표시됨) 담배 BY-2 PCP에 의한 상이한 전체-식물 발현 시스템 (N. 벤타미아나(N. benthamiana), N. 타바쿰(N. tabacum) K326 및 N. 타바쿰 SR-1)의 비교를 도시하는 다이아그램이다.
도 5는 배치 배양된 세포 및 연속 배양된 세포로부터 각각 제조된, 커플링된 전사/번역 세포 비함유 담배 BY-2 시스템에서 생성된 향상된 황색 형광 단백질 (eYFP)의 수율 비교를 도시하는 다이아그램이다.
도 6은 소르부스 토르미날리스(Sorbus torminalis) 세포의 반연속 배양을 위한 온라인 데이터를 도시하는 다이아그램이다.
도 7은 피루스 코뮤니스(Pyrus communis) 세포의 반연속 배양을 위한 온라인 데이터를 도시하는 다이아그램이다..
도 8은 유전율(permittivity) 설정 값에 따라 표준 N. 타바쿰 cv BY-2 배치 발효에 비해 본 발명에 따른 공정 이용시 개선을 도시하는 다이아그램이다.
도 9는 A) 배치 발효 공정에서 배양 시간 동안 배양 부피, 세포 밀도, 공급 속도 및 회수 속도 및 B) 유가 발효 공정에서 배양 시간 동안 배양 부피, 세포 밀도, 공급 속도 및 회수 속도의 두 다이아그램을 도시한다.
도 10은 A) 반복된 배치 발효 공정에서 배양 시간 동안 배양 부피, 세포 밀도, 공급 속도 및 회수 속도 및 B) 화학조절배양장치/터비도스탯 발효 공정에서 배양 시간 동안 배양 부피, 세포 밀도, 공급 속도 및 회수 속도의 두 다이아그램을 도시한다.
도 11은 배양 시간 동안 배양 부피, 세포 밀도, 공급 속도 및 회수 속도의 관점에서 본 발명에 따른 발효 공정의 특징을 도시하는 다이아그램이다.
도 12는 배치 발효 공정 동안 세포 및 배양 상청액에서 유전자이식 니코티아나 타바쿰 BY 2 세포주의 유전율 및 2G12 항체 농도를 도시하는 다이아그램이다.
도 13은 본 발명에 따른 발효 공정 동안 세포 및 배양 상청액에서 유전자이식 니코티아나 타바쿰 BY 2 세포주의 유전율 및 2G12 항체 농도를 도시하는 다이아그램이다.
도 14는 본 발명에 따른 전체 공정 동안 유전율, 배지 공급 부피 및 유전자이식 CHO DG44 세포 배양액의 누적된 회수 부피를 도시하는 다이아그램이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 고도로 일관되고 재현가능한 방식으로 단백질과 같은 진핵생물 세포 (바이오매스) 및/또는 진핵생물 세포-유래된 생성물을 생산하기 위한 신규한 공정 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 공정은 세포-밀도 조절된 세포 배양 공정이며, 이 때 배양 용기에서 세포 배양액의 부피 조정은 세포 배양액 중 세포 밀도를 조절한다. 상기 공정 및 방법은 고도로 일관되고 재현가능한 방식으로 식물 및 포유동물-기반 시스템 둘 모두에 적합하며, 이 때 공정은 강력하고 재현가능한 생산은 규제 요건을 더 잘 충족한다. 본 발명의 공정의 한 가지 이점은 양호한 유사성(comparability), 배치-대-배치 일관성 및 낮은 변동성으로 인해 스크리닝 및 생성물 발생을 위한 개선된 세포를 생산하는 능력이다. 게다가, 기재된 공정에 의해 매우 생육가능한 (지수적으로 성장하는) 세포를 제공하는 능력은 (i) 높은 형질전환 효율, (ii) 생산성 (생성물 수율, 효소 활성) 및 (iii) 높은 대사 활성 (세포 비함유 시스템에 적용)의 이점을 제공한다. 본 발명의 공정 및 방법은 증가된 실행-대-설정-시간 비, 낮은 인력 요건 및 증가된 공간-시간-수율로 인해 더욱 경제적이다. 특히, 회수 시간 및 회수되는 부피는 기재된 공정에 더 유연하여, 여러 작은 생산 캠페인을 실행할 때 (맞춤형 의약 또는 제품 개발) 예측하기 어려운 요구에 대응할 수 있게 한다. 상기 방법은 연속 발효 전략 (화학조절배양장치, 관류)의 많은 이점을 제공하면서 유지 단계 동안 세포 생육성, 생성물 안정성 및 품질에 관한 문제를 회피/해소한다.
본 발명에 따른 공정 및 방법은 발효 공정 동안 세포 밀도 (또는 세포 밀도, 바이오매스 밀도, 세포 농도 또는 부피 당 세포 수와 관련된 임의의 다른 특성)를 조절하는 새로운 방식으로 구성된다. 이는 발효 브로쓰 (즉, 세포 배양액)의 부피를 변화시켜 바이오매스를 조정함에 의해 달성된다. 센서는 연속하여 바이오매스 (입력 신호)를 측정하고 컨트롤러는, 예를 들어 적절한 부피를 배지 저장소로부터 배양 용기에 첨가하도록 펌프를 촉발시키는 출력 신호를 발생시켜, 세포 배양 부피를 변화시키는 제어 루프가 이용될 수 있다. 적절한 부피를 첨가함에 의해, 세포 밀도는 시간 경과에 따라 일정하게 유지된다 (대안적으로, 세포 밀도에 대한 시간-의존적인 함수가 정의되고 그에 따라 제어될 수 있다). 이렇게 함으로써, 세포는 끊임없이 성장기로 유지된다. 발효기는 최소 및 최대 충전 수준 사이에서 동작한다. 회수된 부피는 이 최소 및 최대 범위 내에서 가변적일 수 있다. 최소 및 최대 부피는 용기 형상에 의해 주어진다. 최소 부피는 프로브/센서 또는 교반기와 같은 모든 장치가 적절한 측정, 혼합 및 공정의 제어를 제공하기 위해 충분히 발효 브로쓰와 접촉함을 보장하기 위해 발효기 내에 유지되어야 하는 부피이다. 최대 충전 수준은 용기를 넘치는 발효 브로쓰 또는 거품이 발생할 수 없도록 보장하는 부피로 정의된다. 최대 충전 부피에 도달하면, 발효 브로쓰를 회수해야 한다. 대안적으로, 즉, 더 높은 세포 밀도를 얻기 위해, 제어 루프를 바꿀 수 있다. 상이한 시점에 가변적인 부피로 회수될 수 있는 발효 브로쓰는 매우 일관되고 재현가능하다. 당업자는 또한, 예를 들어 실제 세포 배양 부피가 최대 부피 이상으로 증가하는 것을 막거나, 원격 회수가 가능하도록 자동화 회수 기능이 실행될 수 있음을 이해할 것이다. 자동화 회수 기능은, 예를 들어, 예컨대 아날로그 또는 디지털 출력 신호에 의해 외부적으로 제어되는 펌프와 함께 수위 센서를 이용하여 실현될 수 있다.
즉, 일시적인 생산 기법에 생산된 세포를 이용하기 위해, 신규하고 효율적인 진핵생물 세포 생산 기법을 제공하는 것이 목적이었다. 최근에 진핵생물 세포를 이용한 일시적인 생산 기법이 상당한 관심을 얻고 있다. 이는, (i) 유전자이식 시스템 (예컨대, 유전자이식 식물)에 비해 높은 수율, (ii) 짧은 생산 주기 (수 일 vs. 개월 또는 심지어 수 년), 특히 응급 상황 (전염병, 맞춤형 의약)에서 빠른 반응 시간 및 빠른 제품 및 임상 개발을 포함하는 여러 이유 때문이다.
따라서, 유리한 구체예에서, 본 발명에 따른 공정 및 방법은 후속하여 일시적인 생산에서 숙주 세포로서 이용되는 세포 (바이오매스)를 제공하기 위해 이용된다. 이는 이러한 세포가 후속하여 적절한 수단에 의해 트랜스펙션/형질전환되고 인큐베이션되어 관심 분자(생성물)을 제공할 것임을 의미한다. 세포 생육성은 세포 현탁액 (동물 및 식물 세포 둘 모두)을 활용한 일시적인 생산 플랫폼에 매우 중요하다. 일시적 생산을 위해 다량의 균질하고 재현가능한 출발 물질(세포)이 또한 요구된다.
본 발명에 따른 공정을 이용하는 한 가지 이점은 일부 구체예에서 정지기가 발생하기 않고 전체 생산 공정을 통틀어 세포 생육성이 유지되어, 공정이 배치, 유가 및 관류 방법에 비해 이점을 갖는다는 것이다.
추가 이점은 본 발명의 공정 및 방법이 세포 바이오매스를 생산하기 위해 (재조합 유전자의 발현을 억제하는 조건 하에) 기재된 방법에 따른 첫 번째 배양 단계를 이용한 다음, 이러한 세포를 또 다른 발효기에 전달하고, 이어서 첫 번째 배양 단계와 상이한 조건 하에 유전자-발현이 유도되거나 세포가 바이러스로 감염되거나 세포가 인큐베이션되는 두 번째 단계를 실행함에 의해 "발효 연쇄반응"을 진행하는데 이용될 수 있다는 것이다. 이것은 두 번째 단계가 세포 생산기보다 짧거나 (양호한 공간-시간-수율), 예컨대 세포가 바이러스 또는 슈도바이러스에 의해 감염될 때 물리적 분리가 요구되는 발효 연쇄반응에 특히 유리하다.
시험관내 번역을 위한 세포 비함유 추출물 (용해물)의 생산을 위해 다량의 균질한 출발 물질이 요구된다. 생성된 용해물의 최적 생산성을 확보하기 위해 세포는 높은 대사 활성 및 높은 생육성을 특징으로 하는 지수적 성장기에 있어야 한다. 또한 회수 시점에 세포 밀도가 중요한 역할을 한다. 통상적으로 세포 배양액은 배치 모드로 요망되는 세포 밀도까지 성장하고, 회수되고, 즉시 처리된다. 이는, 큰 발효 공정에서 성장 속도가 변화하여 특정 회수 시점을 정확하게 예측할 수 없게 만드므로, 시간의 관점에서 높은 유연성을 필요로 한다. 게다가 배양 공정에 대한 세포의 최적 순응(adaption)이 배치 모드에서는 보장될 수 없다. 세포 물질을 고도로 활성인 용해물로 처리하는 것은 또 다른 중요한 요인이다. 식물 기반 세포 비함유 용해의 생산을 위해 확립된 프로토콜은 종종 시간-소모적이고 비용-집약적이다.
따라서, 본 발명의 공정 및 방법은 이상적으로 유전자 발현 및/또는 단백질 생산을 위해 그러한 "세포 비함유 시스템"을 제조하는데 후속적으로 이용되는 진핵생물 세포를 생산하기에 적합하다. 이는 단순히 이러한 시스템이 또한 출발 물질로서 일관되고 재현가능하며 고도로 생육가능한 세포를 필요로 하기 때문이다. 지수 성장기 및 일정한 세포 밀도의 세포 배양액의 연속 제어되는 발효가 가능하기 때문에, 최적 생산성을 지닌 용해물을 발생시키는 세포 물질이 언제든지 용기의 최소/최대 범위 내의 요구되는 부피로 회수될 수 있다. 수 개월 동안의 연속 발효는 또한 세포의 발효 조건에 대한 최적 순응을 보장한다. 생성된 일관된 세포 출발 물질은 처리된 최종 생성물의 품질에 큰 영향을 미친다. 세포 물질을 용해물로 처리하는 동안 프로토플라스테이션(protoplastation)에 대한 비용은 통상적인 효소를 식품 산업을 위해 원래 설계된 액체 셀룰라제 및 펙티나제에 의해 대체함에 의해 백배 넘게 감소될 수 있었다. 동시에 시간 단위 당 개선된 프로토플라스테이션이 관찰되었다. 이러한 효소 제조물의 사용은 보통의 시장 가격으로 식물-기반 용해물의 상업적 생산을 허용한다. 변경된 완충제, 세척 및 원심분리 단계, 및 연속 대신 불연속 퍼콜 구배의 사용과 같은 문헌[Komoda et al. (2004)]에 기재된 프로토콜의 추가 변형은 더 빠른 생산 뿐만 아니라 용이한 확장성을 이끌어 내었다.
일시적인 발현에 의해 관심 분자를 생산하기 위해 트랜스펙션/형질전환에 후속 사용하기 위한 고도로 일관되고 재현가능한 세포 바이오매스를 제공, 가변적인 시점에 가변적인 부피로 재현가능한 발효 브로쓰의 회수를 가능하게 하는 연속 세포 배양 전략 제공과 같은 본 발명의 공정 및 방법에 의해 해결될 수 있는 여러 추가 이점이 존재한다. 추가로, 본 발명의 공정 및 방법은 높은 생육성을 지닌 지수적으로 성장하는 세포를 연속하여 제공한다.
더욱이, 본 발명의 공정 및 방법은 다음 문제를 해결한다. 연속 발효에서 종래 기술에서 세포-유래된 생성물 및/또는 세포 함유 세포 배양액은 연장된 기간에 걸쳐 회수되어야 하고, 따라서 회수된 물질은 추가로 인큐베이션된다 (소위 유지 단계). 이 유지 단계는 (i) 세포 생육성이 감소할 것이고/거나 (ii) 생성물 품질이 손상될 수 있으므로 문제가 된다. 결과적으로 배치의 규정이 더욱 어렵다. 게다가, 식물 현탁액 세포의 연속 발효는 기술적 도전과제인데, 그 이유는 낮은 흐름 속도의 현탁액의 연속 제거는 회수 파이프의 막힘을 발생시키고, 본질적으로 발효 공정을 종료시키기 때문이다. 추가로, 배치 및 유가 발효는 낮은 (비경제적) 실행-대-설정-시간 비의 문제가 있다. 더욱이, 생성물 균질성 (예컨대, 항체의 N-당화)은, 세포 생육성이 발효 끝으로 갈수록 감소하여, 전형적으로 세포 용해, 세포내 생성물(상이한 N-당화), 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA의 방출을 초래하기 때문에, 포유동물-세포의 배치 및 유가 발효에 있어서 중요한 문제이다. 본 발명의 공정 및 방법은 이러한 문제를 해결한다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 공정 및 방법의 발명자들은,
- 고도로 일관되고 재현가능한 세포 바이오매스의 연속 생성
- 반연속 배양 전략의 강력함 (64일이 넘는 공정 시간이 달성됨)
- 반복된 배치 배양에 비해 증가된 공간-시간 수율 (식물 세포 바이오매스)
- 용존 산소 조절은 끊임없는 지수적 성장 속도를 보장함
- 여러 공정 동안 상이한 식물 현탁액 세포의 성공적인 배양 (니코티아타, 피루스 및 소르부스 종)
- 일시적인 유전자 발현 및 상이한 항체의 생산에 생성된 식물 세포의 성공적인 이용
- 세포 비함유 시스템에 대한 BY-2 식물 세포의 이용이 입증됨
- 공정 내에서 세포 농도의 증가/감소
- 자동화 회수 절차의 구현 ("실행 시간(hands-on-time)" 감소)을 제시한다.
요약해 보면, 본 발명은 치료 적용을 위한 분자를 생산하기 위해 일시적인 생산 플랫폼을 사용하는데 있어서의 중요한 요건인 고도로 일관되고 재현가능한 방식으로 세포 (바이오매스)를 생산하는 능력을 지닌 공정 및 방법에 관한 것이다.
또 다른 직접적인 효과는 본 발명의 공정 및 방법이 매우 생육가능한 (지수적으로 성장하는) 세포를 제공하여, (i) 높은 형질전환 효율 및 (ii) 생산성 (생성물 수율, 효소 활성 등)의 이점을 제공하는데 이상적으로 적합하다는 것이다. 동시에 불순물: 프로테아제 및 다른 요망되지 않는 효과를 발생시킬 수 있는 아폽토틱 또는 사멸 세포는 감소된다.
또한 본 발명의 공정 및 방법의 다른 효과는 세포 비함유 시스템을 위한 성분을 제조/유래시키는데 이용될 수 있는 고도로 생육가능하고, 일관되며 재현가능한 세포의 전달이다.
또 다른 효과는 실행-대-설정-시간 비가 증가하는 것이고 이점은 생산이 더 저렴하고 빨라지며 인력이 덜 필요하다는 것이다. 이는 또한 유도성 발현이 이용되고 성장 및 생산기의 명확한 분리가 이루어질 수 있는 미생물 시스템에 대한 주요 장점이다.
또한 다른 효과는 회수 시간 및 회수된 부피가 더욱 유연하다는 것이다. 이는, 예를 들어 맞춤 의약을 생산할 때 또는 이전 사이클의 결과에 직접 부응하는 제품 개발 사이클에서 예상할 수 있는 바와 같이, 여러 작은 생산 캠페인 진행시 예측하기 어려운 요구에 대응할 때 이점이 된다.
또한 다른 효과는 본 발명의 공정 및 방법이 유지 단계를 필요로 하지 않고, 즉, 연속 발효 전략(화학조절배양장치)의 많은 이점을 제공하고 유지 단계 동안 세포 생육성, 생성물 안정성 및 품질에 관한 문제를 회피한다는 것이다. 이 특징은 유휴 시간을 줄임으로써 더 나은 장비 활용을 가능하게 하므로 다운스트림 처리에서 심각한 장애물을 제거한다.
본 발명의 유리한 구체예는 진핵생물 세포 및/또는 진핵생물 세포-유래된 생성물의 생산을 위한 세포-밀도 조절된 세포 배양 공정에 관한 것이고, 이 때 세포 배양 동안의 세포 밀도는 배양 용기에서 세포 및 영양소 배지를 포함하는 세포 배양액의 부피를 조정함에 의해 조절되며, 상기 공정은,
a) 세포를 규정된 부피의 세포 배양액에서 성장시키는 단계,
b) 밀도 센서에 의해 세포 배양액 중 세포 밀도를 측정하는 단계,
c) 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하여 세포를 성장기로 유지함에 의해 세포 배양액에서 세포 밀도를 조절하는 단계,
d) 요망되는 세포 밀도에서 세포 배양액의 분획을 회수하는 단계로서, 회수된 분획이 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 포함하는, 단계,
e) 세포 배양 분획의 반복된 회수가 가능하도록 개시된 순서로 상기 단계 중 하나 또는 전부를 반복하는 단계, 및
f) 임의로 회수된 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 처리하는 단계를 포함한다.
용어 "규정된 부피"는 세포가 성장하는 세포 배양액의 규정된 출발 부피를 나타낸다. 초기 성장기 후에, 세포는 발효 용기의 규정된 부피 범위 내에서 성장하며, 이 때 세포 배양액의 부피 조정은 세포 밀도를 조절한다. 출발 부피로서 규정된 부피는 또한 세포 배양액의 최소 부피로서 언급될 수 있었다.
추가로 본 발명의 유리한 구체예는 진핵생물 세포 및/또는 진핵생물 세포-유래된 생성물의 생산을 위한 세포-밀도 조절된 세포 배양 공정에 관한 것이고, 이 때 세포 배양 동안의 세포 밀도는 배양 용기에서 세포 및 영양소 배지를 포함하는 세포 배양액의 부피를 조정함에 의해 조절되며, 상기 공정은,
a) 세포를 가변적인 세포 배양 부피를 갖는 세포 배양액에서 성장시키는 단계로서, 배양 부피는 전체 세포 배양 공정 동안 일정하게 조절되지 않는, 단계,
b) 밀도 센서에 의해 세포 배양액 중 세포 밀도를 측정하는 단계,
c) 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하여 세포를 성장기로 유지함에 의해 세포 배양액에서 세포 밀도를 조절하는 단계,
d) 요망되는 세포 밀도에서 세포 배양액의 분획을 회수하는 단계로서, 회수된 분획이 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 포함하고, 용기의 세포 배양 부피가 상기 분획의 회수 후에 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 연속하여 일정하게 유지되지 않고/거나 회수된 분획의 부피가 즉시 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 보충되지 않는, 단계,
e) 세포 배양 분획의 반복된 회수가 가능하도록 개시된 순서로 상기 단계 중 하나 또는 전부를 반복하는 단계, 및
f) 임의로 회수된 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 처리하는 단계를 포함한다.
용어 "세포 밀도" 또는 "세포 질량 밀도"는 세포 배양액 중 단위 부피 당 세포의 수를 나타낸다 (배양 배지의 부피 당 세포의 수, 부피 당 세포의 질량 (g/L), 패킹된 세포 부피 (%), 부피 당 습윤 또는 건조 세포 중량 (g/L), 배양액 부피의 부피 당 세포 부피). 세포 밀도는 또한 세포 밀도, 바이오매스 밀도, 세포 부피 및 농도 또는 부피 당 세포 수와 관련된 임의의 다른 특성을 포함한다.
용어 "세포 배양"은 동물 또는 식물과 같은 다세포 유기체로부터의 세포의 배양을 나타낸다. 본 발명에 따르면 세포 배양액은 진핵생물 세포 및 액체 영양소 배지 (세포 성장 배지 또는 배양 배지)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포-유래된 생성물"은 세포에 의해 합성된 임의의 생성물 또는 세포에 의해 합성된 생성물을 이용하여 배양 용기에서 제조된 생성물을 나타낸다. 세포-유래된 생성물은 또한 세포 성분의 도음으로 배양 용기에서 생성된 생성물, 예컨대 세포로부터 생성된/유래된 효소에 의해 세포 배양액에 첨가된 기질로부터 전환된 생성물을 포함한다. 세포-유래된 생성물은 (비제한적으로) 재조합 단백질과 같은 단백질, 특히 세포 배양 배지로 분비된 단백질을 포함한다. 세포-유래된 생성물은 또한 바이러스를 포함한다. 세포-유래된 생성물은 또한 세포로부터 유래된 성분, 예컨대 막, 세포벽, 소기관, 단백질, 효소, 핵산, 리보솜, 색소, 일차 및 이차 대사산물을 포함한다. 더욱이, 세포-유래된 생성물은 또한 세포 추출물 또는 분획 (앞서 언급된 성분들의 임의의 조합물을 함유하는 혼합물)을 포함한다.
바람직한 구체예에 따르면, 세포 배양액에 포함된 진핵생물 세포는 두 번째 배양 단계를 수행하기 전에, 바람직하게는 기능성 프로모터에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 이종성 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터로 형질전환된 천연 (예컨대, 야생형) 또는 비-유전자이식 세포이고, 이 때 상기 적어도 하나의 이종성 핵산 서열은 누적되고 회수되는 요망되는 세포-유래된 생성물을 코딩한다.
배양되고 생산된 진핵생물 세포는 인간, 동물 및 식물 세포, 특히 식물 현탁액 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포를 포함한다. 식물 세포의 예는 니코티아나 타바쿰 (예컨대, BY-2, NT1 등), 다우투스 카로타(Dautus carota), 탁수스 종(Taxus sp.), 카타란투스 로세우스(Catharanthus roseus), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens), 제아 메이스(Zea mays), 글리신 맥스(Glycine max), 니코티아나 벤타미아나, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 피루스 코뮤니스, 소르부스 토르미날리스로부터의 세포이다. 곤충 세포의 예는 Sf9, Sf21 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(High Five)로부터의 세포이다. 포유동물 세포의 예는 HEK, CHO, BHK, EB66, MDCK(Madin Darby 개 신장) 세포, 또는 PER.C6, Hep G2 등과 같은 인간 세포이다.
일부 유리한 구체예에서, 사전에 배양/발효 용기 외부에서 제조된 세포 배양액이 스타터 배양액으로서 배양 용기에 첨가된다.
본원에서 사용되는 "스타터 배양액"은 실제로 발효를 수행하는 미생물학적 배양액이다. 이러한 스타터는 일반적으로 발효/배양에 이용되는 진핵생물 세포에 의해 잘 집락화된 배양 배지로 구성된다.
본 발명의 구체예에서, 반연속 배양 공정은 다음과 같이 동작한다:
· 7 L 생물반응기 내에 1.5 L 배지 (최소 부피)의 접종
· 0,1 bar의 과도-압력, 조절되지 않은 pH, 500 mL/분의 일정한 공기 공급, 26℃의 제어된 온도 및 30% 용존 산소 (교반기 속도 100-300 rpm를 조절함에 의해 제어됨) 하에 배양
· 배양된 세포 (BY-2 세포 4일)에 따라 초기 배치-단계
· 바이오매스 농도 (예컨대, 100 g/L BY-2 세포)를 조절하기 위한 제어 루프 개시
· 신선하고 멸균된 배지의 공급에 의해 (저장소를 멸균 배지로 다시 채움에 의해 배지 공급) 반응기 부피 증가와 커플링된 세포의 연속 성장
· 최대 충전 부피에 도달시 필수적인 회수, 자동화
· 최소 내지 최대 부피의 범위 내에서 다양한 가능한 현탁액 부피의 시간 독립적인 회수.
상기 언급된 대로, 본 발명의 공정은 발효/배양 공정 동안 세포 밀도를 제어하는 신규한 방법으로 구성된다. 이는 발효 브로쓰의 부피를 변화시킴에 의해 바이오매스를 조정함으로써 달성된다. 일부 유리한 구체예에서, 밀도 센서가 연속하여 바이오매스 (입력 신호)를 측정하고 컨트롤러가 예를 들어 펌프를 촉발시켜 적절한 부피를 배지 저장소로부터 발효 용기에 첨가시키는 출력 신호를 발생시키는 제어 루프가 이용된다. 적절한 부피를 첨가시킴에 의해, 세포 밀도는 시간 경과에 따라 일정하게 유지된다 (대안적으로, 세포 밀도에 대한 시간-의존적인 함수가 정의되고 그에 따라 제어될 수 있다). 이렇게 함으로써, 세포는 끊임없이 성장기로 유지된다. 발효기는 최소 및 최대 충전 수준 사이에서 동작한다. 회수된 부피는 특정 범위 내에서 가변적일 수 있다. 상기 범위는 발효기 내에 유지되어야 하는 최소 부피 및 용기의 최대 충전 부피에 의해 정의된다. 최대 충전 수준에 도달하면, 발효 브로쓰를 회수해야 한다. 대안적으로, 즉, 더 높은 세포 밀도를 얻기 위해, 제어 루프를 바꿀 수 있다. 상이한 시점에 회수될 수 있는 발효 브로쓰는 고도로 일관되고 재현가능하다.
유리한 구체예의 첫 번째 단계에서, 세포는 가변적인 세포 배양 부피를 갖는 세포 배양액에서 성장하였고, 이 때 배양 부피는 전체 세포 배양 공정 동안 일정하게 조절되지 않는다. 특히, 세포 배양액의 부피는 공정 시간 동안 현저하게 변한다. 이는 배양 배지의 첨가가 세포 밀도에 의해 조절되는 동안, 작업자에 의해 수행되는 임의적 회수 때문이다. 회수가 발생하지 않는 기간 동안, 세포 배양액의 부피는 증가한다. 회수시에, 세포 배양액의 부피는 임의로 감소하지만 (즉, 작업자에 의해 선택된 대로) 규정된 부피 범위 내에 있다. 부피 범위는 실제 배양 부피에서 최소 배양 부피를 뺀 부피와 같거나 그보다 낮게 정의된다.
이는 특히 세포 배양 부피가 화학조절배양장치 및 터비도스탯 공정에서 수행되는 바와 같이 "연속하여 일정하게" 또는 특히 "본질적으로 연속하여 일정하게" 유지되는 공정 또는 회수된 세포 배양액이 "즉시 보충되는" 공정과 대조적이다.
본 발명의 문맥 내에서 "일정한", 특히 "본질적으로 일정한"은 단기간 변동이 관찰되고 연장된 시간창에 걸친 평균 값은 실험적 한계 내에서 요망되는 값으로 유지됨을 의미한다. 더 정확하게 말하자면, 단기간은 10분 미만의 기간을 의미하고 연장된 시간창은 30분 초과의 기간을 나타낸다. 더욱이, "연속하여 일정하게", 특히 "본질적으로 연속하여 일정하게"라 함은 적어도 12 h, 바람직하게는 24 h, 더욱 바람직하게는 48 h 및 가장 바람직하게는 적어도 72 h의 기간을 나타낸다.
두 번째 단계에서, 세포 배양액 중 세포 밀도는 밀도 센서에 의해 측정된다. 유리한 구체예에서, 세포 밀도는 밀도 센서에 의해 측정되며, 여기서 밀도 센서는 탁도 측정에 기반한 센서, 레이저 산란 측정, NIR 측정 또는 다른 분광 측정, 또는 용량성 측정 또는 세포 계수기와 같은 앳 라인(at line) 시스템 또는 세포 밀도를 측정하고 피드백-제어를 가능하게 하는 임의의 다른 방법으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 밀도 센서는 세포 배양액에서 지속적으로 세포 밀도를 측정한다.
세 번째 단계에서, 세포 배양액 I 중 세포 밀도는 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하여 세포를 성장기로 유지함에 의해 조절되었다. 종래 M 기의 끝으로부터 DNA 합성의 시작까지, 간기 내 첫 번째 단계로서 정의되는 "성장기"를 G1이라고 부른다 (G는 갭을 나타냄). 이 단계 동안 M 기 동안 상당히 느려진 세포의 생합성 활성은 높은 속도로 재개된다. G1의 지속기간은 심지어 동일한 종의 다른 세포 간에도 매우 가변적이다. 이 단계에서, 세포는 이의 단백질 공급을 증가시키고, 소기관 (예컨대 미토콘드리아, 리보솜)의 수를 증가시키고, 크기가 커진다.
추가 구체예에서, 적절한 부피의 영양소 배지가 적어도 하나의 영양소 배지 저장소로부터 배양 용기 중 세포 배양액에 전달된다.
일부 유리한 구체예에서, 세포 밀도는 세포 밀도 (입력 신호)를 연속하여 측정하는 밀도 센서 및 펌프 또는 밸브를 촉발시켜 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하는 출력 신호를 생성하는 컨트롤러를 포함하는 제어 루프를 이용하여 조절된다.
일부 구체예에서, 적절한 부피는 펌프를 이용하여 배지 저장소로부터 발효 용기에 첨가되거나, 중력 또는 압력에 의해 구동되고 밸브를 통해 제어된다.
추가 구체예에서, 세포 배양액 중 세포 밀도는 시간 경과에 따라 일정하게 조절되거나 세포 밀도에 대한 특수한 시간-의존적 함수로 조절된다. 더욱이, 배양 용기는 최소 및 최대 세포 배양 충전 수준 사이에서 작동될 수 있다.
네 번째 단계에서, 세포 배양액의 분획은 요망되는 세포 밀도로 회수될 수 있고, 이 때 회수된 분획은 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 포함하며, 용기의 세포 배양 부피는 상기 분획의 회수 후에 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 연속하여 일정하게 유지되지 않고, 특히 본질적으로 일정하게 유지되지 않는다.
상기 언급된 대로, 세포 배양액의 부피는 공정 시간 동안 현저하게 변한다. 이는 배양 배지의 첨가가 세포 밀도에 의해 조절되는 동안, 작업자에 의해 수행되는 임의적 회수 때문이다. 회수가 발생하지 않는 기간 동안, 세포 배양액의 부피는 증가한다. 회수시에, 세포 배양액의 부피는 임의로 감소하지만 (즉, 작업자에 의해 선택된 대로) 규정된 부피 범위 내에 있다. 부피 범위는 실제 배양 부피에서 최소 배양 부피를 뺀 부피와 같거나 그보다 낮게 정의된다. 이는 특히 세포 배양 부피가 화학조절배양장치 및 터비도스탯 공정에서 수행되는 바와 같이 "본질적으로 연속하여 일정하게" 유지되는 공정 또는 회수된 세포 배양액이 "즉시 보충되는" 공정과 대조적이다. 본 발명의 문맥 내에서 "본질적으로 일정한"은 단기간 변동이 관찰되고 연장된 시간창에 걸친 평균 값은 실험적 한계 내에서 요망되는 값으로 유지됨을 의미한다. 더 정확하게 말하자면, 단기간은 10분 미만의 기간을 의미하고 연장된 시간창은 30분 초과의 기간을 나타낸다. 더욱이, "본질적으로 연속하여 일정하게"라 함은 적어도 12 h, 바람직하게는 24 h, 더욱 바람직하게는 48 h 및 가장 바람직하게는 적어도 72 h의 기간을 나타낸다.
네 번째 단계에서, 세포 배양액의 분획은 요망되는 세포 밀도로 회수될 수 있고, 이 때 회수된 분획은 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 포함하며, 용기의 세포 배양 부피는 상기 분획의 회수 후에 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 연속하여 일정하게 유지되지 않고, 특히 본질적으로 일정하게 유지되지 않고 및/또는 회수된 분획의 부피는 즉시 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 보충되지 않는다.
용어 "즉시 보충되는"이란 유사한 양의 신선 배지를 용기에 첨가함에 의한 회수된 세포 배양액의 교체를 나타낸다. 본 발명의 문맥 내에서, 유사한 양의 신선 배지는 회수된 세포 배양액 플러스 또는 마이너스 25%와 동일한 부피로 정의된다. 또한, "즉시"는 12 h 미만, 바람직하게는 6 h 미만, 및 더욱 바람직하게는 3 h 미만의 기간을 나타낸다. "즉시"는 또한 "바로" 또는 "연속하여"로 대체될 수 있었다.
회수될 수 있는 세포 배양액의 분획은 특정 한도 내에 있다. 회수 후에, 남아 있는 부피는 공정을 지지하기에 충분해야 하고, 즉, 특정 최소 부피의 세포 배양액은 항상 배양 용기에 남아 있어야 한다. 이 최소 부피는 용기, 바이오매스 센서, 교반기 등을 포함하는 여러 가지에 의존적이다. 그러나, 임의의 주어진 시점에 발효 배양액의 현재 부피에서 배양 용기에 유지되어야 하는 최소 부피를 뺀 임의의 부피 분획이 회수될 수 있다.
상기 언급된 대로, 본 발명에 따른 공정 및 방법은 후속 다운스트림 처리를 위한 유지 단계를 요구하지 않고 고도로 재현가능한 발효 브로쓰를 유연하게 제공하는데 이용될 수 있다. 회수 시점에 관한 유연성은 다운스트림 인프라 (단위 조작) 및 스태프의 높은 활용을 가능하게 한다. 이러한 특정 기능은 다운스트림 처리에서 발생하는 지연을 보상하는데 이용될 수 있다. 생물약제의 생산을 위한 배치 및 유가 공정의 경우, 다운스트림 처리의 유휴 시간이 회수 시간의 준비를 보장하기 위해 허용되어야 하는데, 그 이유는 준비되지 되지 않은 상태가 사양으로부터의 편차를 초래하여 엄청난 경제적 손실을 동반한 배치 거부를 발생시키기 때문이다. 반대로, 본 발명에 따른 공정 및 방법은 배양 용기로부터 적절한 부피 분획의 제거에 의해 회수 시점을 연기하는 것이 가능하다. 결과적인 경제적 손실은 전반적인 생산 공정의 일부만이 폐기되므로 훨씬 적다.
일부 구체예에서, 복수의 배양 용기가 연결되어 배양 부피를 증가시킨다. 이는 또한 배양의 중단 없이 용기를 세정하고(벽 성장, 필터 등) 재구성하기 위해(고장난 부품교체, 센서 재보정) 용기를 세트에서 빼낼 수 있으므로 공정이 더 오래 실행될 수 있게 할 것이다. 배양액은 모든 용기가 동일한 배양액을 함유하도록 보장하기 위해 연결된 용기 간에 교환되고 (예컨대, "펌핑됨") 혼합될 필요가 있다. 유리한 구체예에서, (i) 적어도 하나의 추가 배양 용기가 첫 번째 배양 용기에 연결되어 배양 부피를 증가시키고, (ii) 각 연결된 배양 용기에서의 세포 밀도는 동일하며, (iii) 세포 배양액은 배양 용기 간에 교환된다. 또 다른 구체예에서, 배양 용기는 배양 부피를 감소시키기 위해 2개 이상의 연결된 배양 용기 세트로부터 제거될 수 있었다.
추가 구체예에서, 진핵생물 세포는 미세담체의 존재 하에 배양된다. 미세담체는 배양 용기와 같은 생물반응기에서 부착 세포의 성장을 허용하는 지지 매트릭스이다. 덱스트란-기반 (Cytodex, GE Healthcare), 콜라겐-기반 (Cultispher, Percell), 미세다공성 젤라틴-코팅된 미세담체 비드 (Cytodex®, Percell Biolytica AB), 및 폴리스티렌-기반 (SoloHill Engineering) 미세담체를 포함하는 여러 유형의 미세담체가 시판된다. 이들은 그 다공성, 비중, 광학 특성, 동물 성분의 존재, 및 표면 화학에 있어서 상이하다. 그 후 "빈" (즉, 세포 비함유) 미세담체가 새로운 배지와 유사한 방식으로 제공되고, 즉 세포 배양액에 이들의 첨가는 세포 밀도를 통해 조절된다. 미세담체는 신선한 영양소 배지 저장소에 의해 또는 분리된 저장소로부터 현탁액으로서 함께 공급될 수 있다.
추가 구체예에서, 임의로 회수된 세포 및/또는 세포-유래된 생성물은 추가로 처리된다. 첫 번째 단계에서, 세포를 원심분리, 여과/진공-여과 또는 침강에 의해 회수된 세포 배양 분획으로부터 분리할 수 있다. 그 후 분리된 세포를 일시적인 발현 시스템에 추가로 이용할 수 있다. 식물 세포 배양액의 경우 세포는 WO2013/113504 A1에 기재된 일시적인 생산 공정에 이용될 수 있다. 포유동물 세포 배양액의 경우 세포는 일시적인 발현에 이용될 수 있다. 포유동물 세포에 대한 유전자 전달은 바이러스에 의해 (Douglas 2008 Biotechnol Prog) 또는 무기 화합물 (예컨대, 칼슘 포스페이트 CaPi, (Jordan and Wurm 2004 Methods)) 또는 양이온성 폴리머 (예컨대, 폴리에틸렌이민 PEI (Baldi, Hacker et al. 2012 Protein Expression in Mammalian 세포) 또는 양이온성 지질 (예컨대, LipofectAMINE, FuGENE, 293fectin)과 같은 화학적 작용제에 의해 또는 미세주입 또는 전기천공과 같은 기계적 방법 (Pham, Kamen et al. 2006 Mol Biotechnol)에 의해 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 회수된 세포 배양 분획 중 세포-유래된 생성물 및 세포는 원심분리 및/또는 여과 및/또는 침강에 의해 분리될 수 있다. 세포 배양 상청액이 세포로부터 분리되면 상청액 생성물은 생성물의 로컬리제이션(localization)에 따라 추가로 처리될 것이다. 세포-유래된 생성물이 분비되면 생성물은, 예컨대 크로마토그래피 또는 침전 방법을 이용하여 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다. 세포-유래된 생성물이 세포내 생성물인 경우 생성물은, 세포를 예컨대 초음파 또는 블렌더 또는 볼 밀의 도움으로 균질화시킴에 의해 세포로부터 추출되어야 한다. 그 후 세포 단편은 여과 또는 원심분리에 의해 세포 추출물로부터 제거될 수 있고 세포 추출물은 추가로 처리될 수 있다. 세포 추출물은 그 자체로 생성물로서 이용될 수 있다. 또는 생성물은, 예컨대 크로마토그래피 또는 침전 방법을 이용하여 세포 추출물로부터 정제될 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명에 따른 공정은 배지가 첨가되지 않고 세포 배양의 분획이 회수되지 않은, 요망되는 세포 밀도에 도달한 적어도 하나의 성장기에 이어 세포 밀도가 본질적으로 일정하게 유지되는 적어도 하나의 연속기를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 공정은 배지가 첨가되지 않고 세포 배양의 분획이 회수되지 않은, 요망되는 세포 밀도에 도달한 초기 성장기에 이어, 세포 밀도가 본질적으로 일정하게 유지되는, 여러, 즉 2개 이상의 연속기를 포함하고, 여기서 연속기는 더 높은 세포 밀도에 도달한 또 다른 성장기 또는 보다 낮은 세포 밀도에 도달한 희석기에 의해 분리된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 공정은 세포 밀도가 일정하게 유지되고, 48 h 초과, 바람직하게는 96 h 초과, 보다 바람직하게는 144 h 초과 및 가장 바람직하게는 168 h 초과의 지속기간을 지니며, 2회 이상의 회수 단계가 수행되는 연속기를 포함한다.
상기 언급된 대로, 본 발명에 따른 공정은 여러 용도에 양호한 세포를 제공한다. 예를 들어, 생산된 세포는 분석적 검정 (예컨대, 약물 또는 다른 화학적 화합물의 대사), 유전자 발현의 유도 (예컨대, 간 세포의 P450, 리포터 유전자, 또는 이의 세포 조합물의 어떤 종류의 추가 배양)에 이용될 수 있다.
유리한 구체예에서, 본 발명에 따른 공정 및 방법은 후속하여 일시적인 생산을 위한 숙주 세포로서 이용되는 세포를 제공한다. 이는 이러한 세포가 관심 분자(생성물)를 제공하기 위해 후속하여 적절한 수단에 의해 트랜스펙션/형질전환되고 인큐베이션될 것을 의미한다. 이는 세포 현탁액을 이용한 일시적인 생산 플랫폼에 매우 중요하다 (동물 및 식물 세포 둘 모두).
유리한 구체예에서, 본 발명은,
i) 세포를 본 발명의 공정에 따라 배양하고 회수하는 단계,
ii) 회수된 세포를 핵산으로 형질전환시켜 안정한 세포주를 수득하는 단계를 포함하는, 안정한 세포주를 생성하는 방법에 관한 것이다.
유리한 구체예에서, 본 발명은,
i) 트랜스펙션된 세포를 본 발명의 공정에 의해 배양하는 단계,
ii) 유전자 증폭을 증가시키기 위해, 예컨대 MTX 농도를 단계적 증가시키는 단계를 포함하는, CHO 세포에서, 예컨대 MTX에 의해 유전자 증폭을 수행하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환", "형질전환된" 및 "트랜스펙션된"은 임의의 핵산 또는 핵산 유사체의 생산된 진핵생물 세포 (숙주 세포)로의 전달에 관한 것이다. 형질전환 후에 핵산은 숙주 세포의 유전체로 안정하게 통합될 수 있다. 대안적으로, 전달된 핵산은 유전체로 통합되지 않을 수 있고 세포질 또는 핵 또는 임의의 세포 소기관에서 그 효과를 발휘할 수 있다. 핵산은 바이로이드, 바이러스 또는 해체된 바이러스와 같은 자율 복제 엘리먼트, 또는 하나를 초과하는 바이러스로부터의 필수 엘리먼트의 조합물일 수 있다. 대안적으로, 전달된 핵산은 단지 바이로이드, 바이러스 또는 해체된 바이러스와 같은 자율 복제 엘리먼트의 성분일 수 있다. 다른 성분이 숙주 세포 또는 유전자이식 숙주 세포에 의해 제공/보완될 수 있다.
일부 구체예에서, 핵산은 벡터, 특히 발현 벡터에 포함된다. "벡터"는 그 중에서도 자체적으로 전파 또는 동원될 수 있거나 없고, 원핵생물 또는 진핵생물 숙주를 변형시킬 수 있으며, 염색체외에 존재하는 이중 또는 단일 가닥 선형 또는 원형 형태의 임의의 플라스미드, 코스미드, 파지, 또는 바이러스 벡터를 포함하는 것으로 정의된다 (예컨대, 복제 기점을 지닌 자율 복제 플라스미드).
"발현 벡터"는 핵산이 미생물 또는 식물 세포와 같은 숙주 세포에서의 전사를 위해 적절한 프로모터 또는 다른 조절 엘리먼트의 조절 하에 있고 이에 작동적으로 연결된 벡터를 나타낸다. 벡터는 다수의 숙주에서 기능하는 이중-기능성 발현 벡터일 수 있다. 유전체 또는 서브유전체 DNA의 경우, 이는 그 고유의 프로모터 또는 다른 조절 엘리먼트를 함유할 수 있고, cDNA의 경우, 이는 숙주 세포에서의 발현을 위해 적절한 프로모터 또는 다른 조절 엘리먼트의 조절 하에 있을 수 있다. "작동적으로 연결된"은 프로모터로부터 전사가 개시되도록 적합하게 정위되고 배향된 동일한 핵산 분자의 일부로 합쳐진 것을 의미한다.
유리한 구체예에서, 본 발명의 공정에 의해 생산된 세포는 식물 세포이고 식물 세포 물질을 배지-박탈된 다공성 구조의 비-조직 다층 세포 팩의 형태로 생성하고 후속하여 상기 세포 팩을 유지하기 위해 이용될 수 있다 (WO 2013/113504 A1에 기재된 바와 같음).
따라서, 본 발명은 또한
(i) 세포를 식물 세포 현탁 배양액으로부터 분리함에 의해 다공성 구조를 갖는 세포 팩을 제공하는 단계로서, 이 때 세포는 본 발명에 따른 배양 방법에 의해 배양되고, 세포 팩에 포함된 액체의 함량은 cm3 당 0.1 내지 0.9 g의 습윤 세포 중량의 세포 팩 밀도에 상응하도록 감소되고 조정되어, 상기 세포 팩의 배지-박탈된 다공성 구조 특성을 확립하는 단계, 및
(ii) 상기 배지-박탈된 다공성 구조의 세포 팩을 비-액체 환경에서 50 내지 100%의 상대 습도 하에 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 배지-박탈된 다공성 구조의 비-조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 물질의 생성 및 상기 세포 팩의 후속 유지를 위한 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 방법의 유리한 구체예는 (i) 균질한 식물 바이오매스의 제공을 위해, 식물 세포 현탁액을 본 발명의 배양 공정에 따라 배양하는 첫 번째 배양 단계, (ii) cm3 당 0.1 내지 0.9 g, 바람직하게는 0.2 내지 0.85 g, 가장 바람직하게는 0.4 내지 0.8 g의 습윤 세포 중량의 밀도를 지닌 다공성 세포 팩이 생성되는 방식으로 액체 배지가 식물 세포로부터 분리되는 분리 단계, 및 (iii) 세포 팩이 제어된 조건 하에 (상기 참조) 적어도 다른 날 동안 비-액체 환경에서 추가로 인큐베이션되는 두 번째 배양 단계를 포함한다. 실제 상황 및 의사의 판단에 따라서, 상기 두 번째 배양 단계는 수 일 동안 수행될 수 있다. 전형적으로 두 번째 배양 단계는 2 내지 7일, 바람직하게는 3 내지 5일 동안 수행된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 공정 및 방법은 재조합 단백질과 같은 관심 분자 (세포 또는 세포 바이오매스에 반해)를 제공하기 위해 이용된다. 이러한 구체예에서, 본 발명은 잠재적으로 더욱 균질한 고 품질의 생성물을 제공하고 또한 현재 확립된 발효 전략에 비해 더 높은 수율을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는,
i) 유전자이식 세포를 본 발명의 공정에 따라 배양하고 회수하는 단계,
ii) 세포를 배양 상청액으로부터 분리하는 단계,
iii) 배양 상청액 (분비된 단백질)의 처리 단계 또는
iv) 세포로부터 관심 분자의 추출 단계를 포함하는, 유전자이식 세포에 의해 재조합 단백질 또는 세포 유래 생성물을 제공하기 위한 신규한 공정의 용도이다.
세포-유래된 생성물이 분비되면, 생성물은 예컨대 크로마토그래피 또는 침전 방법을 이용하여 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다. 세포-유래된 생성물이 세포내 생성물인 경우 생성물은, 세포를 예컨대 초음파 또는 블렌더 또는 볼 밀의 도움으로 균질화시킴에 의해 세포로부터 추출되어야 한다. 그 후 세포 단편은 여과 또는 원심분리에 의해 세포 추출물로부터 제거될 수 있고 세포 추출물은 추가로 처리될 수 있다. 세포 추출물은 그 자체로 생성물로서 이용될 수 있다. 또는 생성물은, 예컨대 크로마토그래피 또는 침전 방법을 이용하여 세포 추출물로부터 정제될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 세포 비함유 시스템을 위한 성분의 생산을 위해 고도로 유사하고 재현가능한 세포를 제공하는 것이다. 시험관내 번역을 위한 세포 비함유 추출물 (용해물)의 생산을 위해 다량의 균질한 출발 물질/세포가 요구된다. 생성된 용해물의 최적 생산성을 확보하기 위해 세포는 지수적 성장기에 있어야 한다. 또한 회수 시점에 세포 밀도가 중요한 역할을 한다. 통상적으로 세포 배양액은 배치 모드로 요망되는 세포 밀도까지 성장하고, 회수되고, 즉시 처리된다. 이는, 큰 발효 공정에서 성장 속도가 변화하여 특정 회수 시점을 정확하게 예측할 수 없게 만드므로, 시간의 관점에서 높은 유연성을 필요로 한다. 게다가 배양 공정에 대한 세포의 최적 순응이 배치 모드에서는 보장될 수 없다. 세포 물질을 고도로 활성인 용해물로 처리하는 것은 또 다른 중요한 요인이다. 식물 기반 세포 비함유 용해물의 생산을 위해 확립된 프로토콜은 종종 시간-소모적이고 비용-집약적이다.
따라서, 본 발명은,
i) 본 발명의 공정에 따라 세포를 배양하고 회수하는 단계,
ii) 회수된 세포에 추출 처리를 사용하여 배양된 세포의 세포 비함유 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 시험관내 번역을 위해 세포 비함유 추출물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
상기 언급된 대로, 유리한 구체예에서 회수된 세포는 지수적 성장기에 있다.
추가 구체예에서, 추출 처리는 효소적 처리이거나 효소적 처리를 포함한다. 본 발명자들은 세포 물질을 용해물로 처리하는 동안 프로토플라스테이션에 대한 비용이 통상적인 효소를 식품 산업을 위해 원래 설계된 액체 셀룰라제 및 펙티나제에 의해 대체함에 의해 백배 넘게 감소될 수 있었음을 발견하였다. 동시에 시간 단위 당 개선된 프로토플라스테이션이 관찰되었다. 이러한 효소 제조물의 사용은 보통의 시장 가격으로 식물-기반 용해물의 상업적 생산을 허용한다.
변경된 완충제, 세척 및 원심분리 단계, 및 연속 대신 불연속 퍼콜 구배의 사용과 같은 문헌[Komoda et al. (Komoda, Naito et al. 2004 Proc Natl Acad Sci U S A)]에 기재된 프로토콜의 추가 변형은 더 빠른 생산 뿐만 아니라 용이한 확장성을 이끌어 내었다. 프로토플라스트 배출(evacuolation)에 대해 기재된 대안적인 방법은 문헌[Sonobe et al. (Sonobe 1996 J. Plant Res.)]에 개시되었다. 문헌[Gursinsky et al. (Gursinsky, Schulz et al. 2009 Virology)]은 최종 용해물의 S7-누클레아제에 의한 엔도겐 mRNA의 추가적 분해에 의해 매우 개선된 번역 활성을 나타낸다.
더욱이, 회수된 세포 배양 분획 내에 포함된 세포는 또한 후속 발효 공정을 접종하는데 이용될 수 있다.
요약해 보면, 본 발명의 공정에 따라 배양되고 회수된 세포는 후속 배양 단계를 수행하는데 이용될 수 있고, 여기서 (i) 세포는 트랜스펙션/형질전환되고, (ii) 유전자 발현은 유도인자의 첨가에 의해 유도되며, (iii) 세포는 감염되고, (IV) 세포는 세포-유래된 생성물 누적을 장려하는 조건 하에 배양되고, (iv) 핵산은 세포로 트랜스펙션되고, 및/또는 (v) 세포는 분석적 검정에 이용된다.
상기 언급된 대로, 본 발명은 진핵생물 세포 및/또는 진핵생물 세포-유래된 생성물의 생산을 위한 세포-밀도 조절된 세포 배양 공정에 관한 것이고, 이 때 세포 배양 동안의 세포 밀도는 배양 용기에서 세포 및 영양소 배지를 포함하는 세포 배양액의 부피를 조정함에 의해 조절되며, 상기 공정은,
a) 세포를 규정된 부피의 세포 배양액에서 성장시키는 단계,
b) 밀도 센서에 의해 세포 배양액 중 세포 밀도를 측정하는 단계,
c) 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하여 세포를 성장기로 유지함에 의해 세포 배양액에서 세포 밀도를 조절하는 단계,
d) 요망되는 세포 밀도에서 세포 배양액의 분획을 회수하는 단계로서, 회수된 분획이 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 포함하는, 단계,
e) 세포 배양 분획의 반복된 회수가 가능하도록 개시된 순서로 상기 단계 중 하나 또는 전부를 반복하는 단계, 및
f) 임의로 회수된 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 처리하는 단계를 포함하고, 여기서
- 진핵생물 세포는 식물 현탁액 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고/거나,
- 세포-유래된 생성물은 효소, 항체, 항체 단편, 백신, 사이토카인, 호르몬, 펩티드 또는 바이러스 또는 바이러스 유사 입자 또는 핵산과 같은 일차 또는 이차 대사산물 또는 재조합 단백질일 수 있고/거나,
- 세포 배양액은 스타터 배양액으로서 배양 용기에 첨가될 수 있고/거나,
- 밀도 센서는 탁도 측정에 기반한 센서, 레이저 산란 측정, NIR 측정 또는 또는 용량성 측정 또는 세포 계수기와 같은 앳 라인 시스템 또는 세포 밀도를 측정하고 피드백-제어를 가능하게 하는 임의의 다른 방법으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고/거나,
- 세포 배양액 중 세포 밀도는 지속적으로 측정될 수 있고/거나,
- 적절한 부피의 영양소 배지는 적어도 하나의 영양소 배지 저장소로부터 배양 용기의 세포 배양액에 전달될 수 있고/거나,
- 세포 밀도는 연속하여 세포 밀도 (입력 신호)를 측정하는 센서 및 펌프/또는 밸브를 촉발시키는 출력 신호를 생성하거나 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하는 컨트롤러를 포함하는 제어 루프를 이용함에 의해 조절될 수 있고/거나,
- 세포 밀도는 세포 배양액에서 시간 경과에 따라 일정하게 또는 세포 밀도에 대한 특정 시간-의존적인 함수로 조절될 수 있고/거나,
- 배양 용기는 최소 및 최대 세포 배양액 충전 수준 사이에서 동작할 수 있고/거나,
- 발효 배양의 최소/최대 범위 내의 임의의 부피 분획은 배양 용기로부터 회수될 수 있고/거나,
- 세포 배양액의 분획은 세포가 지수적 성장기에 있을 때 회수될 수 있고/거나,
- (i) 적어도 하나의 추가 배양 용기는 첫 번째 배양 용기에 연결되어 배양 부피를 증가시킬 수 있고, (ii) 각 연결된 배양 용기에서의 세포 밀도는 동일할 수 있으며, (iii) 세포 배양액은 배양 용기 간에 교환될 수 있고/거나,
- 세포는 미세담체의 존재 하에 배양될 수 있고/거나,
- 세포는 회수된 세포 배양 분획으로부터 분리될 수 있고/거나,
- 회수된 세포 배양 분획의 세포-유래된 생성물 및 세포는 원심분리 및/또는 여과 및/또는 침강에 의해 분리될 수 있고/거나,
- 회수된 세포 배양 분획에 포함된 세포를 이용하여 후속 발효 공정을 접종할 수 있고/거나,
- 회수된 세포는 후속 배양 단계를 수행하는데 이용될 수 있고/거나 (여기서 (i) 세포는 트랜스펙션/형질전환되고, (ii) 유전자 발현은 유도인자의 첨가에 의해 유도되며, (iii) 세포는 감염되고, (IV) 세포는 세포-유래된 생성물 누적을 장려하는 조건 하에 배양되고, (iv) 핵산은 세포로 트랜스펙션되고, 및/또는 (v) 세포는 분석적 검정에 사용된다),
- 세포는 세포 비함유 추출물을 제조하는데 이용될 수 있고/거나
더욱이, 본 발명은,
i) 상기 언급된 공정에 따라 세포를 배양하고 회수하는 단계,
ii) 회수된 세포에 추출 처리를 사용하여 배양된 세포의 세포 비함유 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 시험관내 번역을 위해 세포 비함유 추출물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이고, 여기서
- 회수된 세포는 지수적 성장기에 있을 수 있고/거나,
- 추출 처리는 효소적 처리를 포함할 수 있고/거나,
- 효소적 처리는 셀룰로스 및 펙티나제 처리를 포함할 수 있고/거나,
- 세포 용해물은 세포 비함유 추출물을 제조하기 위한 이의 상청액을 수득하기 위해 원심분리될 수 있다.
더욱이, 본 발명은,
i) 상기 언급된 공정에 따라 세포를 배양하고 회수하는 단계,
ii) 회수된 세포를 핵산으로 형질전환시켜 안정한 세포주를 수득하는 단계를 포함하는, 안정한 세포주를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은,
(i) 세포를 식물 세포 현탁 배양액으로부터 분리함에 의해 다공성 구조를 갖는 세포 팩을 제공하는 단계로서, 이 때 세포는 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 배양되고, 세포 팩에 포함된 액체의 함량은 cm3 당 0.1 내지 0.9 g의 습윤 세포 중량의 세포 팩 밀도에 상응하도록 감소되고 조정되어, 상기 세포 팩의 배지-박탈된 다공성 구조 특성을 확립하는 단계, 및
(ii) 상기 배지-박탈된 다공성 구조의 세포 팩을 비-액체 환경에서 50 내지 100%의 상대 습도 하에 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 배지-박탈된 다공성 구조의 비-조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 물질의 생성 및 상기 세포 팩의 후속 유지를 위한 방법에 관한 것이다.
도 9, 10 및 11은 상이한 발효 공정을 나타내고, 여기서 공정들은 배양 부피, 세포 밀도, 공급 속도 및 회수 속도를 비교함에 의해 구별될 수 있다. 언급된 도면에서, 세포 밀도는 배양액에서 mL 당 세포의 수 또는 해당 숫자로 변형되거나 관련될 수 있는 파라미터로서 정의되고, 배양 부피는 생물반응기에서 발효 브로쓰의 부피로서 정의되고, 공급 부피는 공정 동안 생물반응기에 첨가되는 배지의 누적 부피로서 정의되고, 회수 부피는 공정 동안 생물반응기로부터 제거되는 발효 브로쓰의 누적 부피로서 정의되고, 공급 속도는 시간 단위 당 생물반응기에 첨가되는 배지의 부피로서 정의되고 (예컨대, mL/min), 회수 속도는 시간 단위 당 생물반응기로부터 제거되는 발효 브로쓰의 부피로서 정의되고 (예컨대, mL/min), 희석 속도는 화학조절배양장치/터비도스탯에 대한 공급 속도 및 회수 속도와 동일하다.
유리한 구체예에서, 본 발명에 따른 공정은 7 L 용기에서 수행되고, 센서 및 임펠러의 구성은, 예컨대 제조업체에서 언급한 대로, 최소 부피가 1 L이고, 최대 부피가 6 L이며, 배양된 세포가 24 h의 배가 시간을 지닐 것을 요구한다.
첫 번째 예에서, 실제 부피 ("충전 수준")는 4 L이다. 작업자는, 예컨대 화학조절배양장치/터비도스탯 공정에서 필수적인 바와 같이, 연장된 기간 동안 이를 수집할 필요 없이 (이는 또한 수집 또는 유지 단계로 불린다) 예컨대 한 번에 3 L를 회수하여 전체 회수물을 처리할 수 있다. 대안적으로, 작업자는 또한 예컨대 세포 생육성 또는 세포 배양액의 다른 파라미터를 측정하기 위해 100 mL를 회수하기로 결정할 수 있거나, 소규모 실험을 수행한 다음, 후속하여 추가 처리를 위해 2.9 L를 회수할 수 있다.
두 번째 예에서, 충전 수준은 6 L이다. 작업자는 3 L를 회수하고, 예컨대 후속하는 일시적인 유전자 발현 실험에 세포를 이용한다. 다음 날 아침에, 실제 부피는 배양 성장 및 신선한 배지의 비례적 첨가로 인해 예컨대 5 L에 도달하였다. 이제 작업자는 다시 3 L를 회수하여 동일한 실험을 수행할 수 있고, 배양액으로부터 회수된 세포가 동일한 특성 (예컨대, 세포 밀도, 생육성 및 트랜스펙션 효율과 같은 다른 성능 특성)을 지님을 확인할 수 있다. 이는 배치 또는 유가 공정으로부터 회수된 세포와 대조적이다. 저녁에, 실제 부피는 예컨대 2.6 L이고, 작업자는 1 L를 회수하여 배양액으로부터 회수된 세포가 동일한 특성을 지님을 재확인할 수 있다.
세 번째 예에서, 실제 부피는 4 L이고 세포는 시험관내 번역을 위해 이용되는 세포 비함유 추출물의 생성에 이용된다. 오늘, 여러 연구자들은 어떤 것도 미리 계획되지 않은 그러한 실험을 수행하기로 결정하고 세포 배양 유닛으로부터 세포를 주문하였다. 9:30에 첫 번째 연구자가 1 L의 발효 브로쓰를 회수하고, 두 번째 연구자가 정확히 10분 후에 또 다른 2 L를 회수한다. 동시에 세 번째 연구자는 단지 또 다른 250 mL를 요구하지만 실제 배양 부피가 1.25 L에 도달할 때까지 조금 기다릴 필요가 있다.
배양 부피가 최대 부피에 도달하면, 발효 브로쓰를 자동 또는 수동으로 제거해야 한다. 역시 제거되는 부피는 최대 부피에서 최소 부피를 뺀 범위 내에서 자유롭게 선택될 수 있다. 공정이 미래에, 예컨대 오후, 다음 날 또는 다음 주에 요망되는 부피의 배양 브로쓰를 생산하도록 회수 부피가 선택될 수 있다는 것이 본 발명의 특별한 특징이다. 그리고 역시, 회수된 발효 브로쓰는 고도로 재현가능하다.
이러한 예는 유연한 회수를 허용하고 사전 회수 (이는 이용되거나 폐기된다)의 고의적 배치를 통해 회수 시점의 타이밍을 조정할 가능성을 작업자에 제공함에 의해 작업 흐름이 최적화될 수 있음을 명백하게 보여준다. 이에 의해, 본 발명에 따른 공정은 후속 단계로 용이하게 조절될 수 있어서, 전반적인 높은 유연성 및 강력함을 초래한다. 이를 통해 생산 설비를 더 잘 사용할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되며 이를 제한하는 것으로 간주되지 않는다.
방법 및 실시예
하기 실시예에서, 본 발명의 물질 및 방법이 제공된다. 이러한 실시예는 단지 예시를 목적으로 하며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 됨이 이해되어야 한다. 본원에 개시된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로서 본원에 포함된다.
1.) 7-L 교반된 탱크 생물반응기에서 BY-2 식물 현탁액 세포의 배양
배양은 26℃에서 오토클레이브가능한 7-L 교반된 탱크 생물반응기 (Applikon, Schiedam, the Netherlands)에서 수행되었다. 생물반응기에 최소 부피의 1.5 L의 변형된 MS-배지 (Murashige and Skoog, 1962; MS-염 4.3 g/L, 마이오이노시톨 100 mg/L, KH2PO4 200 mg/L, HCl-티아민 1 mg/L, 2,4-디클로로페녹시아세트산 0.2 mg/L, 수크로스 30 g/L)가 충전되었고 BY-2 세포의 6일된 전배양액으로 접종되었다. Pluronic L-61 (BASF, Mount Olive, NJ)을 0.01% (v/v)의 농도로 첨가하여 발포 및 벽 성장을 조절하였다. ez-컨트롤 (Applikon)을 이용하여 발효를 제어하였고 온라인 데이터를 수집하는데 BioXpert XP를 이용하였다. 반응기를 0.5 L/min의 일정한 흐름 속도로 통기시켰다. 용존 산소 농도 (dO2)는 교반기 속도를 조절함에 의해 30%의 포화도로 조절되었다. pH를 모니터하였으나 조절하지 않았다. Futura RFIS 시스템 (Aber Instruments, Aberystwyth, UK)을 이용하여 생육가능한 온라인 바이오매스를 측정하였다. 세포의 유전율 및 배지의 전도도를 환형 전극 (12 x 120 cm) 및 편광 보정되는 0.6 MHz의 세포 배양 모드로 작동하는 표준 원격 Futura 기기를 이용하여 동시에 측정하였다. 바이오매스 센서는 Futura 소프트웨어에 의해 제어되었다. 이 생물반응기의 최소 작업 부피는 적당한 측정을 보장하고 적절한 혼합믈 하기 위해 모든 센서가 세포 배양액과 적절하게 접촉하는데 요구되는 1.5 L였다. 최대 작업 부피는 5.5 L였다. 회수는 수동적으로 또는 자동화 회수 절차에 의해 수행되었다. 따라서, 5.5 L의 충전 부피에 고정된 수위 센서의 출력 신호는 외부 펌프를 개폐하는데 이용되었다. BioExpert를 이용하여 수위 센서의 출력 신호를 기록하고 발효 레시피 내에서 프로그래밍된 단계로 외부 펌프를 원격 제어하였다. 프로그래밍된 단계는 펌프의 실행 시간에 기반하여 회수 부피를 규정하였다. 회수 튜브는 반응기가 무인 상태에 놓일 때 (즉, 주말 동안) 외부 펌프에 연결되었다. 충전 부피가 5.5 L에 도달하여 수위 프로브와 접촉할 때마다, 외부 펌프용 출발 신호가 생성되었다. 그 실험에서, 규정된 부피의 1 L의 현탁액이 반응기 밖으로 펌핑되었다. 이러한 제어 루프는 발효의 정기적 관리의 필요성을 회피하고 무인 상태로 있을 때 반응기가 넘치는 것을 방지하기 위한 안전 조치로서 기능하였다.
접종 및 초기 유도기 후에 세포는 지수적 성장기로 들어갔다. 지수적 성장기 동안 0.029 h-1의 특정 성장 속도로 현탁액은 116 h의 배양 후에 100 g/L 신선 중량의 바이오매스 농도에 도달하였다. 유전율 측정을 위한 공정 값은 설정 값으로 고정되었다. 추가로 배양 공정에서 실제 공정 값은 5초 간격으로 상응하는 유전율 설정 값과 비교되었다. 이러한 연속 성장기의 시작에서 유전율 설정 값은 상이한 시점에 조정되었는데, 그 이유는 오프라인으로 측정된 신선 중량이 100 g/L 미만이었기 때문이다. PID (비례 적분 미분) 컨트롤러를 공정 제어에 이용하였고 컨트롤러 출력을 액추에이터 출력으로 변환시키는 액추에이터로서 펌프를 이용하였다. 이 경우 액추에이터 출력은 공정 값의 오프셋, PID 설정 및 배지 첨가에 이용된 배관에 따라 생물반응기에 첨가된 신선 배지의 특정 부피였다. 탱크로부터 생물반응기로 신선 배지의 첨가는 발효 브로쓰의 희석 및 유전율의 감소를 발생시켜, 공정 값을 설정 값으로 조정하였다. 초기 배치-단계가 바이오매스 제어를 시작함에 의해 차단된 후에, 배양 및 바이오매스 생산은 추가 64일 동안 계속되어 총 88 L의 현탁액 및 8.8 kg의 세포를 생산하였다. 1200 h의 배양 동안 공정으로부터 상이한 간격 (총 36회 회수)으로 상이한 시점에 가변적인 부피 (0.01 L - 4.0 L)가 회수될 수 있다. 1200 h의 공정 시간 후에 온라인 데이터의 수집이 중단되었기 때문에 도 2 및 표 1은 단지 이 기간 동안의 데이터를 나타낸다.
도 2는 신규한 배양 전략에 의한 담배 BY-2 세포의 배양을 도시한다. A: 배양 공정 동안 산소 농도의 추이, 교반기 속도 및 기록된 회수(■). B: 전도도, pH 및 유전율 (바이오매스 농도)에 대한 공정 값의 발생. C: 연속 공정 단계 동안 배지 첨가의 추이. 공급 부피는 배지 첨가에 대한 온라인 데이터를 나타내고 회수 부피는 오프라인으로 기록된 회수에 대한 것이다.
표 1은 발효 공정 동안 상이한 시간에 상이한 가변적인 회수 부피 및 전체 공정 동안 누적된 회수 부피를 나타낸다. 예를 들어, 430.1 h에 0.6 L의 부피가 회수된 반면 (표 1, 회수 번호 11), 793.2 h에 3.2 L의 부피가 회수되었다 (표 1, 회수 번호 24).
두 번의 연속 회수 시점 사이의 최단 시간은 3.6 h (표 1, 회수 번호 30-31)인 반면, 두 번의 회수 시점 사이의 최장 시간은 73.7 h (표 1, 회수 번호 31-32)이었다. 310.4 h에서 334 h까지의 발효 시간 사이에 상이한 부피를 갖는 세 번의 개별 회수가 수행되었다 (표 1; 회수 번호 7-9). 이는 회수 부피 및 회수 시간 간격이 매우 유연하고, 따라서 요구에 따라 회수가 가능함을 명백하게 입증한다.
표 1: 배양 동안 수행된 회수의 기록
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생산기 동안 세포는 0.029 h-1의 동일한 특정 성장 속도로 지수적으로 성장하였고, 이는 지수적 성장기 동안 측정되었다. 더욱이, dO2, pH, 전도도 및 유전율에 대한 온라인 신호는 공정을 통틀어 제어 루프 시작 후부터 일정하게 머물렀고, 따라서 공정의 강력함을 입증한다. 특히 유전율은 온라인 신호를 고려할 때 뿐만 아니라 실제 바이오매스 농도의 관점에서도 일정하였으며, 이는 패킹된 세포 부피(PCV)의 오프라인 파라미터, 건조 중량 및 신선 중량을 결정함에 의해 오프라인으로 측정되었다. 온라인 및 오프라인 파라미터의 비교는 둘 모두의 방법 간에 탁월한 일치를 나타내었다 (도 3).
2.) 식물 세포에서 일시적인 발현에 의한 생산 및 스크리닝
담배 BY 2 식물 세포 팩 (PCP) (특허 번호 WO 2013/113504 A1)을 이용한 발현 작제물의 고처리량 스크리닝을 위한 새롭게 개발된 절차를 잎의 표준 아그로인필트레이션(agroinfiltration)과 비교하였다. 신규한 배양 전략으로 배양된 담배 BY-2 세포를 96-웰 수신 플레이트로 옮기고 진공을 가함에 의해 약 200 mg의 신선 중량을 지닌 96-웰 PCP를 동시에 생성하였다. OD600 = 0.1의 200 mL A. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 균주 GV3101 현탁액을 첨가함에 의해 PCP를 트랜스펙션시켰다. 3개의 박테리아 배양액을 이용하였는데, 각각은 3개의 항체 중 하나에 대한 발현 작제물을 지니므로, 각 작제물로 트랜스펙션된 32개 PCP를 생성하였다. 30분 동안 인큐베이션 후에, 현탁액을 진공 여과에 의해 제거하여, 다공성 PCP를 재생시켰다. 일시적인 유전자 발현을 위해, PCP를 함유하는 수신 플레이트를 파이토챔버(phytochamber)에서 26℃ 및 50% 습도로 5일 동안 인큐베이션시켰다. 동시에, 4주된 니코티아나 타바쿰 K326, N. 타바쿰 SR-1 및 N. 벤타미아나 식물을 PCP에 이용된 동일한 배양액으로부터 유래된 A. 투메파시엔스 현탁액 (OD600 = 1)으로 침윤시켰다. 각 식물에 대한 4개의 잎 (다른 연령)에 박테리아를 주입하고, 식물을 23℃에서 16-h 광주기로 5일 동안 인큐베이션시켰다. 총 가용성 단백질을 PCP 및 잎으로부터 추출하고, 3개 항체의 농도를 표면 플라스몬 공명 분광학에 의해 비교하였다 (도 4).
도 4는 아그로박테리움-매개된 유전자 전달 5일 후 일시적인 유전자 발현 (항체 누적으로 표시됨)의 스크리닝을 위한 담배 BY-2 PCP에 의한 상이한 전체-식물 발현 시스템 (N. 벤타미아나, N. 타바쿰 K326 및 N. 타바쿰 SR-1)의 비교를 도시한다. 항체 농도는 SPR 분광학에 의해 결정되었다.
상기 비교는 상이한 일시적인 발현 방법이 상대적 항체 수율에 관해 유사한 결과를 제공함을 나타내었으므로, PCP가 전체 식물에서 발현 작제물의 활성을 예측할 수 있음을 나타낸다. PCP 방법은 또한 항체 누적에 대한 변동 계수가 훨씬 낮음을 특징으로 하면서, 2F5 누적의 3배 증가를 포함하는, 3개 모두의 항체에 대해 최고 농도를 달성하였다 (표 2).
새롭게 개발된 배양 전략은 식물 세포 팩을 이용한 고처리량 스크리닝 플랫폼의 요구에 대해 식물 세포 바이오매스를 공급하는 완벽한 방법을 제시한다. 더욱이 이는 유사한 품질의 식물 세포 바이오매스를 연속적으로 생성함에 의해 스크리닝의 반복성을 보장한다.
표 2: 침윤 5일 후 상이한 발현 시스템으로부터의 추출물에서 항체 농도의 정량 (BY-2 PCP n = 32, 식물 종 n = 3)
Figure pct00002
3.) 시험관내 번역을 위한 세포 비함유 추출물 (용해물)의 생산
실험적 배치에서, 배치 배양액에서 성장한 담배 Bright Yellow 2 (BY-2) 세포로부터 제조된 용해물의 생산성을 연속 발효로 성장한 것들과 비교하였다. 각각의 경우에 20%의 패킹된 세포 부피를 갖는 1 리터의 BY-2 세포 배양액을 문헌[Komoda et al. (2004)]에 따른 용해된 제조물에 대한 변형된 프로토콜로 동시에 처리하였다.
각각의 경우에 3% (w/v) 수크로스, 1 mg/L 티아민 하이드로클로라이드, 0,2 mg/L 2,4 디클로로페녹시아세트산 및 100 mg/L 마이오이노시톨이 보충된 Murashige 및 Skoog 액체 배양액 (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture, Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande)에서 성장한 1 리터의 BY-2 세포 배양액을 250xg에서 5분 동안 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 3.6 g/L Kao 및 Michayluk 배지 (Duchefa Biochemie), 0.36 M 만니톨, 3% (v/v) Rohament CL, 2% (v/v) Rohament PL 및 0.1% (v/v) Rohapect UF (모두 AB Enzymes, Darmstadt, Germany로부터 획득함) 뿐만 아니라 파이토호르몬 NAA (α-나프탈산 0.5 μg/mL) 및 BAP (6-벤질아미노퓨린 1 μg/mL)으로 구성된 3 부피의 프로토플라스테이션 완충제에 재현탁시켰다. 포타슘 하이드록사이드에 의해 5의 pH로 조정하였다. 현탁액을 27℃ 및 70 rpm에서 1.5h 동안 인큐베이션시켰다. 프로토플라스테이션 후에 현탁액을 110xg에서 5분 동안 원심분리시키고 생성된 세포 펠렛을 0.7 M 만니톨, 20 mM MgCl2, 및 5 mM PIPES-KOH (pH 7.0)에서 (위에서 아래로) 3 mL 0%, 3 mL 15%, 5 mL 30%, 5 mL 40% 및 3 mL 70% 퍼콜 (GE Healthcare, Munich, Germany)로 구성된 불연속 퍼콜 구배에 바로 적용시켰다. 12.000xg에서 1 h 동안 원심분리 후에 배출된 프로토플라스트 (소위 미니 프로토플라스트)를 40% 및 70% 퍼콜 층 사이의 계면으로부터 회수하고 100xg에서 5분 동안 0.7 M 만니톨에서 세척하였다. 미니 프로토플라스트를 3 부피의 TR 완충제 (30 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 80 mM 포타슘 아세테이트, 0.5 mM 마그네슘 아세테이트, 2 mM DTT 및 50 mL 당 한 정제의 완전 EDTA-비함유 프로테아제 억제제 혼합물 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany))에 재현탁시켰다. 후속하여 미니 프로토플라스트를 질소 감압 챔버 (Parr Instrument, Frankfurt, Germany)에서 10 bar로 30분 동안 붕괴시켰다. 핵 및 막 단편을 500xg 및 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 제거하였다. 0.5 mM CaCl2 및 75 U/mL 누클레아제 S7 (Roche Diagnostics)의 첨가 후에 상청액을 20℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 용해물에 1 mM EGTA를 보충하고, 액체 질소에서 동결시키고, 1 mL 분취량으로 -80℃에 저장하였다.
반응 성분의 농도를 고려하여 생성된 용해물을 최대의 시험관내 번역 활성으로의 실험 설계 (DoE) 전략에 의해 최적화시켰다. 연속 발효된 세포로부터 수득된 용해물에 의해, 배치 모드로 배양된 세포로부터 제조된 용해물에 비해 100% 더 높은 번역 활성이 관찰되었다 (도 5). 또한 리보솜의 농도 및 그 결과로서 더 높은 생산성에 대한 지시인자로서 260 nm에서의 흡광도는 연속 발효된 세포로부터 수득된 용해물에서 더 높았다 (+20-25%).
커플링되지 않고 (주형으로서 mRNA) 커플링된 (주형으로서 플라스미드 DNA) 배치 모드에서 BY-2 용해물의 생산성은 시판되는 식물-기반 시스템(밀 배아 추출물)보다 거의 2배 더 높다.
도 5는 배치 배양된 세포 및 연속 배양된 세포로부터 각각 제조된, 커플링된 전사/번역 세포 비함유 담배 BY-2 시스템에서 생산된 향샹된 황색 형광 단백질 (eYFP)의 수율 비교를 도시한다. 그래프에 도시된 대로, 번역 활성에서의 >100% 증가가 배치 유래된 용해물에 비해 연속 배양된 세포 유래된 용해물로부터 달성될 수 있었다. 인큐베이션은 25℃ 및 750rpm에서 최대 39h 동안 수행되었다.
4.) 3-L 교반된 탱크 생물반응기에서 소르부스 토르미날리스 현탁 배양액 (Elsbeere)의 배양. 배양은 오토클레이브가능한 3-L 교반된 탱크 생물반응기 (Applikon, Schiedam, The Netherlands)에서 26℃로 수행되었다. 생물반응기에 2 L MS-배지 (Murashige and Skoog, 1962; MS-염 4.3 g/L, 마이오이노시톨 100 mg/L, KH2PO4 200 mg/L, HCl-티아민 1 mg/L, 2.4-디클로로페녹시아세트산 0.2 mg/L, 수크로스 30 g/L)를 충전하고 소르부스 토르미날리스 세포의 6일된 전배양액으로 접종하였다. Pluronic L-61 (BASF, Mount Olive, NJ)을 0.01% (v/v)의 농도로 첨가하여 발포 및 벽 성장을 조절하였다. 용존 산소 농도 (dO2)는 소결된 금속 스파저를 이용하여 가압된 공기를 발효기에 0.1 vvm의 통기율로 자동으로 펄싱시킴에 의해 20% 포화도 설정 값으로 유지되었다. ez-컨트롤 (Applikon)을 이용하여 발효를 제어하였고 온라인 데이터를 수집하는데 BioXpert XP를 이용하였다. pH를 모니터하였으나 조절하지 않았다. Futura RFIS 시스템 (Aber Instruments, Aberystwyth, UK)을 이용하여 생육가능한 온라인 바이오매스를 측정하였다. 세포의 유전율 및 배지의 전도도를 환형 전극 (12 x 120 cm) 및 편광 보정되는 0.6 MHz의 세포 배양 모드로 작동하는 표준 원격 Futura 기기를 이용하여 동시에 측정하였다. 바이오매스 센서는 Futura 소프트웨어에 의해 제어되었다. 유전율 측정을 위한 공정 값은 발효 공정 동안 상이한 설정 값으로 고정되었다 (40 pF/cm 0-4.5 dpi; 45 pF/cm 4.5-8.5 dpi; 8.5-11.5 dpi부터 50 pF/cm). 배양 공정에서 실제 공정 값을 5초 간격으로 상응하는 유전율 설정 값과 비교하였다. PID 컨트롤러를 공정 제어에 이용하였다. P, I 및 D 파라미터의 특정 설정은 P-게인(gain) = 20, I-시간 = 0 및 D-시간 = 0이었다. 액추에이터는 컨트롤러 출력을 액추에이터 출력으로 변환시켰다. 유전율 신호가 설정 값을 초과했을 때 펌프는 새로운 멸균 배지를 배지 탱크로부터 생물반응기에 첨가하여, 배지를 희석시키고 유전율을 설정 값의 값으로 감소시키도록 조절되었다. 도 6은 N.타바쿰 cv. BY-2 세포 뿐만 아니라 성공적으로 배양된 소르부스 토르미날리스로부터의 현탁액 세포 배양액도 발효 전략에 적합함을 명백하게 보여준다. 발효의 처음 4일 동안 세포는 배치 단계였고 처음으로 40 pF/cm의 설정 값에 도달하였다. 접종한 지 4,5일 후에 설정 값은 45pF/cm로 증가하였다. 세포는 이러한 설정 값에 도달하는데 대략 하루를 필요로 하였다. 설정 값은 약 4일 동안 45 pF/cm로 고정되었다. 이러한 3일 사이에 총 200 mL의 현탁액이 회수될 수 있었다. 접종한 지 8.5일 후 설정 값은 다시 50 pF/cm로 증가하였고 세포는 대략 하루 후에 이러한 바이오매스에 다시 도달하였다. 발효는 추가 3일 동안 구동되었다. 대략 총 400 mL의 세포 현탁액이 11.5일에 회수될 수 있었다.
5.) 3-L 교반된 탱크 생물반응기에서 피루스 코뮤니스 현탁 배양액 (Birne)의 배양
배양은 오토클레이브가능한 3-L 교반된 탱크 생물반응기 (Applikon, Schiedam, The Netherlands)에서 26℃로 수행되었다. 생물반응기에 2 L MS-배지 (Murashige and Skoog, 1962; MS-염 4.3 g/L, 마이오이노시톨 100 mg/L, KH2PO4 200 mg/L, HCl-티아민 1 mg/L, 2.4-디클로로페녹시아세트산 0.2 mg/L, 수크로스 30 g/L)를 충전하고 소르부스 토르미날리스 세포의 6일된 전배양액으로 접종하였다. Pluronic L-61 (BASF, Mount Olive, NJ)을 0.01% (v/v)의 농도로 첨가하여 발포 및 벽 성장을 조절하였다. 용존 산소 농도 (dO2)는 소결된 금속 스파저를 이용하여 가압된 공기를 발효기에 0.1 vvm의 통기율로 자동으로 펄싱시킴에 의해 20% 포화도 설정 값으로 유지되었다. ez-컨트롤 (Applikon)을 이용하여 발효를 제어하였고 온라인 데이터를 수집하는데 BioXpert XP를 이용하였다. pH를 모니터하였으나 조절하지 않았다. Futura RFIS 시스템 (Aber Instruments, Aberystwyth, UK)을 이용하여 생육가능한 온라인 바이오매스를 측정하였다. 세포의 유전율 및 배지의 전도도를 환형 전극 (12 x 120 cm) 및 편광 보정되는 0.6 MHz의 세포 배양 모드로 작동하는 표준 원격 Futura 기기를 이용하여 동시에 측정하였다. 바이오매스 센서는 Futura 소프트웨어에 의해 제어되었다. 유전율 측정을 위한 공정 값은 발효 공정 동안 상이한 설정 값으로 고정되었다. 추가로 배양 공정에서 실제 공정 값을 5초 간격으로 상응하는 유전율 설정 값과 비교하였다. PID 컨트롤러를 공정 제어에 이용하였다. P, I 및 D 파라미터의 특정 설정은 P-게인 = 20, I-시간 = 0 및 D-시간 = 0이었다. 액추에이터는 컨트롤러 출력을 액추에이터 출력으로 변환시켰다. 유전율 신호가 설정 값을 초과했을 때 펌프는 새로운 멸균 배지를 배지 탱크로부터 생물반응기에 첨가하여, 배지를 희석시키고 유전율을 설정 값의 값으로 감소시키도록 조절되었다.
이 발효 전략을 피루스 코뮤니스로부터 배양된 현탁 세포주에 이용하였다. 공정 내에서 유전율 설정 값의 단계식 증가 또는 감소 효과를 조사하여야 한다.
도 7에서 "점-선-점" 선은 전체 공정 동안 설정 값 변화를 나타낸다. 접종한 지 6일 후에 40 pF/cm의 첫 번째 설정 값에 도달하였고 (dpi) 그 뒤에 설정 값은 43 pF/cm으로 증가하였다. 일단 배양액이 또한 43 pF/cm에 도달하면 설정 값은 85 pF/cm까지 5 pF/cm 단위로 다시 증가하였다. 배양액은 18.6 dpi 후에 85 pF/cm에 도달하였고 다시 80 pF/cm로 감소하였다. 배양액을 약 8일 동안 그 수준으로 유지한 다음 설정 값을 70 pF/cm 및 50 pF/cm으로 추가로 단계적으로 감소시켰다. 발효의 끝에 바이오매스를 접종한 직후에 도달한 유전율로 희석시켰고 배양액은 고전적인 배치 발효에서와 같이 정상적인 성장을 보였다. 이 실험은 설정 값의 변화에 대한 전체 공정의 강력함을 명확히 입증한다. 이 실험은, 한편으로 공정이 피루스 코뮤니스 세포 배양액의 배양에 적합하고, 다른 한편으로 설정 값에서의 변화가 공정에 부정적인 영향을 주지 않음을 명확히 입증한다.
6.) 시간-개선
도 8은 공정 시간 및 N. 타바쿰 BY-2 세포 배양액의 성장 거동에 기반한 회수된 바이오매스의 이론적 계산을 도시한다. 둘 모두의 발효 전략에 대한 계산은 5 L 부피의 세포 현탁액에 기반하였다. BY-2 세포 배양은 배치 배양에서 20% PCV (100 mg/L 신선 중량)에 도달하는데 5일 및 50% (250 mg/L 신선 중량)의 PCV에 대해서는 7일을 각각 필요로 하였다. 용기를 세정, 준비 및 멸균하기 위한 설정 시간은 둘 모두의 발효 전략에 대해 동일하였다 (1일). 고전적인 배치 발효의 경우 전체 발효 브로쓰가 회수될 수 있고(5L) 신규한 공정의 경우 최대 4L의 회수 부피가 계산에 이용되었다. 신규한 공정이 3일마다 정상 상태에 있다면 최대 회수 부피가 용기로부터 제거될 수 있었다.
도 8의 상부는 회수 기준이 20% PCV (신규한 공정에서 설정 값을 의미함)일 때 시간 경과에 따른 바이오매스의 회수를 도시한다. 배치 배양액은 5dpi 후에 이러한 바이오매스에 도달하였다. 둘 모두의 전략은 6dpi 후에 바이오매스의 첫 번째 회수를 제공한다. 첫 번째 배치에서 고전적인 배치 발효는 0.5 kg의 바이오매스를 제공하고 신규한 공정은 0.4 kg의 바이오매스를 제공한다. 그 시점에 배치 배양액이 더 양호해 보인다. 그러나 일단 회수 기준 (신규한 공정에서 설정 값을 의미함)에 도달하면 신규한 발효 공정은 0.4 kg의 바이오매스를 다시 제공하는데 단 3일만을 요구하며, 이에 반해 고전적인 배치 발효는 0.5 kg에 대해 6일을 요구한다. 48일의 시간을 고려할 때 8회의 고전적인 배치 발효가 수행되어 4kg 바이오매스의 회수로 이어질 수 있다. 동일한 시간 틀에서 신규한 발효 공정이 수행될 수 있는 15회 회수는 6 kg 바이오매스를 발생시킬 수 있다. 이것은 약 50%의 증가된 공간-시간 수율이다. 공간-시간 수율에서의 증가는 회수 기준이 50%의 PCV (250 mg/L)로 이동한 경우 더욱 더 높다 (도 8 하부 그래프). BY-2 세포는 그 바이오매스에 도달하는데 8일이 필요하다. 48일을 고려하면 고전적인 배치 공정에 의해 6회 생산 사이클이 수행되어 7.5 kg의 바이오매스를 발생시킬 수 있다. 신규한 공정의 경우 47일에 14회 생산 사이클이 수행되어 14 kg의 바이오매스 및 86%의 공간-시간 수율의 증가를 발생시킬 수 있다. 이러한 데이터는 표 3에서 조합된다.
표 3
Figure pct00003
이 그래프는 유전율 설정 값에 따른 표준 N. 타바쿰 cv. BY-2 배치 발효와 비교시 시간 개선을 나타낸다.
7.) 배치 발효 및 본 발명에 따른 공정에 의한 유전자이식 BY-2 세포주의 재조합 항체 생산
종래에 개시된 대로 (Holland, Sack et al. 2010 Biotechnol Bioeng) 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 인코딩하는 바이너리 T-DNA 플라스미드를 지니는 재조합 아그로박테리아에 의한 형질전환에 의해 HIV-1 중화 2G12 항체를 생산하는 유전자이식 담배 BY-2 세포 현탁 세포주 (GFD#5)를 생성하였다. 배치 발효 및 ELISA에 의한 2G12 항체 누적의 분석을 종래에 기재된 대로 수행하였다 (Holland, Sack et al. 2010 Biotechnol Bioeng). 배치 발효를 161시간 동안 수행하였다. 48 h 유도기 이후에 104 h의 지수적 세포 성장기가 이어졌다. 배양 상청액 중 2G12 농도는 지수적 세포 성장 동안 120 h의 공정 시간까지 88 ng/mL의 수준까지 증가하였다. 그 후 농도는, 비록 배양이 여전히 지수적 성장기에 있었지만, 다음 41 h 동안 35 ng/mL의 수준으로 감소하였다. 세포내 농도 수준은 72 h의 공정 시간 후에 4000 ng/mL였고 120 h 후에 2250 ng/mL의 수준으로 일정하게 감소하였고 공정의 끝까지 일정하게 유지되었다 (도 12). 본 발명에 따른 발효는 다음과 같이 수행되었다. 배양액을 5% (v/v)의 7일된 전배양액으로 접종하였다. 출발 부피는 3 L 유리 반응기에서 1 L였다. 이러한 반응기 유형의 최소 작업 부피는 0.5 L이고 최대 작업 부피는 2.7 L이다. 120 h의 초기 배치 단계 후에 유전율 설정 값은 45 pF/cm으로 설정되었고 컨트롤러 루프가 개시되었다. 배양액이 이미 54 pF/cm의 유전율에 도달하였기 때문에 45 pF/cm의 유전율에 도달할 때까지 신선 배지를 반응기로 펌핑하였다. 그 후 이 설정 값을 48 h 동안 일정하게 유지한 후 90 pF/cm로 증가시켰다. 배양액은 이러한 유전율 수준에 도달하는데 37 h의 성장을 필요로 하였고, 그 후 추가 58 h 동안 일정하게 유지되었다. 초기 단계에서 (0-120 h 발효 시간) 둘 모두의 공정은 세포내 2G12 농도 및 배양 상청액에서 2G12 농도에 대해 유사한 수준을 제공하였다. 배치 발효와 대조적으로 본 발명에 따른 공정에서의 세포내 2G12 농도는 120 h 후에 7000 ng/mL까지 급격히 증가하였고, 발효 공정의 끝까지 더 높은 생성물 수준이 유지되었다. 배양 상청액의 2G12 항체 농도는 또한 배치 발효 공정과 실질적으로 상이하였다. 그와 반대로 농도는 다시 감소하지 않았지만 오히려 전체 공정 동안 배치 발효의 최대 수준에 비해 14배 증가인 1260 ng/mL 의 최종 생성물 농도로 지속적으로 증가하였다 (도 13).
실시예는 본 발명에 따른 신규한 발효 공정이 고도로 재현가능한 바이오매스를 생산하기에 적합할 뿐만 아니라, 세포 배양 상청액 및 세포내 둘 모두에서 재조합 단백질의 누적을 증가시키는데 유용함을 명백하게 보여준다. 배치 발효에서 세포내 2G12 항체 수준은 60 h으로부터 160 h의 회수까지 4.0 μg/mL에서 2.25 μg/mL으로 꾸준히 감소하였다. 반대로 본 발명에 따른 신규한 공정에서 2G12 항체 수준은 120 h으로부터 144 h까지 3.7 μg/mL에서 7.0 μg/mL로 증가하였는데, 이는 유전율이 45 pF/cm로 일정하게 유지되는 시작 단계와 일치한다. 세포내 2G12 항체 수준 증가는 거의 2배의 증가일 뿐 아니라 또한 이것은 120 h - 288 h 동안 높은 수준으로 유지되었다. 이는 또한 본 발명에 따른 공정이 특히 컨트롤러 루프가 초기 성장기 이후 개시된 후에 세포내 생성물 수준에 관해 낮은 변동성을 특징으로 함을 나타낸다.
세포 배양 상청액에서 2G12 항체의 누적은 심지어 더 높은 차이를 나타내었다. 배치 발효의 수준이 120 h에 피크를 나타내고 그 후 떨어진 반면, 신규한 발효 공정의 경우 세포 배양 상청액에서 2G12 항체의 꾸준한 증가가 관찰되었다.
놀랍게도, 2G12 항체 수준의 증가는 45 pF/cm에 상응하는 중간 세포 밀도에서 관찰되었을 뿐 아니라, 또한 유지되거나 (세포내 2G12) 심지어 90 pF/cm에서 추가로 증가되었다 (세포 배양 상청액 2G12). 따라서, 세포 배양 상청액에서 2G12 생성물 수준은 또한, 특히 긴 공정 지속기간 동안, 낮은 변동성을 나타내었다. 게다가 세포 배양 상청액에서 2G12 생성물 수준의 지속적인 증가는 본 발명에 따른 공정의 높은 견고성 및 양호한 생성물을 전달하는 이의 용량을 입증한다. 이는 배치 발효의 세포 배양 상청액 중 2G12 수준이 120 h 후에 다시 감소하였고, 이는 생성물이 분해되었음을 의미한다는 사실로부터 명백하다.
본 실시예는 세포 내 및 상청액 둘 모두에서 세포 성장 및 생육성 뿐만 아니라 재조합 단백질 생성물의 누적을 유지하면서, 유전율에 대한 설정 값이 공정 내에서 용이하게 변화될 수 있음을 추가로 보여준다. 이는 본 발명에 따른 공정의 높은 견고성 뿐만 아니라 이의 유용성 및 공정 개발 및 개선을 위한 고유한 옵션을 입증한다.
7.) CHO 세포의 발효
본 발명에 따른 발효를 모노클로날 항체를 생산하는 유전자이식 CHO DG44 현탁 세포주로 수행하고 다음과 같이 수행하였다. 출발 부피는 3 L 유리 반응기에서 4 mM L-글루타민이 보충된 하이포크산틴 및 티미딘이 없는 (Lonza, 12-771Q) 0.8 L의 PowerCHO-2 CD였고 (최소 작업 부피 = 0.5 L, 최대 작업 부피 = 2.7) 배양액을 2,8·108개 세포로 접종하였다. 용존 산소 농도 (dO2)는 소결된 금속 스파저를 이용하여 가압된 공기를 발효기에 0.1 vvm(부피/부피/분)의 통기율로 자동으로 펄싱시킴에 의해 30% 포화도 설정 값으로 유지되었다. 온도는 37℃로 제어되었고 100 rpm의 고정된 교반기 속도를 이용하였다. pH를 모니터하고 0.5M NaOH에 의해 7.0의 설정 값으로 조절하였다. ez-컨트롤 (Applikon)을 이용하여 발효를 제어하였고 온라인 데이터를 수집하는데 BioXpert XP를 이용하였다. Futura RFIS 시스템 (Aber Instruments, Aberystwyth, UK)을 이용하여 생육가능한 온라인 바이오매스를 측정하였다. 세포의 유전율 및 배지의 전도도를 환형 전극 (12 x 120 cm) 및 편광 보정되는 0.6 MHz의 세포 배양 모드로 작동하는 표준 원격 Futura 기기를 이용하여 동시에 측정하였다. 바이오매스 센서는 Futura 소프트웨어에 의해 제어되었다. 배양 공정에서 실제 공정 값을 5초 간격으로 유전율 설정 값과 비교하였다. PID 컨트롤러를 공정 제어에 이용하였다. P, I 및 D 파라미터의 특정 설정은 P-게인 = 20, I-시간 = 0 및 D-시간 = 0이었다. 액추에이터는 컨트롤러 출력을 액추에이터 출력으로 변환시켰다. 유전율 신호가 설정 값을 초과했을 때 펌프는 4mM L-글루타민이 보충된 새로운 멸균 PowerCHO-2 CD를 배지 저장소로부터 생물반응기에 첨가하여, 유전율이 설정 값에 도달할 때까지 배양액을 희석시켰다.
접종 후에 3.5·105개 세포/mL에 상응하는 1.2 pF/cm의 발효 유전율이 수득되었다. 유전율 설정 값은 3 pF/cm로 정의되었고 컨트롤러 루프가 개시되었다. 초기 단계 (배치 단계)에서 배양액의 세포 밀도는 이러한 설정 값에 도달할 때까지 증가하였다. 이러한 초기 단계 동안 세포 배양 부피는 변하지 않았다. 세포의 대사 활성으로 인해 용존 산소 농도 및 pH-값은 이들의 설정 값에 도달할 때까지 떨어진다.
26 h 후 세포 밀도는 3.5·105개 세포/mL에서 6,8·105개 세포/mL까지 증가하였고 유전율은 1.2 pF/cm으로부터 2.3 pF/cm에 상응하는 변화를 나타내었다. 37 h의 발효 후 3 pF/cm의 설정 값에 도달하였고 그 후 유지되었다. 이러한 단계 동안 배양 부피는 증가하였다 (도 14 배지 공급). 50 h 후 성장 배양에 영향 없이 10 mL의 임의의 부피가 회수되었다. 73.2 h의 발효 시간에 830 mL의 또 다른 회수가 실행되었고 1 h 후 또 다른 620 mL가 회수되었다. 직후에 (1.5 h) 설정 값은 4.5 pF/cm로 증가하였고 14 h 후 새로운 설정 값에 도달하였다. 4.5 pF/cm의 일정한 유전율의 두 번째 단계 동안 세포 배양을 방해하지 않고, 세 번 더 임의의 세포 배양 분획이 회수되었다.
세포의 생육성은 Thoma 챔버에서 또는 CASY에 의해 염색하고 계수함에 의해 결정되었다. 표 4에 제시된 결과는 본 발명에 따른 공정이 전체 발효 시간 동안 고도로 생육가능한 포유동물 세포를 재현가능하게 전달함을 입증한다. 특히 매우 생육성인 세포는 또한 상이한 유전율로 수득되었다. 더욱이, 상기 공정은 또한 고품질의 세포 유래 생성물, 즉 모노클로날 항체를 생성하였다. 특히 항체 생성물은 전체 발효 시간 동안 증가하였음에 주목하라. 비교를 위해 세포 배양액의 분획을 발효 73.2 h (*) 후에 수집 컨테이너에 회수하였고 (유지 단계 샘플**) 24 h 동안 4℃에서 유지 단계를 수행하였다. 세포 생육성은 명백하게 94%에서 85%로 현저하게 감소하였다. 유지 단계 전(*) 및 후(**)의 항체 농도의 비교는 또한 생성물 농도가 40 μg/mL에서 29 μg/mL로 감소하였음을 보여준다 (표 4). 이는 명백하게 본 발명에 따른 공정의 이점을 입증한다.
표 4: 유전자이식 CHO DG44 세포주를 이용한 본 발명에 따른 발효의 배양 상청액에서 유전율, 생육가능한 세포 계수, 생육성 및 항체 농도
Figure pct00004
본 실시예는 본 발명에 따른 공정이 또한 고도로 재현가능한 생육성 세포 또는 세포 유래 생성물, 예컨대 항체 및 재조합 단백질을 생산하기 위한 포유동물에 세포에 적합함을 명백하게 보여준다 (도 14).
참고문헌
본 출원을 통틀어 인용된 문헌 참조, 발행된 특허, 및 공개된 특허 출원을 포함하는 모든 인용된 참고문헌의 내용은 명백하게 참조로서 본원에 포함된다.
Figure pct00005

Claims (15)

  1. 진핵생물 세포 및/또는 진핵생물 세포-유래된 생성물의 생산을 위한 세포-밀도 조절된 세포 배양 공정으로서, 이 때 세포 배양 동안의 세포 밀도는 배양 용기에서 세포 및 영양소 배지를 포함하는 세포 배양액의 부피를 조정함에 의해 조절되고, 상기 공정은,
    a) 세포를 가변적인 세포 배양 부피를 갖는 세포 배양액에서 성장시키는 단계로서, 배양 부피가 전체 세포 배양 공정 동안 일정하게 조절되지 않는, 단계,
    b) 밀도 센서에 의해 세포 배양액 중 세포 밀도를 측정하는 단계,
    c) 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하여 세포를 성장기로 유지함에 의해 세포 배양액에서 세포 밀도를 조절하는 단계,
    d) 요망되는 세포 밀도에서 세포 배양액의 분획을 회수하는 단계로서, 회수된 분획이 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 포함하고, 용기의 세포 배양 부피가 상기 분획의 회수 후에 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 연속하여 일정하게 유지되지 않고/거나 회수된 분획의 부피가 즉시 영양소 배지를 용기에 첨가함에 의해 보충되지 않는, 단계,
    e) 세포 배양 분획의 반복된 회수가 가능하도록 개시된 순서로 상기 단계 중 하나 또는 전부를 반복하는 단계, 및
    f) 임의로 회수된 세포 및/또는 세포-유래된 생성물을 처리하는 단계를 포함하는, 세포 배양 공정.
  2. 제 1항에 있어서, 세포 배양액의 세포 밀도가 연속하여 측정되는 공정.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 세포 밀도가 세포 밀도 (입력 신호)를 연속하여 측정하는 센서 및 펌프/또는 밸브를 촉발시키는 출력 신호를 생성하거나 적절한 부피의 영양소 배지를 세포 배양액에 첨가하는 컨트롤러를 포함하는 제어 루프를 이용함에 의해 조절되는 공정.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양액의 세포 밀도가 시간 경과에 따라 일정하게 조절되거나 세포 밀도에 대한 특수한 시간-의존적인 함수로 조절되는 공정.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 용기가 최소 및 최대 세포 배양 충전 수준 사이의 부피 범위 내에서 동작하는 공정.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배양액의 최소/최대 범위 내에서 임의의 부피 분획이 배양 용기로부터 회수되는 공정.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 적어도 하나의 추가 배양 용기가 첫 번째 배양 용기에 연결되어 배양 부피를 증가시키고, (ii) 각 연결된 배양 용기에서의 세포 밀도가 동일하며, (iii) 세포 배양액이 배양 용기 간에 교환되는 공정.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 세포 배양 분획에 포함된 세포를 후속 발효 공정을 접종하는데 이용하는 공정.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 세포가 후속 배양 단계를 수행하는데 이용되고, 여기서 (i) 세포가 트랜스펙션/형질전환되고, (ii) 유전자 발현이 유도인자의 첨가에 의해 유도되며, (iii) 세포가 감염되고, (IV) 세포가 세포-유래된 생성물 누적을 장려하는 조건 하에 배양되고, (iv) 핵산이 세포로 트랜스펙션되고, 및/또는 (v) 세포가 분석적 검정에 이용되는 공정.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 세포 비함유 추출물을 제조하는데 이용되는 공정.
  11. 시험관내 번역을 위한 세포 비함유 추출물을 제조하기 위한 방법으로서,
    i) 세포를 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 공정에 따라 배양하고 회수하는 단계,
    ii) 회수된 세포에 추출 처리를 사용하여 배양된 세포의 세포 비함유 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 회수된 세포가 지수적 성장기에 있는 방법.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 추출 처리가 효소적 처리를 포함하는 방법.
  14. 안정한 세포주를 생성하는 방법으로서,
    i) 세포를 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 공정에 따라 배양하고 회수하는 단계,
    ii) 회수된 세포를 핵산으로 형질전환시켜 안정한 세포주를 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 배지-박탈된 다공성 구조의 비-조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 물질의 생성 및 상기 세포 팩의 후속 유지를 위한 방법으로서,
    (i) 세포를 식물 세포 현탁 배양액으로부터 분리함에 의해 다공성 구조를 갖는 세포 팩을 제공하는 단계로서, 이 때 세포가 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 배양되고, 세포 팩에 포함된 액체의 함량이 cm3 당 0.1 내지 0.9 g의 습윤 세포 중량의 세포 팩 밀도에 상응하도록 감소되고 조정되어, 상기 세포 팩의 배지-박탈된 다공성 구조 특성을 확립하는 단계, 및
    (ii) 상기 배지-박탈된 다공성 구조의 세포 팩을 비-액체 환경에서 50 내지 100%의 상대 습도 하에 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 방법.
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