JP6741031B2 - 細胞検査装置、細胞検査方法、プログラム、および記録媒体 - Google Patents

細胞検査装置、細胞検査方法、プログラム、および記録媒体 Download PDF

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Description

本発明は、細胞検査装置、細胞検査方法、プログラム、および記録媒体に関する。
細胞の培養において、生存率の高い培養前半においては、生細胞数とキャパシタンスの線形性が強い。このため、培養中のベッセル内の生細胞数を、インピーダンスセンサを用いて測定する手法は、液体中の細胞培養一般に利用可能である。しかしながら、この手法では、生存率が高く維持される培養前半では一致するが、生存率が低下する培養後半において線形性がなくなり、推定値とサンプリングによる実測値が乖離する場合がある。
推定値とサンプリングによる実測値が乖離することに対して、インピーダンスセンサで取得したデータを、コンピュータ上のソフトウェアで処理することで補正して推定値を得る手法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１に記載の技術では、培養時の生細胞体積を正解データとしている。なお、生細胞体積は、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で計測する。特許文献１に記載の技術で用いた培養データでは、生細胞体積と、取得した周波数毎のキャパシタンスデータからの推定値とが、培養の前半では一致するが、培養後半では乖離する。
このため、特許文献１に記載の技術では、インピーダンスセンサで取得したデータを、周波数毎のキャパシタンスデータに分け、さらに最大値と最小値を用いて正規化する。そして、特許文献１に記載の技術では、乖離量に基づく周波数で前半と後半に分け、周波数を横軸、正規化した値を縦軸として、前半の積分した面積と後半の積分した面積の比から生細胞体積に対する補正値を求める。特許文献１に記載の技術では、インピーダンスセンサで取得したデータを用いて、計測値と推測値との乖離量と、上述した面積比とに相関がある細胞の培養に適用している。
米国特許第９５６８４４９号明細書
しかしながら、特許文献１に記載の技術では、生細胞体積の推定が特定の培養条件時に限られるという課題があった。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであって、細胞培養における播種から一定以下の生存率に死滅するまでの培養期間の内の所定期間において、高精度に生細胞数推定を実現することができる細胞検査装置、細胞検査方法、プログラム、および記録媒体を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の一態様に係る細胞検査装置（２）は、培養液のインピーダンスを計測するインピーダンスセンサ（センサ２０、プローブ２１、センサ部２２）と、細胞の培養開始から死滅までの培養期間の内の所定期間が複数の期間に分類され、分類された前記複数の期間毎に、前記インピーダンスを用いて、前記所定期間において培養液中の生存している生細胞数を推定するための係数を記憶する記憶部（２７）と、前記インピーダンスを取得し、前記インピーダンスに対して前記記憶部が記憶する前記期間毎の係数の少なくとも１つを用いて、生細胞数を推定する生細胞数推定部（制御部２４、演算部２６、生細胞数推定部２８）と、を備える。
また、本発明の一態様に係る細胞検査装置において、前記記憶部は、前記インピーダンスセンサが計測した前記インピーダンスと、前記所定期間において培養液中の生存している細胞数に関する情報と、前記インピーダンスを計測した時刻とに基づいて、前記所定期間が複数に分類され、前記分類された期間毎に前記係数を記憶するようにしてもよい。
また、本発明の一態様に係る細胞検査装置において、前記生細胞数推定部は、細胞の培養開始から死滅までの期間において、前記インピーダンスと、前記生存している細胞数に関する情報と、前記インピーダンスと前記生存している細胞数に関する情報を計測したときの前記所定期間の開始時刻からの経過時間と、に対して主成分分析を行い、前記主成分分析を行った結果に基づいて、生細胞数を推定する係数を求め、前記主成分分析を行った結果に基づいて、前記所定期間を複数に分類し、前記分類した期間毎に求めた前記係数を前記記憶部に記憶させるようにしてもよい。
また、本発明の一態様に係る細胞検査装置において、前記生細胞数推定部は、直線回帰、部分的最小二乗回帰、および二次以上の回帰のうち少なくとも１つを用いて、前記係数を求めるようにしてもよい。
また、本発明の一態様に係る細胞検査装置において、前記生細胞数推定部は、前記経過時間を所定時間毎に増やし、前記インピーダンスの変化と、前記生存している細胞数の変化との差または比を求め、前記比が所定の範囲外の場合を、第ｎ（ｎは１以上の整数）の期間と第ｎ＋１の期間との分岐点として求め、求めた分岐点に基づいて、前記第ｎの期間を分類するようにしてもよい。
上記目的を達成するため、本発明の一態様に係る細胞検査方法は、インピーダンスセンサと、細胞の培養開始から死滅までの培養期間の内の所定期間が複数の期間に分類され、分類された前記複数の期間毎に、前記インピーダンスセンサが計測したインピーダンスを用いて、前記所定期間において培養液中の生存している生細胞数を推定するための係数を記憶する記憶部と、生細胞数推定部と、を有する細胞検査装置における細胞検査方法であって、前記インピーダンスセンサが、前記所定期間において培養液のインピーダンスを計測する手順と、前記生細胞数推定部が、前記インピーダンスを取得し、前記インピーダンスに対して前記記憶部が記憶する前記期間毎の係数の少なくとも１つを用いて、生細胞数を推定する手順と、を含む。
上記目的を達成するため、本発明の一態様に係るプログラムは、インピーダンスセンサと、細胞の培養開始から死滅までの培養期間の内の所定期間が複数に分類され、分類された前記複数の期間毎に、前記インピーダンスセンサが計測したインピーダンスを用いて、前記所定期間において培養液中の生存している生細胞数を推定するための係数を記憶する記憶部と、生細胞数推定部と、を有する細胞検査装置のコンピュータに、計測された培養液のインピーダンスを取得するステップと、前記インピーダンスに対して前記記憶部が記憶する前記期間毎の係数の少なくとも１つを用いて、生細胞数を推定するステップと、を実行させる。
上記目的を達成するため、本発明の一態様に係る記録媒体は、上記のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能なプログラム記録媒体である。
本発明によれば、細胞培養における播種から一定以下の生存率に死滅するまでの培養期間の内の所定期間において、高精度に生細胞数推定を実現することができる。
本実施形態に係る細胞検査システムの構成例を示す図である。 本実施形態に係るキャパシタンスと生細胞密度を主成分分析した結果例を示す図である。 図２に示した主成分分析した結果を３つの局面に分類した例である。 図２の主成分分析の結果を３つの局面毎に分けた図である。 本実施形態に係る学習動作モードの際に生細胞数推定部が行う処理手順例を示すフローチャートである。 本実施形態に係る記憶部が記憶する情報例を示す図である。 本実施形態に係る推定動作モードの際に生細胞数推定部が行う処理手順例を示すフローチャートである。 本実施形態に係る学習した後、生細胞数を推定した結果例を示す図である。 本実施形態に係る培養の全期間で推定した生細胞数とオフラインで実測した生細胞数の例を示す図である。 比較例により推定数と実測値が乖離する例を示す図である。
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
図１は、本実施形態に係る細胞検査システム１の構成例を示す図である。図１の示すように、細胞検査システム１は、細胞検査装置２、培養槽３、セルカウンター４を含んで構成される。細胞検査装置２は、センサ２０、操作部２３、表示部２５、記憶部２７、および生細胞数推定部２８を備える。生細胞数推定部２８は、制御部２４、演算部２６を備える。センサ２０は、プローブ２１、センサ部２２を備える。制御部２４は、計時部２４１を備える。演算部２６は、分類部２６１、推定部２６２を備える。
センサ２０、操作部２３および表示部２５は、生細胞数推定部２８の制御部２４に接続されている。制御部２４は、演算部２６と接続されている。また、記憶部２７は、演算部２６に接続されている。セルカウンター４は、取得した計測値を制御部２４に出力する、なお、セルカウンター４と制御部２４は、有線または無線接続されていてもよい。
培養槽３は、細胞を含む培養液が入れられている。なお、培養槽３には、センサ２０と、特許文献１と同様に、不図示の攪拌機、ヒータ等が取り付けられている。攪拌機、ヒータは、細胞検査装置２によって制御される。検査対象の細胞は、例えばＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞である。
セルカウンター４は、培養液をサンプリングし、生細胞を染色して培養液中の生細胞密度（ＶＣＤ；Ｖｉａｂｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）［ｃｅｌｌ／ｍＬ］を計測する。なお、センサ２０がキャパシタンスを計測するタイミングと、生細胞密度の取得のタイミングは、一致している必要はない。計測するタイミングは、例えば、キャパシタンスを連続して測定し、生細胞密度を間欠的に取得するようにしてもよい。セルカウンター４は、計測した生細胞密度を示す情報を細胞検査装置２に出力する。なお、セルカウンター４による計測は、オフラインで行われ、学習動作モードの際に用いられる。なお、学習動作モードとは、生細胞数の推定を行うために、予め推定対象の細胞を用いて培養し、培養中の情報の学習を行う動作モードである。なお、培養中は、培養液が攪拌機で攪拌されているため、培養液中の細胞分布が一様であるとする。
細胞検査装置２は、学習動作モードの際、セルカウンター４が計測した生細胞密度を示す情報と、センサ２０が計測した計測値とを取得する。なお、細胞検査装置２は、培養を開始したとき時刻の計時を開始し、生細胞密度を示す情報と計測値を取得した時刻を計時し、取得した生細胞密度を示す情報と計測値に、計時した時刻（経過時間）を対応付けて記憶する。細胞検査装置２は、記憶させた情報に基づいて、細胞数を推定するための前処理を行う。なお、細胞数を推定するための前処理については、後述する。
細胞検査装置２は、学習したデータを用いて推定を行う推定動作モードの際、センサ２０が計測した計測値を取得する。なお、細胞検査装置２は、培養を開始したとき時刻の計時を開始し、計測値を取得した時刻を計時する。細胞検査装置２は、細胞数を推定するための前処理と、計測値に基づいて、培養液中の生細胞数を推定する。
プローブ２１は、測定プローブ、インピーダンス変化センサを含む。なお、インピーダンス変化センサとは、細胞を含む培養液のインピーダンスを計測するセンサである。インピーダンス変化センサが計測する計測値には、所定の周波数範囲（例えば１０ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの範囲）において、複数の異なる周波数それぞれのインピーダンスが含まれている。プローブ２１は、培養液のインピーダンスを計測し、計測した計測値をセンサ部２２に出力する。なお、プローブ２１は、計測した計測値を増幅する増幅部を有していてもよい。
センサ部２２は、プローブ２１が出力する計測値をキャパシタンス（誘電率）と、誘電コンダクタンス（導電率）の２つに周知の手法で分離し、分離したキャパシタンスと、コンダクタンスを制御部２４に出力する。なお、センサ部２２は、プローブが計測した計測値を増幅する増幅部を有していてもよい。なお、キャパシタンスは、例えば１０ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの周波数成分を含む。
操作部２３は、例えば、表示部２５上に設けられているタッチパネルセンサ、操作ボタン等である。操作部２３は、利用者が操作した操作結果を検出し、検出した操作結果を制御部２４に出力する。操作結果には、細胞名、培養条件の設定値、動作モード、培養開始指示、培養終了指示等が含まれる。なお、動作モードとは、学習動作モードと推定動作モードとがある。
制御部２４は、操作部２３が出力する操作結果に基づいて、学習動作モードであることを示す情報、または推定動作モードであることを示す情報を演算部２６に出力する。制御部２４は、培養開始指示に応じて、培養条件の設定値によって培養槽３の攪拌機、ヒータ等を制御して培養を開始する。なお、制御部２４は、培養開始時に計時部２４１を用いて計時を開始する。制御部２４は、学習動作モードと推定動作モードの際、オンライン処理で、所定の時間間隔で、センサ部２２が出力する計測値を取得する。制御部２４は、学習動作モードと推定動作モードの際、計測値を取得したときに計時した経過時刻を示す情報を計測値に対応付けて、演算部２６に出力する。なお、制御部２４は、生細胞数と計測値と経過時間を記憶部２７に記憶させるようにしてもよい。制御部２４は、学習動作モードの際、オフライン処理で、センサ部２２の計測値を取得するタイミング毎に、セルカウンター４が出力する生細胞密度を示す情報を取得する。制御部２４は、学習動作モードの際、生細胞密度を取得したときに計時した経過時刻を示す情報を生細胞密度に対応付けて、演算部２６に出力する。なお、制御部２４は、生細胞数と経過時間を記憶部２７に記憶させるようにしてもよい。制御部２４は、推定動作モードの際、演算部２６が出力する推定された細胞数を表す情報を取得する。なお、演算部２６が出力する推定された細胞数を表す情報には、培養開始からの経過時間が含まれている。制御部２４は、演算部２６が出力する推定された細胞数を表す情報に基づいて、細胞数の推定結果の画像を生成し、生成した細胞数の推定結果の画像を表示部２５上に表示させる。
表示部２５は、例えば、液晶表示装置、有機ＥＬ（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）表示装置等である。表示部２５は、制御部２４が出力した表示画像を表示させる。表示画像は、培養条件の設定画面、細胞数の推定結果の画像等である。
演算部２６の分類部２６１は、学習動作モードの際、培養開始から培養終了までの期間、制御部２４が出力する計測値と、計測値を取得したときに計時された経過時間を示す情報をリアルタイムで取得する。分類部２６１は、学習動作モードの際、オフタイムで生細胞密度を示す情報と、生細胞密度を示す情報を取得したときに計時された経過時間を示す情報をオフライン処理で取得する。分類部２６１は、学習動作モードの際、取得した培養開始から培養終了までの期間、計測値に、生細胞密度と、計測値と生細胞密度を取得したときに計時された経過時間を示す情報を対応付けて記憶部２７に記憶させる。分類部２６１は、学習動作モードの際、記憶させた培養開始から培養終了までの期間の計測値と生細胞密度と経過時間を示す情報を用いて、主成分分析を行う。なお、分類部２６１は、計測値のうち、キャパシタンスの値を用いる。このため、分類部２６１が、主成分分析に用いるデータ数は、一例として、周波数範囲が２８７ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの範囲で１８点とすると、１８（周波数）×１バッチのデータ数となる。なお、１バッチとは、培養開始から培養終了までの期間である。分類部２６１は、学習動作モードの際、主成分分析した結果に基づいて、計測値と生細胞数を分類するための境界情報を求める。分類部２６１は、学習動作モードの際、求めた境界情報に基づいて、主成分分析した結果を分類し、分類した局面毎に含まれる計測値と生細胞密度を示す情報を求める。分類部２６１は、学習動作モードの際、求めた境界情報、局面毎に含まれる計測値と生細胞密度を示す情報を記憶部２７に記憶させる。演算部２６の推定部２６２は、学習動作モードの際、求められた境界情報に基づいて、キャパシタンスの主成分と生細胞密度との関係を、例えば線形回帰、または部分的最小二乗回帰（ＰＬＳ；Ｐａｒｔｉａｌ Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、二次以上の回帰によって、分類した局面毎に係数を求め、求めた係数を記憶部２７に記憶させる。
演算部２６の推定部２６２は、推定動作モードの際、培養開始から培養終了までの期間、制御部２４が出力する計測値と、計測値を取得したときに計時された経過時間を示す情報を取得する。推定部２６２は、推定動作モードの際、計測値のうち、キャパシタンスの値を、記憶部２７が記憶する境界情報を用いて、取得したキャパシタンスがどの局面に対応するか判別する。なお、局面については、後述する。推定部２６２は、推定動作モードの際、判別した結果に応じて、計測されたキャパシタンスを、係数を用いて補正することで、生細胞数を推定する。推定部２６２は、推定した生細胞数を表す情報に、計測値を取得したときに計時された経過時間を示す情報を対応付けて、制御部２４に出力する。
記憶部２７は、細胞名、培養条件の設定値等を記憶する。記憶部２７は、学習動作モードの際、計測値と生細胞密度と経過時間等を記憶する。記憶部２７は、学習動作モードのときに決定した境界情報、境界それぞれの係数等を記憶する。記憶部２７は、局面を分類する際に用いられる分離確率ｒの閾値を記憶する。なお、分離確率ｒについては、後述する。
＜学習動作モード＞
次に、学習動作モードの際に、分類部２６１と推定部２６２が行う処理例を、図２〜図４を用いて説明する。ここで、周波数毎のキャパシタンスの計測値の割合と、生細胞密度とキャパシタンスにおける変数間の関係が同時に変化し、変化しない間は定常であると仮定する。すなわち、キャパシタンスのカーブが一定範囲内である場合は、一定の生細胞密度とキャパシタンスとの関係が成り立っているため、単一の手法で検出可能である。また、生細胞密度とキャパシタンスの関係が変化した場合は、周波数毎のキャパシタンスの割合が変化し、その変化を検出可能であるとする。このような仮説の基では、培養全期間をキャパシタンスの状態が定常な局面毎に分割し、分割した局面それぞれに推定手法と係数を決定することができる。
図２は、本実施形態に係るキャパシタンスと生細胞密度を主成分分析した結果例を示す図である。図２おいて、横軸は第１主成分、縦軸は第２主成分である。また、各点の濃淡は、培養における経過時間を表し、薄いほど経過時間が短いことを表し、すなわち培養前半であることを表す。また、各点の濃淡は、濃いほど経過時間が長いこと、すなわち培養の後半であることを表している。
図２に示すように、主成分分析した結果は、符号ｇ１〜ｇ３の略直線で囲まれた三角形と見なせる。このような主成分分析結果の場合、符号ｇ１〜ｇ３のどの辺にデータ点が属しているかは、数理的に判別できる。
分類部２６１は、学習動作モードの際、例えばロジスティック回帰を用いて主成分分析結果を３つの局面に分ける。そして、分類部２６１は、キャパシタンスデータと各時刻の正解ラベル「第１局面Ｉ」、「第２局面ＩＩ」、「第３局面ＩＩＩ」を用意する。さらに、分類部２６１は、各ラベル間の境界ベクトルを、回帰によって求める。符号ｇ１で示した略直線で示されるデータが第１局面Ｉである。符号ｇ２で示した略直線で示されるデータが第２局面ＩＩである。符号ｇ３で示した略直線で示されるデータが第３局面ＩＩＩである。
ここで、第１局面Ｉと第２局面ＩＩと判別手法例を説明する。以下の説明では、培養開始の時刻を０とし、経過時間をｔとする。分類部２６１は、時刻０からｔまでの生細胞密度の変化とキャパシタンスの変化との割合［｛生細胞密度（ｔ）−生細胞密度（０）｝／｛キャパシタンス（ｔ）−キャパシタンス（０）｝］を求める。測定間隔が、例えば１時間毎であったとき、分類部２６１は、時刻ｔを１時間毎に増やして比を順次求める。すなわち、分類部２６１は、経過時間が１時間後の比、２時間後の比、３時間後の比、・・・・のように求めていく。そして、分類部２６１は、経過時間が１時間の時の比と２時間の時の比の差または比を求め、差が所定範囲内にあるか、または比が所定範囲内であるか否かを判別する。分類部２６１は、差または比が所定範囲内である場合、線形性が継続していると判別する。分類部２６１は、差または比が所定範囲外である場合、線形性が継続していないと判別し、第１局面Ｉと第２局面ＩＩとの分岐点であると判別する。
分類部２６１は、この分岐点を第２局面ＩＩの開始点とし、開始点（分岐点）から時刻ｔまでの生細胞数の変化と主成分分析したときの第２成分の変化との割合を求める。分類部２６１は、経過時間が１時間の時の比と２時間の時の比の差または比を求め、差が所定範囲内にあるか、または比が所定範囲内であるか否かを判別する。分類部２６１は、差または比が所定範囲外である場合、線形性が継続していないと判別し、第２局面ＩＩと第３局面ＩＩＩとの分岐点であると判別する。なお、上述した分岐点の算出手法は一例であり、これに限らない。また、局面が４つ以上の場合、分類部２６１は、さらに第ｎ局面と第ｎ＋１局面との分岐点を求める。
ここで、境界情報について説明する。
境界情報には、上述した分岐点と、分岐点に含まれるキャパシタンスが含まれる。分類部２６１は、分岐点に含まれるキャパシタンスを、局面を判別するために求める。また、分類部２６１は、局面毎に係数を求める。局面が３つの場合、局面の係数は、第１局面Ｉで使用される第１の係数と、第２局面ＩＩで使用される第２の係数と、第３局面で使用される第３の係数と、を有する。分類部２６１は、局面の分類を、分離確率ｒを用いて行う。なお、分類部２６１は、分離確率ｒを、係数とキャパシタンスからデータ毎に計算する。例えば、２つの局面に分類する場合、分類部２６１は、第１局面Ｉと第２局面ＩＩとを判別を、分離確率ｒが０．５未満のとき第１局面Ｉであると判別し、分離確率ｒが０，５以上のとき第２局面ＩＩであると判別する。
判別するための係数を用いて、局面を分離した結果が、図３である。
図２に示したデータ点を、符号ｇ１〜ｇ３に基づいて局面を分離すると、図３のようになる。
図３は、図２に示した主成分分析した結果を３つの局面に分類した例である。図３において、横軸は第１主成分、縦軸は第２主成分である。
図３に示す例では、データ点を、線分ｇ１１、ｇ１２およびｇ１３によって、第１局面Ｉ、第２局面ＩＩ、第３局面ＩＩＩの３つの局面に分類した例である。
次に、分類部２６１は、分割後の局面と、局面それぞれにおける培養期間内に、生細胞密度とキャパシタンスとの関係を確認する。図３のように３つに分けた局面のそれぞれでのキャパシタンスによる主成分と生細胞密度との関係は、図４のようになる。
図４は、図２の主成分分析の結果を３つの局面毎に分けた図である。図４（Ａ）は、第１局面Ｉにおける主成分分析結果である。横軸が第１主成分、縦軸が生細胞密度である。図４（Ｂ）は、第２局面ＩＩにおける主成分分析結果である。横軸が第２主成分、縦軸が生細胞密度である。図４（Ｃ）は、第３局面ＩＩＩにおける主成分分析結果である。横軸が第１主成分、縦軸が生細胞密度である。
推定部２６２は、図４（Ａ）に対して、例えば第１主成分に対する線形回帰または部分的最小二乗回帰によってキャパシタンスと生細胞数の関係を求める。推定部２６２は、図４（Ｂ）に対して、例えば第２主成分に対する線形回帰または部分的最小二乗回帰によってキャパシタンスと生細胞数の関係を求める。推定部２６２は、図４（Ｃ）に対して、例えば第１主成分に対する二次以上の回帰によってキャパシタンスと生細胞数の関係を求める。推定部２６２は、求めた係数を局面に対応付けて記憶部２７に記憶させる。
ここで主成分は、キャパシタンスの周波数成分である。例えば、キャパシタンスの周波数範囲が２８７ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの場合、第１主成分の周波数が６００ｋＨｚであり、第２主成分の周波数が２８７ｋＨｚ〜２０ＭＨｚである。
そして、推定部２６２は、第１局面Ｉと第２局面ＩＩとを判別する第１の係数と、例えば６００ｋＨｚのキャパシタンスと生細胞密度を用いて、直線回帰によって第１局面Ｉの係数を求める。
また、推定部２６２は、第２局面ＩＩと第３局面ＩＩＩとを判別する第２の係数と、例えば２８７ｋＨｚ〜２０ＭＨｚのキャパシタンスと生細胞密度を用いて、部分的最小二乗回帰によって第２局面ＩＩの係数を求める。
さらに、推定部２６２は、第２局面ＩＩと第３局面ＩＩＩとを判別する第２の係数と、例えば６００ｋＨｚのキャパシタンスと生細胞密度を用いて、二次の回帰によって第３局面ＩＩＩの係数を求める。
なお、上述した係数の求め方は一例であり、これに限らない。
なお、図２〜図４に示した例では、主成分分析した結果を３つに分割する例を示したが、これに限らない。分割数は、主成分分析によって得られた結果に基づいて、２つであってもよく、４つ以上であってもよい。推定部２６２は、分割した局面毎に係数を求めるようにしてもよい。
図５は、本実施形態に係る学習動作モードの際に生細胞数推定部２８が行う処理手順例を示すフローチャートである。なお、図５は、主成分分析の結果をｎ（ｎは２以上の整数）個に分類する例である。
（ステップＳ１）制御部２４は、オンライン処理で、センサ部２２が出力する計測値を取得し、計測値を取得したときの培養開始からの経過時間を計時する。続けて、制御部２４は、計測値と経過時間を示す情報を、演算部２６に出力する。続けて、分類部２６１は、制御部２４が、出力する計測値と経過時間を示す情報を、取得する。続けて、分類部２６１は、取得した計測値と経過時間を示す情報を記憶部２７に記憶させる。
（ステップＳ２）制御部２４は、計測が終了したか否かを判別する。なお、計測の終了は、例えば、制御部２４は、操作部２３が操作者によって計測終了が操作されたことを検出して行う。制御部２４は、計測が終了していないと判別した場合（ステップＳ２；ＮＯ）、処理をステップＳ１に戻す。制御部２４は、計測が終了したと判別した場合（ステップＳ２；ＹＥＳ）、処理をステップＳ２に進める。
（ステップＳ３）制御部２４は、オフライン処理で、センサ２０が計測したタイミング毎に、培養開始から終了までの培養液中の生細胞密度を示す情報を取得し、生細胞密度を取得したときの経過時間を計時する。続けて、制御部２４は、生細胞密度と経過時間を示す情報を分類部２６１に出力する。続けて、分類部２６１は、制御部２４が出力する生細胞密度を示す情報と経過時間を取得し、取得した生細胞密度を示す情報と経過時間を記憶部２７に記憶させる。
（ステップＳ４）分類部２６１は、記憶部２７に記憶させた培養開始から培養終了までの期間の計測値と生細胞密度と経過時間を用いて、主成分分析を行う。
（ステップＳ５）分類部２６１は、主成分分析した結果に基づいて、例えばロジスティック回帰を用いて計測値と生細胞密度を分類するための境界情報を求める。続けて、分類部２６１は、求めた境界情報に基づいて、主成分分析した結果を分類し、分類した局面毎に含まれる計測値と生細胞密度を示す情報を求める。
（ステップＳ６）推定部２６２は、求められた境界情報に基づいて、キャパシタンスの主成分と生細胞密度との関係を、例えば線形回帰、部分的最小二乗回帰、または二次以上の回帰によって、分類した局面毎に係数を求める。続けて、推定部２６２は、求めた係数を記憶部２７に記憶させる。
以上で、学習動作モードを終了する。
なお、上述した例では、生細胞密度をオフライン処理で取得する例を説明したが、オンライン処理で取得するようにしてもよい。また、細胞検査装置２は、上述した学習を細胞や、培養条件毎に行い学習するようにしてもよい。この場合、細胞検査装置２は、細胞や培養条件毎に、境界情報と係数を対応づけて記憶部２７に記憶させるようにしてもよい。また、上述した例では、局面毎に係数を求める例を説明したが、関係式であってもよい。
また、上述した例では、学習動作モードの際に、生細胞密度をセルセンサで計測する例を説明したが、これに限らない。生細胞密度または生細胞数を、他のセンサや測定器で計測してもよい。
なお、図２〜図５では、細胞の培養開始から死滅までの期間を複数の局面に分類する例を説明したが、これに限らない。分類部２６１は、細胞の培養期間における任意の期間に対して主成分分析を行い、局面に分類するようにしてもよい。この場合も、推定部２６２は、細胞の培養期間における任意の期間に対して、分類された局面毎に係数を求めるようにしてもよい。
また、図５では、計測が終了した後に主成分分析を行い、分類された局面（期間）毎に係数を求める例を説明したが、これに限らない。分類部２６１は、センサ部２２、セルカウンター４から取得した計測値に対して、培養を開始した時刻から経過時間まで、または所定期間の開始時刻から経過時間まで、例えば計測値を取得したタイミング毎に主成分分析を行いつつ係数を推定するようにしてもよい。なお、分類部２６１は、計測値が異なる局面に切り替わった際、切り替わる前の局面の最終的な係数を記憶部２７に記憶させ、係数を初期化した後、新たな局面の係数を推定する。すなわち、分類部２６１は、オンラインで局面の分類、係数の推定を行うようにしてもよい。
さらに、推定部２６２は、このようにオンラインで分類された局面と、推定された係数を用いて、生細胞数を推定するようにしてもよい。
また、上述した例では、局面毎に設定した係数の１つを用いて、生細胞数を推定する例を説明したが、これに限らない。推定部２６２は、例えば、第１局面Ｉと第２局面ＩＩとの切り替わりにおいて、第１局面の係数の６０％を乗じ、第２局面の係数に４０％を乗じた係数によって生細胞数を推定するようにしてもよい。これにより、本実施形態によれば局面と局面との切り替わりにおいて、局面を連続的に切り替えることができる。
ここで、学習動作モードによって記憶部２７が記憶する情報の例を説明する。
図６は、本実施形態に係る記憶部２７が記憶する情報例を示す図である。図６に示すように、記憶部２７は、局面毎に、生細胞数を推定するための係数を記憶する。
＜推定動作モード＞
次に、推定動作モードの際に、推定部２６２が行う処理例を、図６を用いて説明する。図７は、本実施形態に係る推定動作モードの際に生細胞数推定部２８が行う処理手順例を示すフローチャートである。なお、図７は、学習動作モードで主成分分析の結果をｎ（ｎは２以上の整数）個に分類した例である。
（ステップＳ１０１）制御部２４は、オンライン処理で、センサ部２２が出力する計測値を取得し、計測値を取得したときの培養開始からの経過時間を計時する。続けて、制御部２４は、計測値と経過時間を示す情報を、演算部２６出力する。続けて、分類部２６１は、制御部２４が、出力する計測値と経過時間を示す情報を、取得する。なお、分類部２６１は、取得した計測値と経過時間を示す情報を記憶部２７に記憶させるようにしてもよい。
（ステップＳ１０２）推定部２６２は、計測値のうち、キャパシタンスの値を、記憶部２７が記憶する境界情報を用いて、取得したキャパシタンスがどの局面に対応するか判別する。
（ステップＳ１０３）推定部２６２は、判別した結果、キャパシタンスが第１局面に属するか、第２局面に属するか、・・・、第ｎ局面に属するかを判別する。推定部２６２は、キャパシタンスが第１局面に属すると判別した場合（ステップＳ１０３；第１局面）、処理をステップＳ１０４に進める。推定部２６２は、キャパシタンスが第２局面に属すると判別した場合（ステップＳ１０４；第２局面）、処理をステップＳ１０５に進める。推定部２６２は、キャパシタンスが第ｎ局面に属すると判別した場合（ステップＳ１０３；第ｎ局面）、処理をステップＳ１０６に進める。
（ステップＳ１０４）推定部２６２は、記憶部２７に記憶されている第１局面の係数を用いて、計測値を補正することで、生細胞数を推定する。例えば、推定部２６２は、計測値のキャパシタンスに係数を乗じることで生細胞数の推定値を求める。本実施形態では、このように記憶部２７に記憶されている第１局面の係数を用いて、計測値を補正することで、生細胞数を推定することを、第１推定手法という。処理後、推定部２６２は、処理をステップＳ１０７に進める。
（ステップＳ１０５）推定部２６２は、記憶部２７に記憶されている第２局面の係数を用いて、計測値を補正することで、生細胞数を推定する。本実施形態では、このように記憶部２７に記憶されている第２局面の係数を用いて、計測値を補正することで、生細胞数を推定することを、第２推定手法という。処理後、推定部２６２は、処理をステップＳ１０７に進める。
（ステップＳ１０６）推定部２６２は、記憶部２７に記憶されている第ｎ局面の係数を用いて、計測値を補正することで、生細胞数を推定する。本実施形態では、このように記憶部２７に記憶されている第ｎ局面の係数を用いて、計測値を補正することで、生細胞数を推定することを、第ｎ推定手法という。処理後、推定部２６２は、処理をステップＳ１０７に進める。
（ステップＳ１０７）推定部２６２は、推定した生細胞数を表す情報に経過時間を示す情報を対応付けて、制御部２４に出力する。続けて、制御部２４は、推定部２６２が出力する推定した細胞数を表す情報、経過時間を示す情報を用いて画像情報を生成し、生成した画像情報を表示部２５に表示させる。
（ステップＳ１０８）制御部２４は、計測が終了したか否かを判別する。なお、計測の終了は、例えば、制御部２４は、操作部２３が操作者によって計測終了が操作されたことを検出して行う。制御部２４は、計測が終了していないと判別した場合（ステップＳ１０８；ＮＯ）、処理をステップＳ１０１に戻す。制御部２４は、計測が終了したと判別した場合（ステップＳ１０８；ＹＥＳ）、処理を終了する。
なお、推定部２６２は、細胞の培養期間における任意の期間に対して、分類された局面毎の係数を用いて生細胞数の推定を行うようにしてもよい。
また、推定に用いるキャパシタは、局面に適した周波数の範囲または周波数のデータを用いるようにしてもよい。なお、用いる周波数範囲または周波数は、測定周波数のうち最も線形性と安定性のバランスが良い範囲または周波数を選択するようにしてもよい。
次に、上述したように学習した後、推定した結果例を説明する。
図８は、本実施形態に係る学習した後、生細胞数を推定した結果例を示す図である。図８において、横軸は時刻、右縦軸が細胞数である。また、左縦軸の１が第１局面に属することを表し、左縦軸の２が第２局面に属することを表し、左縦軸の３が第３局面に属することを表している。
また、三角印は、実測された生細胞数を表す。破線ｇ２１は、第１推定手法で推定した生細胞数を表す。一点破線ｇ２２は、第２推定手法で推定した生細胞数を表す。実線ｇ２３は、第３推定手法で推定した生細胞数を表す。破線ｇ１４は、分類された局面を表す。
図８の符号ｇ１４に示すように、第１局面と第２局面との間の判別結果、第２局面と第３局面との間の判別結果が、２つの局面を振動している期間があるが、推定値が近接しているため、どちらの局面に判別されても推定結果への影響は小さい。
次に、本実施形態を適用して培養の全期間で推定した生細胞数の例を説明する。
図９は、本実施形態に係る培養の全期間で推定した生細胞数とオフラインで実測した生細胞数の例を示す図である。図９において、横軸は時刻、縦軸は生細胞数の実測値と推定値である。符号ｇ３１が実測値であり、符号ｇ３２が推定値である。
図９においても、推定値が不連続な箇所があるが、図８と同様に局面の切り替わり箇所である。図９のように、実測値を正解データとすれば、本実施形態では、全期間にわたって精度よく生細胞数を推定できる。
ここで、推定数と実測値が乖離する比較例を説明する。
特許文献１に記載の従来手法では、培養後半の乖離を小さくする一方で、培養前半の乖離を大きくするような場合がある。これに対して、比較例では、培養前半の補正量を抑えつつ、培養後半の補正量を確保するように特許文献１に記載の従来手法の補正式の修正を行った。このようにして補正した場合、適切に補正できる培養状態もあったが、図１０に示すように、培養前半に計測値と実測値との間に乖離が発生することがあった。
図１０は、比較例により推定数と実測値が乖離する例を示す図である。図１０において、横軸は経過時間、縦軸は生細胞密度（ＶＣＤ）である。三角印は、生細胞密度の実測値である。符号ｇ４１は、比較例による培養前半の予測値である。符号ｇ４２は、比較例による培養後半の予測値である。
図１０に示す例では、培養前半の乖離が、実測値に対し低く発生している。
すなわち、比較例に示したように、特許文献１に記載の従来手法の関係式を補正しても、単一の手法では、培養前半は補正せず、培養後半は補正する、といった対応ができない。
これに対して、本実施形態では、培養開始から培養終了までを局面毎に分離し、局面毎に適切な補正を行うための手法（係数を用いて推定）を適用するようにした。これにより、本実施形態によれば、培養条件が異なり、乖離の傾向が異なる場合に対しても、細胞培養（特にＣＨＯ細胞）における播種から一定以下の生存率に死滅するまでの全期間において、高精度な生細胞数推定を実現することができる。さらに本実施形態では、局面毎に最適な推定手法の自動選択を可能にしながら、推定に用いるキャパシタンスデータ以外のデータを必要としない効果を得ることができる。なお、本実施異形態では、分類した各局面における各推定手法は、キャパシタンスの挙動が定常とみなせる局面のみに適用されるので、汎用的に高精度な推定ができる。
なお、上述した例では、センサ２０が計測したインピーダンスのうちキャパシタと生細胞密度に対して主成分分析等を行って期間を分類し、期間毎にキャパシタを用いて、培養液中の生存している生細胞数を推定するための係数を設定する例を説明したが、これに限らない。細胞検査システム１は、センサ２０が計測したキャパシタンスとコンダクタンスと生細胞密度に対して主成分分析等を行って期間を分類し、期間毎にインピーダンスを用いて、培養液中の生存している生細胞数を推定するための係数を設定するようにしてもよい。
なお、上述した例では、制御部２４と演算部２６が分かれている例を説明したが、制御部２４と演算部２６が一体に構成されていてもよい。
以上のように、本実施形態によれば、細胞培養における播種から一定以下の生存率に死滅するまでの培養期間の内の所定期間において、高精度に生細胞数推定を実現することができる。
また、本実施形態によれば、所定期間を複数の局面に分類し、局面毎に係数を設定し、この係数を用いて生細胞数を推定するようにしたので、生細胞数が減少する培養の後半であっても、精度良く生細胞数を推定することができる。
また、本実施形態によれば、例えば第１局面と第２局面との切り替わりに、第１局面の係数と第２局面の係数を用いて推定するため、局面の切り替わりにおいても精度良く生細胞数を推定することができる。
また、本実施形態では、直線回帰、部分的最小二乗回帰、および二次以上の回帰のうち少なくとも１つを用いて、前係数を求めるため、演算量が少ない。
また、本実施形態では、インピーダンスと実測した生細胞数とを用いて主成分分析を行って局面を分類するので、精度良く局面を分類することができる。
また、本実施形態では、係数とキャパシタンスからデータ毎に計算した確率分布によって、実測中の局面を判定するようにしたので、精度良く局面を判定して、精度良く生細胞数を推定することができる。
なお、本発明における生細胞数推定部２８の機能に全てまたは一部を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより生細胞数推定部２８が行う処理の全てまたは一部を行ってもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータシステム」は、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）を備えたＷＷＷシステムも含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（ＲＡＭ）のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。
また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよい。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。
以上、本発明を実施するための形態について実施形態を用いて説明したが、本発明はこうした実施形態に何等限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変形および置換を加えることができる。
１…細胞検査システム、２…細胞検査装置、３…培養槽、４…セルカウンター、２１…プローブ、２２…センサ部、２３…操作部、２４…制御部、２５…表示部、２６…演算部、２７…記憶部、２８…生細胞数推定部、２４１…計時部、２６１…分類部、２６２…推定部

Claims (8)

  1. 培養液のインピーダンスを計測するインピーダンスセンサと、
    細胞の培養開始から死滅までの培養期間の内の所定期間が複数の期間に分類され、分類された前記複数の期間毎に、前記インピーダンスを用いて、前記所定期間において培養液中の生存している生細胞数を推定するための係数を記憶する記憶部と、
    前記インピーダンスを取得し、前記インピーダンスに対して前記記憶部が記憶する前記期間毎の係数の少なくとも１つを用いて、生細胞数を推定する生細胞数推定部と、
    を備える細胞検査装置。
  2. 前記記憶部は、
    前記インピーダンスセンサが計測した前記インピーダンスと、前記所定期間において培養液中の生存している細胞数に関する情報と、前記インピーダンスを計測した時刻とに基づいて、前記所定期間が複数に分類され、前記分類された期間毎に前記係数を記憶する、請求項１に記載の細胞検査装置。
  3. 前記生細胞数推定部は、
    細胞の培養開始から死滅までの期間において、前記インピーダンスと、前記生存している細胞数に関する情報と、前記インピーダンスと前記生存している細胞数に関する情報を計測したときの前記所定期間の開始時刻からの経過時間と、に対して主成分分析を行い、
    前記主成分分析を行った結果に基づいて、生細胞数を推定する係数を求め、
    前記主成分分析を行った結果に基づいて、前記所定期間を複数に分類し、
    前記分類した期間毎に求めた前記係数を前記記憶部に記憶させる、請求項１または請求項２に記載の細胞検査装置。
  4. 前記生細胞数推定部は、
    直線回帰、部分的最小二乗回帰、および二次以上の回帰のうち少なくとも１つを用いて、前記係数を求める、請求項３に記載の細胞検査装置。
  5. 前記生細胞数推定部は、
    前記経過時間を所定時間毎に増やし、前記インピーダンスの変化と、前記生存している細胞数の変化との差または比を求め、前記比が所定の範囲外の場合を、第ｎ（ｎは１以上の整数）の期間と第ｎ＋１の期間との分岐点として求め、求めた分岐点に基づいて、前記第ｎの期間を分類する、請求項３または請求項４に記載の細胞検査装置。
  6. インピーダンスセンサと、細胞の培養開始から死滅までの培養期間の内の所定期間が複数の期間に分類され、分類された前記複数の期間毎に、前記インピーダンスセンサが計測したインピーダンスを用いて、前記所定期間において培養液中の生存している生細胞数を推定するための係数を記憶する記憶部と、生細胞数推定部と、を有する細胞検査装置における細胞検査方法であって、
    前記インピーダンスセンサが、前記所定期間において培養液のインピーダンスを計測する手順と、
    前記生細胞数推定部が、前記インピーダンスを取得し、前記インピーダンスに対して前記記憶部が記憶する前記期間毎の係数の少なくとも１つを用いて、生細胞数を推定する手順と、
    を含む細胞検査方法。
  7. インピーダンスセンサと、細胞の培養開始から死滅までの培養期間の内の所定期間が複数に分類され、分類された前記複数の期間毎に、前記インピーダンスセンサが計測したインピーダンスを用いて、前記所定期間において培養液中の生存している生細胞数を推定するための係数を記憶する記憶部と、生細胞数推定部と、を有する細胞検査装置のコンピュータに、
    計測された培養液のインピーダンスを取得するステップと、
    前記インピーダンスに対して前記記憶部が記憶する前記期間毎の係数の少なくとも１つを用いて、生細胞数を推定するステップと、
    を実行させるプログラム。
  8. 請求項７に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
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