CN111630148A

CN111630148A - 在防止乳酸积累的同时繁殖细胞培养物的过程和系统

Info

Publication number: CN111630148A
Application number: CN201880087141.8A
Authority: CN
Inventors: B·J·唐尼; J·M·施密特; J·F·布赖特
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2020-09-04
Also published as: WO2019100040A1; KR102589415B1; US11634680B2; JP2021503291A; IL274776A; US20200354666A1; US11999939B2; KR20200086348A; US20230279330A1; CA3083124A1; JP7391840B2; EP3714036A1; JP2023166410A

Abstract

描述了一种预测模型，该模型可以基于初始，测量的浓度和历史数据来预测未来的参数浓度。可以使用多种多元技术来构建能够预测多种和不同的细胞系浓度的预测模型。预测模型也是可伸缩的。在一个实施方案中，确定未来的乳酸浓度轨迹，并且改变或修饰生物反应器内的至少一种条件以将乳酸浓度维持在期望的范围内。

Description

在防止乳酸积累的同时繁殖细胞培养物的过程和系统

优先权要求

本申请基于并要求于2017年11月20日提交的美国临时专利申请序列号62/588,464和于2018年10月18日提交的美国临时专利申请序列号62/747,311的优先权，两者均通过引用并入本文。

背景技术

生物反应器是可以在实验室或工业规模上进行生物反应或过程的装置，在生物制药工业中被广泛使用。生物反应器可用于生产所有不同类型的生物产品。例如，生物产品可以包括细胞培养物和衍生自细胞培养物的材料，衍生自细胞培养物的材料包括饮料、生物燃料、生物能源、生物化学药品、抗生素、氨基酸、酶、单克隆抗体、单体、蛋白质、食品培养物、生物聚合物、酒精、调味剂和香料等等。在一些实施例中，细胞培养物可以生长用于细胞疗法。细胞疗法是通过施用已经离体操纵或改变的自体、异体或异种细胞来预防、治疗、治愈或减轻人类疾病或损伤。细胞疗法的一个目标是修复、替换或恢复受损的组织或器官。

细胞培养物通常在分批过程中生长，其中生物材料保留在生物反应器中直到反应时间结束。在这些方法中的某些方法中，可以周期性地或连续地去除并再补充生物反应器中包含的流体介质，以补充流体介质中包含的营养物并可能去除在该过程中产生的有害副产物。

在细胞培养物的生长过程中，培养基中关键代谢产物的调节可直接影响所生产产品的质量。例如，长期以来，乳酸浓度一直被认为是在细胞培养物，特别是哺乳动物细胞培养物的生长过程中控制的关键代谢产物之一。通常，在细胞培养的指数生长期产生大量的乳酸，而当细胞进入静止期时观察到消耗。高水平的乳酸可能会对细胞培养过程产生许多负面影响。例如，乳酸积累可能与产品质量和属性的负面影响相关。实际上，细胞培养物中乳酸的极度积累会使细胞培养在商业上无法使用。

然而，细胞培养物中的乳酸行为是非常不可预测的。例如，由于调节细胞培养物中乳酸产生和消耗的机制尚不清楚和未知，本领域技术人员已经尝试监测和控制乳酸水平几乎没有成功。细胞代谢行为的高度多元、非线性和随时间变化的性质使得很难识别和纠正乳酸浓度背后的驱动力。

历史上，上游生物过程已经通过去除样品进行监测，然后对样品进行分析以分析选定的代谢产物，例如乳酸水平。过去，已经进行了重复的乳酸浓度测量，以预测细胞培养物是否将以乳酸累积状态结束，从而降低产物浓度。不幸的是，以前的乳酸浓度计算在只发现了与乳酸积累有关的问题，该过程太迟而无法制定供给代谢物或操作条件。

最近，本领域技术人员已经尝试设计预测性控制模型作为在生物产品生产期间使用的质量控制工具。例如，Quin等人在题为“工业模型预测控制技术的综述”的文章中公开了可商购的模型预测控制技术的概述，其通过引用并入本文。Zupke等人发表了一篇题为“实时产品属性控制以制造具有定义的N-连接的聚糖水平的抗体”的文章，并讨论了使用非线性模型预测控制的问题。Sommeregger等人发表了一篇题为“通过质量控制：对哺乳动物细胞培养生物过程进行模型预测控制的文章”，该文章旨在实施过程分析技术以转向更灵活的质量设计方法。然而，上述文章不仅不能公开乳酸浓度控制系统，而且不能提供与反馈机制结合的过程参数的鲁棒控制。

鉴于上述情况，当前需要一种用于监测生物化学和生物制药过程(例如繁殖细胞培养的过程)的改进的过程和系统，该过程和系统允许进行连续或周期性调节以维持生物反应器内的最佳条件。例如，需要一种能够预测细胞培养物中的质量属性浓度并将该质量属性保持在期望限度内的方法和系统。特别地，需要一种方法和系统，该方法和系统不仅能够预测生长的细胞培养物中未来的乳酸浓度，而且能够修饰一个或多个生物反应器对照和/或输入以将乳酸浓度保持在预设的限度内。还需要用于防止乳酸在细胞培养物中积累的改进的方法和系统。

发明内容

本公开总体上涉及一种用于繁殖生物材料(例如细胞培养物)的方法和系统。例如，在一个实施例中，本公开的方法和系统针对繁殖的哺乳动物细胞培养物。根据本公开，已经开发了包含预测模型的控制器，该控制器能够在细胞培养的整个温育期内确定鲁棒的质量属性浓度，例如乳酸浓度。预测模型可用于在繁殖期间选择性地改变细胞培养物中的至少一种条件，以将质量属性浓度保持在预设的范围内。例如，通过本公开的方法和系统，细胞培养物可以以在过程结束时防止乳酸在细胞培养物中的积累的方式繁殖。

例如，在一个实施例中，本公开涉及一种用于繁殖细胞培养物的方法。该过程包括确定细胞培养物中乳酸的浓度。另外，测量细胞培养物中至少一种乳酸影响参数。乳酸浓度和至少一个乳酸影响参数测量值被发送到控制器。根据本公开，控制器包括预测模型，该模型确定细胞培养物中乳酸的未来浓度。然后基于确定的细胞培养物中乳酸的未来浓度，选择性地改变细胞培养物中的至少一种条件，以将乳酸浓度保持在预设的限度内。

如上所述，在一个实施例中，本公开特别地涉及控制细胞培养物中的乳酸浓度。然而，应当理解，本公开的方法和系统可以用于监测和控制细胞培养物中的任何合适的质量属性。除了乳酸之外，质量属性还可包括蛋白质、细胞生长速率、聚糖成分、电荷变体、聚集体、截留(clipping)，二硫键氧化或二硫改组变体。如下所述，该系统和方法特别适合于将乳酸浓度保持在预设范围内。

在一个实施例中，细胞培养物在收获前具有温育期。例如，温育期可以为约12小时至约28天。乳酸浓度可以在温育期开始时进行测量并馈送至控制器。根据初始乳酸浓度，控制器可以在整个温育期结束时预测乳酸浓度。控制器还可以配置为确定用于改变细胞培养物中的至少一种状况的纠正措施，以便将乳酸浓度维持在预设的限度内。例如，在控制器确定细胞培养物中乳酸的未来浓度并采取任何纠正措施之前，可以在约12小时至约4天的时间内确定乳酸浓度信息。例如，在控制器做出乳酸预测确定之前，可以在约5％至约40％的温育期来测量的乳酸浓度。可以测量乳酸浓度，并在整个温育过程中将其送至控制器，从而使控制器可以继续做出未来的预测，并根据需要在细胞培养物中进行调整。

如上所述，除了乳酸浓度之外，还测量至少一种乳酸影响参数并将其馈送到控制器。乳酸影响参数例如可以包括pH、谷氨酸浓度、葡萄糖浓度、天冬酰胺浓度、温度或营养物给料速率。在一个实施例中，测量至少两个乳酸影响参数，例如至少三个乳酸影响参数，并将测量的数据发送至控制器，用于确定细胞培养物中乳酸的未来浓度。

在一个实施例中，在该过程中在细胞培养物中有选择地改变以控制乳酸浓度的至少一种条件是送到细胞培养物中的营养培养基。例如，可以改变营养培养基的成分和/或可以改变营养培养基的流速以影响乳酸水平。例如，营养培养基可以包含碳水化合物源、氨基酸源、维生素、脂质、蛋白质、肽或其混合物。

在一个实施例中，在细胞培养物中改变以控制乳酸浓度的至少一种条件是细胞培养物的pH。在又一个实施例中，细胞培养物和营养培养基的pH均被改变和控制，以控制乳酸水平。

本公开的系统和过程可用于控制任何合适的细胞培养。在一个实施例中，细胞培养物包含哺乳动物细胞。例如，细胞培养物可用于重组蛋白生产。

控制器中包含的用于预测乳酸浓度的预测模型可以基于将乳酸浓度与先前的参考数据进行比较。可以通过改变预测模型的乳酸影响参数来确定乳酸浓度的未来值，以最小化乳酸浓度预测值与规定参考轨迹的平方偏差。在一个实施例中，预测模型可包括加权以进一步改善结果。例如，在一个实施例中，可以将加权应用于预测输出和参考轨迹之间的差。在一个实施例中，例如，可以基于测量的时间段来应用加权。例如，与在生长周期的后期收集的数据相反，可以在生长周期的早期对数据施加更大的权重。

控制器中包含的预测模型可以使用各种多元方法来预测将来的乳酸浓度和乳酸状态。例如，未来的乳酸状态可以由控制器来确定，控制器选自偏最小二乘分析、分类树、支持向量机、线性判别分析等的一种或多种技术中的控制器。在一个实施例中，该预测模型包括至少两种用于预测未来乳酸状态的多元方法。例如，预测模型可以包括神经网络分析、支持向量机和潜在变量建模中的至少两项。在一个实施例中，控制器使用降阶时间变化的自回归外生模型来预测未来的乳酸浓度。

通过本公开的方法，可以监测和控制乳酸水平，使得细胞培养物在温育期结束时不显示乳酸累积。例如，在一个实施例中，系统可以包括分类模型，该分类模型预测细胞培养物是否以消耗乳酸的状态或产生乳酸的状态结束。此外，控制器可以包括一个动态模型，该模型可以预测未来几天(可能到细胞培养温育期结束时)规定的乳酸浓度。可以为动态模型提供乳酸影响参数的不同值，以进行数值预测，以确定在细胞培养物生长过程中采取任何纠正措施的最佳策略。在一个实施例中，可以设计处理系统，使得生物培养在特定的乳酸浓度范围内结束。例如，温育期结束时的乳酸浓度可以约小于2g/L、例如约小于1.5g/L、例如约小于1g/L。

以上乳酸浓度范围仅是示例性的。本公开的过程和系统可以适合于任何特定的应用。例如，尽管高乳酸浓度可能是不希望的，但是较低的乳酸浓度也可能也是不希望的。与简单地控制乳酸浓度相反，本公开的方法和系统可以控制细胞培养物的代谢状态。例如，在一个实施例中，与仅控制最终乳酸浓度相反，本公开内容的方法和系统可以控制乳酸浓度随时间的斜率。

本公开还针对用于繁殖细胞培养物的系统。该系统包括限定用于接收细胞培养物的中空内部的生物反应器。该生物反应器包括多个端口，用于从中空内部进料和/或去除材料。用于将营养培养基进料到生物反应器的中空内部的营养培养基进料与生物反应器上的至少一个端口流体连通。该系统还包括控制器，该控制器配置为接收生物反应器中包含的细胞培养物的乳酸浓度测量值。控制器还配置为接收至少一种乳酸影响参数的测量值。控制器包括预测模型，该模型确定生物反应器中所含细胞培养物中乳酸的未来浓度。例如，可以将预测模型配置为在细胞培养的整个温育期中预测乳酸浓度。控制器配置为基于预测的乳酸浓度来控制营养培养基进料，以选择性地增加或减少营养培养基向生物反应器中的流动，以将乳酸浓度保持在预设极限内。

下面更详细地讨论本公开的其他特征和方面。

附图说明

在本说明书的其余部分中，更具体地阐述了本公开的完整而可行的公开，包括参考附图，其中：

图1是根据本公开的生物反应器系统的一个实施例的截面图；

图2是示出根据本公开的控制系统的一个实施例的图；

图3是说明在细胞培养温育期中控制乳酸浓度的图；和

图4至图19是在以下示例中获得的一些结果的图形表示。

在本说明书和附图中重复使用参考字符旨在表示本发明的相同或相似特征或元件。

具体实施方式

本领域的普通技术人员将理解，本讨论仅是示例性实施例的描述，并且无意于限制本公开的更宽方面。

总的来说，本公开涉及种用于生产生物产品的方法和系统。例如，在一个实施例中，本公开涉及一种用于在生物反应器内繁殖细胞培养物的方法和系统。本公开的系统可以使用开环或闭环控制来监视质量属性，例如生物反应器中的一个或多个参数，然后自动改变或改变影响物质流入或流出生物反应器的参数的流量。

通常，根据本公开，可以在细胞培养物中监测和控制任何合适的质量属性。在一个实施例中，该系统包括预测控制模块，该预测控制模块不仅可以输入实际细胞培养物测量值，而且还可以输入来自先前细胞培养物的参考数据。基于输入的信息，预测模型可以使用多元分析，以便计算细胞培养物中一种或多种质量属性的未来浓度。例如，在一个实施例中，预测模型在计算未来浓度水平时使用两种不同的多元分析方法。

根据本公开内容监视和控制的质量属性可以根据特定应用和期望结果而变化。例如，可以控制的质量属性包括蛋白质滴度、细胞生长速率和聚糖成分。聚糖成分可包括半乳糖基化、高甘露糖种类、唾液酸化和岩藻糖基化。在另一个实施例中，被控制的质量属性可以包括电荷变体。例如，电荷变体可以涉及C端赖氨酸裂解、脱酰胺、加合物形成、琥珀酰亚胺形成、氧化、C端脯氨酸酰胺化、异构化和/或唾液酸化。可以控制的其他质量属性包括聚集体浓度、截留、二硫键氧化和二硫键改组。

在一个实施例中，本公开内容的方法和系统特别涉及监测和控制细胞培养物中乳酸的浓度。根据本公开，建立能够基于初始乳酸浓度数据确定细胞培养物中未来乳酸浓度轨迹的预测模型。可以在细胞培养过程的早期确定未来的乳酸浓度，从而可以手动或自动控制生物反应器内的一种或多种条件，以将乳酸浓度保持在预设的范围内。通过本公开的方法和系统，例如，可以在温育期间的过程中以及在收获细胞培养物之前防止乳酸积累在细胞培养物中。

特别有利的是，本公开内容的方法和系统可以按比例缩放到各种不同的生物反应器尺寸和各种细胞系。例如，根据本公开使用的预测模型是鲁棒的并且针对不依赖细胞系的平台过程而开发，因此可以用于临床以及商业制造中。可以根据本公开内容生产所有不同的生物产物。例如，该系统和方法可以适合于在生物反应器内繁殖的任何细胞培养物。在一个实施例中，细胞培养物包含哺乳动物细胞。哺乳动物细胞非常频繁地用于生产复杂的生物药物。例如，哺乳动物细胞可用于重组蛋白生产。例如，本公开内容的系统和方法可以直接影响并提高产品产量和产品质量，从而导致滴度浓度增加。

在一个实例中，本公开的系统和方法用于从生物反应器内的基因修饰的哺乳动物细胞产生生物治疗性蛋白质。这种产生可以来自已建立的细胞培养物的细胞系，例如CHO、NSO或PER.C6。这些细胞表达目的蛋白质，然后将蛋白质分泌到培养基中。细胞培养物可以在补料分批方法中生长，如本文所用，补料分批方法也包括灌注型细胞培养系统，其中从生物反应器或非灌注系统中定期或连续地去除流体。

参考图1，示出了根据本发明的生物反应器系统的一个实施例。该生物反应器系统包括生物反应器10。通常，本公开的系统和方法可以使用任何合适的生物反应器。例如，生物反应器可以包括发酵罐、搅拌釜反应器、粘附的生物反应器、波型生物反应器、一次性生物反应器等。在图1所示的实施例中，生物反应器10包括中空容器或容器，该中空容器或容器包括用于接收在流体生长培养基中的细胞培养物的生物反应器容积12。如图1所示，该生物反应器系统可以进一步包括连接至诸如双叶轮16和18的搅拌器的可旋转轴14。

生物反应器10可以由各种不同的材料制成。在一个实施例中，例如，生物反应器10可以由诸如不锈钢的金属制成。金属生物反应器通常设计为可重复使用。

可替代地，生物反应器10可以包括由刚性聚合物或柔性聚合物膜制成的一次性生物反应器。例如，当由刚性聚合物制成时，生物反应器壁可以是独立的。备选地，生物反应器可以由柔性的聚合物膜或形状顺应的材料制成，该材料可以是液体不可渗透的并且可以具有内部亲水性表面。在一个实施例中，生物反应器10可以由柔性聚合物膜制成，该柔性聚合物膜被设计为插入刚性结构中，例如用于呈现期望形状的金属容器。可用于制造刚性容器或柔性聚合物膜的聚合物包括聚烯烃聚合物，例如聚丙烯和聚乙烯。或者，该聚合物可以是聚酰胺。在又一个实施例中，柔性聚合物膜可以由不同聚合物材料的多层形成。在一个实施例中，可对柔性聚合物膜进行γ辐射。

生物反应器10可以具有任何合适的体积。例如，生物反应器10的体积可以为0.1mL至约25,000L或更大。例如，生物反应器10的体积12可以约大于0.5L、例如约大于1L、例如约大于2L、例如约大于3L、例如约大于4L、例如大于约5L、例如大于约6L、例如大于约7L、例如大于约8L、例如大于约10L、例如大于约12L、例如约大于15L、例如大于约20L、例如大于约25L、例如大于约30L、例如大于约35L、例如大于约40L、例如约大于约45L。生物反应器10的体积通常约小于25,000L、例如约小于15,000L、例如约小于10,000L、例如约小于5,000L、例如约小于1,000L、例如约小于800L、例如约小于600L、例如约小于400L、例如约小于200L、例如约小于100L、例如约小于50L、例如约小于40L、例如约小于30L、例如约小于20L、例如约小于10L。生物反应器可以为约1L至约5L。在一个替代实施例中，生物反应器的体积可以为约25L至约75L。在又一个实施例中，生物反应器的体积可以为约1,000L至约5,000L。

除了叶轮16和18之外，生物反应器10可以包括各种附加设备，例如挡板、喷射器、气体供应、热交换器或热循环器端口等，其允许生物细胞的培养和繁殖。例如，在图1所示的实施例中，生物反应器10包括喷射器20和挡板22。喷射器20与气体供应装置48流体连通，以向生物反应器10供应气体，例如二氧化碳、氧气和/或空气。另外，生物反应器系统可以包括用于测量和监测压力、泡沫、pH、溶解氧、溶解二氧化碳等的各种探针。

如图1所示，生物反应器10可以包括连接至叶轮16和18的可旋转轴14。可旋转轴14可以连接至用于使轴14和叶轮16和18旋转的电动机24。叶轮16和18可以由任何合适的材料制成，例如金属或生物相容性聚合物。适合在生物反应器系统中使用的叶轮的实例包括水翼式叶轮、高密度桨叶式叶轮、高密度水翼式叶轮、Rushton叶轮、斜叶式叶轮、平缓的船用叶片式叶轮等。当包含两个或更多个叶轮时，叶轮可以沿着旋转轴14间隔开。

如图1所示，生物反应器10还包括多个端口。所述端口可允许供应管线和进料管线进入和流出生物反应器10，以添加和去除流体和其他材料。另外，一个或多个端口可用于连接至一个或多个探针以监测生物反应器10内的状况。此外，生物反应器10与称重传感器相关联地放置，以测量生物反应器内培养物的质量。

在图1所示的实施例中，生物反应器10包括连接至流出物28的底部端口26，以连续或周期性地从生物反应器中抽出材料。另外，生物反应器10包括多个顶部端口，例如端口30、32和34。端口30与第一流体进料36流体连通，端口32与第二进料38和端口34流体连通。进料口36与第三进料40流体连通。进料口36、38和40用于向生物反应器10进料各种不同的材料，例如营养培养基。如本文所用，营养培养基是指可以增加生物产品的质量的任何流体、化合物、分子或物质，例如生物体可以用来生活、生长或以其他方式添加生物质的任何物质。例如，营养物进料可包括用于呼吸或任何类型的新陈代谢的气体，例如氧气或二氧化碳。其他营养培养基可包括碳水化合物源。碳水化合物源包括复合糖和单糖，例如葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖及其混合物。营养培养基也可以包含氨基酸。氨基酸可以包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、单一氨基酸及其外消旋混合物。术语“氨基酸”也可以指已知的非标准氨基酸，例如4-羟基脯氨酸、ε-N、N、N-三甲基赖氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、γ-羧基谷氨酸、γ-N-乙酰赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸、N-乙酰丝氨酸、N、N、N-三甲基丙氨酸、N-甲酰蛋氨酸、γ-氨基丁酸、组胺、多巴胺、甲状腺素、瓜氨酸、鸟氨酸、β-氰基丙氨酸、高半胱氨酸、氮杂和S-腺苷甲硫氨酸。在一些实施例中，氨基酸是谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、酪氨酸或缬氨酸。

营养培养基也可以包含一种或多种维生素。营养培养基中可能包含的维生素包括B组维生素，例如B12。其他维生素包括维生素A、维生素E、核黄素、硫胺素、生物素及其混合物。营养培养基还可以包含一种或多种脂肪酸和一种或多种脂质。例如，营养培养基供给可以包括胆固醇、类固醇及其混合物。营养培养基还可以向生物反应器提供蛋白质和肽。蛋白质和肽包括例如白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白、胎球蛋白及其混合物。本公开内容内的生长培养基还可包括生长因子和生长抑制剂、微量元素、无机盐、水解产物及其混合物。可能包含在生长培养基中的微量元素包括微量金属。痕量金属的实例包括钴、镍等。

如图1所示，生物反应器可以与多种营养物质进料连通。以这种方式，可以将营养培养基进料到仅包含单一营养物的生物反应器中，以在过程中更好地控制生物反应器中营养物的浓度。另外或替代地，不同的进料管线可用于将气体和液体分别进料至生物反应器。

除了生物反应器10的顶部和底部上的端口之外，生物反应器还可以包括沿着侧壁设置的端口。例如，图1所示的生物反应器10包括端口44和46。

端口44和46与监视和控制系统连通，该监视和控制系统可维持生物反应器10中一种或多种参数的最佳浓度，以用于繁殖细胞培养或以其他方式产生生物产物。在所示的实施例中，例如，端口44与pH传感器52相关联，而端口46与溶解氧传感器54相关联。pH传感器52和溶解氧传感器54与控制器60连通。可以配置本公开的“生物反应器”以允许确定和测量生物反应器10内所包含的细胞培养物中的各种参数。一些测量可以在线进行，例如pH和溶解氧。但是，也可以在线或离线进行测量。例如，在一个实施例中，生物反应器10可以与采样站连通。可以将细胞培养物的样品送入采样站进行各种测量。在另一个实施例中，细胞培养物的样品可以从生物反应器中取出并离线测量。

根据本公开，可以在生物反应器10内的细胞培养物的生长过程中测量多个参数。通常，结合一个或多个其他参数来测量由本公开的过程和系统控制的参数，所述一个或多个其他参数可以影响被控制的参数的浓度。例如，在一个实施例中，结合至少一种其他乳酸影响参数在细胞培养物中测量乳酸浓度。乳酸影响参数可包括例如谷氨酸浓度、葡萄糖浓度、氨基酸浓度和天冬酰胺浓度等。在一个实施例中，可以使用任何合适的仪器例如由NovaBiomedical出售的NOVABioprofile 400分析仪来进行细胞培养物的在线或离线分析。上述分析仪能够结合一种或多种乳酸影响参数来测量乳酸浓度。

根据本公开，除了生物反应器中的各种其他条件外，乳酸浓度和一种或多种乳酸影响参数的浓度可以被馈送到控制器60。控制器包括控制模型，该控制模型基于根据输入的数据，当细胞培养物继续繁殖时，能够预测未来的乳酸浓度。例如，在一个实施例中，控制器可以提供预警系统，该预警系统产生关于细胞培养物温育期结束时乳酸浓度是否在预设限度内或细胞培养物是否将结束乳酸积累的百分比概率。控制器60还可以配置为精确地预测未来的乳酸浓度。例如，在一个实施例中，控制器可以预测乳酸浓度轨迹，该乳酸浓度轨迹在整个培养期间预测直至收集细胞培养物为止的乳酸浓度。在一个实施例中，控制器还可以配置为在乳酸浓度不在预设极限内的情况下建议或自动执行纠正措施。例如，控制器可以配置为确定营养物供给的变化，或将乳酸浓度驱动至期望值所需的其他操作条件的变化。为了确定纠正措施，控制器可以运行多个迭代以基于改变生物反应器内的一个或多个条件直到确定一个或多个条件的优化改变来确定将来的乳酸浓度。

控制器60可以包括一个或多个可编程设备或微处理器。如图1所示，控制器60可以与一种或多种进料36、38和40以及一种或多种流出物28连通。此外，控制器60可以与pH传感器52、溶解氧传感器54和将气体馈送到喷雾器20的气体供应装置48。控制器60可以配置为基于乳酸浓度和一种或多种乳酸影响参数的浓度来增加或减少材料流入和流出生物反应器10的流量。以这种方式，控制器60可以将乳酸浓度保持在预设极限内。控制器60可以在开环控制系统中操作或可以在闭环控制系统中操作，其中对输入和/或输出设备的调整是完全自动化的。在其他实施例中，控制器60可以建议纠正措施以便影响乳酸浓度，并且纠正措施可以手动进行。

参考图2，示出了根据本公开的生物反应器系统的一个实施例。如图所示，将细胞培养物在生物反应器10中培养一段时间，然后收获。在温育期间，监测生物反应器10中的各种参数。这些参数由一个或多个分析仪70测量。根据本公开，分析仪70周期性地或连续地监测被传送至控制器60的乳酸浓度。为了使控制器60预测细胞培养物中未来的乳酸浓度。此外，还测量至少一个其他乳酸影响参数并将其馈送到控制器60。所测量的乳酸影响参数可以包括细胞培养物的pH、谷氨酸盐浓度、葡萄糖浓度、天冬酰胺浓度、温度和/或营养物进料速率。在一个实施例中，在该过程中测量至少两个乳酸影响参数、例如至少三个乳酸影响参数、例如至少四个乳酸影响参数。例如，一个或多个分析器70可以测量从大约两个乳酸影响参数到大约八个乳酸影响参数。包括乳酸浓度的所有测量数据被馈送到控制器60。这些参数可以连续或周期性地测量。

除了在生物反应器10中测量的实时数据外，还可以收集来自先前细胞培养物的参考数据72并将其馈送到控制器60。过去参考数据的使用可以改善计算的未来乳酸浓度。例如，参考数据72可以包括细胞培养物中的乳酸浓度轨迹，其中乳酸影响参数已经大大变化，这可以改善控制器60的可预测性。

如图2所示，可以用目标乳酸分布对控制器60进行编程。控制器60可包括至少一个控制模型74。在一个实施例中，例如，控制器可包括分类模型和预测模型。可以配置分类模型以产生细胞培养物的温育期以乳酸积累状态或消耗乳酸状态结束的百分比概率。分类模型可以使用各种多元方法，包括单独的偏最小二乘分析或与线性判别分析结合使用。分类模型还可使用分类树、支持向量机等。在一个实施例中，可以将由每个分类模型得出的概率百分比的中位数用作细胞培养的最终概率百分比。在一个实施例中，可以向用户呈现细胞培养物将以乳酸积累状态结束的概率百分比，以便允许用户确定在细胞培养物的生长过程中是否需要干预以确保细胞培养物的温育期以所需的乳酸浓度极限而结束。

控制器60还可以包括预测模型。预测模型可以确定整个温育期间的未来乳酸浓度轨迹。另外，预测控制器可以配置为预测在指定的控制范围内生物反应器10内的一种或多种条件的变化将如何影响在指定的预测范围内的乳酸浓度。例如，如图2所示，预测模型74可以与优化器76通信。如果一个或多个条件改变，则优化器76可以配置为模拟生物反应器10内的结果。条件可以包括改变营养培养基的进料速率，从而改变葡萄糖浓度、谷氨酸盐浓度、天冬酰胺浓度等。除了营养物进料速率之外，优化器76还可以改变各种其他条件，包括pH和气体速率添加。优化器76可以运行多次模拟和多次迭代，以便确定细胞培养物中是否需要纠正措施，如果需要，则不仅要改变生物反应器的最佳条件，而且要确定改变的幅度。预测模型最终确定操纵变量的变化，以使乳酸浓度与指定参考轨迹的未来偏差最小。随着将来的数据馈送到控制器60，优化器76可以在整个温育期间继续运行模拟，以便进一步改变或调整操纵变量，从而改变细胞培养物中的一个或多个条件。

图3示出了一个实施例，通过该实施例，预测模型74和优化器76可以在控制器60内操作。如图3所示，进行细胞培养的各种测量并将其馈送到控制器。例如，控制器可以接收乳酸浓度信息、pH信息和营养供给信息。然后，预测模型计算或确定导致预测范围的乳酸浓度轨迹。如图3所示，控制器60也可以用乳酸浓度设定点进行预编程。设定点可以是细胞培养物中期望的最终乳酸浓度，其指示细胞培养物不处于乳酸积累状态。

如图3所示，在该实施例中，优化器76通过更改细胞培养物中的pH和营养物质进料来运行模拟。例如，优化器可以基于在受控范围内操纵pH和营养物进料来运行模拟。基于pH和营养物进料的变化，重新计算预测范围内的乳酸轨迹，以确定是否需要改变细胞培养物中的一种或多种条件，以将乳酸浓度水平维持在所需限度内。该过程可以在整个温育期间连续或周期性发生。如上所述，控制器60可以配置为自动控制生物反应器内的状况，或者可以被设计为警告用户，以便用户可以手动进行改变。

预测模型可以运行模拟并基于使用各种多元方法进行确定。在一个实施例中，例如，可以通过最小化或优化预测模型中的乳酸影响参数的变化来确定乳酸浓度轨迹，以便最小化乳酸浓度预测与规定的参考轨迹的加权平方偏差和每个操纵变量的变化和加权平方偏差。可以根据线性不等式约束执行此优化，具体取决于每个可控变量的数量会随时间变化。

在一个实施例中，预测模型可以包括采用降阶线性模型的预测控制算法，诸如降阶时间变化的自回归外生模型(ARX模型)。可以在预测模型中使用的技术包括神经网络、支持向量机，包括部分最小二乘分析在内的潜在变量建模。另外，可以使用决策树和线性判别分析。

在一个实施例中，将至少两种多元方法结合到预测模型中。例如，在确定乳酸浓度预测中，预测模型可以包括神经网络模型、支持向量机和潜在变异模型中的至少两个。

在一个实施例中，预测模型是非线性ARX模型，其包括模型回归器和非线性估计器。非线性估计器可以包括线性和非线性函数，线性和非线性函数作用于模型回归变量以提供模型输出。

在一个实施例中，设计了一种降阶模型，该模型足以表示要控制的系统的输入输出动态。可以识别出一组对感兴趣的输出有很大影响的操纵变量。结合先前的输出值的知识来操纵变量值的知识可用于预测未来的行为。在一个实施例中，多输入单输出ARX公式中的输入和输出之间的关系具有以下形式：

其中y(t)是输出/控制变量，u_j(t)表示n_i个操纵变量之一，n_k是时间延迟，n_a是极数，n_b是零数，a_i和b_ji是通过识别过程待确定的系统。在随时间变化的ARX模型中，代表每个参数影响的系数随时间(即天)而变化，因此该模型随时间变化。(1)中编写的ARX模型是提前一步的预测器；根据输出的先前值以及操作变量的当前值和先前值确定在t天的输出值。通过使用前一天的输出预测以及可控变量的规定值(例如由控制策略确定的值)，可以将该模型扩展为多步提前预测器，以预测未来的输出值。

在一个实施例中，可以通过最小化重复之间的任何多步自举均方根预测误差来确定模型参数。在这些多步骤模拟中，可以将记录的过程数据用于操作变量，而将上述方程式的预测输出值用于后续的预测时间(day)。

如上所述，在一个实施例中，本公开的系统和方法涉及使用一组受控变量来调节乳酸浓度。在一个实施例中，模型预测控制器可以根据对期望的乳酸浓度以及所记录的操纵变量和乳酸浓度的先前值的了解，在控制范围内规定操纵变量的值。模型预测控制器可以采用从历史过程数据中开发的随时间变化的ARX模型来确定可操纵变量的值，所述变量值将导致将来乳酸浓度达到所需值。乳酸预测是在预测范围内从控制范围内的操作变量值序列中以多步方式生成的。在控制范围内确定操作变量的最佳值，以最小化目标函数，该函数涉及模型输出预测与预测范围内所需轨迹的偏差。一旦确定了操纵变量的最佳顺序，在一个实施例中，这些值中只有第一个可以在生物反应器中使用。以这种方式，在下一个采样时刻，测量乳酸浓度并重复该过程。因为在每个随后的优化周期中都使用了记录的而不是预测的乳酸浓度，所以在多步预测中可能累积的预测误差对控制器实现的影响受到限制。

在一个实施例中，模型预测控制器的设计可以包括指定多个设计参数以计算在控制器操作期间优化的目标函数。例如，在一个实施例中，可以基于最小均方使用以下算法：

其中：

P是预测范围内的天数

是降阶模型中乳酸浓度的预测值

r是所需参考轨迹的乳酸浓度值

是待应用于预测范围中每一天的预测输出与参考轨迹之间的差异的权重

n_mv是操纵变量的数量

u_j是特定日期操作变量j的值

是在第i^th个预测天数上对操纵变量j的后续操纵变量值之间的差应用的权重

是第j^th个操纵变量的比例因子，用于处理操纵变量之间的比例差异

在一个实施例中，可以将上述方程式右侧的系数设置为0，以提供以下简化方程式。

其中：P是预测范围内的天数；

是降阶模型中乳酸浓度的预测值；r是所需参考轨迹的乳酸浓度值；

是待应用于预测范围中每一天的预测输出和参考轨迹之间的差异的权重。

目标函数使来自参考轨迹的预测输出中的差异不利。如果对远期降阶模型的多步预测准确性存在担忧，则可以在整个预测范围内使用不同的权重。通过最小化关于受控变量的边界约束和速率约束的目标函数，可以实现在控制范围内受控变量的最佳值。

特别有利的是，本公开的控制器60能够在温育期的早期提供指示，以指示细胞培养物是否将以乳酸积累状态结束。例如，已经发现该预测模型是可靠的，因此可以在过程中尽早做出有关乳酸浓度的准确预测，这提供了采取纠正措施的充分机会，以便通过提高滴定度浓度来改善产品质量。

例如，控制器可以配置成在少于大约40％的温育时间，例如少于大约30％的温育时间，例如少于大约20％的温育时间之后做出关于乳酸浓度的初始预测。温育时间，例如小于温育时间的约15％，例如小于温育时间的约10％，甚至小于温育时间的约5％。例如，在一个实施例中，控制器可以在细胞培养物中接收周期性的乳酸浓度信息，并在细胞培养的最初12小时内、例如在细胞培养的最初2天内、例如在细胞培养的最初4天内，接收关于至少一种其他乳酸影响参数的数据，并且控制器能够准确确定乳酸浓度轨迹，从而确定是否需要采取纠正措施。例如，在一个实施例中，控制器60可以在接收数据约12小时至约4天之后并且基于数据如何适合于预测模型而开始对生物反应器中的至少一种状况进行选择性调节。

为将来控制乳酸浓度，可以改变生物反应器内的一种或多种条件。例如，可以选择性地控制生物反应器内的一种或多种影响乳酸的参数，以控制乳酸的浓度。改变的条件可以包括pH、碳水化合物浓度(例如葡萄糖浓度)、氨基酸浓度(例如谷氨酸盐浓度和/或天冬酰胺浓度)等。可以通过向细胞培养物中加入酸或碱来改变细胞培养物的pH，例如将二氧化碳气体通过喷雾器和/或将碳酸氢钠加入细胞培养物中。细胞培养物中的碳水化合物浓度和/或氨基酸浓度可以通过改变进料到生物反应器10中的营养培养基来改变和修饰。

在一个实施例中，例如，除了乳酸浓度之外，还可以监测谷氨酸盐浓度并将其馈送到控制器60。基于温育期间内的预测乳酸轨迹，然后可以选择性地控制谷氨酸盐浓度以便保持乳酸浓度在所需范围内。在另一可替代的实施例中，可以结合乳酸浓度监测天冬酰胺浓度。如果需要采取任何纠正措施以将乳酸浓度保持在预先选择的范围内，则可以通过控制营养培养基的流量或通过单独控制天冬酰胺来增加或降低天冬酰胺向生物反应器的流量来控制天冬酰胺的浓度。在一个实施例中，除了监测和控制pH之外，在该过程中还监测谷氨酸盐浓度、天冬酰胺浓度或谷氨酸盐浓度和天冬酰胺浓度两者。已经发现除了一种或多种氨基酸或一种或多种碳水化合物外，监测和控制pH可有效地将乳酸浓度保持在精心控制的范围内。

如上所述，在一个实施例中，可以控制所监测的乳酸影响参数以对乳酸浓度具有期望的影响。然而，在替代实施例中，在过程中可以监测第一乳酸影响参数，而可以控制第二乳酸影响参数，以影响乳酸浓度。

已经发现本公开的系统和方法有效地控制细胞培养物中乳酸的浓度。例如，通过本公开的方法，细胞培养物的温育期可以以消耗乳酸的状态来结束，并且可以防止以乳酸积累的状态来结束。细胞培养物中乳酸的最终浓度将取决于许多因素，并且主要取决于所繁殖的细胞的类型。在一个实施例中，细胞培养物的最终乳酸浓度通常可以约小于3g/L、例如约小于2.5g/L、例如约小于2g/L、例如约小于1.5g/L、例如约小于1g/L。

特别有利的是，控制器60还可以包括鲁棒的预测模型，该模型不仅可以针对不同的生物反应器类型和生物反应器体积进行扩展的，而且还可以有效地应对多种多样的细胞系。例如，发现当预测模型使用不止一种多元技术时，例如当使用两种多元技术或三种多元技术时，该预测模型非常适合用于多细胞系。

除了监测一种或多种乳酸影响参数外，控制器还可以控制各种其他工艺条件。例如，控制器可以与热循环器、称重传感器、控制泵进行通信和控制，并从各种传感器和探头接收信息。例如，控制器可以控制和/或监视氧张力、温度、搅拌条件、压力、泡沫水平等。例如，控制器可以接收温度信息并控制流体供给到生物反应器周围的水套中以增加或降低温度。

通过本公开的方法，可以以优异的产品特性生长细胞培养物。例如，可以以优异的生存力特征培养细胞培养物。例如，可以通过将活细胞计数除以总细胞计数来测量生存力，这是可以在过程中同时测量的两个参数。根据本发明，细胞培养物可以根据本发明生长，所述细胞培养物具有大于约0.6，例如大于约0.7、例如大于约0.8、例如大于约0.9的如上所述的生存率。实际上，生存率可以约大于0.94、例如约大于0.96、例如约大于0.98。

另外，出乎意料地发现，本公开的系统和方法可以提高滴定度生产率。特别地，发现相对于根据本发明未控制的相同细胞培养物，根据本发明方法控制的细胞培养物可增加的产物滴度浓度，并且其中两种细胞培养物均以完全同的乳酸浓度来终止相或彼此在0.5g/L之内的乳酸浓度而终止，例如在0.25g/L之内。这个结果是惊人的和出乎意料的。

参考以下示例可以更好地理解本公开。

示例

使用五个克隆的补料分批过程数据来创建随时间变化的动态模型，该动态模型用于编程到控制器中的预测模型中，以根据规定的pH值和营养物体积预测未来的乳酸浓度的天数。在温育期的第三天后，预测模型确定了在控制范围内采用的最佳pH值和养分量，该值可在运行的余下的时间内最佳地将乳酸浓度驱动至规定的设定点。第二天采用这些优化的pH和营养成分值。在输入乳酸浓度后，每天结束时重复该过程。繁殖的细胞培养物是用于生产蛋白质产物的哺乳动物细胞培养物。传播了八种不同的培养物。根据本公开，使用预测模型控制四种细胞培养物。剩余的四种细胞培养物生长，以用于比较。每种细胞培养物均在1升搅拌釜的生物反应器中生长。然而，根据本公开，两种细胞培养物在1.5升搅拌釜的生物反应器中生长并用预测模型控制，以证明可扩展性。繁殖了以下8种样品细胞培养物：

如上所述，根据本公开，控制了No.3、4、7和8的样品。

更具体地，稳定表达重组蛋白的CHO-K1SV衍生的克隆常规地使用可商购的CD-CHOAGT^TM悬浮培养。将接种菌培养液在Kuhner孵化器中的摇瓶中保持在37℃，5％CO₂的条件下，且无湿度控制。使细胞定期繁殖以维持指数生长，并根据需要扩展以接种台式生物反应器以进行本文所述的实验。

使用2-L尺寸的玻璃生物反应器(BroadleyJames)进行补料分批实验。pH、DO和温度设定点等生物反应器条件根据实验计划而有所不同。培养液的pH使用CO₂喷射和添加碱滴定剂进行控制。根据需要使用氧气喷射将溶解的氧气保持在设定点。使用加热夹套控制培养温度。根据需要添加浓缩的葡萄糖储备溶液，以在整个生产过程中保持至少0.5g/L的残留葡萄糖浓度。反应器实验进行了12天。

已经开发出分类模型，以根据直到指定结束日(第3、4和5天)的过程数据预测最终的乳酸状态。对于考虑的每个结束日，开发了以下分类模型：线性判别分析(LDA)、分类树、应用于偏最小二乘得分的线性判别分析(PLS-LDA)、支持向量机(SVM)和逻辑回归。每个模型都是使用Matlab统计和机器学习工具箱(R2016b)中的函数(fitcdiscr、fitctree、plsregress、fitcsvm、fitglm)从训练数据集中存在的批量展开过程数据中计算出来的。跨分类模型采用了0.5(即50％)的类别阈值概率。

在所有结束日期持续产生良好分类精度的模型包括：PLS-LDA、LDA、分类树和这些模型的集合。分类模型能够准确地对有利和不利的乳酸运行进行分类，验证准确性介于83％(第3天)到88％(第4和5天)之间。尽管第4天和第5天模型总共达到了等效的验证分类准确性，但第4天整体模型在各个克隆之间产生了比较一致的验证性能。模型中通常出现的属性包括代谢物(谷氨酸盐、葡萄糖和谷氨酰胺)和与pH调节相关的属性(CO₂喷射速率)。

在Matlab中建立了采用时变ARX模型的模型预测控制器(MPC)，并使用Matlab优化工具箱(R2016b)的fmincon来最小化成本函数。在仿真中初始化控制器设计参数，并在初步实验运行期间对其进行调整。具体而言，将所有天数的所需乳酸参考轨迹设置为零。所采用的预测范围和控制范围分别为7天和1天。第3天后，由于仅需要进行第10天的预测，所以预测范围减小了。第10天后，受控变量的值保持在最后一个控制器指定的值。较长的预测范围可确保考虑到运行结束时受控变量变化的全部影响，而较短的控制范围可确保对受控变量采取积极的控制措施。由于在较长的预测范围内预测准确性不会显着降低，因此所有预测误差都被认为对最小化成本函数有同等的贡献(即，所有

都设置为成一致(unity))。营养供给的量应限制在1.8％和3.6％之间，第3-6天的最大变化限制为+/-1.8％，否则为+/-1.0％。pH的约束条件确定为6.7和7.2，这几天之间的最大pH变化设置为+/-0.5。

将所得的MPC用于一系列实验生物反应器运行中，以确定其将运行驱动至有利的乳酸终止状态的功效(efficacy)。实验中使用的细胞培养物与已知在现有方法开发中表现出乳酸积累的克隆相关。实验MPC运行与两个对照运行同时进行：一个具有已知乳酸累积行为的基础运行，第二个运行是在正常操作条件下，供给中所含的补充天冬酰胺达到了良好的乳酸最终状态。在这组实验中，在原始反应器工作体积(1L)和按比例放大工作体积1.5L的条件下，采用了pH和营养物质进料量的变化。两种对照运行均按预期进行，补充基础和天冬酰胺的运行分别以不利和有利的乳酸状态结束。MPC运行在第3天结束时开始控制，导致细胞培养物达到良好的乳酸终止状态，且乳酸浓度明显低于基础运行。

一组实验还评估了MPC补偿pH和葡萄糖浓度引起的乳酸诱导的干扰的能力。在每次运行的早期都使用升高的pH或葡萄糖水平，以产生升高的乳酸浓度水平。在该实验的所有运行中均使用补充天冬酰胺的供给。使用了两次对照运行：一次具有正常的pH和葡萄糖水平，第二次具有升高的pH水平(7.2和0.15死区)。一个MPC运行在第3天使用与相应对照运行相同的升高的pH水平，而第二个MPC运行具有增加的初始葡萄糖浓度。MPC运行拒绝了pH和葡萄糖的初始干扰，两次运行均比升高的pH对照运行产生更低的最终乳酸浓度。其他测量的细胞培养参数的变化遵循与初始实验中所证实的趋势相似的趋势。与之前的实验相反，MPC实验的存活细胞密度与对照实验的pH值没有升高相似。MPC运行中增加的营养物质进料量会导致铵离子浓度增加和谷氨酸盐延迟消耗。

参照图4和5，显示了在12天的温育期内的乳酸浓度。如图所示，含有普通营养培养基而没有对照的1号样品产生了非常高的乳酸浓度。因此，过去，为了控制乳酸水平，针对特定的细胞培养物对营养培养基进行了修饰和优化。例如，样品2、5和6中的营养培养基均已修饰。

3号和4号样品是仅向细胞培养物供给通用营养培养基的细胞培养生长(run)，但是根据本发明来控制细胞培养。如图4所示，无需改变特定细胞培养物的营养培养基，就可以控制乳酸水平。图4和图5证明了该预测模型能够在温育期内控制乳酸浓度。

参照图6和7，显示了在12天的温育期内的营养供给和pH。

图8和9显示了在12天的温育期内的铵浓度谷氨酸盐浓度和谷氨酰胺浓度。另一方面，图10和11显示了细胞培养物中的葡萄糖进料和葡萄糖浓度。

图12和13与产品质量有关。这些图显示了细胞存活率百分比和活细胞密度。另一方面，图14和15显示了滴定剂进料和重量克分子渗透压浓度。

图16至图19示出了，即使最终乳酸浓度保持与不受控制的细胞培养物相似的情况下，根据本公开内容控制的细胞培养物实际上如何产生更高的产物浓度。

为了进行滴度分析，将标准曲线一式三份运行，并在整个温育期间分散。将这些值取平均值以构建用于定量的标准曲线。分析了第7至13天或7至14天。

图16和17显示产物滴定度(标准化)。如图所示，根据本公开内容繁殖的细胞培养物意外地并且显着地具有增加的产物滴度或浓度。类似的结果在图18和19中示出。图18和19示出了每天产生的细胞数量。

本文所述的装置、设施和方法适用于培养任何期望的细胞系，包括原核和/或真核细胞系。此外，在实施例中，所述装置、设施和方法适合于培养悬浮细胞或贴壁依赖性(贴壁)细胞，并且适合于配置用于生产药物和生物药物产品--例如多肽产品、核酸产品(例如DNA或RNA)，或细胞和/或病毒(例如用于细胞和/或病毒疗法的细胞和/或病毒)。

在实施例中，细胞表达或产生产物，例如重组治疗或诊断产物。如下文更详细地描述，细胞产生的产物的实例包括但不限于抗体分子(例如，单克隆抗体、双特异性抗体)、抗体模拟物抗体(与抗原特异性结合但在结构上不相关的多肽分子，例如DARPins、亲和体、adnectins或IgNARs)、融合蛋白(例如Fc融合蛋白、嵌合细胞因子)，其他重组蛋白(例如糖基化蛋白、酶、激素)、病毒疗法(例如抗癌溶瘤剂，用于基因治疗和病毒免疫治疗的病毒载体)、细胞治疗剂(例如多能干细胞、间充质干细胞和成年干细胞)、疫苗或脂质包裹的颗粒(例如外来体、病毒样颗粒)、RNA(例如siRNA)或DNA(例如质粒DNA)、抗生素或氨基酸。在实施例中，所述装置、设施和方法可用于生产生物仿制药。

如所提及的，在实施例中，装置、设备和方法允许产生真核细胞(例如哺乳动物细胞)或低等真核细胞(例如酵母细胞或丝状真菌细胞)，或原核细胞(例如革兰氏阳性或由真核细胞大规模合成的革兰氏阴性细胞)和/或真核或原核细胞的产物(例如蛋白质、肽、抗生素、氨基酸、核酸(例如DNA或RNA)。除非本文另有说明，否则装置、设施和方法可以包括任何所需的体积或生产能力，包括但不限于小型规模、中试规模和完整生产规模的能力。

此外，除非另有说明，否则装置、设备和方法可包括任何合适的反应器，包括但不限于搅拌釜、气浮、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷射床生物反应器。如本文所用，“反应器”可包括发酵罐或发酵单元，或任何其他反应容器，并且术语“反应器”可与“发酵罐”互换使用。例如，在一些方面，示例性生物反应器单元可以执行以下一项或多项或全部：营养物和/或碳源的进料、合适的气体(例如氧气)的注入、发酵的入口和出口流或细胞培养基、气相和液相分离、维持温度、维持氧气和二氧化碳水平、维持pH值水平、搅拌(例如搅拌)和/或清洗/消毒。示例性的反应器单元(例如发酵单元)可以在该单元内包含多个反应器，例如，该单元可以具有1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45，每个单元和/或设施中的50、60、70、80、90或100或更多的生物反应器可以包含多个在设施中具有单个或多个反应器(reacotrs)的单元。在各种实施例中，生物反应器可以适合于分批、半分批、分批、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施例中，生物反应器可具有约100mL至约50,000L的体积。非限制性实例包括100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升公升、1000公升、1500公升、2000公升、2500公升、3000公升、3500公升、4000公升、4500公升、5000公升、6000公升、7000公升、8000公升、9000公升、10000公升、15000公升、20000公升，和/或50000升。另外，合适的反应器可以是多次使用、一次性使用、一次性或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，所述材料包括金属合金(例如不锈钢(例如316L或任何其他合适的不锈钢)和因科镍合金)、塑料和/或玻璃。

在实施例中，除非本文另有说明，否则本文描述的装置、设施和方法还可以包括任何其他未提及的合适的单元操作和/或设备，例如用于分离、纯化和分离这种产品的操作和/或设备。可以使用任何合适的设施和环境，例如传统的棒状建筑设施、模块化、移动和临时设施，或任何其他合适的构造、设施和/或布局。例如，在一些实施例中，可以使用模块化的洁净室。另外并且除非另有说明，本文描述的装置、系统和方法可以在单个位置或设施中容纳和/或执行，或者可替代地在单独或多个位置和/或设施中容纳和/或执行。

通过非限制性实例而非限制地，美国公开号2013/0280797号、2012/0077429、2011/0280797、2009/0305626和美国专利号8,298,054、7,629,167、No.5,656,491(通过引用整体并入本文)描述了可能合适的示例设施、设备和/或系统。

在实施例中，细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是例如人或啮齿动物或牛细胞系或细胞株。这种细胞、细胞系或细胞株的例子是例如小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HT1080、H9、HepG2、MCF7、MDBK Jurkat、NIH3T3、PC12、BHK(婴儿仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、YB2/0、Y0、C127、L细胞、COS(例如COS1和COS7)、QC1-3、HEK-293、VERO、PER.C6、Hela、EB1、EB2、EB3、溶瘤或杂交瘤细胞系。优选地，哺乳动物细胞是CHO细胞系。在一个实施例中，该细胞是CHO细胞。在一个实施例中，该细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1 SV细胞、DG44CHO细胞、DUXB11 CHO细胞、CHOS、CHO GS敲除细胞、CHO FUT8 GS敲除细胞、CHOZN或CHO衍生的细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GSKO细胞)是例如CHO-K1 SV GS敲除细胞。例如，CHO FUT8敲除细胞是

CHOK1 SV(Lonza Biologics，Inc.)。真核细胞也可以是禽细胞、细胞系或细胞株，例如，

细胞、EB14、EB24、EB26、EB66或EBv13。

在一个实施例中，真核细胞是干细胞。干细胞可以是例如多能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)、成年干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、组织特异性干细胞(例如造血干细胞)和间充质干细胞(MSC)。

在一个实施例中，细胞是本文描述的任何细胞的分化形式。在一个实施例中，细胞是源自培养物中任何原代细胞的细胞。

在实施例中，细胞是肝细胞，例如人肝细胞、动物肝细胞或非实质细胞。例如，该细胞可以是可平板代谢合格的人类肝细胞、可平板诱导诱导的人类肝细胞、可电镀QualystTransporter CertifiedTM人肝细胞、悬浮液合格的人类肝细胞(包括10个供体和20个供体合并的肝细胞)、人肝库普夫细胞、人肝星状细胞、狗肝细胞(包括单个和合并的Beagle肝细胞)、小鼠肝细胞(包括CD-1和C57BI/6肝细胞)、大鼠肝细胞(包括Sprague-Dawley，WistarHan和Wistar肝细胞)、猴肝细胞(包括食蟹猴或恒河猴猴子肝细胞)、猫肝细胞(包括家养短毛猫肝细胞)和兔肝细胞(包括新西兰白肝细胞)。肝细胞的例子可从美国北卡罗来纳州戴维斯驱动公园(LLC,6,Davis Drive Research Triangle Park,North Carolina,USA27709)三角研究实验室商业地购得。

在一个实施例中，真核细胞是低等真核细胞，例如酵母细胞(例如毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)和安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))、巴斯德毕赤酵母属(Komagataellagenus)(例如巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris)、巴斯德毕赤酵母(Komagataellapseudopastoris)或巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii))、酿酒酵母属(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、啤酒酵母(cerevisae)，克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum))、克鲁维酵母属(例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))、假丝酵母属(例如产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii))、白地霉属(例如发酵地霉(Geotrichum fermentans))、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。优选的是巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母菌株的实例是X33、GS115、KM71、KM71H和CBS7435。

在一个实施例中，真核细胞是真菌细胞(例如曲霉属(例如黑曲霉、烟曲霉、米曲霉、小巢状曲菌)、枝顶孢属(例如嗜热枝顶孢)、毛壳菌属(例如嗜热毛壳菌)、金孢子菌属(如嗜热金孢子菌)、虫草属(例如蛹虫草)、棒囊壳属、栉霉属(Ctenomyces)、镰刀霉(Fusarium)(例如尖孢镰刀菌(F.oxysporum))、小丛壳属(如禾谷球孢菌(G.graminicola))、肉座菌属(例如红褐肉座菌)、稻瘟病菌(如稻瘟菌)、毁丝霉属(例如嗜热毁丝霉)、丛赤壳属(例如血赤壳)、链孢霉菌(例如粗糙链孢菌)、青霉菌、侧孢霉属(例如嗜热侧孢霉)、梭孢壳属(例如太瑞斯梭孢壳霉(T.terrestris)、异宗梭孢壳菌(T.heterothallica))、木霉属(例如里氏木霉)或轮枝菌属(例如由大黄轮枝菌))。

在一个实施例中，真核细胞是昆虫细胞(例如，Sf9、MimicTMSf9、Sf21、HighFiveTM(BT1-TN-5B1-4)或BT1-Ea88细胞)、藻类细胞(例如，双眉藻属、硅藻纲要(Bacillariophyceae)、杜氏藻属、小球藻属、衣藻属、蓝藻属(蓝藻细菌)、微绿球藻属、螺旋藻属或棕鞭藻属)或植物细胞(例如单子叶植物(例如玉米、水稻、小麦或狗尾草)或双子叶植物(例如，木薯、马铃薯、大豆、番茄、烟草、苜蓿、小立碗藓(Physcomitrella patens)或拟南芥)。

在一个实施例中，细胞是细菌或原核细胞。

在实施例中，原核细胞是革兰氏阳性细胞，例如芽孢杆菌、链霉菌、链球菌、葡萄球菌或乳杆菌。可以使用的芽孢杆菌是例如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。在实施例中，所述细胞是枯草芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌3NA和枯草芽孢杆菌168。哥伦布OH43210-1214西12大道556,484生物科学芽孢杆菌遗传库中心(Bacillus Genetic Stock Center，Biological Sciences 556,484West12thAvenue，Columbus OH 43210-1214)。

在一个实施例中，原核细胞是革兰氏阴性细胞，例如沙门氏菌，或大肠杆菌，例如TG1、TG2、W3110、DH1、DHB4、DH5a、HMS 174、HMS174(DE3)、NM533、C600、HB101、JM109、MC4100、XL1-Blue和Origami，以及衍生自大肠杆菌B菌株，例如BL-21或BL21(DE3)，所有这些都可商购获得。

合适的宿主细胞可商购，例如购自诸如德国微生物保藏DSMZ(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen)和德国布伦瑞克细菌培养股份有限公司(Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)的培养物保藏中心或美国模式菌种保藏中心(ATCC)(AmericanType Culture Collection)。

在实施例中，培养的细胞用于产生蛋白质(例如抗体，例如单克隆抗体)和/或重组蛋白质，用于治疗用途。在实施例中，培养的细胞产生肽、氨基酸、脂肪酸或其他有用的生化中间体或代谢产物。例如，在实施例中，可以产生具有约4000道尔顿至大于约140000道尔顿的分子量的分子。在实施例中，这些分子可以具有一定范围的复杂性，并且可以包括翻译后修饰(包括糖基化)。

在实施例中，目标蛋白(POI)是，例如BOTOX、肉毒杆菌、肉毒毒素制剂、益普生肉毒杆菌素(Dysport)(或其它肉毒杆菌神经毒素的血清型)、葡糖苷酶α、达托霉素、YH-16、绒毛膜促性腺激素α，非格司亭、西曲瑞克、白细胞介素-2、阿地白介素、替西白介素(teceleulin)、地尼白介素、干扰素α-n3(注射)、干扰素α-nl、DL-8234、干扰素、三得利(γ-1a)、干扰素γ、胸腺素α1、他索纳明、DigiFab、ViperaTAb、EchiTAb、CroFab、奈西立肽、阿巴西普、阿法赛特、利比、艾投特明α(eptoterminalfa)、特立帕肽(骨质疏松症)、注射用降钙素(骨病)、降钙素(鼻，骨质疏松症)、依那西普、谷他血红蛋白250(牛)(hemoglobinglutamer 250(bovine))、屈特尔康金α(drotrecogin alpha)、胶原酶、卡培立肽、重组人表皮生长因子(局部凝胶，伤口愈合)、DWP401、达贝泊汀α(darbepoetin alpha)、依泊汀ω(epoetin omega)、依泊丁β、依泊丁α、地西卢定、来匹芦定、比伐卢定、诺那凝血素α、凝血因子Ⅸ粉针剂(Mononine)、依他凝血素α(活化)、重组因子VIII+VWF、浓缩的重组抗血友病因子、重组因子VIII、因子VIII(重组)、血源性凝血因子(Alphanate)、辛凝血素α(octocogalpha)、因子VIII、帕利夫明、印地激酶(indikinase)、替奈普酶、阿替普酶、帕米普酶、瑞替普酶、那替普酶、孟替普酶、促滤泡素α、rFSH、hpFSH、米卡芬净、非格司亭、来格司亭、那托司亭、舍莫瑞林、胰高血糖素、艾塞那肽、普兰林肽、伊米苷酶(iniglucerase)、加硫酶、留可曲平(leucotropin)、莫拉司亭(molgramostirn)、醋酸曲普瑞林、组氨瑞林(皮下植入物，Hydron)、地洛瑞林、组氨瑞林、那法瑞林、亮丙瑞林缓释库(缓释给药系统)、亮丙瑞林植入物(DUROS)、戈舍瑞林、尤得盼(Eutropin)、KP-102程序(KP-102program)、促生长激素、美卡舍明(生长障碍)、恩夫韦替(enlfavirtide)、Org-33408、甘精胰岛素、赖谷胰岛素、胰岛素(吸入)、赖脯胰岛素、地特胰岛素、胰岛素(口腔，RapidMist)、美卡舍明-林菲培、阿那白滞素、基因重组IL-2、99mTc-阿西肽(apcitide)注射液、麦罗匹德(myelopid)、重组干扰素β-1b、醋酸格拉替雷、格旁(Gepon)、沙格司亭、奥普瑞白介素、人白细胞衍生的α干扰素、倍尔来福(Bilive)、胰岛素(重组)、重组人胰岛素、门冬胰岛素、美卡舍明(mecasenin)、干扰素α-2a、干扰素-α2、阿尔法弗隆(Alfaferone)、复合α干扰素、干扰素α、阿温耐克斯重组人黄体生成素(Avonex'recombinant human luteinizing hormone)、脱氧核糖核酸酶、曲弗明、齐考诺肽、他替瑞林、地博特明α(diboterminalfa)、阿托西班、贝卡普勒明、依替巴肽、扎马拉(Zemaira)、CTC-111、夏伐克-B(Shanvac-B)、HPV疫苗(四价)、奥曲肽、兰瑞肽、安瑟斯替(ancestirn)、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、拉罗尼酶、蓝铜胜肽(外用凝胶)、拉布立酶、兰尼单抗、干扰素γ-1b、佩乐能、曲可明(Tricomin)、重组屋尘螨过敏脱敏注射液、重组人甲状旁腺激素(PTH)1-84(sc，骨质疏松症)、依泊汀δ、转基因抗凝血酶III、格兰蒂曲平(Granditropin)、透明质酸酶、重组胰岛素、干扰素-α(口服含片)、GEM-21S、伐普肽、艾度硫酸酯酶(idursulfase)、奥马曲拉(omnapatrilat)、重组血清白蛋白、赛妥珠单抗、羧肽酶(glucarpidase)、人重组C1酯酶抑制剂(血管神经性水肿)、拉诺替普酶、重组人生长激素、恩夫韦肽(无针注射，生物喷射器200(Biojector 2000))、VGV-1、干扰素(α)、芦西纳坦(lucinactant)、阿肽地尔(吸入，肺部疾病)、艾替班特、艾卡拉肽(ecallantide)、奥米加南、奥罗格雷(Aurograb)、醋酸培西加南、ADI-PEG-20、LDI-200、地加瑞克、贝辛白介素(cintredelinbesudotox)、Favld、MDX-1379、ISAtx-247、利拉鲁肽、特立帕肽(骨质疏松症)、替法可近、AA4500、T4N5脂质体洗剂、卡妥索单抗、DWP413、ART-123、克里萨林(Chrysalin)、去氨普酶、安地普酶、绒促卵泡素α(corifollitropinalpha)、TH-9507、替度鲁肽、戴麦德(Diamyd)、DWP-412、生长激素(缓释注射)、重组G-CSF、胰岛素(吸入，AIR)、胰岛素(吸入，Technosphere)、胰岛素(吸入，AERx)、RGN-303、DiaPep277、干扰素β(丙型肝炎病毒感染)(HCV))、干扰素α-n3(口服)、贝拉西普(belatacept)、透皮胰岛素贴剂、AMG-531、MBP-8298、Xerecept、奥培巴坎、AIDSVAX、GV-1001、LymphoScan、豹蛙酶、利普散(Lipoxysan)、卢舒普肽、MP52(β-磷酸三钙载体、骨再生)、黑色素瘤疫苗、西普乐克-T(sipuleucel-T)、CTP-37、印瑟吉(Insegia)、维特斯朋(vitespen)、人凝血酶(冷冻，手术出血)、凝血酶、TransMID、蛇毒纤溶酶(alfimeprase)、普瑞凯希、特利加压素(静脉注射，肝肾综合征)、EUR-1008M、重组FGF-I(注射，血管疾病)、BDM-E、罗替格普肽(rotigaptide)、ETC-216、P-113、MBI-594AN、耐久霉素(吸入，囊性纤维化)、SCV-07、OPI-45、内皮抑素、血管抑制素、ABT-510、鲍曼-伯克抑制剂浓缩物(Bowman Birk Inhibitor Concentrate)、XMP-629、99mTc-Hynic-磷脂结合蛋白V、卡哈拉德F(kahalalide F)、CTCE-9908、替维瑞克(延长释放)、奥扎里克(ozarelix)、罗米德普(rornidepsin)、BAY-504798、白细胞介素4、PRX-321、佩斯坎(Pepscan)、埃布他德金(iboctadekin)、rh乳铁蛋白、TRU-015、IL-21、ATN-161、西仑吉肽、白蛋白干扰素、Biphasix、IRX-2、ω干扰素、PCK-3145、CAP-232、帕西瑞肽、huN901-DMI、卵巢癌免疫治疗疫苗、SB-249553、Oncovax-CL、OncoVax-P、BLP-25、CerVax-16、多表位肽黑色素瘤疫苗(MART-1，gp100，酪氨酸酶)、奈米非肽、rAAT(吸入)、rAAT(皮肤病学)、CGRP(吸入，哮喘)、培那西普(pegsunercept)、胸腺素β4、普利德普(plitidepsin)、GTP-200、雷莫拉宁、GRASPA、OBI-1、AC-100、鲑鱼降钙素(口服，艾力更(eligen))、降钙素(口服，骨质疏松症)、艾沙瑞林、卡普瑞林、卡德法(Cardeva)、维拉弗明(velafermin)、131I-TM-601、KK-220、T-10、乌拉立肽、地来司他(depelestat)、赫马肽(hematide)、克里萨林(Chrysalin)(局部)、rNAPc2、重组因子V111(聚乙二醇化脂质体)、bFGF、聚乙二醇化重组葡萄球菌激酶变体、V-10153、SonoLysis Prolyse、NeuroVax、CZEN-002、胰岛细胞新生疗法(isletcellneogenesis therapy)、rGLP-1、BIM-51077、LY-548806、艾塞那肽(控制释放，微球体(Medisorb))、AVE-0010、GA-GCB、阿伏瑞林、ACM-9604、乙酸利那洛肽(linaclotideacetate)、CETi-1、赫莫斯盘(Hemospan)、VAL(可注射的)、速效胰岛素(可注射的、Viadel)、鼻内胰岛素、胰岛素(吸入)、胰岛素(口服、艾力更(eligen))、重组甲硫氨酸人瘦素、皮崔金拉(pitrakinra)(皮下注射，湿疹)、皮崔金拉(吸入干粉，哮喘)、白细胞介素注射剂、RG-1068、MM-093、NBI-6024、AT-001、PI-0824、Org-39141、Cpn10(自身免疫疾病/炎症)、ta乳铁传递蛋白(talactoferrin)(局部)、rEV-131(眼科)、rEV-131(呼吸系统疾病)、口服重组人胰岛素(糖尿病)、RPI-78M、奥普瑞白介素(口服)、CYT-99007CTLA4-Ig、DTY-001、伐拉司特(valategrast)、干扰素α-n3(局部)、IRX-3、RDP-58、涛弗隆(Tauferon)、胆盐刺激脂肪酶、梅里斯普酶(Merispase)、碱性磷酸酶、EP-2104R、美拉诺坦-II(Melanotan-II)、布雷默浪丹、ATL-104、重组人微纤溶酶、AX-200、SEMAX、ACV-1、Xen-2174、CJC-1008、强啡肽A、SI-6603、LAB GHRH、AER-002、BGC-728、疟疾疫苗(病毒体，PeviPRO)、ALTU-135、细小病毒B19疫苗、流感疫苗(重组神经氨酸酶)、疟疾/HBV疫苗、炭疽疫苗、Vacc-5q、Vacc-4x、HIV疫苗(口服)、HPV疫苗、达特类毒素(Tat Toxoid)、YSPSL、CHS-13340、PTH(1-34)脂质体乳膏(Novasome)、奥斯布尔(Ostabolin-C)、PTH类似物(局部，牛皮癣)、MBRI-93.02、MTB72F疫苗(结核病)、MVA-Ag85A疫苗(结核病)、FARA04、BA-210、重组鼠疫FIV疫苗、AG-702、OxSODrol、rBetV1、Der-p1/Der-p2/Der-p7过敏原靶向疫苗(尘螨过敏)、PR1肽抗原(白血病)、突变体ras疫苗、HPV-16E7脂肽疫苗、迷路(labyrinthin)疫苗(腺癌)、CML疫苗、WT1-肽疫苗(癌症)、IDD-5、CDX-110、明曲斯(Pentrys)、诺雷林(Norelin)、CytoFab、P-9808、VT-111、艾罗卡肽(icrocaptide)、替柏明(telbermin)(皮肤病、糖尿病足溃疡)、芦平曲韦、雷替库罗(reticulose)、rGRF、HA、α-半乳糖苷酶A、ACE-011、ALTU-140、CGX-1160、血管紧张素治疗性疫苗、D-4F、ETC-642、APP-018、rhMBL、SCV-07(口服，结核)、DRF-7295、ABT-828、ErbB2比免疫毒素(抗癌)、DT3SSIL-3、TST-10088、PRO-1762、库姆波托(Combotox)、缩胆囊素-B/胃泌素受体结合肽、111In-hEGF、AE-37、曲妥珠单抗(trasnizumab)-DM1、拮抗剂G、IL-12(重组)、PM-02734、IMP-321、rhIGF-BP3、BLX-883、CUV-1647(局部)、基于L-19的放射免疫治疗剂(癌症)、Re-188-P-2045、AMG-386、DC/1540/KLH疫苗(癌症)、VX-001、AVE-9633、AC-9301、NY-ESO-1疫苗(肽)、NA17.A2肽、黑素瘤疫苗(脉冲抗原治疗药)、前列腺癌疫苗、CBP-501、重组人乳铁蛋白(干眼症)、FX-06、AP-214、WAP-8294A(可注射的)、ACP-HIP、SUN-11031、肽YY[3-36](肥胖，鼻内)、FGLL、阿塞西普、BR3-Fc、BN-003、BA-058、人甲状旁腺激素1-34(鼻，骨质疏松症)、F-18-CCR1、AT-1100(乳糜泻/糖尿病)、JPD-003、PTH(7-34)脂质体乳膏(Novasome)、耐久霉素(眼科，干眼症)、CAB-2、CTCE-0214、Glyco聚乙二醇化促红细胞生成素、EPO-Fc、CNTO-528、AMG-114、JR-013、因子XIII、氨基康定、PN-951、716155、SUN-E7001、TH-0318、BAY-73-7977、替维瑞克(立即释放)、EP-51216、hGH(控制释放，Biosphere)、OGP-I、西夫韦肽、TV4710、ALG-889、Org-41259、rhCC10、F-991、胸腺五肽(肺病)、r(m)CRP、肝脏选择性胰岛素(hepatoselective insulin)、速碧林、L19-IL-2融合蛋白、弹性蛋白酶抑制剂、NMK-150、ALTU-139、EN-122004、rhTPO、血小板生成素受体激动剂(血小板减少症)、AL-108、AL-208、神经生长因子拮抗剂(疼痛)、SLV-317、CGX-1007、INNO-105、口服特立帕肽(eligen)、GEM-OS1、AC-162352、PRX-302、LFn-p24融合疫苗(Therapore)、EP-1043、小儿肺炎(S pneumoniae pediatric)疫苗、疟疾疫苗、脑膜炎奈瑟菌B组疫苗、新生儿B族链球菌疫苗、炭疽疫苗、HCV疫苗(gpE1+gpE2+MF-59)、中耳炎治疗、HCV疫苗(核心抗原+ISCOMATRIX)、hPTH(1-34)(透皮，ViaDerm)、768974、SYN-101、PGN-0052、阿维库明(aviscumnine)、BIM-23190、结核疫苗、多表位酪氨酸酶肽、癌症疫苗、恩卡斯替母(enkastim)、APC-8024、GI-5005、ACC-001、TTS-CD3、血管靶向TNF(实体瘤)、去氨加压素(口腔控制释放)、奥那西普或TP-9201。

在一些实施例中，POI是阿达木单抗(HUMIRA)、英夫利昔单抗(REMICADETM)、利妥昔单抗(RITUXANTM/MAB THERATM)、依那西普(ENBRELTM)、贝伐单抗(AVASTINTM)、曲妥单抗(HERCEPTINTM)、培非司亭(pegrilgrastim)(NEULASTATM)或任何其它合适的POI，包括生物仿制药和生物仿生药(biobetters)。

其它合适的POI是下表1和US2016/0097074中列出的那些。

表1

在实施方案中，多肽是表2所示的激素、凝血/凝血因子、细胞因子/生长因子、抗体分子、融合蛋白、蛋白疫苗或肽。

表2示例性产品

在实施方案中，蛋白质是多特异性蛋白质，例如表3中所示的双特异性抗体。

表3:双特异性形式

在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以实践对本发明的这些和其他修改和变化，本发明的精神和范围在所附权利要求中更具体地阐述。另外，应当理解，各个实施例的各方面可以全部或部分互换。此外，本领域普通技术人员将理解，前述描述仅是示例性的，并且无意于限制本发明，因此在这样的所附权利要求中进一步描述。

Claims

1.一种用于繁殖细胞培养物的方法，包括：

确定细胞培养物中质量属性的浓度；

测量细胞培养物中至少一种影响属性的参数；

将质量属性浓度和至少一个属性影响参数测量值发送给控制器，该控制器包括预测模型，该模型确定细胞培养物中质量属性的未来浓度；和

基于所确定的细胞培养物中质量属性的未来浓度来选择性地改变细胞培养物中的至少一种条件，以将质量属性浓度保持在预设限度内。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述质量属性包括乳酸、蛋白质、聚糖、电荷变体、聚集体、二硫键氧化或二硫改组变体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述预测模型使用至少两种不同的多元方法来确定未来浓度。

4.一种繁殖细胞培养物的方法，包括：

确定细胞培养物中乳酸的浓度；

测量细胞培养物中至少一种乳酸影响参数；

将乳酸浓度和至少一个乳酸影响参数测量值发送给控制器，该控制器包括预测模型，该模型确定细胞培养物中乳酸的未来浓度；和

基于确定的细胞培养物中乳酸的未来浓度，选择性地改变细胞培养物中的至少一种条件，以将乳酸浓度保持在预设的限度内。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述乳酸影响参数包括pH、谷氨酸盐浓度、葡萄糖浓度、天冬酰胺浓度、温度或营养物进料速率。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，测量至少两个乳酸影响参数，并且将所测量的数据发送到所述控制器，以用于确定所述细胞培养物中乳酸的未来浓度。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过改变供给到所述细胞培养物中的营养培养基来选择性地改变所述至少一种条件。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述营养培养基包括碳水化合物源、氨基酸源、维生素、脂质、蛋白质、肽或其混合物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，通过改变营养培养基向细胞培养物的流速来改变供给到细胞培养物的营养培养基。

10.根据权利要求7、8或9所述的方法，其中，除了改变供给到细胞培养物中的营养培养基之外，还选择性地改变细胞培养物的pH，以将乳酸浓度保持在预定的限度内。

11.根据权利要求4至10中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物在收获之前具有温育期，并且其中所述预测模型预测在所述温育期结束时的最终乳酸浓度。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，细胞培养物在收获之前具有温育期，其中，在所述温育期中，选择性地改变所述细胞培养物中的至少一种条件，以使在温育期结束时细胞培养物的最终的乳酸浓度约小于2g/L、例如约小于1.5g/L、例如约小于1g/L。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法导致细胞培养物的滴度浓度增加。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物包含哺乳动物细胞。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞培养物以分批方法繁殖约12小时至约28天，然后收获。

16.根据权利要求15所述的方法，其中在所述控制器确定所述细胞培养物中的乳酸的未来浓度之前，确定所述细胞培养物中的乳酸浓度约12小时至约4天。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述分批处理包括在收获所述细胞培养物之前的温育时间，并且其中在所述控制器确定细胞培养物中乳酸的未来浓度之前，在所述温育时间的约5％至约40％期间测量所述乳酸浓度。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，至少每24小时，例如至少每12小时，确定一次乳酸浓度，所有所述乳酸浓度数据都馈送到所述控制器，并且其中，所述控制器配置为：随着收到进一步的数据，反复确定细胞培养物中乳酸的未来浓度。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述预测模型基于乳酸浓度与先前参考数据的比较。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述乳酸的未来浓度由所述预测模型根据从规定的参考轨迹预测的乳酸浓度的平方偏差来确定。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，还基于所述至少一种乳酸影响参数的变化的平方偏差来确定所述乳酸的预测浓度。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述乳酸的预测浓度由所述控制器来确定，所述控制器选自偏平方分析、分类树、支持向量确定、线性判别分析或其混合的一种或多种技术中的控制器。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述乳酸的未来浓度由所述控制器使用降阶时间变化的自回归外生模型来确定。

24.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述预测模型对每天的预测输出和所述参考轨迹之间的差采用加权。

25.一种用于繁殖细胞培养物的系统，包括：

限定用于接收细胞培养物的中空内部的生物反应器，该生物反应器包括用于从中空内部进料和/或去除材料的多个端口；

用于将营养培养基进料到生物反应器的中空内部的营养培养基进料，所述营养培养基进料与所述生物反应器上的至少一个端口流体地连通；

控制器配置为接收包含在生物反应器中的细胞培养物的乳酸浓度测量值，所述控制器也配置为接收至少一个乳酸影响参数的测量值，所述控制器包括预测模型，所述预测模型确定所述生物反应器中的细胞培养物中的乳酸的未来浓度，所述控制器配置为控制营养培养基进料，以基于预测的乳酸浓度来选择性地增加或减少营养培养基向生物反应器的流动，以将乳酸浓度保持在预设的限度内。

26.根据权利要求25所述的系统，其中所述至少一种乳酸影响参数包括pH、谷氨酸盐浓度、葡萄糖浓度、天冬酰胺浓度，温度或营养物进料速率。

27.根据权利要求25或26所述的系统，其中，所述预测模型基于将乳酸浓度与先前的参考数据进行比较。

28.根据权利要求25至27中任一项所述的系统，其中，所述乳酸的未来浓度由所述预测模型根据从规定的参考轨迹预测的乳酸浓度的加权平方偏差来确定。

29.根据权利要求28所述的系统，其中，还基于所述至少一种乳酸影响参数的变化的加权平方偏差来确定所述乳酸的预测浓度。

30.根据权利要求25至29中任一项所述的系统，其中，所述乳酸的未来浓度由控制器来确定，所述控制器从选自偏方分析、分类树、支持向量确定、线性判别分析或其混合的一种或多种技术中的控制器。

31.根据权利要求25至30中任一项所述的系统，其中，所述乳酸的未来浓度由所述控制器使用降阶时间变化的自回归外生模型确定。