ES2898637T3 - Métodos y aparatos de espectroscopia dieléctrica - Google Patents

Métodos y aparatos de espectroscopia dieléctrica Download PDF

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Abstract

Un método para la determinación de una propiedad biológica de células suspendidas en unos medios líquidos, comprendiendo el método: recibir datos de las propiedades eléctricas de las células obtenidos aplicando una señal a dichas células en más de dos frecuencias de señal; recibir datos de las propiedades biológicas de las células obtenidos usando una técnica analítica alternativa; generar al menos un valor representativo de la dependencia de la frecuencia de dichos datos de las propiedades eléctricas; determinar una relación entre dichos datos de las propiedades biológicas y dicho valor representativo de dichos datos de las propiedades eléctricas, en donde dicho valor se genera determinando una relación de área bajo la curva derivada de los datos de las propiedades eléctricas, en donde dicho valor representativo de dichos datos de las propiedades eléctricas representa una forma de dichos datos de las propiedades eléctricas en relación con la frecuencia; y en donde dicha relación se usa para ajustar una o más condiciones ambientales de dichas células.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y aparatos de espectroscopia dieléctrica
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de EE.UU. No. 61/584,141, presentada el 6 de enero de 2012, titulada "DIELETRIC SPECTROSCOPY METHODS AND APPARATUS"; a la solicitud provisional de EE.UU. No. 61/699,805 presentada el 11 de septiembre de 2012, titulada "DETECTION OF APOPTOSIS USING DIELECTRIC SPECTROSCOPY"; y a la aplicación provisional de EE.Uu . No. 61/703,103, presentada el 19 de septiembre de 2012, titulada "DIELECTRIC SPECTROSCOPY METHODS AND APPARATUS".
Campo
La tecnología descrita se refiere a métodos y aparatos para predecir propiedades biológicas, tales como la biomasa viable en una población de células usando una señal eléctrica.
Antecedentes
Tradicionalmente, el recuento de células se realiza mezclando una alícuota de una población de células con colorante azul de tripano y contando las células dispuestas en una platina de hemocitómetro usando un microscopio. Luego, se determina la densidad de células viables por métodos de recuento visual. Tales técnicas de hemocitómetro son propensas a errores y requieren una muestra manual de los contenidos del biorreactor. En consecuencia, se han desarrollado varias técnicas analíticas alternativas, que incluyen técnicas que cuentan las células basadas en la impedancia eléctrica, así como técnicas que usan la exclusión con azul de tripano.
Las técnicas de espectroscopia dieléctrica (DS) miden la impedancia eléctrica de una muestra aplicando una señal variable en el tiempo a la muestra a través de electrodos. Las técnicas de DS pueden proporcionar información sobre la estructura y las propiedades de las células, que incluye el contenido intracelular, la forma de la membrana y la polarización, y otras propiedades de las células.
Las propiedades dieléctricas de las células biológicas pueden proporcionar información sobre el estado celular y molecular de una población dada de células. Las propiedades dieléctricas de las células biológicas se caracterizan principalmente por la dispersión beta, un fenómeno de relajación dieléctrica, que se observa en el intervalo de frecuencia media y alta (HF) del espectro de radio. El mecanismo de dispersión beta se debe a la polarización de Maxwell-Wagner (polarización interfacial) en las interfaces externas e internas de la membrana de fosfolípidos, y está causado por la capacidad de las membranas de las células biológicas para impedir la corriente eléctrica. Se pueden observar contribuciones adicionales a la dispersión beta debido a la presencia de orgánulos, heterogeneidad de la población de células, y otros fenómenos.
Las técnicas de DS para estimar las propiedades dieléctricas de las células biológicas se analizan en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. números 4,810,650, 4,965,206, 6,496,020, 6,596,507, y 7,930,110. En las técnicas conocidas para estimar los datos de las propiedades biológicas, los datos de las propiedades eléctricas se reciben aplicando una señal a una solución de células a través de múltiples frecuencias. SOLEY A ET AL: "On-line monitoring of yeast cell growth by impedance spectroscopy", JOURNAL Of BIOTECHNOLOGY, vol. 118, 10 de septiembre de 2005, páginas 398-405 y MICHAL dAb ROS ET AL: "Cole-Cole, linear and multivariate modeling of capacitance data for on-line monitoring of biomass", BIOPROCESS AND BIo Sy STEMS ENGINEERING, vol. 32, 11 de junio de 2008, páginas 161-173 describen otros ejemplos de implementación de espectroscopía dieléctrica para monitorear propiedades dieléctricas de las células biológicas.
Existe una necesidad de técnicas de cribado no destructivas para asociar fenómenos físicos específicos de las células con fenómenos de biología de las células y de las moléculas. El cribado basado en células es un potente método que usa células vivas para probar el efecto de diferentes nutrientes, tóxicos, y factores ambientales en el fenotipo celular y molecular de las células. Así, hay una amplia oportunidad para el desarrollo de herramientas que permitan la predicción sistemática de las características de viabilidad de las células.
Compendio
La presente invención se refiere a métodos y aparatos para determinar una propiedad biológica, tal como la biomasa viable, usando un dispositivo de medición eléctrica de barrido de frecuencia (por ejemplo, una sonda de permitividad), y usando propiedades biológicas, tal como la biomasa viable medida por una técnica analítica alternativa (tal como la exclusión con colorante azul de tripano (por ejemplo, la biomasa viable medida usando un contador de células automatizado)) como una calibración.
Se describen métodos y aparatos para correlacionar un volumen de células viables medido por exclusión con colorante azul de tripano y un volumen de células viables determinado por métodos basados en capacitancia. Ciertas realizaciones de estas técnicas usan información medida a través de un espectro dieléctrico para estimar a priori el volumen de células viables.
Los dispositivos para medir la impedancia de una muestra se pueden usar para predecir la biomasa midiendo el cambio en la capacitancia de un sistema. Estos dispositivos de medición también tienen la capacidad de medir un espectro dieléctrico midiendo la permitividad relativa de un sistema usando señales aplicadas a través de varias frecuencias diferentes. Con algunas formas de biomasa, cuando la viabilidad del cultivo comienza a disminuir, la precisión del uso de capacitancias medidas del sistema para predecir la biomasa viable comienza a divergir en comparación con otros métodos (por ejemplo, exclusión con colorante azul de tripano). Se observa una divergencia en el valor medido entre los dos métodos que es aproximadamente proporcional a la viabilidad del cultivo. Esta divergencia se puede interpretar como que es causada por células que no pueden excluir el colorante en el método de exclusión con azul de tripano que conserva las membranas de las células intactas o parcialmente intactas. Esta conservación de la membrana de la célula produce una señal de capacitancia residual, aunque estas células se consideran no viables según la exclusión con colorante azul de tripano.
La espectroscopia dieléctrica es una técnica no invasiva que se puede usar para ilustrar el comportamiento a nivel celular, por ejemplo, en procesos de crecimiento de las células en biorreactores. La espectroscopia dieléctrica puede proporcionar una instantánea rica en datos a nivel celular de las células en un biorreactor. Por ejemplo, los dispositivos de medición usados en la realización de la espectroscopía dieléctrica funcionan detectando una capacitancia, o capacidad para almacenar carga eléctrica, de las células de una población (por ejemplo, una suspensión de células) en función de la frecuencia aplicada al dispositivo de medición. Esta medición se puede lograr realizando un escaneo de frecuencias o, en muchos casos, midiendo solo un valor de capacitancia. La biomasa viable se puede predecir a través de la medición de uno o más valores de capacitancia que son indicativos de la magnitud total (o intensidad, y también llamado incremento dieléctrico) de la curva de dispersión beta. Se sabe que el incremento dieléctrico se refiere directamente a los datos de las propiedades biológicas (por ejemplo, biovolumen total) del sistema a través de la relación
Figure imgf000003_0001
Donde r es el radio de las células promedio, O es el biovolumen total, Cm es la capacitancia específica de la membrana, y As es el incremento dieléctrico.
El estado de la técnica actual asume que las propiedades medidas se deben solo a células viables y, por lo tanto, usa una medición de capacitancia que es indicativa del incremento dieléctrico para predecir la biomasa medida por una técnica analítica alternativa, que incluye los métodos de recuento de células fuera de línea, tal como la exclusión con colorante azul de tripano (por ejemplo, usando un analizador Cedex). En los métodos de la técnica anterior, se determina una relación entre la magnitud de la dispersión beta y una propiedad biológica medida.
La relación se aplica a las mediciones de capacitancia posteriores para predecir los datos de las propiedades biológicas. Esta predicción generalmente resulta válida cuando se mide la biomasa viable cuando las células mantienen una viabilidad constante. Sin embargo, el método se rompe cuando la viabilidad de las células comienza a cambiar, lo que da como resultado divergencias entre la viabilidad predicha basada en la capacitancia y la viabilidad medida usando una técnica analítica alternativa.
Los dispositivos de medición adecuados que se pueden usar en la realización de la espectroscopía dieléctrica son fácilmente discernibles para un experto en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar dispositivos de medición de electrodo de dos terminales, de electrodo de cuatro terminales, de cámara coaxial, dieléctrico de un solo cabezal, y multihilos en ciertas realizaciones de la tecnología descrita. En algunos ejemplos, los dispositivos de medición incluyen un generador de señales, un receptor, y un analizador de señales acoplado a un electrodo o sonda para medir las propiedades electromagnéticas de una muestra. La(s) capacitancia(s) resultante(s), o espectro dieléctrico, se verá afectado por atributos de la célula tales como la morfología, la carga de la membrana, los orgánulos, la salud, y/o la acumulación de metabolitos dentro de la célula, y la(s) capacitancia(s) resultante(s) pueden, por lo tanto, proporcionar información sobre estos atributos en tiempo real.
En algunas realizaciones, la tecnología descrita permite la medición precisa de la viabilidad de las células a lo largo del ciclo de vida de un cultivo de células, no solo durante la fase de crecimiento. Esto puede permitir un esquema de alimentación donde los alimentos se basan en la biomasa y, por lo tanto, en la demanda de las células. Por ejemplo, las reacciones extracelulares de un bioproducto con los componentes del alimento pueden producir cantidades inaceptables de impurezas del producto, pero se debe añadir alguna cantidad del componente del alimento para continuar produciendo el producto. Así, un alimento variable basado en la biomasa de las células (por ejemplo, volumen de células viables) puede permitir un control más preciso de los componentes del alimento en tales situaciones.
La presente invención proporciona, por lo tanto, un método y un aparato para determinar una propiedad biológica de células suspendidas en unos medios líquidos según las reivindicaciones independientes 1 y 13, respectivamente. Las realizaciones preferidas de la invención se establecen en las reivindicaciones dependientes.
Lo anterior y otros objetos, características, y ventajas de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un esquema de un sistema adecuado en el que se pueden implementar las realizaciones, técnicas y tecnologías descritas.
La figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo generalizado para determinar las relaciones entre los datos de las propiedades biológicas y los datos de las propiedades eléctricas de las células.
La figura 3 es un gráfico que ilustra la relación de viabilidad versus permitividad para determinar una relación entre los datos de las propiedades biológicas y los datos de las propiedades eléctricas obtenidos en dos frecuencias.
La figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un método de combinación de las mediciones de la magnitud y forma de los datos de las propiedades eléctricas para obtener una nueva correlación para predecir datos de las propiedades biológicas en pruebas posteriores.
La figura 5 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo generalizado de un método de cálculo de las divergencias entre las mediciones recibidas y las mediciones de calibración.
La figuras 6A-B son gráficos que ilustran los resultados experimentales obtenidos usando métodos ejemplares de predicción del volumen de células viables obtenidos según la tecnología descrita.
La figura 7 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo generalizado de un método de correlación de divergencias para varias mediciones de permitividad.
La figura 8A es un gráfico que ilustra una serie de curvas de permitividad versus frecuencia (espectros) tomadas en diferentes puntos de tiempo, mientras que la figura 8B es un gráfico que ilustra una serie de espectros de permitividad normalizada versus frecuencia tomados en diferentes puntos de tiempo.
La figura 9 ilustra una ecuación ejemplar para normalizar los datos de permitividad.
La figura 10 es un gráfico que ilustra la generación de una relación de área de permitividad basada en partes de frecuencia diferentes de uno de los espectros de la figura 8B.
Las figuras 11 y 12 ilustran ecuaciones ejemplares para determinar una relación de área de permitividad usando datos de las propiedades eléctricas.
Las figuras 13A y 13B son gráficos que ilustran los resultados experimentales obtenidos usando métodos ejemplares de predicción del volumen de células viables obtenido según la tecnología descrita.
La figura 14 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo generalizado para determinar las relaciones entre los datos de las propiedades biológicas y los datos de las propiedades eléctricas de las células.
Las figuras 15A-B ilustran un diagrama de flujo para un ejemplo más detallado de correlación y aplicación de las divergencias de volúmenes de células viables calculados usando una técnica analítica alternativa.
Las figuras 16A-E son gráficos que ilustran los resultados experimentales obtenidos usando métodos ejemplares de predicción del volumen de células viables obtenido según la tecnología descrita.
La figura 17 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo generalizado de un método de crecimiento de células en un medio conductor.
La figura 18 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo generalizado de un método de comparación de las mediciones entre dos poblaciones de células, como se puede usar en ciertas realizaciones de la tecnología descrita. Las figuras 19A-F son gráficos que ilustran diversas mediciones obtenidas a lo largo del tiempo para poblaciones de células, como se puede observar usando el método descrito en la figura 18.
Las figuras 20A y B son gráficos que ilustran diversas mediciones obtenidas a lo largo del tiempo para poblaciones de células, como se puede observar usando el método descrito en la figura 18.
La figura 21 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo generalizado de un método de aplicación de una correlación basado en un método analítico alternativo para generar una predicción usando varias mediciones de permitividad. Las figuras 22A-C son una serie de gráficos que ilustran los cambios en los espectros dieléctricos que se pueden observar en ciertos ejemplos de la tecnología descrita.
La figura 23 ilustra un ejemplo generalizado de un entorno informático adecuado en el que se pueden implementar las realizaciones, técnicas y tecnologías descritas.
Descripción detallada
Esta descripción se expone en el contexto de realizaciones representativas que no pretenden ser limitantes de ninguna manera.
Como se usa en esta solicitud y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una", "el" y “la” incluyen las formas plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, el término "incluye" significa "comprende".
Algunos de los métodos descritos se pueden implementar con instrucciones ejecutables por ordenador almacenadas en uno o más medios de almacenamiento legibles por ordenador (por ejemplo, medios legibles por ordenador no transitorios, tal como uno o más componentes de memoria volátiles (tales como memoria dinámica de acceso aleatorio (DRAM) o memoria estática de acceso aleatorio (SRAM)), o componentes de memoria no volátiles (tales como discos duros) y ejecutados en un ordenador. Cualquiera de las instrucciones ejecutables por ordenador para implementar las técnicas descritas, así como cualquier dato creado y usado durante la implementación de las realizaciones descritas, se puede almacenar en uno o más medios legibles por ordenador (por ejemplo, medios legibles por ordenador no transitorios). Las instrucciones ejecutables por ordenador pueden ser parte de, por ejemplo, una aplicación de software dedicada o una aplicación de software a la que se accede o se descarga a través de un navegador web u otra aplicación de software (tal como una aplicación informática remota). Tal software se puede ejecutar, por ejemplo, en un solo ordenador local (por ejemplo, cualquier ordenador adecuado disponible comercialmente) o en un entorno de red (por ejemplo, a través de Internet, una red de área amplia, una red de área local, una red cliente-servidor (tal como una red informática en la nube) u otra red similar) usando uno o más ordenadores de red.
Para mayor claridad, solo se describen ciertos aspectos seleccionados de las implementaciones basadas en software. Se omiten otros detalles que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, debe entenderse que la tecnología descrita no se limita a ningún lenguaje o programa informático específico. Asimismo, la tecnología descrita no se limita a ningún ordenador o tipo de hardware en particular. Ciertos detalles de ordenadores y hardware adecuados son bien conocidos y no es necesario que se expongan en detalle en esta descripción.
Las teorías de funcionamiento, los principios científicos, u otras descripciones teóricas presentadas en la presente memoria en referencia a los sistemas, métodos y aparatos de esta descripción se han proporcionado con los propósitos de una mejor comprensión y no pretenden ser limitantes en su alcance. Los sistemas, métodos, y aparatos de las reivindicaciones adjuntas no se limitan a aquellos sistemas, métodos y aparatos que funcionan de la manera descrita por tales teorías de funcionamiento.
A menos que se especifique lo contrario, los términos "capacitancia" y "permitividad" se tratan como equivalentes para los propósitos de la presente descripción, por razones que serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica relevante. Además, a menos que se especifique lo contrario, los términos "biomasa viable", "volumen de células viables", "biovolumen", y "fracción de volumen viable" se tratan como equivalentes para los propósitos de la presente descripción, por razones que serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica relevante.
Como se usa en esta solicitud y en las reivindicaciones, el término "magnitud" se refiere a la intensidad, o distancia entre las mesetas de frecuencia baja y alta, de la curva de dispersión beta obtenida cuando se mide una propiedad eléctrica de una muestra de células. Como se usa en esta solicitud y en las reivindicaciones, el término "dependencia de la frecuencia" se refiere a una relación entre la frecuencia de una señal aplicada a una muestra de células para medir una propiedad eléctrica y las mediciones de propiedades eléctricas así obtenidas.
Todas las marcas comerciales usadas en la presente memoria se usan solo con propósitos ilustrativos y son propiedad de sus respectivos propietarios.
Introducción
Los dispositivos para medir las propiedades eléctricas de una población de células se pueden usar para predecir datos de las propiedades biológicas (por ejemplo, características de viabilidad de las células y características de la biomasa tales como volumen de células viables (VCV)) midiendo los cambios en la capacitancia y/o permitividad de un sistema. Estos dispositivos de medición (por ejemplo, sondas de permitividad) pueden escanear a través de diversas frecuencias y crear un espectro dieléctrico. Sin embargo, con algunos tipos de células, se observan divergencias entre la viabilidad predicha basada en la capacitancia y la viabilidad medida por exclusión con azul de tripano (por ejemplo, usando un analizador Cedex).
En un ejemplo de la tecnología descrita, para compensar esta disparidad, los datos de escaneo de frecuencia se recopilan a lo largo del tiempo en un cultivo de células alimentado por lotes (por ejemplo, células mamíferas). Los escaneos de frecuencia se normalizan (por ejemplo, en un intervalo de 0,0 a 1,0) dividiendo los valores de permitividad medidos por el valor máximo de permitividad medido. Se observa una diferencia en las formas relativas de las curvas de dispersión beta (por ejemplo, el espectro dieléctrico que consiste en la permitividad medida en función de la frecuencia) en la región de frecuencia alta durante la fase de viabilidad decreciente de la vida útil del cultivo (la fase donde se observa la divergencia). Esta diferencia de forma en la dispersión beta se puede cuantificar tomando una relación integral de la parte superior de la curva en comparación con la curva completa para una pluralidad de puntos de tiempo.
En una realización, el valor de la relación integral se correlaciona luego con la divergencia observada entre los valores de exclusión con azul tripano y de la capacidad. La correlación observada tiende a ser lineal. Esta correlación se puede usar para corregir las divergencias observadas durante las ejecuciones posteriores, ya que la pendiente y la intersección permanecen relativamente constantes entre las ejecuciones. Así, las realizaciones de la tecnología descrita permiten mediciones precisas de las características de viabilidad de las células (por ejemplo, volumen de células viables) a lo largo de toda la vida útil del cultivo, no solo durante la fase de crecimiento.
Ejemplo de Biorreactor para su Uso en la Predicción de la Viabilidad y la Salud de las Células
La figura 1 es un esquema de un sistema 100 adecuado para el crecimiento de un cultivo de células según algunas realizaciones de la tecnología descrita. La viabilidad de las células de cultivo se puede predecir usando, por ejemplo, cualquiera de los métodos descritos en las figuras 2-9 y descripciones adjuntas.
Como se muestra en la figura 1, un sistema 100 de biorreactor ejemplar para fabricar un bioproducto incluye un biorreactor 105 que tiene un recipiente 110 capaz de proporcionar un entorno aséptico adecuado para contener una población 120 de células que pueden producir el bioproducto. La población 120 de células contiene medios y al menos una especie no disuelta, ya sea como una suspensión o adherida a un sustrato. En algunos ejemplos, la población 120 de células incluye una mezcla de células dispersas en unos medios líquidos (formando una suspensión). El sistema 100 también contiene un sistema de muestreo 130 (por ejemplo, un citómetro de flujo) conectado operativamente al recipiente 110 y capaz de extraer una muestra del recipiente. El sistema 100 también incluye un dispositivo 140 de medición (por ejemplo, una sonda de permitividad, u otro dispositivo de medición adecuado para medir una propiedad eléctrica de la población 120 de células) conectado operativamente al recipiente 110, el dispositivo de medición que está configurado para medir una propiedad eléctrica de la población 120 de células en el recipiente y generar en respuesta una señal correspondiente.
Se proporciona un sistema 150 de control que incluye un entorno 155 informático y, en algunos ejemplos, el sistema de control puede transmitir y recibir datos y/o instrucciones legibles por ordenador desde recursos informáticos en una nube 157 informática. El software 158 para implementar las tecnologías descritas, que incluyen las instrucciones legibles por ordenador, se puede almacenar en un medio de almacenamiento legible por ordenador en el entorno 155 informático y/o la nube 157 informática. El sistema 150 de control puede usar el entorno 155 informático para analizar señales recibidas desde el dispositivo 140 de medición y generar señal(es) de salida capaces de controlar uno o más dispositivos 160-165 de entrada y/o salida que están configurados para medir o alterar las condiciones ambientales dentro del recipiente 110. Por ejemplo, los dispositivos 160-162 se pueden usar para controlar y/o extraer: los medios de alimentación, agua, y soluciones ácidas o básicas, respectivamente. Se puede usar un intercambiador 163 de calor para calentar o enfriar el recipiente 120. Un motor 164 está conectado a un eje 165 impulsor, que se puede usar para agitar la población 120 de células (o para agitar los medios en el biorreactor). En otros ejemplos, se puede usar un impulsor magnético u otro mecanismo de mezcla/agitación adecuado. No todas las conexiones de señal y alimentación entre los dispositivos 160-165 y el sistema 150 de control se representan en la figura 1.
En algunas realizaciones, el bioproducto se selecciona entre alimentos, bebidas, biocombustibles, bioenergía, etanol de base biológica, biodiésel, adhesivos de base biológica, productos bioquímicos, bioterapéuticos, plásticos biodegradables, o mezclas de los mismos. En otras realizaciones, el bioproducto es un bioterapéutico. En otras realizaciones más, el bioproducto es un bioterapéutico seleccionado de productos farmacéuticos, proteínas terapéuticas, fragmentos de proteínas, anticuerpos, vacunas, o mezclas de los mismos.
En algunos ejemplos, el recipiente se selecciona entre fermentadores anaeróbicos, fermentadores aeróbicos, reactores de tanque de mezcla, biorreactores adherentes, biorreactores de tipo onda, y biorreactores desechables.
En algunos ejemplos, la población de células comprende células vivas, células muertas, fragmentos de células, sustratos sólidos que tienen células adheridas a los mismos, partículas, o mezclas de los mismos. Las células vivas pueden incluir bacterias, levaduras, células animales, células de mamíferos, células de e-coli, o mezclas de las mismas. En algunas realizaciones, la población de células incluye células animales. En otras realizaciones, la población de células incluye células de mamífero.
En algunos ejemplos, las propiedades biológicas de la población de células se pueden seleccionar ajustando propiedades a nivel de los medios y/o propiedades a nivel celular. En algunas realizaciones, las propiedades de la población de células que se pueden medir y/o ajustar incluyen volumen de células viables (VCV), volumen de células viables compactadas (PVCV), densidad de células viables (VCD), concentración de células viables (VCC), viabilidad, salud de las células, o mezclas de los mismos. En otras realizaciones, las propiedades de la población de células que se pueden ajustar incluyen pH, oxígeno disuelto, osmolalidad, concentraciones de nutrientes, amoníaco/amonio, lactato/ácido láctico, pCO2, electrolitos (tales como K+, Ca++, y/o Na+), aminoácidos, nicotinamida adenina dinucleótido/nicotinamida adenina dinucleótido en su forma reducida (NAD/NADH), impurezas, pureza, fenotipos, estados metabólicos, ciclo de las células, o mezclas de los mismos.
En algunos ejemplos, los dispositivos de entrada adecuados que se pueden acoplar al sistema 150 de control incluyen sondas de pH, medidores de oxígeno disuelto, electrodos selectivos de iones, dispositivos de osmometría, cromatógrafos de líquidos de alta resolución, cromatógrafos de gases, cromatógrafos de iones, medidores de conductividad, espectroscopios Raman, espectroscopios de infrarrojo cercano, espectroscopios dieléctricos, fluorómetros, espectroscopios de ultravioleta/visible, sondas de capacitancia, medidores de luminiscencia, sondas redox, citómetros de flujo, hemocitómetros, electro-rotadores, sondas de electroforesis, sondas de dielectroforesis, o mezclas de los mismos.
En algunos ejemplos, los dispositivos de salida adecuados que se pueden configurar para alterar al menos una propiedad de la población de células incluyen sistemas de mezcla/agitación, sistemas de control de temperatura, bombas de gas, bombas de nutrientes, sistemas de extracción de productos, sistemas de extracción de impurezas, sistemas de ajuste de pH, o mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones, el sistema 150 de control está configurado para alterar al menos una propiedad de la población de células dentro del recipiente, lo que da como resultado una mejora en al menos uno de rendimiento de bioproducto, pureza de bioproducto, velocidad de producción de bioproducto, coste reducido, consumo de energía reducido, o generación de residuos reducida, en relación con un sistema que se controla manualmente. En algunas realizaciones, un sistema de muestreo aséptico está conectado operativamente al sistema de control.
Los bioproductos se hacen en los biorreactores, que son sistemas que soportan un entorno biológicamente activo. Ejemplos de biorreactores incluyen fermentadores (anaeróbicos o aeróbicos), reactores de tanque de mezcla, biorreactores adherentes, biorreactores de tipo onda, y biorreactores desechables. Un biorreactor puede incluir, por ejemplo, una cámara de fermentación grande para el crecimiento de organismos que se puede usar para producir bioproductos.
Los biorreactores generalmente contienen un compuesto completo que comprende una población de células. Como se usa en la presente memoria, el término "compuesto completo" significa el contenido del biorreactor (o una parte del mismo), que incluye "medios" y especies "no disueltas" o "adheridas". Como se usa en la presente memoria, el término "medios" significa la fase líquida, que incluye todas las sustancias disueltas, tales como nutrientes, sustancias orgánicas disueltas, especies de iones, etc. Como se usa en la presente memoria, el término especie "no disuelta" o "adherida" significa las células vivas, células muertas, fragmentos de células, sustratos sólidos que tienen células adheridas a ellos, u otras partículas presentes en todo el compuesto.
En algunos ejemplos, se pueden producir proteínas bioterapéuticas a partir de células de mamífero modificadas genéticamente dentro de un biorreactor. Tal producción puede ser a partir de líneas celulares de cultivos de células establecidos, tales como, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma murino (NS0). Estas células expresan la proteína de interés y posteriormente la secretan a los medios. En muchos casos, las células de mamíferos se cultivan en un proceso de alimentación por lotes. Sin embargo, debe entenderse que los métodos y sistemas descritos en la presente memoria se pueden aplicar en sistemas de cultivo de células de tipo perfusión u otros sistemas similares.
En algunos casos, los biorreactores se pueden configurar para ajustar o controlar las entradas al biorreactor, que incluyen, por ejemplo, una o más de las siguientes variables de pH, oxígeno disuelto (OD), concentraciones de reactivo/nutriente, temperatura, o agitación. Tales biorreactores pueden incluir reactores de tipo tanque de mezcla, así como biorreactores adherentes, biorreactores de tipo onda o biorreactores desechables.
Los biorreactores normalmente están equipados con un medio para mezclar o agitar la población de células en el biorreactor, que incluye el uso de mezcla mecánica, bombas de circulación, placas deflectoras cambiantes, esquemas de vibración mecánica, agitación ultrasónica, agitadores acústicos, agitadores de burbujas de gas, generadores de vórtices, bombeo por cavitación, o combinaciones de los mismos. Los biorreactores también normalmente están equipados con intercambiadores de calor para mantener o controlar la temperatura en el biorreactor.
Ejemplo de Método de Cálculo de las Divergencias entre Mediciones Obtenidas con Señales de Frecuencia Variable y Mediciones de Calibración
La presente solicitud describe métodos mejorados de uso de la dependencia de la frecuencia de datos de las propiedades eléctricas medidos en dos o más frecuencias para determinar una propiedad biológica de las células con mayor precisión que los métodos de la técnica anterior que se basan solo en mediciones de la magnitud de una propiedad eléctrica.
La figura 2 es un diagrama 200 de flujo que describe un método ejemplar para determinar una relación entre los datos de las propiedades biológicas para una población de células y un valor representativo de los datos de las propiedades eléctricas para una población de células. Según la presente invención, se genera un valor que representa la dependencia de la frecuencia de dichos datos de las propiedades eléctricas.
En el bloque 210 de proceso, se reciben datos de las propiedades eléctricas que representan al menos una propiedad eléctrica de una población de células. Los datos de las propiedades eléctricas se obtienen aplicando una señal eléctrica a las células en más de dos frecuencias de señal.
Los datos de las propiedades eléctricas se obtienen aplicando una señal de frecuencia variable a una población de células con un dispositivo de medición. Las propiedades eléctricas adecuadas que se pueden medir con un dispositivo de medición incluyen capacitancia, permitividad, constante dieléctrica, resistencia, impedancia, voltaje, o corriente.
Por ejemplo, una sonda de permitividad capaz de aplicar varias frecuencias diferentes a una suspensión de células en un biorreactor, tal como la línea Futura de sensores de biomasa y el Monitor 200 de Biomasa (fabricado por Aber Instruments del Reino Unido), y el Sistema de Biomasa Fogale (fabricado por Fogale Nanotech de Francia) se puede usar para medir la permitividad o capacitancia de las células cuando se aplica una señal de frecuencia variable. Alternativamente, los dispositivos de medición adecuados incluyen electrodos externos colocados en el exterior o en el interior del biorreactor y conectados a un generador y receptor de señales adecuados.
Según la presente invención, las mediciones se obtienen aplicando una señal de frecuencia variable (por ejemplo, una onda sinusoidal que tiene una frecuencia variable a través de un intervalo de frecuencia seleccionado, o en dos o más frecuencias seleccionadas) a la población de células mientras se mide una propiedad eléctrica tal como permitividad o capacitancia. Se pueden usar varias frecuencias seleccionadas, por ejemplo, frecuencias entre 50 kHz y 10 MHz. La permitividad medida de la población de células variará dependiendo de la frecuencia de la señal aplicada usada para medir la permitividad. Por ejemplo, la permitividad puede variar desde una medición alta de 4x10-9 Faradios por metro (F/m) en una frecuencia baja de 50 kHz a una medición baja de 1x10-11 F/m en una frecuencia alta de 10 MHz. Como se usa en la presente memoria, los términos "frecuencia baja" y "frecuencia alta" son relativos, y no necesariamente se refieren a una frecuencia baja o alta absoluta.
Después de recibir los datos de las propiedades eléctricas, el método procede al bloque 220 de proceso.
En el bloque 220 de proceso, los datos de las propiedades biológicas para las mediciones observadas en las células se obtienen usando un método analítico alternativo. Los datos de las propiedades biológicas ejemplares incluyen volumen de células viables (VCV), volumen de células viables compactadas (PVCV), densidad de células viables (VCD), concentración de células viables (VCC), viabilidad, salud de las células, nivel de apoptosis, o mezclas de los mismos.
En general, el término "técnicas analíticas alternativas" se refiere a técnicas para obtener mediciones de calibración basadas en el análisis de la biomasa de las células de formas distintas a la medición de al menos una propiedad eléctrica de una población de células aplicando una señal de frecuencia variable a la población de células con una dispositivo de medición. Las técnicas analíticas alternativas adecuadas para realizar tales mediciones de calibración incluyen, pero no se limitan a: recuento usando un hemocitómetro, exclusión con azul de tripano, caspasas para medir la apoptosis de las células, clasificación de células activadas por fluorescencia usando citometría de flujo, u otras técnicas conocidas por un experto en la técnica.
Después de recibir los datos de las propiedades biológicas, el método procede al bloque 230 de proceso.
En el bloque 230 de proceso, se generan valores representativos de los datos de las propiedades eléctricas en función de la frecuencia recibida en el bloque 210 de proceso. Según la presente invención, el valor representativo de los datos de las propiedades eléctricas en función de la frecuencia representa una forma. En una realización, la forma de los datos de las propiedades eléctricas se refiere a la curva obtenida de la representación de los datos de las propiedades eléctricas en función de la frecuencia y, así, representa la dependencia de la frecuencia de las propiedades eléctricas. Un ejemplo es la curva de dispersión beta obtenida representando la permitividad versus la frecuencia. La curva de dispersión beta depende de la frecuencia. Los valores representativos de la forma de los datos de las propiedades eléctricas se generan por la reducción apropiada de datos sobre las frecuencias a las que se miden los datos de las propiedades eléctricas. Para los ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el valor representativo se puede generar ajustando una curva a los datos de las propiedades eléctricas, por análisis multivariante, determinando la pendiente de una línea correspondiente a los datos de las propiedades eléctricas, o determinando una relación de los datos de las propiedades eléctricas medidos a diferentes frecuencias. Según la presente invención, el valor representativo se genera determinando una relación de área bajo la curva derivada de los datos de las propiedades eléctricas. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los valores representativos representan una forma correspondiente al espectro de datos de las propiedades eléctricas tomados sobre dos o más frecuencias de señal en las que se obtuvieron los datos de las propiedades eléctricas respectivos. En dichos ejemplos, los valores representativos representan una relación de área. En dichos ejemplos, el valor representativo de la forma se puede obtener ajustando la curva de dispersión beta a una función matemática tales como una línea, polinomio, expansión de series de Taylor, u otros métodos evidentes para aquellos familiarizados con el ajuste de curvas, ajustando la curva de dispersión beta a un modelo de relevancia física, tales como un modelo Cole-Cole de uno o múltiples términos, modelo Debye, modelo Davidson-Cole, o modelo Havriliak-Negami, que analizan los datos de las propiedades eléctricas usando métodos multivariante (análisis multivariante o de variable latente), u otros métodos que sean capaces de cuantificar la forma de una curva.
Después de generar los valores representativos, el método procede al bloque 240 de proceso.
En el bloque 240 de proceso, se determina una relación entre los datos de las propiedades biológicas y los valores representativos de la forma de los datos de las propiedades eléctricas. En algunas realizaciones, la relación incluye una correlación entre los datos de las propiedades biológicas y la forma de los datos de las propiedades eléctricas, y una correlación de este tipo se puede determinar usando las técnicas descritas para el bloque 230 de proceso. Así, la correlación describe la relación entre la forma de la propiedad eléctrica de las células medida en dos o más frecuencias y las mediciones de datos de las propiedades biológicas, tales como VCV, PVCV, VCD, VCC, viabilidad, salud de las células, o nivel de apoptosis.
En algunos ejemplos de la tecnología descrita, la relación incluye una correlación generada basada en las mediciones de permitividad recibidas en el bloque 210 de proceso y las mediciones de calibración determinadas usando una técnica analítica alternativa.
La relación generada en el bloque 240 de proceso se puede aplicar para generar una o más mediciones corregidas basadas en los datos de las propiedades eléctricas recibidos en el bloque 210 de proceso. Por ejemplo, si la relación incluye una correlación en forma de una ecuación de intersección de pendiente, la ecuación se puede usar para calcular mediciones corregidas basadas en los datos de las propiedades eléctricas. La correlación generada (entre los datos de las propiedades eléctricas y los datos de las propiedades biológicas) se puede aplicar a futuras mediciones de propiedades eléctricas para predecir los valores de las propiedades biológicas.
Determinar una Relación usando Datos de las Propiedades Eléctricas de Dos Frecuencias
En un ejemplo fuera del alcance de la presente invención, el método de la invención puede utilizar datos de las propiedades eléctricas obtenidos aplicando una señal a las células en dos frecuencias. La figura 3 es un gráfico 300 que indica una dependencia de la frecuencia de los datos de las propiedades eléctricas con respecto a la frecuencia ilustrando un gráfico de viabilidad las células versus una relación de permitividad cuando se usa una frecuencia alta de 6,451 MHz y una frecuencia baja de 1,391 MHz. Los datos se dan en la Tabla 1.
Tabla 1
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La viabilidad de las células se puede determinar usando la exclusión con colorante azul de tripano medida por un citómetro de flujo.
El valor representativo de los datos de las propiedades eléctricas se puede determinar tomando una relación de la permitividad medida en la frecuencia alta en relación con la permitividad medida en la frecuencia baja.
La relación entre el valor representativo de los datos de las propiedades eléctricas (o la forma de la curva de dispersión beta) y los datos de las propiedades biológicas (en este caso, la viabilidad de las células) se puede determinar formando una relación lineal entre la relación de permitividad y la viabilidad de las células, como se muestra por la ecuación mostrada en la figura 3. Esta nueva correlación se puede usar para predecir datos de las propiedades biológicas (por ejemplo, viabilidad de las células) en pruebas posteriores.
Ejemplo de Utilización de las Mediciones tanto de la Forma como de la Magnitud de la Dispersión Beta para Obtener una Mejor Predicción del Volumen de Células Viables.
La figura 4 describe un método de combinación de las mediciones tanto de la magnitud como de la forma de la curva de dispersión beta medida a partir de un experimento de calibración para lograr una predicción más precisa de la biomasa viable en comparación con el uso de solo la magnitud. En términos generales, el parámetro de magnitud se correlaciona primero con la biomasa, un modelo se ajusta a esa correlación, y el parámetro de forma se usa posteriormente para describir la divergencia (o distancia) de cada medición del modelo de magnitud.
En el bloque 410 de proceso, los datos de las propiedades eléctricas se obtienen aplicando una señal a las células en un biorreactor en múltiples frecuencias. Estos datos de las propiedades eléctricas se obtienen a través de la curva de dispersión beta tal como para permitir la medición tanto de la forma como de la magnitud (incremento dieléctrico como se describió anteriormente).
En el bloque 420 de proceso, se cuantifica la magnitud de la dispersión beta. Los métodos para cuantificar la magnitud de la dispersión beta incluyen medición de permitividad en una sola frecuencia en la curva de dispersión beta, la medición de la diferencia entre las mesetas de frecuencia baja y alta de la dispersión beta, o cualquier otro método adecuado para cuantificar la magnitud de la curva de dispersión beta.
En el bloque 425 de proceso, se cuantifica la forma de la curva de dispersión beta.
En el bloque 430 de proceso, la magnitud de la dispersión beta está en relación con los datos de las propiedades biológicas obtenidos usando técnicas analíticas alternativas, tales como las descritas anteriormente, y otras técnicas fácilmente determinables para los expertos en la técnica relevante.
En el bloque 440 de proceso, se determina una relación entre la magnitud de la dispersión beta y los datos de las propiedades biológicas. La relación entre la magnitud de la curva de dispersión beta y los datos de las propiedades biológicas se puede determinar como sigue: una relación lineal durante todo o una parte del ciclo de vida de las células, una relación lineal durante la fase de crecimiento de las células, u otros métodos fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.
La relación entre la magnitud de la curva de dispersión beta y los datos de las propiedades biológicas es un modelo lineal que se ajusta a los datos de las propiedades biológicas durante la fase de crecimiento. En el bloque 450 de proceso, se determina la divergencia entre la relación desarrollada en el bloque 440 y los datos de las propiedades biológicas. En este ejemplo, la divergencia se calcula por la diferencia entre los datos de las propiedades biológicas medidos por una técnica analítica alternativa y los datos de las propiedades biológicas predichos usando la relación lineal determinada durante la fase de crecimiento de las células.
En el bloque 460 de proceso, la forma de la curva de dispersión beta del bloque 425 se combina con la divergencia en el bloque 450 para desarrollar una nueva relación para predecir los datos de las propiedades biológicas.
En el bloque 470 de proceso, la nueva relación desarrollada a partir del bloque 460 se usa para desarrollar una nueva correlación para predecir datos de las propiedades biológicas en pruebas posteriores (por ejemplo, una nueva población de células). Se pueden usar estas correlaciones (una que relaciona la magnitud de la dispersión beta con los datos de las propiedades biológicas, la otra que relaciona la forma de la dispersión beta con la divergencia de la primera correlación) en mediciones posteriores de la dispersión beta obtenida a partir de las células para obtener una mejor predicción de datos de las propiedades biológicas a partir del estado actual de la técnica.
Por lo tanto, la predicción resultante del volumen de células viables se puede expresar en forma de la siguiente ecuación:
Figure imgf000010_0001
Donde VCV son los datos de las propiedades biológicas predichos (en este caso, volumen de células viables), a es una constante de proporcionalidad ajustada a los datos, C es un valor que cuantifica la magnitud de la curva de dispersión beta, p es una constante de ajuste de proporcionalidad para los datos, SF es un valor que cuantifica la forma de la curva de dispersión beta, y k es un valor de desviación (que puede pasarse por alto en muchos casos). Se pueden usar otras combinaciones de C y SF además de esta combinación lineal simple, que son fácilmente determinables por los expertos en la técnica relevante.
Ejemplo de Corrección de la Permitividad Medida en una Sola Frecuencia Correlacionando la Respuesta de la permitividad sobre Múltiples Frecuencias con las Propiedades Biológicas Medidas
La figura 5 es un diagrama 500 de flujo que describe un método ejemplar de recepción de mediciones obtenidas aplicando una señal de frecuencia variable a una población de células con un dispositivo de medición, que calcula las divergencias entre las mediciones de propiedades eléctricas recibidas y varias mediciones de calibración, y que determina una relación o correlación entre la respuesta de permitividad en función de la señal de frecuencia variable y la divergencia para generar una predicción más precisa de un volumen de células viables para la población, como se puede usar en ciertas realizaciones de la tecnología descrita.
En el bloque 510 de proceso, se reciben datos que representan varias mediciones de una propiedad eléctrica de una población de células. Las mediciones se pueden obtener aplicando una señal de frecuencia variable (por ejemplo, una onda sinusoidal que tiene una frecuencia variable a través de un intervalo de frecuencia seleccionado, o en dos o más frecuencias seleccionadas) a la población de células mientras se mide una propiedad eléctrica tal como permitividad o capacitancia. Se pueden usar varias frecuencias seleccionadas, por ejemplo, frecuencias entre 50 kHz y 10 MHz. La permitividad medida de la población de células variará dependiendo de la frecuencia de la señal aplicada usada para medir la permitividad. Por ejemplo, la permitividad puede variar desde una medida alta de 4x 10-9 Faradios por metro (F/m) en una frecuencia baja de 50 kHz a una medición baja de 1x10-11 F/m en una frecuencia alta de 10 MHz. Como se usa la presente memoria, los términos "frecuencia baja" y "frecuencia alta" son relativos, y no necesariamente se refieren a una frecuencia baja o alta absoluta. De esta forma, se pueden obtener datos de las propiedades eléctricas en función de la frecuencia. Por ejemplo, se puede medir la respuesta de permitividad en función de la frecuencia, tal como la curva de dispersión beta.
Las células pueden ser células de mamífero (por ejemplo, de las líneas celulares CHO o NS0) suspendidas en una solución de nutrientes.
Los datos recopilados en el bloque 510 de proceso se pueden recopilar a lo largo de un período del orden de segundos, minutos, horas, o días, según se adapte a las especies de células en la población y las condiciones de ambientales.
Con ciertas células, el volumen de células viables (VCV) predicho de la población medido por el Monitor 200 de Biomasa de Aber, que determina el VCV basado en la correlación lineal entre una medición de la magnitud de la dispersión beta y las mediciones reales del VCV comenzará a divergir del VCV real medido por exclusión con azul de tripano a lo largo del ciclo de vida de la población, como se ilustra en el gráfico 600 de la figura 6A. La figura 6A ilustra el volumen de células viables medido usando la sonda de la técnica anterior y por Cedex, un dispositivo de recuento de las células automático que usa la exclusión con azul de tripano para determinar el VCV por análisis de imagen. Como se muestra, la predicción del VCV de la sonda de permitividad se indica por puntos de muestra cuadrados (por ejemplo, los puntos 601 y 602), y el VCV medido por exclusión con azul de tripano se indica por una línea 605. Una vez que han sido recopilados los datos de las mediciones usando la técnica analítica alternativa (en este caso, el método de exclusión con azul de tripano), el método procede al bloque 520 de proceso.
En el bloque 520 de proceso, se calcula una calibración (en otras palabras, una relación) entre los datos de las propiedades eléctricas en función de la frecuencia recopilada en el bloque 510 de proceso y las mediciones determinadas usando una técnica analítica alternativa, en este caso el método de exclusión con azul de tripano. Ciertas poblaciones de células presentan una respuesta de permitividad diferente para volúmenes de biomasa similares dependiendo de la etapa del ciclo de vida de las células. Así, la respuesta de permitividad en función de la frecuencia, o la curva de dispersión beta, se puede usar para identificar la etapa del ciclo de vida de la célula. Por ejemplo, algunas poblaciones de células presentan diferentes respuestas de permitividad antes y después de que se haya logrado el crecimiento máximo.
En general, el término "técnicas analíticas alternativas" se refiere a técnicas para obtener mediciones de calibración basadas en el análisis de la biomasa de las células de formas distintas a la medición de al menos una propiedad eléctrica de una población de células aplicando una señal de frecuencia variable a la población de células con un dispositivo de medición. Las técnicas analíticas alternativas adecuadas para realizar tales mediciones de calibración incluyen, pero no se limitan a: recuento usando un hemocitómetro, exclusión con azul tripano, caspasas para medir la apoptosis de las células, clasificación de células activadas por fluorescencia usando citometría de flujo, u otras técnicas conocidas por un experto en la técnica.
Comparando las diferencias en la respuesta de permitividad (en función de la frecuencia) medida por un dispositivo de medición eléctrico aplicando una señal de frecuencia variable, con una medición del volumen de biomasa generado por una técnica analítica alternativa, se puede calcular una calibración (o relación) entre la respuesta de permitividad y el volumen de biomasa real. La figura 6B ilustra que el mismo volumen de células viables generará diferentes valores de permitividad en una sola frecuencia dependiendo de la etapa del ciclo de vida de las células. En la figura 6B, la permitividad medida en una sola frecuencia se representa frente al volumen de células viables. La figura 6B muestra las divergencias observadas entre las permitividades medidas en una sola frecuencia por la sonda de la técnica anterior durante la fase de crecimiento de un cultivo (indicada por una primera parte 612 de una serie de datos), y las permitividades medidas durante las fases de viabilidad estacionaria y decreciente (indicadas por una segunda parte 614 de una serie de datos), después de que se haya logrado el volumen máximo de biomasa (aquí, después del VCV máximo). Una divergencia de este tipo normalmente es causada por cambios en la estructura de la pared de las células a medida que disminuye la salud de las células en el cultivo.
Se puede determinar una calibración o relación usando la respuesta de permitividad en función de la frecuencia para mejorar la precisión de las mediciones futuras del volumen de células viables usando los datos de las propiedades eléctricas. Pasando a la etapa 530 de la figura 5, esto se logra caracterizando la dependencia de la frecuencia de la respuesta de permitividad medida generando un valor que es representativo de la forma de la curva de dispersión beta. Luego se determina una relación entre la dependencia de la frecuencia de la respuesta de permitividad (es decir, el valor representativo de la forma de la curva de dispersión beta) y el volumen de células medido usando el método analítico alternativo, en este caso el método de exclusión con azul de tripano medido por Cedex. En particular, la relación se determina correlacionando el valor representativo de la forma de la curva de dispersión beta con la divergencia observada entre la magnitud de la permitividad medida en una sola frecuencia y el volumen de células viables medido usando el método analítico alternativo, en este caso el método de exclusión con azul de tripano medido por Cedex. Esta relación permite la corrección de la divergencia observada entre el volumen de células viables según lo predicho por la sonda de permitividad de la técnica anterior medida en una sola frecuencia y el volumen de células viables medido usando exclusión con azul tripano en futuras mediciones del volumen de células viables usando solo mediciones de permitividad. La calibración determinada en el bloque 530 de proceso se puede usar luego para medir las propiedades de las células en otras poblaciones de células.
Ejemplo de Método de Correlación de Mediciones con Mediciones de Calibración Alternativas
La figura 7 es un diagrama 700 de flujo que describe un método ejemplar para correlacionar una relación de área basada en mediciones de permitividad obtenidas usando una sonda de permitividad con mediciones obtenidas usando una técnica analítica alternativa, como se puede usar en ciertas realizaciones de la tecnología descrita.
En el bloque 710 de proceso, se reciben varias mediciones de permitividad £ que se obtienen aplicando una señal de frecuencia variable a una población de células usando un dispositivo de medición adecuado. Por ejemplo, se puede usar una sonda de permitividad capaz de la aplicación de varias frecuencias diferentes a una suspensión de células en un biorreactor, tales como la línea Futura de sensores de biomasa y el Monitor 200 de Biomasa (fabricado por Aber Instruments del Reino Unido), y el Sistema de Biomasa de Fogale (fabricado por Fogale Nanotech de Francia). Alternativamente, los dispositivos de medición adecuados incluyen electrodos externos colocados en el exterior o en el interior del biorreactor y conectados a un generador y receptor de señales adecuados. Se pueden emplear frecuencias y técnicas adecuadas para la aplicación de una señal de frecuencia variable a una población de células como se describió anteriormente con respecto al bloque 710 de proceso. En el gráfico 800 de la figura 8A se muestra un ejemplo de varias mediciones de permitividad obtenidas aplicando una señal de frecuencia variable usando una sonda de permitividad. Como se muestra, se muestran cuatro series de datos correspondientes a mediciones hechas en cuatro períodos de tiempo diferentes (aquí, en los días 3, 6, 8, y 11 del ciclo de vida de una población de células). Como se muestra, la permitividad medida generalmente disminuye a medida que aumenta la frecuencia de la señal de muestreo, pero cada serie de datos presenta una forma diferente. Es decir, la respuesta de permitividad observada en función de la frecuencia es diferente para cada una de las diferentes series de datos de las propiedades eléctricas tomadas en los diferentes puntos de tiempo.
Las mediciones de permitividad £ a través de todos los espectros de frecuencia se puede normalizar a un intervalo de 0,0 a 1,0 usando la ecuación mostrada en la figura 9. Así, cada medición de permitividad £ se normaliza dividiendo por la permitividad máxima medida £max para que un conjunto de mediciones produzca una permitividad normalizada £n. La permitividad normalizada £n se usará para determinar las relaciones de área Ra, como se describe a continuación con respecto a los bloques 730-750 de proceso. Un ejemplo de cuatro series de datos de las mediciones de permitividad normalizadas £n se muestran en el gráfico 850 de la figura 8B. Como se muestra, cada una de las cuatro series de datos se ha corregido para que varíe entre 0,0 y 1,0 (por ejemplo, la serie 870 de datos normalizada corresponde a la serie 820 de datos de la figura 8A). La serie 820 de datos se midió a las 66 horas en el ciclo de vida del cultivo de células. En otros ejemplos, las mediciones de permitividad no se normalizan.
Después de obtener varias mediciones de permitividad y (opcionalmente) normalizar las mediciones de permitividad, el método procede al bloque 720 de proceso.
En el bloque 720 de proceso, se calcula una divergencia entre las mediciones de permitividad obtenidas en el bloque 710 de proceso y las mediciones de calibración determinadas usando una técnica analítica alternativa de manera similar a las descritas anteriormente con respecto al bloque 520 de proceso. Por ejemplo, la divergencia entre la magnitud de la permitividad medida en una sola frecuencia y la propiedad biológica medida usando la técnica analítica alternativa (en este caso, el volumen de células viables) se calcula para cada uno de los puntos de tiempo medidos. Después que se ha calculado la divergencia, el método procede al bloque 730 de proceso.
En los bloques 730 a 750 de proceso, se calcula un valor representativo de la respuesta de permitividad en función de la frecuencia, o forma de los datos de las propiedades eléctricas, usando relaciones de área bajo las curvas de permitividad versus frecuencia. En el bloque 730 de proceso una primera área a1 se determina integrando varias mediciones de permitividad (o muestras) tomadas entre una frecuencia baja fL seleccionada y una frecuencia alta fH seleccionada. En algunos ejemplos, las frecuencias más altas y más bajas son las frecuencias más altas y más bajas aplicadas a la población de células cuando se miden permitividades. En otros ejemplos, se usan otras frecuencias altas y bajas como frecuencias seleccionadas. En algunos ejemplos, las mediciones de permitividad se normalizan, como se analizó anteriormente con respecto al bloque 710 de proceso. La primera área a1 se puede calcular usando cualquier técnica adecuada, que incluye la interpolación polinomial en cuadratura, la interpolación en cuadratura adaptativa, la extrapolación, y/o el análisis de Monte Carlo. Después de calcular la primera área a1, el método procede al bloque 740 de proceso. Por ejemplo, el gráfico 1000 de la figura 10 muestra esta primera área a1 como primera serie 1020 de datos normalizada para el intervalo fL a fH.
En el bloque 740 de proceso, una segunda área a2 se determina integrando varias mediciones de permitividad (o muestras) tomadas entre una frecuencia seleccionada fQ y ya sea la frecuencia baja fL o la frecuencia alta fH usadas para calcular la primera área a1 en el bloque 730 de proceso. La frecuencia fQ se selecciona para estar entre fL y fH. En algunos ejemplos, la frecuencia seleccionada está predeterminada en una frecuencia fija (por ejemplo, 808,5 kHz) o como una proporción de la frecuencia (por ejemplo, fQ se selecciona para incluir las tres cuartas partes superiores del intervalo de frecuencia entre fL y fH). En otros ejemplos, la frecuencia fQ se selecciona basada, al menos en parte, en las muestras de permitividad usando un análisis de sensibilidad. Por ejemplo, si la forma de una curva de las muestras de permitividad incluye un "codo", o un cambio brusco en la permitividad medida en función de la frecuencia (específicamente en este caso, un punto de inflexión), se usa el punto de frecuencia en el codo como la frecuencia seleccionada fQ como una región apropiada para corregir las células enfermas en la población. En otros ejemplos, se usa un punto de inflexión a lo largo de la curva de las muestras de permitividad como frecuencia seleccionada fQ. En otros ejemplos, la frecuencia fQ se selecciona basada en los datos de permitividad medidos anteriormente. La integración del área debajo de la curva formada por las muestras de permitividad se puede realizar de una manera similar a la descrita con respecto al bloque 740 de proceso. Por ejemplo, el gráfico 1000 de la figura 10 representa esta segunda área a2 para la primera serie 1020 de datos normalizada para el intervalo fQ a fH. Como se muestra en la figura 10, la primera área ai comprende toda el área de la segunda área a2, así como un área adicional a la izquierda de fQ. Después de calcular la segunda área a2, el método procede al bloque 750 de proceso.
En el bloque 750 de proceso, se calcula una relación de área Ra. La relación de área Ra es un valor que es representativo de la forma de las curvas de permitividad versus frecuencia mostradas en la figura 10. Por ejemplo, la segunda área a2 dividida por la primera área a1 se usa como la relación de área Ra. Una ecuación de ejemplo para calcular la relación de área Ra para una integral entre una frecuencia seleccionada fQ y una frecuencia alta fH se muestra en la figura 11. Un ejemplo de ecuación para calcular la relación de área Ra para una integral entre una frecuencia baja fL y una frecuencia seleccionada fQ se muestra en la figura 12. Se pueden usar otros cálculos de relación de área. Una relación de área Ra se puede calcular para cada conjunto de mediciones de permitividad obtenidas en un punto de tiempo en particular. Por ejemplo, los datos para las mediciones de permitividad se pueden obtener cada 12 horas para una población de células a lo largo de un período de 10 días, y se calcula una relación de área Ra correspondiente para cada conjunto de mediciones de permitividad de barrido de frecuencia. Después de que se calculan varias relaciones de área Ra, el método procede al bloque 760 de proceso.
En el bloque 760 de proceso, varias relaciones de área RA calculadas en el bloque 750 de proceso se correlacionan con las mediciones de calibración determinadas usando la técnica analítica alternativa en el bloque 720 de proceso. Por ejemplo, el volumen de células viables (VCV), medido usando un contador de células automatizado (por ejemplo, un analizador Cedex), se puede usar para contar automáticamente las células para determinar el VCV usando la exclusión con azul de tripano. Como entenderá fácilmente un experto en la técnica, se puede usar cualquiera de varias técnicas analíticas alternativas adecuadas. Además, las mediciones de calibración no se limitan al VCV, sino en algunos ejemplos pueden incluir otras propiedades de la biomasa tal como volumen de células viables compactadas (PVCV), densidad de células viables (VCD), concentración de células viables (VCC), viabilidad, salud de las células, nivel de apoptosis, u otras mediciones adecuadas. La correlación se puede calcular usando una técnica adecuada, que incluye los métodos de correlación lineal (por ejemplo, usando correlación lineal de Pearson), correlación no lineal (por ejemplo, usando correlación de rango de Spearman), o técnicas de correlación matricial. Así, en algunos ejemplos, se calcula una correlación en forma de intersección de pendiente, mientras que en otros ejemplos, se usan correlaciones más complejas. Las correlaciones así calculadas se pueden usar para corregir las divergencias observadas en otros cultivos de células usando mediciones de permitividad, o mediciones de otras propiedades eléctricas adecuadas. Es decir, el volumen de células viables predicho usando la magnitud de la permitividad medida a la frecuencia fC se puede corregir usando la correlación entre la relación de área y la divergencia para corregir el volumen de células viables predicho usando solo la magnitud de la permitividad medida.
La figura 13A incluye un gráfico 1360 que ilustra varias mediciones y cálculos a lo largo de un tiempo de cultivo de 250 horas basado en la realización del método ejemplar de la figura 7. Como se muestra, una línea 1361 indica las relaciones de área calculadas para las tres cuartas partes superiores de las frecuencias (como se muestra, por encima de 808,5 kHz). Varios puntos de la muestra (por ejemplo, los puntos 1362 y 1363 de la muestra) indican la viabilidad de las células (medido usando un analizador Cedex). Una línea 1364 indica la viabilidad predicha calculada usando relaciones de área basadas en frecuencias por encima de 808,5 kHz que usan el método descrito en la figura 7.
La figura 13B incluye un gráfico 1370 que representa una correlación 1371 correspondiente generada entre las relaciones de área para las tres cuartas partes superiores de las frecuencias (como se muestra, las relaciones de área calculadas para frecuencias por encima de 808,5 kHz) y el porcentaje de viabilidad de las células (medido con un analizador Cedex). Así, como se muestra, los valores representativos de la forma de los datos de las propiedades eléctricas (las relaciones de área bajo las curvas de permitividad versus frecuencia) se pueden correlacionar con la propiedad biológica (porcentaje de viabilidad) medida usando una técnica analítica alternativa. Las mediciones de propiedades eléctricas hechas usando un dispositivo de medición de barrido de frecuencia se pueden usar para formar un ajuste a los datos de las propiedades biológicas obtenidos usando técnicas analíticas alternativas, y la correlación resultante se puede usar en mediciones posteriores para obtener predicciones más precisas de la propiedad biológica.
Ejemplo de Método de Predicción del Volumen de Células Viables Usando Correlación de Relación de Área
La figura 14 es un diagrama 1400 de flujo que ilustra un ejemplo de recepción de un primer conjunto de mediciones de propiedades eléctricas para una población de células y la aplicación de una correlación al primer conjunto de mediciones para generar una predicción de la viabilidad de las células, como se puede usar en algunos ejemplos de la tecnología descrita.
En el bloque 1410 de proceso, se recibe un primer conjunto de mediciones (o muestras) de propiedades eléctricas, las mediciones que se obtienen aplicando una señal de frecuencia variable a una primera población de células con un dispositivo de medición. Por ejemplo, se puede usar una sonda de permitividad para medir la permitividad o capacitancia de la primera población cuando se aplica una señal de frecuencia variable usando técnicas similares a las descritas anteriormente con respecto al bloque 510 de proceso. Las propiedades eléctricas adecuadas que se pueden medir con un dispositivo de medición incluyen capacitancia, permitividad, constante dieléctrica, resistencia, impedancia, voltaje, o corriente. Después de obtener el primer conjunto de mediciones, el método procede al bloque 1420 de proceso.
En el bloque 1420 de proceso, se recibe una correlación basada en un segundo conjunto de mediciones de propiedades eléctricas para un segundo conjunto de células. Por ejemplo, la correlación se puede determinar usando las técnicas descritas anteriormente con respecto a la figura 7. Así, la correlación recibida describe la relación entre una propiedad eléctrica de la población de células y las mediciones de la biomasa de las células, tales como VCV, PVCV, VCD, VCC, viabilidad, salud de las células, o nivel de apoptosis. Después de que se recibe la correlación, el método procede al bloque 1430 de proceso.
En el bloque 1430 de proceso, la correlación recibida en el bloque 1420 de proceso se aplica para generar una o más mediciones corregidas basadas en el primer conjunto de mediciones recibidas en el bloque 1410 de proceso. Por ejemplo, si la correlación está en forma de una ecuación de intersección de pendiente, la ecuación se puede usar para calcular mediciones corregidas basadas en permitividades normalizadas basadas en el primer conjunto de mediciones de propiedades eléctricas. Así, se puede obtener una medición más precisa del estado de la célula en la primera población, sin el uso de la(s) técnica(s) analíticas alternativas usadas para producir la correlación.
Ejemplo Más Detallado de Predicción del Volumen de Células Viables
Las figuras 15A-15B ilustran un diagrama 1500 de flujo que describe otro ejemplo, más detallado, de predicción de la divergencia de las propiedades eléctricas para una población de células para corregir las predicciones de viabilidad de las células, como se puede usar con ciertos ejemplos de la tecnología descrita. En las figuras 6A y 6B, las figuras 8A y 8B, la figura 10, las figuras 13A y 13B y las figuras 16A-E se muestran los gráficos que representan los datos asociados con un ejemplo de población de células analizadas usando el método representado en el diagrama 1500 de flujo. Sin embargo, estos gráficos no se limitan a este método de ejemplo, y también se pueden usar para ilustrar otras realizaciones de la tecnología descrita.
En el bloque 1510 de proceso, se mide la permitividad de una primera población de células en una o más frecuencias seleccionadas a lo largo de un período de tiempo. Por ejemplo, se puede usar una sonda de permitividad para medir la capacitancia en múltiples frecuencias a lo largo del ciclo de vida de una población de células de mamíferos, de una manera similar a la descrita anteriormente con respecto al bloque 210 de proceso. En otros ejemplos, una capacitancia, u otras propiedades eléctricas, de una población de células se puede medir en una o más frecuencias seleccionadas a lo largo de un período de tiempo.
En el bloque 1511 de proceso, se miden fuera de línea varias mediciones de volumen de células viables para una segunda población de células a lo largo de un período de tiempo usando un método analítico alternativo. Por ejemplo, una población similar de células de la misma especie medida en el bloque 1510 de proceso se puede medir usando exclusión con azul tripano u otros métodos mencionados anteriormente. No es necesario que las mediciones hechas en los bloques 1510 y 1511 de proceso ocurran durante el mismo período de tiempo. Por ejemplo, las mediciones de volumen de células viables se pueden realizar semanas o meses antes de las mediciones de capacitancia hechas en el bloque 1510 de proceso. Después de medir las capacitancias y los volúmenes de las células viables en el bloque 1510 y 1511 de proceso, el método procede al bloque 1520 de proceso.
En el bloque 1520 de proceso, se reciben (por ejemplo, en un entorno informático adecuado) los datos de permitividad (por ejemplo, basados en la capacitancia medida en el bloque 1510 de proceso). Los valores de capacitancia medidos en el bloque 1510 de proceso se pueden expresar como capacitancia, permitividad, u otra propiedad eléctrica adecuada. Los datos de permitividad se pueden normalizar antes de ser recibidos, o recibidos en valores absolutos o relativos y normalizados usando el entorno informático. Después de recibir los datos de permitividad, el método procede al bloque 1530 de proceso.
En el bloque 1530 de proceso, los datos de permitividad recibidos basados en las capacitancias medidas del bloque 1510 de proceso se comparan con los datos de volumen de células viables medidos en el bloque 1511 de proceso. Como se muestra en la figura 16A, se puede representar un gráfico 1650 de las permitividades en una sola frecuencia (expresadas en pF por cm) a lo largo de un eje y versus volúmenes de las células viables (expresados en pL por mL) a lo largo de un eje x, donde los volúmenes de las células viables se miden usando el método analítico alternativo en el bloque 1511 de proceso. Como se muestra, una parte 1651 inferior de las permitividades representadas en el gráfico representa las mediciones tomadas durante la fase de crecimiento de la población de células, mientras que la parte 1652 superior representa mediciones tomadas después de la fase de crecimiento. Así, la figura 16A representa una clara divergencia de permitividad versus volumen de células viables basado en del ciclo de vida de las células en la población.
En el bloque 1532 de proceso, se seleccionan uno o más puntos "sanos" en el gráfico de permitividad para desarrollar una correlación lineal versus capacitancia. Los puntos sanos se seleccionan como los puntos que corresponden a la fase de crecimiento del cultivo. Los puntos sanos se pueden seleccionar de varias formas. Por ejemplo, una persona puede analizar los datos y seleccionar los puntos sanos. Alternativamente, los puntos sanos se pueden detectar comparando permitividades medidas anteriormente. Por ejemplo, cuando la permitividad comienza a caer, se determina que la fase de crecimiento ha pasado, y solo se consideran las muestras de permitividad anteriores. En otros ejemplos, los puntos sanos se pueden determinar basados en cuándo comienzan a disminuir las mediciones del volumen de células viables del bloque 1511 de proceso. Como se muestra en la figura 16C, se ha determinado que un punto 1681 de datos en la parte inferior de la serie de datos es un punto sano durante la fase de crecimiento, mientras que otro punto 1682 de datos de la serie de datos se ha determinado que es una medición tomada después de que se ha logrado el volumen máximo de las células viables en la primera población de células. Después de que se genera una correlación lineal para los puntos sanos (representados en la figura 16C como una línea 1683), el método procede al bloque 1534 de proceso.
En el bloque 1534 de proceso, se calcula la divergencia (por ejemplo, las divergencias indicadas por las flechas 1685, 1686, y 1687 en la figura 16C) de cada medición a partir de la correlación lineal generada en el bloque 1532 de proceso. En algunos ejemplos, las divergencias se pueden filtrar para seleccionar puntos no sanos, manteniendo solo las divergencias por encima de un cierto umbral absoluto o porcentual. En otros ejemplos, todas las divergencias se guardan para una correlación posterior. Después de calcular las divergencias de una o más muestras a partir de la correlación lineal, el método procede al bloque 1540 de proceso.
En el bloque 1540 de proceso, las divergencias calculadas en el bloque 1534 de proceso se correlacionan con una relación de área para producir una correlación para su uso con análisis posteriores de poblaciones de células. Es decir, las divergencias se correlacionan con un valor representativo de la forma de la curva de dispersión beta correspondiente al punto de tiempo respectivo en el que se midió la permitividad. Por ejemplo, las relaciones de área se pueden calcular de una manera similar a las relaciones de área discutidas anteriormente con respecto a la figura 7. Se muestra en el gráfico 1690 de la figura 16D un ejemplo de una correlación entre las relaciones de área en las tres cuartas partes superiores del espectro de frecuencia usado para medir la población de células, y las divergencias calculadas en el bloque 1534 de proceso. Como se muestra, las divergencias presentan una correlación casi lineal (representada por una línea 1691) con las relaciones de área seleccionadas. Así, se establece una relación entre las relaciones de área, o valor representativo de la forma de los datos de permitividad versus frecuencia, y los datos de las propiedades biológicas medidos por la técnica analítica alternativa, en este caso basado en las divergencias entre los datos de las propiedades biológicas medidos por la técnica analítica alternativa y la permitividad medida en una sola frecuencia.
Esta correlación entre las relaciones de área y la divergencia entre la magnitud de los datos de permitividad y el volumen de células viables real se puede usar para ejecuciones posteriores para células similares para corregir el volumen de células viables predicho solo por los valores de permitividad, especialmente después de las fases de crecimiento, donde se observan mayores divergencias entre el volumen de células viables predicho por la magnitud de la permitividad y el volumen de células viables real medido por el método de exclusión con azul tripano. La correlación se puede almacenar en unos medios de almacenamiento legibles por ordenador para su uso, por ejemplo, en un entorno informático acoplado a un sistema de control de biorreactores, o, alternativamente, la correlación se puede almacenar en medios de almacenamiento legibles por ordenador en una nube informática, por ejemplo, en un sitio web alojado por un fabricante de sondas o un proveedor de líneas celulares.
La figura 15B ilustra una técnica adicional que se puede realizar una vez que se ha generado la correlación en el bloque 1540 de proceso. Las técnicas asociadas con los bloques 1570-1580 de proceso se pueden realizar por una entidad diferente a la que realiza el método asociado con los bloques 1510-1540 de proceso, o por la misma entidad.
En el bloque 1570 de proceso, las capacitancias (o, alternativamente, las permitividades) para una segunda población de células se miden en dos o más frecuencias seleccionadas a lo largo de varios períodos de tiempo. Por ejemplo, se puede usar una sonda de permitividad para medir la capacitancia en múltiples frecuencias a lo largo del ciclo de vida de una población de células de mamíferos, de manera similar a la descrita anteriormente con respecto al bloque 510 de proceso. En algunos ejemplos, las frecuencias seleccionadas y/o los períodos de tiempo son los mismos que los usados para las mediciones hechas en el bloque 1510 de proceso, mientras que en otros ejemplos, las frecuencias y/o períodos de tiempo seleccionados son diferentes.
En el bloque 1571 de proceso, se mide una permitividad en una sola frecuencia seleccionada para la segunda población de células (que es indicativa de la magnitud de la dispersión beta). El volumen de células viables predicho por esta medición de permitividad se corrige basado en las permitividades medidas usando la señal de frecuencia variable en el bloque 1570 de proceso. El cambio en la forma de la permitividad versus la curva de frecuencia indica un tiempo donde la relación de la permitividad a volumen de células viables comienza a divergir. Una vez que se han medido las permitividades en los bloques 1570 y 1571 de proceso, el método procede al bloque 1580 de proceso.
En el bloque 1580 de proceso, la correlación generada en el bloque 1540 de proceso se aplica para calcular una divergencia de las mediciones hechas en los bloques 1570 y/o 1571 de proceso a partir de la correlación. Así, usando esta correlación, se puede corregir la predicción del volumen de células viables basada en las mediciones de permitividad hechas en los bloques de proceso 1570 y/o 1571, sin el uso de métodos analíticos alternativos.
Una vez que se han calculado las divergencias, se pueden predecir los atributos de la segunda población de células, tales como el volumen de células viables (VCV), el volumen de células viables compactadas (PVCV), la densidad de células viables (VCD), la concentración de células viables (VCC), la viabilidad, la salud de las células, o el nivel de apoptosis. Un gráfico 1695 de la figura 16E muestra un ejemplo del biovolumen (por ejemplo, punto 1696 de datos) medido por un analizador Cedex (usando exclusión con azul de tripano), el biovolumen predicho sin corregir (por ejemplo, la serie 1697 de datos) medido por una sonda de permitividad, y el biovolumen predicho corregido (por ejemplo, la serie de 1698 datos) basado en las técnicas descritas anteriormente.
Ejemplo de Método de Cultivo de Células en Crecimiento Usando una Predicción de Biomasa de las Células
La figura 17 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo de células en crecimiento en un medio conductor, que recibe una predicción de biomasa (por ejemplo, el VCV) basada en una correlación entre dos técnicas de medición, que incluyen la aplicación de una señal de frecuencia variable al medio conductor y el ajuste de las condiciones del medio conductor basado en la predicción de la viabilidad las células.
En el bloque 1710 de proceso, se cultiva una población de células en un medio conductor, usando, por ejemplo, el sistema 100 de biorreactor descrito anteriormente con respecto a la figura 1. Las células se pueden cultivar en un entorno aséptico en comunicación con una sonda de permitividad sumergida al menos parcialmente en la población. En otras realizaciones, la sonda se puede sumergir o interactuar de otro modo con la población solo durante períodos de tiempo limitados. Una vez que el entorno de las células está configurado como se desea para el crecimiento de las células, el método procede al bloque 1720 de proceso.
En el bloque 1720 de proceso, se recibe una predicción corregida de la biomasa de las células (por ejemplo, el VCV) basada en una correlación de dos técnicas de medición. Por ejemplo, la técnica de aplicación de una señal frecuencia variable al medio conductor del bloque 1710 de proceso se puede usar como la primera técnica para una de las mediciones, y se puede usar una técnica de medición fuera de línea, tal como la exclusión con azul de tripano, como la segunda técnica de medición. La correlación puede ser lineal o no lineal, y se puede basar en las técnicas analizadas anteriormente con respecto a las figuras 2, 7 y 15A-B. La predicción se puede generar localmente (por ejemplo, por un sistema de control que tenga un entorno informático) o de forma remota (por ejemplo, en una nube informática). Después que se recibe una predicción de biomasa de las células, el método procede al bloque 1730 de proceso.
En el bloque 1730 de proceso, se ajustan una o más condiciones ambientales de la población de células basadas en la predicción de biomasa de las células generada en el bloque 1720 de proceso. Por ejemplo, se pueden aumentar, disminuir, retener, o añadir los medios de alimentación, agua, soluciones ácidas o básicas u otras entradas. También se pueden ajustar otras entradas, tal como la temperatura del biorreactor o la agitación de la población de células. También se pueden ajustar las salidas del biorreactor. Por ejemplo, se puede adquirir una muestra de células de la población de células, o extraer una fracción determinada del volumen de la población de células del biorreactor. Las entradas y/o salidas se pueden seleccionar, por ejemplo, para mejorar la velocidad de crecimiento de las células, mejorar la salud de las células, o retardar o detener el crecimiento de las células. Así, se puede producir un bioproducto basado en la correlación de la primera técnica de medición con la segunda técnica de medición.
Ejemplo de Método de Uso de Señales de Frecuencia Variable y Mediciones de Calibración para Medir la Apoptosis
La apoptosis (muerte de las células programada) es un proceso biológico altamente regulado y bien definido. La apoptosis conduce a cambios característicos en la morfología de las células y la muerte de las células, por ejemplo, el sangrado, la reducción de las células, y la fragmentación nuclear. La apoptosis es esencial para la vida multicelular, y los defectos en el proceso de apoptosis pueden provocar enfermedades fatales tales como el cáncer.
La detección y medición de la apoptosis es útil por varias razones. Por ejemplo, las células muertas no producen proteínas u otros subproductos como lo hacen las células vivas. Algunas de las causas de la apoptosis son bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, son causas de apoptosis la privación de nutrientes, la acumulación de desechos, y las condiciones del proceso, que incluyen el estrés oxidativo, la hipoxia, y el desprendimiento.
La Tabla 2 enumera varias dianas de tinción, junto con una fase de apoptosis correspondiente para detectar las dianas de tinción.
Tabla 2
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La figura 18 es un diagrama 1800 de flujo que describe un método ejemplar de recepción de mediciones eléctricas obtenidas aplicando una señal de frecuencia variable a dos poblaciones de células diferentes con un dispositivo de medición, una de las poblaciones que se cultiva en un entorno inducido por apoptosis, y que predice el nivel de apoptosis en una de las poblaciones, como se puede usar en ciertas realizaciones de la tecnología descrita.
La figura 19A es un gráfico 1900 que ilustra la viabilidad de las células (a lo largo del eje y) en dos poblaciones de células diferentes a lo largo de un período de tiempo (a lo largo del eje x) en un experimento de ejemplo correspondiente al método de la figura 18. Como se muestra, una primera línea 1910 indica la viabilidad de una primera población de células, que tiene apoptosis inducida usando la adición de un agente de estaurosporina. En este caso, se usó una concentración de estaurosporina de 1 pM. Una segunda línea 1915 indica la viabilidad de una segunda población de células, que es una población de control que no se induce usando un agente de estaurosporina.
En el bloque 1810 de proceso, se reciben datos que representan varias mediciones de una propiedad eléctrica de una primera población de células. Las mediciones se pueden obtener aplicando una señal de frecuencia variable (por ejemplo, una onda sinusoidal que tiene una frecuencia variable a través de un intervalo de frecuencia seleccionado, o en dos o más frecuencias seleccionadas) a la población de células mientras se mide una propiedad eléctrica tal como permitividad o capacitancia. Se pueden usar varias frecuencias seleccionadas, por ejemplo, frecuencias entre 50 kHz y 10 MHz. La permitividad medida de la población de células variará dependiendo de la frecuencia de la señal aplicada usada para medir la permitividad. Por ejemplo, la permitividad puede variar desde una medición alta de 4x10-9 Faradios por metro (F/m) en una frecuencia baja de 50 kHz a una medición baja de 1x10-11 F/m en una frecuencia alta de 10 MHz. Como se usa en la presente memoria, los términos "frecuencia baja" y "frecuencia alta" son relativos, y no necesariamente se refieren a una frecuencia baja o alta absoluta. Las células pueden ser células de mamífero (por ejemplo, a partir de las líneas celulares CHO o NS0) suspendidas en una solución de nutrientes.
Los datos recopilados en el bloque 1810 de proceso se pueden recopilar a lo largo de un período del orden de segundos, minutos, horas, o días, según sea adecuado para las especies de células en la población y las condiciones ambientales. Como se muestra en el gráfico 850 en la figura 8B, la permitividad normalizada (representada en el eje y) de la población de células se mide en varias frecuencias diferentes (representadas en el eje x) en los siguientes períodos de tiempo después del inicio del crecimiento de las células: día 3, día 6, día 8, y día 11 (870). La forma de la curva así obtenida cambia a lo largo del tiempo, debido a cambios en la estructura celular de la población de células.
En un período de tiempo designado, se induce la apoptosis en la primera población de células añadiendo un agente inductor de apoptosis al entorno. Por ejemplo, como se muestra en la figura 19A, la apoptosis se induce en la primera población de células en el tiempo indicado por una línea 1919 discontinua.
En el 1820 bloque de proceso, se recibe un segundo conjunto de mediciones de una propiedad eléctrica para una segunda población de células usando técnicas similares a las analizadas con respecto al bloque 1810 de proceso. La segunda población de células tiene condiciones ambientales diferentes a las usadas para la primera población de células en el bloque 1810 de proceso. Por ejemplo, la segunda población de células puede ser una población de control, que no tiene la apoptosis inducida usando un agente. La segunda línea 1915 indica la viabilidad de la población de control.
La figura 19B es un gráfico 1930 que ilustra la densidad de células viables (VCD) (eje y izquierda) y el porcentaje de viabilidad de las células (eje y derecha) representados a lo largo del tiempo (eje x) para la primera y segunda mediciones de la primera y segunda poblaciones de células recibidas en los bloques 1810 y 1820 de proceso. Como se muestra en la figura 19B, la primera población de células que se trata con estaurosporina en el día 14 (en un tiempo 1933 indicado por una línea discontinua) presenta una disminución del VCD (serie 1931 de datos) y del porcentaje de viabilidad (serie 1932 de datos). La segunda población de células sin tratar presenta una disminución del VCD (serie 1935 de datos) y del porcentaje de viabilidad (serie 1936 de datos), pero a una velocidad de disminución sustancialmente reducida. Un cuadro 1939 de líneas discontinúas indica el período de tiempo de la figura 19B que se ilustra con más detalle en las figuras 19C-G.
En el bloque 1830 de proceso, se comparan el primer conjunto de mediciones para la primera población de células y el segundo conjunto de mediciones para la segunda población de células. Como se muestra en el gráfico 1940 de la figura 19C, varias mediciones de capacitancia normalizadas (en el eje y) para el segundo conjunto de mediciones recibidas en el bloque 1820 de proceso se representan frente a la frecuencia a la que se obtuvieron las mediciones (eje x), respectivamente. Se observa una ligera desviación hacia la derecha a partir de las mediciones obtenidas en el tiempo 1933 (línea 1945) y después de 60 horas del crecimiento de las células (línea 1946) después del tiempo 1933.
El gráfico 1950 de la figura 19D ilustra el primer conjunto de mediciones obtenidas de la primera población de células que tiene un agente inductor de apoptosis añadido en el día 14 del crecimiento de las células. Como se muestra, se observa una desviación más sustancial hacia la derecha a partir de las mediciones (línea 1955) obtenidas en el tiempo 1933 de la adición de estaurosporina al crecimiento de las células a las 60 horas después de la adición de estaurosporina (línea 1956).
En el bloque 1840 de proceso, se genera un nivel predicho de apoptosis basado en las mediciones de viabilidad obtenidas usando un método alternativo. Por ejemplo, se puede usar una correlación con las mediciones de viabilidad obtenidas usando técnicas de tinción. Las figuras 20A y 20B son los gráficos 2000 y 2010 de histog ramas de recuentos de células (eje y) representados frente a mediciones de FSC (dispersión directa) obtenidas usando un citómetro de flujo en el día 2 y el día 10 del crecimiento de las células de la primera población de células inducidas por apoptosis, respectivamente.
Como se muestra en la figura 20A, un primer histograma 2020 indica la población de células sanas y un segundo histograma 2025 indica la población de células enfermas, según se determina midiendo la FCS usando un citómetro de flujo después de 48 horas del crecimiento de las células en la primera población de células (antes de inducir la apoptosis). Como se muestra en la FIG. 20B, un tercer histograma 2030 indica la población de células sanas y un cuarto histograma 2035 indica la población de células enfermas, según se determina midiendo la FCS usando un citómetro de flujo después de 10 días del crecimiento de las células en la primera población de células.
Se puede calcular una calibración comparando las diferencias en la respuesta de permitividad de un dispositivo de medición con una predicción del volumen de biomasa generado por una técnica analítica alternativa.
Ejemplo de Método de Correlación de las Mediciones de Permitividad con Mediciones de Calibración Alternativas
La figura 21 es un diagrama 2100 de flujo que describe un método ejemplar de aplicación de una correlación de mediciones de permitividad obtenidas en frecuencias variables a las mediciones de una propiedad biológica obtenidas usando una técnica analítica alternativa, como se puede usar en ciertas realizaciones de la tecnología descrita.
En el bloque 2110 de proceso, se reciben varias mediciones de permitividad que se obtienen aplicando una señal de frecuencia variable a una población de células usando un dispositivo de medición adecuado, como se describió anteriormente. Se pueden emplear frecuencias y técnicas adecuadas para la aplicación de una señal de frecuencia variable a una población de células como se describió anteriormente con respecto al bloque 2110 de proceso.
Las mediciones de permitividad a través de todos los espectros de frecuencia se pueden normalizar en un intervalo de 0,0 a 1,0. Después de obtener varias mediciones de permitividad y (opcionalmente) normalizar las mediciones de permitividad, el método procede al bloque de 2120 de proceso.
En el bloque 2120 de proceso, se recibe una correlación que se ha calculado entre las mediciones de permitividad obtenidas en el bloque 2110 de proceso y las mediciones de calibración determinadas usando una técnica analítica alternativa de una manera similar a las descritas anteriormente, por ejemplo, con respecto a los bloques 760 o 1420 de proceso. Después que se ha calculado la divergencia, el método procede al bloque 2130 de proceso.
En el bloque 2130 de proceso, la correlación recibida en el bloque 2120 de proceso se aplica para generar una predicción de apoptosis en la primera población de células. En algunos ejemplos, una primera área a1 se determina integrando varias mediciones de permitividad (o muestras) tomadas entre una frecuencia baja fL seleccionada y una frecuencia alta fH seleccionada. En algunos ejemplos, las frecuencias más altas y más bajas son las frecuencias más altas y más bajas aplicadas a la población de células cuando se miden las permitividades. En otros ejemplos, se usan otras frecuencias altas y bajas como las frecuencias seleccionadas. En algunos ejemplos, se normalizan las mediciones de permitividad, como se analizó anteriormente con respecto al bloque 2110 de proceso. La primera área a1 se puede calcular usando cualquier técnica adecuada, que incluye la interpolación polinomial en cuadratura, la interpolación en cuadratura adaptativa, la extrapolación, y/o el análisis de Monte Carlo.
Las figuras 19E y 19F son los gráficos 1960 y 1980 que ilustran las relaciones entre la correlación recibida y una relación de área, como se describió anteriormente con respecto al bloque 2130 de proceso. Como se muestra en la figura 19E, una población de células de control presenta una relación 1970 de área relativamente estable a lo largo del tiempo. Como se muestra en la figura 19F, una población de células inducida por apoptosis presenta un aumento en la relación 1975 de área después de que se añade un agente inductor de apoptosis en el tiempo 1990. Basado en estas observaciones, el cambio en la curva de dispersión beta se puede correlacionar y usar para predecir la viabilidad de las células debido a apoptosis en el primer conjunto de mediciones obtenidas en el bloque 2110 de proceso.
Las figuras 22A-C son una serie de gráficos que ilustran los cambios en los espectros dieléctricos para dos poblaciones de células a lo largo de un período de 28 horas. Las series de datos para la primera población de células, que ha tenido apoptosis inducida usando inducción de estaurosporina, se indican por líneas continuas (por ejemplo, las líneas 2210-2216). Las series de datos para la segunda población de células de control, que no ha tenido la apoptosis inducida, se indican por líneas discontinuas (por ejemplo, las líneas 2220-2226).
Se pueden usar varios métodos analíticos diferentes para observar la viabilidad de las células. Por ejemplo, se puede usar el volumen de células viables (VCV), medido usando un contador de células automatizado (por ejemplo, un analizador Cedex), para contar automáticamente las células para determinar el VCV usando la exclusión con azul de tripano. En algunos ejemplos, una técnica de tinción de las células (por ejemplo, que tiene una diana de tinción de ADN, caspasa 3, caspasa 6, caspasa 9 o fosfatidilserina). Como entenderá fácilmente un experto en la técnica, se puede usar cualquiera de varias técnicas analíticas alternativas adecuadas. Además, las mediciones de calibración no se limitan al VCV, sino en algunos ejemplos pueden incluir otras propiedades de la biomasa tales como volumen de células viables compactadas (PVCV), densidad de células viables (VCD), concentración de células viables (VCC), viabilidad, salud de las células, nivel de apoptosis, u otras mediciones adecuadas. La correlación se puede calcular usando una técnica adecuada, que incluye los métodos de correlación lineal (por ejemplo, usando la correlación lineal de Pearson), correlación no lineal (por ejemplo, usando la correlación de rango de Spearman), o técnicas de correlación matricial. Así, en algunos ejemplos, se calcula una correlación en forma de intersección de pendiente, mientras que en otros ejemplos, se usan correlaciones más complejas. Las correlaciones así calculadas se pueden usar para corregir las divergencias observadas en otros cultivos de células usando mediciones de permitividad, o mediciones de otras propiedades eléctricas adecuadas.
Ejemplo de Entorno Informático
La figura 23 ilustra un ejemplo generalizado de un entorno 2300 informático adecuado en el que se pueden implementar las realizaciones, técnicas, y tecnologías descritas. Por ejemplo, el entorno 2300 informático se puede usar para generar correlaciones y predecir volúmenes de células viables, como se describió anteriormente.
El entorno 2300 informático no pretende sugerir ninguna limitación en cuanto al alcance del uso o la funcionalidad de la tecnología, ya que la tecnología se puede implementar en diversos entornos informáticos de propósito general o de propósito especial. Por ejemplo, la tecnología descrita se puede implementar con otras configuraciones de sistemas informáticos, que incluyen dispositivos portátiles, sistemas multiprocesador, electrónica de consumo programable o basada en microprocesadores, ordenadores personales (PC) de red, miniordenadores, ordenadores centrales, y similares. La tecnología descrita también se puede practicar en entornos informáticos distribuidos donde las tareas se realizan por dispositivos de procesamiento remoto que están conectados a través de una red de comunicaciones. En un entorno informático distribuido, los módulos de programa se pueden ubicar en dispositivos de almacenamiento de memoria tanto locales como remotos.
Con referencia a la figura 23, el entorno 2300 informático incluye al menos una unidad 2310 central de procesamiento y una memoria 2320. En la figura 23, esta configuración 2330 más básica se incluye dentro de una línea discontinua. La unidad 2310 central de procesamiento ejecuta instrucciones ejecutables por ordenador y puede ser un procesador real o virtual. En un sistema de multiprocesamiento, múltiples unidades de procesamiento ejecutan instrucciones ejecutables por ordenador para aumentar la potencia de procesamiento y, como tal, se pueden ejecutar múltiples procesadores simultáneamente. La memoria 2320 puede ser una memoria volátil (por ejemplo, registros, caché, memoria de acceso aleatorio (RAM)), memoria no volátil (por ejemplo, memoria de solo lectura (ROM), memoria de solo lectura borrable y programable electrónicamente (EEPROM), memoria de semiconductores (flash), etc.) o alguna combinación de las dos. La memoria 2320 almacena software 2380 que puede, por ejemplo, implementar las tecnologías descritas en la presente memoria. Un entorno informático puede tener características adicionales. Por ejemplo, el entorno 2300 informático incluye el almacenamiento 2340, uno o más dispositivos 2350 de entrada, uno o más dispositivos 2360 de salida, y una o más conexiones 2370 de comunicación. Un mecanismo de interconexión (no mostrado) tal como un bus, un controlador, o una red, interconecta los componentes del entorno 2300 informático. Normalmente, el software del sistema operativo (no mostrado) proporciona un entorno operativo para otro software que se ejecuta en el entorno 2300 informático, y coordina las actividades de los componentes del entorno 2300 informático.
El almacenamiento 2340 puede ser extraíble o no extraíble, e incluye discos magnéticos, cintas o casetes magnéticos, disco compacto de solo lectura (CD-ROM), disco compacto regrabable (CD-RW), disco versátil digital (DVD), o cualquier otro medio que se pueda usar para almacenar información y al que se pueda acceder dentro del entorno 2300 informático. El almacenamiento 2340 almacena instrucciones para el software 2380 y datos (por ejemplo, datos de las mediciones o datos de correlación), que se pueden usar para implementar las tecnologías descritas en la presente memoria.
El(los) dispositivo(s) 2350 de entrada pueden ser un dispositivo de entrada táctil, tales como un teclado alfanumérico, un teclado numérico, un ratón, una pantalla táctil, un lápiz, o una rueda de desplazamiento, un dispositivo de entrada de voz, un dispositivo de escaneo, u otro dispositivo, que proporciona entrada al entorno 2300 informático. Para el audio, el(los) dispositivo(s) 2350 de entrada pueden ser una tarjeta de sonido o un dispositivo similar que acepte entrada de audio en forma analógica o digital, o un lector de CD-ROM que proporcione muestras de audio al entorno 2300 informático. El(los) dispositivo(s) 2360 de salida pueden ser una pantalla, una impresora, un altavoz, una grabadora de CD, u otro dispositivo que proporcione salida desde el entorno 2300 informático.
La conexión o conexiones 2370 de comunicación permiten la comunicación sobre un medio de comunicación (por ejemplo, una red de conexión) a otra entidad informática. El medio de comunicación transmite información tal como instrucciones ejecutables por ordenador, información de gráficos comprimidos, vídeo, u otros datos en una señal de datos modulada.
El(los) dispositivo(s) 2350 de entrada, el(los) dispositivo(s) 2360 de salida y la conexión o las conexiones 2370 de comunicación se pueden usar con un sistema de control para controlar las entradas y/o salidas de un biorreactor. Por ejemplo, los dispositivos de entrada se pueden usar con un sistema de control para modular los medios de alimentación, agua, soluciones ácidas/básicas, calor, y agitación para un biorreactor aséptico. Además, los dispositivos de salida se pueden usar con un sistema de control para tomar muestras o extraer células o fluido de una población de células en un biorreactor o para hacer funcionar un citómetro de flujo. En algunos ejemplos, se usa una conexión 2370 de comunicación, tales como RS-232, bus serie universal (USB), Ethernet, u otra conexión adecuada, para controlar el funcionamiento del biorreactor y ajustar las condiciones ambientales.
Algunas realizaciones de los métodos descritos se pueden realizar usando instrucciones ejecutables por ordenador que implementan toda o una parte de la tecnología descrita en una nube 2390 informática. Por ejemplo, se pueden realizar la generación de correlaciones y la predicción de la viabilidad de las células en servidores ubicados en la nube 2390 informática.
Los medios legibles por ordenador son cualquiera de los medios disponibles a los que se pueda acceder dentro de un entorno 2300 informático. A modo de ejemplo, y no de limitación, con el entorno 2300 informático, los medios legibles por ordenador incluyen la memoria 2320 y/o el almacenamiento 2340. Como debe entenderse fácilmente, el término medios de almacenamiento legibles por ordenador incluye los medios para el almacenamiento de datos tales como la memoria 2320 y el almacenamiento 2340, y no los medios de transmisión que transportan señales de datos moduladas o señales transitorias.
Cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria se puede realizar a través de uno o más medios legibles por ordenador (por ejemplo, almacenamiento u otros medios tangibles) que comprenden (por ejemplo, tener o almacenar) instrucciones ejecutables por ordenador para realizar (por ejemplo, haciendo que un dispositivo informático realice) tales métodos. El funcionamiento puede ser completamente automático, semiautomático, o implicar una intervención manual.
Habiendo descrito e ilustrado los principios de nuestras innovaciones en la descripción detallada y los dibujos adjuntos, se reconocerá que las diversas realizaciones se pueden modificar en disposición y detalle sin apartarse de tales principios. Debe entenderse que los programas, procesos, o métodos descritos en la presente memoria no están relacionados o limitados a ningún tipo de entorno informático en particular, a menos que se indique lo contrario. Se pueden usar diversos tipos de entornos informáticos de propósito general o especializados o realizar operaciones según las enseñanzas descritas en la presente memoria. Los elementos de las realizaciones mostradas en software se pueden implementar en hardware y viceversa.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la determinación de una propiedad biológica de células suspendidas en unos medios líquidos, comprendiendo el método:
recibir datos de las propiedades eléctricas de las células obtenidos aplicando una señal a dichas células en más de dos frecuencias de señal;
recibir datos de las propiedades biológicas de las células obtenidos usando una técnica analítica alternativa; generar al menos un valor representativo de la dependencia de la frecuencia de dichos datos de las propiedades eléctricas;
determinar una relación entre dichos datos de las propiedades biológicas y dicho valor representativo de dichos datos de las propiedades eléctricas,
en donde dicho valor se genera determinando una relación de área bajo la curva derivada de los datos de las propiedades eléctricas, en donde dicho valor representativo de dichos datos de las propiedades eléctricas representa una forma de dichos datos de las propiedades eléctricas en relación con la frecuencia; y
en donde dicha relación se usa para ajustar una o más condiciones ambientales de dichas células.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dichos datos de las propiedades eléctricas y dichos datos de las propiedades biológicas se obtienen en más de dos puntos de tiempo, y dicho valor se genera en cada punto de tiempo respectivo.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho valor se genera por: determinar una primera área (a1) calculando una integral de dicha al menos una propiedad eléctrica entre una frecuencia baja (fL) de dicha señal y una frecuencia alta (fH) de dicha señal;
determinar una segunda área (a2) calculando una integral de dicha al menos una propiedad eléctrica entre una frecuencia seleccionada (fQ) y dicha frecuencia alta (fH) o entre dicha frecuencia seleccionada (fQ) y dicha frecuencia baja (fL), dicha frecuencia seleccionada (fQ) que es mayor que dicha frecuencia baja (fL) y menor que dicha frecuencia alta (fH); y
calcular una relación de área basada en dicha primera área (a1) y dicha segunda área (a2).
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha relación comprende una correlación entre dichos datos de las propiedades biológicas y dichos datos de las propiedades eléctricas.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha relación se determina basada en una divergencia entre la magnitud de dichos datos de las propiedades eléctricas y dichos datos de las propiedades biológicas.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha relación se aplica a datos de las propiedades eléctricas posteriores tomados de una nueva población de dichas células para predecir datos de las propiedades biológicas para dicha nueva población de dichas células.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho valor es representativo tanto de la magnitud como de la dependencia de la frecuencia de dichos datos de las propiedades eléctricas.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se determina una magnitud de dichos datos de las propiedades eléctricas, y dicho valor se usa junto con dicha magnitud para determinar dicha propiedad biológica de dichas células.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos datos de las propiedades eléctricas incluyen al menos uno o más de los siguientes: capacitancia, permitividad, constante dieléctrica, resistencia, impedancia, voltaje, o corriente.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos datos de las propiedades biológicas incluyen al menos uno o más de los siguientes: volumen de células viables (VCV), volumen de células viables compactadas (PVCV), densidad de células viables (VCD), concentración de células viables (VCC), viabilidad, salud de las células, o el nivel de apoptosis.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una o más condiciones ambientales incluyen al menos una o más de las siguientes: velocidad de alimentación, temperatura, velocidad de agitación, condiciones atmosféricas, pH, o condiciones de iluminación.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho método comprende además la aplicación de una correlación a dichos datos de las propiedades eléctricas para generar una predicción de apoptosis para dichas células, dicha aplicación que comprende calcular relaciones de área basadas en al menos una de las siguientes ecuaciones:
Figure imgf000022_0001
en donde Ra es la relación de área calculada, e(f) corresponde a dicha propiedad eléctrica obtenida aplicando dicha señal a dichas células, y fQ es una primera frecuencia seleccionada de dicha señal de frecuencia variable dentro de un intervalo entre una frecuencia baja de las dos o más frecuencias de señal y una frecuencia alta fH de las dos o más frecuencias de señal.
13. Un aparato que comprende:
un reactor para crecimiento de células en un medio conductor;
un dispositivo de medición acoplado al reactor y que está configurado para aplicar una señal eléctrica de frecuencia variable al medio conductor para medir propiedades eléctricas de dichas células;
uno o más recursos de procesamiento acoplados a dicho dispositivo de medición; y
uno o más medios de almacenamiento legibles por ordenador que almacenan instrucciones legibles por ordenador que cuando se ejecutan por dichos recursos de procesamiento hacen que dicho aparato realice el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
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