KR102589415B1 - 락테이트 축적을 방지하면서 세포 배양물을 증식하는 방법 및 시스템 - Google Patents

락테이트 축적을 방지하면서 세포 배양물을 증식하는 방법 및 시스템 Download PDF

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Abstract

초기에 측정된 농도 및 이력 데이터를 기반으로 미래의 파라미터 농도를 예측할 수 있는 예측 모델을 설명한다. 다수의 다변량 기술을 사용하여 다수의 다양한 세포주에 걸쳐서 농도를 예측할 수 있는 예측 모델을 구성할 수 있다. 예측 모델은 또한 확장 가능하다. 일 구현예에서, 미래의 락테이트 농도 궤적이 결정되고, 생물 반응기 내에서 하나 이상의 조건을 변화시키거나 변형시켜 락테이트 농도를 원하는 범위 내로 유지한다.

Description

락테이트 축적을 방지하면서 세포 배양물을 증식하는 방법 및 시스템
관련 출원
본 출원은 2017년 11월 20일에 출원한 미국 가특허 출원 제 62/588,464호 및 2018년 10월 18일에 출원한 미국 가특허 출원 제 62/747,311호에 기반하고 그 우선권을 주장하며, 이들 모두 참조로서 본원에서 인용한다.
본 발명은 락테이트(Lactate) 축적을 방지하면서 세포 배양물을 증식하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
생물학적 반응이나 공정을 실험실 또는 산업 규모로 수행할 수 있는 장치인 생물 반응기는 생물약제 산업 내에서 널리 사용된다. 생물 반응기는 모든 상이한 유형의 바이오 제품을 생산하는데 사용할 수 있다. 바이오 제품은, 예를 들어 세포 배양물 및 음료, 바이오 연료, 바이오 에너지, 생화학 물질, 항생제, 아미노산, 효소, 단클론 항체, 모노머, 단백질, 식품 배양물, 바이오 폴리머, 알콜, 향료, 방향제 등을 포함하는 세포 배양물로부터 유래되는 물질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양물은 세포 요법을 위해 성장시킬 수 있다. 세포 요법은 생체 외에서 조작 또는 변경된 자가, 동종 또는 이종 세포의 투여에 의해 인간에게서 질병 또는 상해를 예방, 치료, 치유 또는 완화하는 것이다. 세포 요법의 한가지 목표는 손상된 조직이나 기관을 복구, 교체 또는 회복하는데 있다.
세포 배양물은 전형적으로, 반응 시간이 종료될 때까지 생물학적 물질이 생물 반응기에 남아 있는 회분식 공정(batch process)에서 성장한다. 이중 특정 공정에서, 유체 매체 내에 함유된 영양분을 보충하기 위해 그리고 공정 동안 생성되는 유해한 부산물을 제거하기 위해, 생물 반응기 내에 들어 있는 유체 배지를 주기적으로 또는 연속적으로 제거 및 재공급할 수 있다.
세포 배양물이 성장하는 동안, 배지에서 주요 대사산물의 조절은 생산되는 제품의 품질에 직접적인 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 락테이트 농도는 세포 배양물, 특히 포유동물 세포 배양물이 성장하는 동안 제어해야 하는 주요 대사산물 중 하나로 오랫동안 여겨져 왔다. 전형적으로, 세포 배양물의 급속 성장기 동안 다량의 락테이트가 생성되는 반면, 세포가 정지기에 들어갈 때는 소비가 관찰된다. 높은 레벨의 락테이트는 세포 배양 공정에 많은 부정적인 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 락테이트 축적은 제품 품질 및 속성의 부정적인 영향과 관련이 있을 수 있다. 실제로, 세포 배양물에서 극단적인 락테이트의 축적은 세포 배양물을 상업적으로 사용할 수 없게 만들 수 있다.
그러나, 세포 배양물에서 락테이트의 거동은 매우 예측 불가능하다. 예를 들어, 세포 배양물에서의 락테이트 생산 및 소비 조절에 관여하는 기작이 불분명하고 알려지지 않은 채로 남아 있기 때문에, 당업자는 락테이트 레벨을 모니터링하고 제어하려고 시도하였으나, 성공을 거두지 못하고 있다. 세포 대사성 거동의 상당한 다변량, 비선형 및 경시적 변화 특성은, 락테이트 농도뒤의 추진력을 식별하고 교정하는 것 모두를 어렵게 한다.
역사적으로는, 샘플을 제거한 다음 락테이트 레벨 등의 선택된 대사산물에 대해 분석함으로써, 상류 바이오 공정을 모니터링했다. 과거에는, 세포 배양이 락테이트 축적 상태로 종료되고 따라서 산물의 농도가 감소하는지를 예측하기 위해서 반복적으로 락테이트 농도 측정값을 취했다. 불행하게도, 이전의 락테이트 농도 계산에서는 공급 대사산물 또는 작동 조건을 명문화하기에는 너무 늦은 공정에서 락테이트 축적과 관련된 문제를 발견한다.
최근에, 당업자는 바이오 제품의 생산 동안 사용하는 품질 관리 툴로서 예측 제어 모델을 설계하려고 시도했다. 예를 들어, 상업적으로 구입할 수 있는 모델 예측 제어 기술의 개요는 Quin 등의 "산업 모델 예측 제어 기술의 조사(A survey of industrial model predictive control technology)"란 제목의 논문에 개시되어 있으며, 이는 참조로서 본원에서 인용한다. Zupke 등은 "규정된 N-결합 글리칸 레벨을 갖는 항체를 제조하기 위한 실시간 산물 속성 제어(Real-time product attribute control to manufacture antibodies with defined N-linked Glycan levels)"란 제목의 논문을 발표하고, 비선형 모델 예측 제어를 사용하는 것에 대해 논의하고 있다. Sommeregger 등은 보다 유연한 품질의 설계 접근법으로 옮겨 가기 위해 공정 분석 기술을 구현하는 것에 관한 "제어에 의한 품질: 포유동물 세포 배양 바이오 공정의 모델 예측 제어를 위해(Quality by control: towards model predictive control of mammalian cell culture bioprocesses)"란 제목의 논문을 발표했다. 그러나, 상기 논문들은 락테이트 농도 제어 시스템을 개시할 뿐만 아니라, 피드백 메커니즘과 결합된 공정 파라미터의 강력한 제어를 제공하지는 못한다.
이러한 점을 고려하여, 생물 반응기 내에서 최적의 조건을 유지하기 위해 연속적 또는 주기적인 조정을 가능케 하는 세포 배양물의 증식을 위한 공정 등의 생화학 및 생물약제 공정을 모니터링하기 위한 개선된 방법 및 시스템에 대한 필요성이 현재 존재한다. 예를 들어, 세포 배양물에서 품질 속성(quality attribute) 농도를 예측하고 그 품질 속성을 원하는 한계 내에서 유지할 수 있는 방법 및 시스템에 대한 필요성이 존재한다. 특히, 성장하는 세포 배양물에서 미래의 락테이트 농도를 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 락테이트 농도를 미리 설정된 한계 내에서 유지하기 위해 하나 이상의 생물 반응기의 제어 및/또는 입력을 수정할 수 있는 방법 및 시스템에 대한 필요성이 존재한다. 또한, 세포 배양물에서 락테이트 축적을 방지하기 위한 개선된 방법 및 시스템에 대한 필요성도 존재한다.
본 발명은 개괄적으로 세포 배양물 등의 생체 물질을 증식하는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 일 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 방법 및 시스템은 포유동물 세포 배양물을 증식하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 세포 배양물의 전체 배양 기간에 걸쳐서 락테이트 농도 같은 강력한 품질 속성 농도를 결정할 수 있는 예측 모델을 포함하는 제어기가 개발되었다. 품질 속성 농도를 미리 설정된 한계 내에서 유지하기 위해, 예측 모델을 이용하여 증식 동안 세포 배양물 내에서 하나 이상의 조건을 선택적으로 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 시스템을 통해, 세포 배양물은 공정 종료시에 세포 배양물 내에서 락테이트 축적을 방지하는 방식으로 증식될 수 있다.
일 구현예에서, 예를 들어, 본 발명은 세포 배양물을 증식하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 세포 배양물에서 락테이트의 농도를 결정하는 것을 포함한다. 또한, 세포 배양물 내에서 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터(lactate influencing parameter)가 측정된다. 락테이트 농도 및 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터의 측정값은 제어기로 전송된다. 본 발명에 따르면, 제어기는 세포 배양물에서 미래의 락테이트 농도를 결정하는 예측 모델을 포함한다. 이어서, 세포 배양물 내의 하나 이상의 조건은 락테이트 농도를 미리 설정된 한계 내에서 유지하기 위해 세포 배양물에서 결정된 미래의 락테이트 농도에 기반하여 선택적으로 변화된다.
전술한 바와 같이, 일 구현예에서, 본 발명은 특히 세포 배양물에서 락테이트 농도를 제어하는 것에 관한 것이다. 그러나, 본 발명의 방법 및 시스템은 세포 배양물 내에서 임의의 적절한 품질 속성을 모니터링하고 제어하기 위해 사용할 수 있는 것을 이해해야 한다. 품질 속성은 락테이트에 추가하여, 단백질, 세포 성장 속도, 글리칸 조성물, 전하 변동, 응집체, 클리핑, 디설파이드 산화, 또는 디설파이드 셔플링 변동(disulfide shuffling variant)을 포함할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 시스템 및 방법은 락테이트 농도를 미리 설정된 한계 내에서 유지하는데 특히 적합하다.
일 구현예에서, 세포 배양물은 수확되기 전에 배양 기간을 갖는다. 배양 기간은, 예를 들어 약 12 시간 내지 약 28 일일 수 있다. 락테이트 농도는 배양 기간의 시작시에 측정되어 제어기에 공급될 수 있다. 초기 락테이트 농도에 기반하여, 제어기는 다음에 배양 기간의 종료를 통해 락테이트 농도를 예측할 수 있다. 제어기는 락테이트 농도를 미리 설정된 한계 내에서 유지하기 위해, 세포 배양물에서 하나 이상의 조건을 변화시키기 위한 교정 조치를 결정할 수도 있다. 예를 들어, 제어기가 세포 배양물에서 미래의 락테이트 농도를 결정하고 임의의 교정 조치를 취하기 전에 약 12 시간 내지 약 4 일 동안 락테이트 농도 정보가 결정될 수 있다. 예를 들어, 제어기가 락테이트 예측 결정을 하기 전에 배양 기간의 약 5% 내지 약 40% 동안 락테이트 농도가 측정될 수 있다. 전체 배양 기간 동안 락테이트 농도를 측정하여 제어기에 공급할 수 있어 제어기가 미래의 배양을 계속하고 세포 배양물 내에서 필요에 따라 조정할 수 있게 한다.
전술한 바와 같이, 락테이트 농도에 추가하여, 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터도 측정되어 제어기로 공급된다. 락테이트 영향 파라미터는, 예를 들어 pH, 글루타메이트 농도, 포도당 농도, 아스파라긴 농도, 온도, 또는 영양분 공급 속도를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 2개 이상의 락테이트 영향 파라미터, 예컨대 3개 이상의 락테이트 영향 파라미터가 측정되고, 측정된 데이터는 세포 배양물에서 미래의 락테이트 농도를 결정하는데 사용하기 위해 제어기로 전송된다.
일 구현예에서, 락테이트 농도를 제어하기 위해 공정 동안 세포 배양물에서 선택적으로 변화되는 하나 이상의 조건은 세포 배양물에 공급되는 영양 배지이다. 예를 들어, 락테이트 레벨에 영향을 주기 위해 영양 배지의 성분이 변화될 수 있고/있거나 영양 배지의 유량이 변화될 수 있다. 영양 배지는, 예를 들어 탄수화물 공급원, 아미노산 공급원, 비타민, 지질, 단백질, 펩티드 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다.
일 구현예에서, 락테이트 농도를 제어하기 위해 세포 배양물 내에서 변화되는 하나 이상의 조건은 세포 배양물의 pH이다. 또 다른 구현예에서, 세포 배양물의 pH 및 영양 배지는 락테이트 레벨을 제어하기 위해 변화되고 조절된다.
본 발명의 시스템 및 방법은 임의의 적절한 세포 배양물을 제어하는데 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 세포 배양물은 포유동물 세포를 함유한다. 예를 들어, 세포 배양물을 재조합 단백질 생산에 사용할 수 있다.
락테이트 농도를 예측하는 제어기 내에 수용된 예측 모델은 락테이트 농도를 이전 기준 데이터와 비교하는 것에 기반할 수 있다. 예측 모델의 락테이트 영향 파라미터(들)을 변경함으로써, 미래의 락테이트 농도를 결정하여 미리 정해진 기준 궤적으로부터의 락테이트 농도 예측의 제곱 편차를 최소화할 수 있다. 예를 들면, 일 구현예에서, 결과를 더 향상시키기 위해 예측 모델은 가중치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 예측된 출력과 기준 궤적 간의 차에 가중치를 적용할 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들어, 가중치는 측정되는 기간에 기반하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 성장 주기 후반에 수집된 데이터와 대조적으로, 성장 주기 초기의 데이터에 더 큰 가중치를 적용할 수 있다.
제어기 내에 수용된 예측 모델은 미래의 락테이트 농도 및 락테이트 상태를 예측하는데 다양한 다변량 방법(multivariate method)을 사용할 수 있다. 예를 들어, 미래의 락테이트 상태는 부분 최소 제곱 분석, 분류 트리, 서포트 벡터 머신, 선형 판별 분석 등으로부터 선택된 한가지 이상의 기술로 제어기에 의해 결정할 수 있다. 일 구현예에서, 예측 모델은 미래의 락테이트 상태를 예측하는데 2가지 이상의 다변량 방법을 포함한다. 예를 들어, 예측 모델은 신경 네트워크 분석, 서포트 벡터 머신 및 잠재 변수 모델링 중 2가지 이상을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제어기는 감소 차수 변화 회귀 외인성 모델을 사용하여 미래의 락테이트 농도를 예측한다.
본 발명의 방법을 통해, 세포 배양물이 배양 기간의 종료시에 락테이트 축적을 보이지 않도록 락테이트 레벨을 모니터링하고 제어할 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들어, 시스템은 세포 배양물이 락테이트를 소비하는 상태 또는 락테이트를 생산하는 상태로 종료되는지를 예측하는 분류 모델을 포함할 수 있다. 또한, 제어기는 잠재적으로, 세포 배양물의 배양 기간이 종료될 때까지 미래 날들에 대한 미리 정해진 락테이트 농도를 예측할 수 있는 동적 모델을 포함할 수 있다. 동적 모델은 상이한 값의 락테이트 영향 파라미터를 구비하여 세포 배양물의 성장 동안 임의의 교정 조치를 취하기 위해 최상의 전략을 결정하는 수치 예측을 실행할 수 있다. 일 구현예에서, 생물 배양이 특정 락테이트 농도 범위 내에서 종료되도록 처리 시스템을 설계할 수 있다. 예를 들어, 배양 기간의 종료시에 락테이트 농도는 약 2 g/L 미만, 예컨대 약 1.5 g/L 미만, 예컨대 약 1 g/L 미만일 수 있다.
상기 락테이트 농도 범위는 단지 예시일 뿐이다. 본 발명의 방법 및 시스템은 임의의 특정 응용에 맞춰 만들 수 있다. 예를 들어, 높은 락테이트 농도가 바람직하지 않을 수 있지만, 더 낮은 락테이트 농도 역시 바람직하지 않을 수도 있다. 본 발명의 방법 및 시스템은 단순히 락테이트 농도를 제어하는 것과 대조적으로 세포 배양물의 대사 상태를 제어할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 방법 및 시스템은 단지 최종 락테이트 농도를 제어하는 것과 대조적으로 시간에 따른 락테이트 농도의 기울기를 제어할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 배양물을 증식하는 시스템에 관한 것이다. 시스템은 세포 배양물을 수용하기 위한 중공의 내부가 규정된 생물 반응기를 포함한다. 생물 반응기는 중공의 내부에 물질을 공급하고/하거나 그로부터 제거하는 다수의 포트를 포함한다. 생물 반응기의 중공 내부로 영양 배지를 공급하는 영양 배지 공급부(nutrient media feed)는 생물 반응기 상의 포트 중 하나 이상의 포트와 유체 연통된다. 시스템은 생물 반응기에 수용된 세포 배양물의 락테이트 농도 측정값을 수신하는 제어기를 더 포함한다. 또한, 제어기는 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터의 측정값도 수신한다. 제어기는 생물 반응기에 수용된 세포 배양물에서 미래의 락테이트 농도를 결정하는 예측 모델을 포함한다. 예를 들어, 예측 모델은 세포 배양물의 전체 배양 기간 내내 락테이트 농도를 예측할 수 있다. 제어기는 락테이트 농도를 미리 설정된 한계 내에서 유지하기 위해, 예측된 락테이트 농도에 기반하여 생물 반응기 내로의 영양 배지의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시키기 위해서 영양 배지 공급부를 제어한다.
본 발명의 다른 특징 및 측면을 아래에서 보다 상세하게 논의한다.
본 발명의 충분하고 가능한 개시는 첨부 도면의 참조를 포함하여, 본 명세서의 나머지 부분에서 보다 구체적으로 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 생물 반응기 시스템의 일 구현예를 나타내는 단면도이다.
도 2는 본 발명에 따른 제어 시스템의 일 구현예를 나타내는 도면이다.
도 3은 세포 배양물의 배양 기간 동안 락테이트 농도의 제어를 나타내는 도면이다.
도 4 내지 도 19는 아래의 실시예에서 얻어진 결과의 일부를 나타낸 그래픽 표현이다.
본 명세서 및 도면에서 참조 문자의 반복 사용은 본 발명의 동일하거나 유사한 특징 또는 요소를 나타내도록 하였다.
본 논의는 단지 예시적인 구현예의 설명이며, 본 발명의 보다 넓은 측면들을 제한하려는 것이 아님을 당업자는 이해해야 한다.
개괄적으로, 본 발명은 바이오 제품을 생산하는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 일 구현예에서, 예를 들어, 본 발명은 생물 반응기 내에서 세포 배양물을 증식하는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 시스템은 생물 반응기에서 하나 이상의 파라미터와 같은 품질 속성을 모니터링한 다음 생물 반응기의 내외부로 영향을 주는 파라미터의 흐름을 자동으로 변화 또는 변경하기 위해 개방루프 또는 폐쇄루프 제어를 사용할 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따라 임의의 적절한 품질 속성이 세포 배양물 내에서 모니터링되고 제어될 수 있다. 일 구현예에서, 시스템은 실제의 세포 배양물 측정값뿐만 아니라 이전 세포 배양물로부터의 기준 데이터가 입력될 수 있는 예측 제어 모듈을 포함한다. 입력된 정보에 기반하여, 예측 모델은 세포 배양물 내에서 하나 이상의 미래의 품질 속성 농도를 계산하기 위해 다변량 분석을 사용할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 예측 모델은 미래의 농도 레벨을 계산하는데 2가지 상이한 다변량 분석 방법을 사용한다.
본 발명에 따라 모니터링되고 제어되는 품질 속성은 특정 응용 및 원하는 결과에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 제어될 수 있는 품질 속성은 단백질 역가, 세포 성장 속도 및 글리칸 조성물을 포함한다. 글리칸 조성물은 갈락토실화, 고 만노스 종들(high mannose species), 시알화 및 푸코실화를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제어되는 품질 속성은 전하 변동을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전하 변동은 C-말단 리신 절단, 탈아미드화, 부가물 형성, 석신화물 형성, 산화, C-말단 프롤린 아미드화, 이성질화 및/또는 시알화와 관련될 수 있다. 제어될 수 있는 다른 품질 속성은 응집체 농도, 클리핑, 디설파이드 산화 및 디설파이드 셔플링 변동을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법 및 시스템은 특히 세포 배양물 내에서 락테이트 농도를 모니터링하고 제어하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 초기 락테이트 농도 데이터에 기반하여 세포 배양물 내에서 미래의 락테이트 농도 궤적을 결정할 수 있는 예측 모델이 확립된다. 락테이트 농도를 미리 설정된 한계 내에서 유지하기 위해, 세포 배양 공정 초기에 미래의 락테이트 농도가 결정되어 생물 반응기 내에서 하나 이상의 조건에 대한 수동 또는 자동 제어를 가능케 한다. 본 발명의 방법 및 시스템을 통해, 예를 들어, 배양 기간 동안 및 세포 배양물을 수확하기 전에 세포 배양물 내에서 락테이트 축적을 방지할 수 있다.
특히 유리하게는, 본 발명의 방법 및 시스템은 여러 상이한 생물 반응기의 크기와 다양한 세포주에 맞춰 크기를 조정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용된 예측 모델은 강력하며, 세포주 의존적이지 않으므로 임상적 및 상업적인 제조에 사용할 수 있은 플랫폼 공정을 위해 개발되었다. 모든 상이한 바이오 제품을 본 발명에 따라 생산할 수 있다. 예를 들어, 시스템 및 방법은 생물 반응기 내에서 증식되는 임의의 세포 배양물에 적합할 수 있다. 일 구현예에서, 세포 배양물은 포유동물 세포를 함유한다. 포유동물 세포는 복잡한 생물약제의 생산에 매우 빈번하게 사용된다. 예를 들어, 포유동물 세포를 재조합 단백질 생산에 사용할 수 있다. 본 발명의 시스템 및 방법은, 예를 들어 제품 수율 및 제품 품질 모두에 직접적으로 영향을 주고 개선하여 역가 농도를 증가시킬 수 있다.
하나의 예에서, 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 생물 반응기 내에서 유전자 변형된 포유동물 세포로부터 생물 치료 단백질을 생산한다. 이러한 생산은, 예를 들어 CHO, NSO 또는 PER.C6 같은 확립된 세포 배양물의 세포주에서 유래될 수 있다. 이들 세포는 관심 단백질을 발현하고, 이어서 단백질을 배지 내로 분비한다. 세포 배양물은 본원에서 사용한 바와 같이, 유체가 생물 반응기 또는 비관류 시스템으로부터 주기적으로 또는 연속적으로 제거되는 관류형 세포 배양 시스템도 포함하는 유가식 공정에서 성장될 수 있다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 생물 반응기 시스템의 일 구현예가 도시되어 있다. 생물 반응기 시스템은 생물 반응기(10)를 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 시스템 및 방법은 임의의 적절한 생물 반응기를 사용할 수 있다. 생물 반응기는, 예를 들어 발효기, 교반 탱크 반응기, 부착식 생물 반응기, 웨이브형 생물 반응기, 일회용 생물 반응기 등을 포함할 수 있다. 도 1에 도시된 구현예에서, 생물 반응기(10)는 유체 성장 배지 내에서 세포 배양물을 수용하기 위한 생물 반응기 용적(12)을 포함하는 중공 용기 또는 컨테이너를 포함한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 생물 반응기 시스템은 이중 임펠러(impeller)(16 및 18) 등의 교반기에 결합된 회전 샤프트(shaft)(14)를 더 포함할 수 있다.
생물 반응기(10)는 여러 상이한 재료로 제조될 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들어, 생물 반응기(10)는 스테인리스 스틸 등의 금속으로 제조될 수 있다. 금속 생물 반응기는 전형적으로 재사용되도록 설계된다.
대안적으로, 생물 반응기(10)는 강성 중합체 또는 가요성 중합체 필름으로 제조된 일회 사용 생물 반응기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 강성 중합체로 제조되는 경우, 생물 반응기 벽은 단독으로 서 있을 수 있다. 대안적으로, 액체 불침투성일 수 있고 내부 친수성 표면을 가질 수 있는 가요성 중합체 필름 또는 형상 적합 물질로 생물 반응기를 제조할 수 있다. 일 구현예에서, 생물 반응기(10)는 원하는 형상을 상정하기 위해 금속 용기 같은 강성 구조에 삽입되도록 설계된 가요성 중합체 필름으로 제조될 수 있다. 강성 용기 또는 가요성 중합체 필름을 제조하는데 사용할 수 있는 중합체는 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌 등의 폴리올레핀 중합체를 포함한다. 대안적으로, 중합체는 폴리아미드일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 가요성 중합체 필름은 상이한 중합체 물질의 다층으로 형성될 수 있다. 일 구현예에서, 가요성 중합체 필름은 감마선 조사될 수 있다.
생물 반응기(10)는 임의의 적절한 용적을 가질 수 있다. 예를 들어, 생물 반응기(10)의 용적은 0.1 mL 내지 약 25,000 L 이상일 수 있다. 예를 들어, 생물 반응기(10)의 용적(12)은 약 0.5 L 초과, 예컨대 약 1 L 초과, 예컨대 약 2 L 초과, 예컨대 약 3 L 초과, 예컨대 약 4 L 초과일 수 있고, 예컨대 약 5 L 초과, 예컨대 약 6 L 초과, 예컨대 약 7 L 초과, 예컨대 약 8 L 초과, 예컨대 약 10 L 초과, 예컨대 약 12 L 초과, 예컨대 약 15 L 초과, 예컨대 약 20 L 초과, 예컨대 약 25 L 초과, 예컨대 약 30 L 초과, 예컨대 약 35 L 초과, 예컨대 약 40 L 초과, 예컨대 약 45 L 초과일 수 있다. 생물 반응기(10)의 용적은 일반적으로 약 25,000 L 미만, 예컨대 약 15,000 L 미만, 예컨대 약 10,000 L 미만, 예컨대 약 5,000 L 미만, 예컨대 약 1,000 L 미만, 예컨대 약 800 L 미만, 예컨대 약 600 L 미만, 예컨대 약 400 L 미만, 예컨대 약 200 L 미만, 예컨대 약 100 L 미만, 에컨대 약 50 L 미만, 예컨대 약 40 L 미만, 예컨대 약 30 L 미만, 예컨대 약 20 L 미만, 예컨대 약 10 L 미만이다. 일 구현예에서, 예를 들어, 생물 반응기의 용적은 약 1 L 내지 약 5 L일 수 있다. 대안적인 구현예에서, 생물 반응기의 용적은 약 25 L 내지 약 75 L일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생물 반응기의 용적은 약 1,000 L 내지 약 5,000 L일 수 있다.
임펠러(16, 18)에 추가하여, 생물 반응기(10)는 생물학적 세포의 배양 및 증식을 가능케 하는 배플(baffles), 스파저(spargers), 기체 공급기, 열교환기 또는 열순환기 포트 등의 다양한 추가 장비를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1에 도시된 구현예에서, 생물 반응기(10)는 스파저(20) 및 배플(22)을 포함한다. 스파저(20)는 이산화탄소, 산소 및/또는 공기 같은 기체를 생물 반응기(10)에 공급하기 위한 기체 공급원(48)과 유체 연통된다. 또한, 생물 반응기 시스템은 압력, 폼(foam), pH, 용존 산소, 용존 이산화탄소 등을 측정 및 모니터링하기 위한 다양한 프로브를 포함할 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 생물 반응기(10)는 임펠러(16, 18)가 부착된 회전 샤프트(14)를 포함할 수 있다. 회전 샤프트(14)는, 이 샤프트(14)와 임펠러(16, 18)를 회전시키기 위한 모터(24)에 결합될 수 있다. 임펠러(16, 18)는 금속 또는 생체 적합성 중합체 같은 임의의 적절한 재료로 제조될 수 있다. 생물 반응기 시스템에 사용하기에 적절한 임펠러의 예는 하이드로포일 임펠러, 고강도 피치 블레이드 임펠러, 고강도 하이드로포일 임펠러, 러쉬톤(Rushton) 임펠러, 피치 블레이드 임펠러, 젠틀 마린 블레이드 임펠러 등을 포함한다. 2개 이상의 임펠러를 포함하는 경우, 임펠러는 회전 샤프트(14)를 따라 이격될 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 생물 반응기(10)는 다수의 포트도 포함한다. 포트는 유체 및 다른 물질을 추가하고 제거하기 위해 생물 반응기(10)의 내외로 보급 라인 및 공급 라인의 설치를 가능케 할 수 있다. 또한, 하나 이상의 포트는 생물 반응기(10) 내부의 상태를 모니터링하기 위해 하나 이상의 프로브에 연결되는 것일 수 있다. 또한, 생물 반응기(10)는 생물 반응기 내의 배양물의 질량을 측정하기 위해 로드셀과 관련하여 배치된다.
도 1에 도시된 구현예에서, 생물 반응기(10)는 생물 반응기로부터 물질을 연속적으로 또는 주기적으로 빼내기 위해 배출부(effluent)(28)에 연결된 하부 포트(26)를 포함한다. 또한, 생물 반응기(10)는 포트(30, 32 및 34) 같은 다수의 상부 포트를 포함한다. 포트(30)는 제 1 유체 공급부(36)와 유체 연통되고, 포트(32)는 제 2 공급부(38)와 유체 연통되며, 포트(34)는 제 3 공급부(40)와 유체 연통된다 공급부(36, 38 및 40)는 영양 배지 같은 여러 상이한 물질을 생물 반응기(10)에 공급하기 위한 것이다. 본원에서 사용한 바와 같이, 영양 배지는 바이오 제품의 질량을 증가시킬 수 있는 임의의 유체, 화합물, 분자 또는 물질, 에컨대 바이오매스를 살게 하거나, 성장시키거나 또는 첨가하기 위해 유기체가 사용할 수 있는 임의 것을 을 지칭한다. 예를 들어, 영양분 공급물은 호흡 또는 임의 유형의 대사에 사용되는 산소 또는 이산화탄소 등의 기체를 포함할 수 있다. 다른 영양 배지는 탄수화물 공급원을 포함할 수 있다. 탄수화물 공급원은 복합당 및 단순당, 예컨대 포도당, 말토오스, 과당, 갈락토오스 및 이들의 조합을 포함한다. 영양 배지는 아미노산도 포함할 수 있다. 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 시스테인, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산, 이들의 단일 입체 이성질체, 및 이들의 라세미 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 용어 "아미노산"은 공지된 비표준 아미노산, 가령, 4-히드록시프롤린, ε-N,N,N-트리메틸리신, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, O-포스포세린, γ-카복시글루타메이트, γ-N-아세틸리신, ω-N-메틸아르기닌, N-아세틸세린, N,N,N-트리메틸알라닌, N-포르밀메티오닌, γ-아미노부티르산, 히스타민, 도파민, 티록신, 시트룰린, 오르니틴, β-시아노알라닌, 호모시스테인, 아자세린, 및 S-아데노시메티오닌을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산은 글루타메이트, 글루타민, 리신, 티로신 또는 발린이다.
영양 배지는 1종 이상의 비타민을 함유할 수도 있다. 영양 배지에 함유될 수 있는 비타민은 B12 같은 B군 비타민을 포함한다. 다른 비타민은 비타민 A, 비타민 E, 리보플라빈, 티아민, 비오틴 및 이들의 조합을 포함한다. 또한, 영양 배지는 1종 이상의 지방산 및 1종 이상의 지질을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 영양 배지 공급부는 콜레스테롤, 스테로이드 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 영양 배지는 단백질 및 펩티드를 생물 반응기에 공급할 수도 있다. 단백질 및 펩티드는, 예를 들어 알부민, 트랜스페린, 피브로넥틴, 페투인 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명 내에서 성장 배지는 또한 성장 인자 및 성장 억제제, 미량 원소, 무기염, 가수분해물 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 성장 배지에 포함될 수 있는 미량 원소는 미량 금속을 포함한다. 미량 금속의 예는 코발트, 니켈 등을 포함한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 생물 반응기는 다수의 영양분 공급부와 연통될 수 있다. 이러한 방식으로, 영양 배지는 공정 동안 생물 반응기에서 영양분의 농도를 보다 잘 제어하기 위해 단일 영양분만을 함유하는 생물 반응기에 공급될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 상이한 공급 라인을 사용하여 기체 및 액체를 생물 반응기에 개별적으로 공급할 수 있다.
생물 반응기(10)의 상부 및 하부의 포트에 추가하여, 생물 반응기는 측벽을 따라 배치된 포트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1에 도시된 생물 반응기(10)는 포트(44 및 46)를 포함한다.
포트(44 및 46)는 세포 배양물을 증식하거나 바이오 제품을 생산하기 위해 생물 반응기(10)에서 하나 이상의 파라미터의 최적 농도를 유지할 수 있는 모니터링 및 제어 시스템과 통신한다. 도시된 구현예에서, 예를 들어, 포트(44)는 pH 센서(52)와 관련되고, 포트(46)는 용존 산소 센서(54)와 관련된다. pH 센서(52) 및 용존 산소 센서(54)는 제어기(60)와 통신한다. 본 발명의 시스템은 생물 반응기(10) 내에 수용된 세포 배양물 내에서 다양한 파라미터의 결정 및 측정을 가능케 할 수 있다. 측정의 일부는 pH 및 용존 산소 같은 라인으로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 그러나 측정은 온라인 또는 오프라인으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 생물 반응기(10)는 샘플링 스테이션과 통신할 수 있다. 세포 배양물의 샘플은 다양한 측정을 하기 위해 샘플링 스테이션에 공급될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포 배양물의 샘플은 생물 반응기에서 분리된 후 오프라인으로 측정될 수 있다.
본 발명에 따르면, 생물 반응기(10) 내에서 세포 배양물의 성장 동안 다수의 파라미터가 측정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법 및 시스템에 의해 제어되는 파라미터는 제어되는 파라미터의 농도에 영향을 줄 수 있는 하나 이상의 다른 파라미터와 함께 측정된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 락테이트 농도는 하나 이상의 다른 락테이트 영향 파라미터와 함께 세포 배양물 내에서 측정된다. 락테이트 영향 파라미터는, 예를 들어 글루타메이트 농도, 포도당 농도, 아미노산 농도, 예컨대 아스파라긴 농도 등을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 세포 배양물의 라인 또는 오프라인에서의 분석은 Nova Biomedical에서 판매하는 NOVA Bioprofile 400 분석기 같은 임의의 적절한 기구를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 분석기는 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터와 함께 락테이트 농도를 측정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 생물 반응기 내의 여러 다른 조건에 추가하여 락테이트 농도 및 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터의 농도는 제어기(60)에 공급될 수 있다. 제어기는 입력된 데이터에 기반하여, 세포 배양물이 계속 증식됨에 따라 미래의 락테이트 농도를 예측할 수 있는 제어 모델을 포함한다. 일 구현예에서, 예를 들어, 제어기는 세포 배양물의 배양 기간의 종료시에 락테이트 농도가 미리 설정된 한계 내에 있는지 또는 세포 배양물이 락테이트를 축적하는 상태로 종료될 것인지에 대한 퍼센트 확률을 생성하는 조기 경보 시스템을 제공할 수 있다. 또한, 제어기(60)는 미래의 락테이트 농도를 정확하게 예측할 수도 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제어기는 세포 배양물이 수확될 때까지 전체 배양 기간을 통해 락테이트 농도를 예측하는 락테이트 농도 궤적을 예측할 수 있다. 일 구현예에서, 제어기는 락테이트 농도가 미리 설정된 한계 내에 있지 않은 경우에 교정 조치를 제안하거나 자동으로 구현할 수 있다. 예를 들어, 제어기는 영양분 공급 변화, 또는 락테이트 농도를 원하는 값으로 유도하기 위해 필요할 수 있는 다른 작동 조건의 변화를 결정할 수 있다. 교정 조치를 결정하기 위해, 제어기는 하나 이상의 조건에서 최적화된 변화가 선택될 때까지 생물 반응기 내에서 하나 이상의 조건을 변경하는 것에 기반하여 미래의 락테이트 농도를 결정하기 위해 여러번 반복 실행할 수 있다.
제어기(60)는 하나 이상의 프로그램 가능한 장치 또는 마이크로프로세서를 포함할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 제어기(60)는 하나 이상의 공급부(36, 38 및 40) 및 하나 이상의 배출부(28)와 통신할 수 있다. 또한, 제어기(60)는 pH 센서(52), 용존 산소 센서(54), 기체를 스파저(20)에 공급하는 기체 공급원(48)과 통신할 수 있다. 제어기(60)는 락테이트 농도 및 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터의 농도에 기반하여 생물 반응기(10)의 내외부로 물질의 유동을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 제어기(60)는 락테이트 농도를 미리 설정된 한계 내에서 유지할 수 있다. 제어기(60)는 개방루프 제어 시스템에서 동작할 수 있거나 폐쇄루프 제어 시스템에서 동작할 수 있으며, 입력 및/또는 출력 장치에 대한 조정은 완전 자동화된다. 다른 구현예에서, 제어기(60)는 락테이트 농도에 영향을 주기 위해 교정 조치를 제안할 수 있고, 교정 조치는 수동으로 수행될 수 있다.
도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 생물 반응기 시스템의 일 구현예가 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 세포 배양물은 배양 기간 동안 생물 반응기(10)에서 배양된 후 수확된다. 배양 동안, 생물 반응기(10) 내의 다양한 파라미터가 모니터링된다. 파라미터는 하나 이상의 분석기(70)에 의해 측정된다. 본 발명에 따르면, 분석기(70)는 제어기(60)에 전달되는 락테이트 농도를 주기적으로 또는 연속적으로 모니터링한다. 또한, 제어기(60)가 세포 배양물 내에서 미래의 락테이트 농도를 예측하기 위해, 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터가 측정되어 제어기(60)에 공급된다. 측정된 락테이트 영향 파라미터는 세포 배양물의 pH, 글루타메이트 농도, 포도당 농도, 아스파라긴 농도, 온도 및/또는 영양분 공급 속도를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 2개 이상의 락테이트 영향 파라미터, 예컨대 3개 이상의 락테이트 영향 파라미터, 예컨대 4개 이상의 락테이트 영향 파라미터가 공정 동안 측정된다. 예를 들어, 하나 이상의 분석기(70)는 약 2개의 락테이트 영향 파라미터 내지 약 8개의 락테이트 영향 파라미터를 측정할 수 있다. 락테이트 농도를 포함한 모든 측정된 데이터는 제어기(60)에 공급된다. 이들 파라미터는 연속적으로 또는 주기적으로 측정될 수 있다.
생물 반응기(10)에서 측정된 실시간 데이터에 추가하여, 이전 세포 배양물로부터의 기준 데이터(72)가 수집되어 제어기(60)에 공급될 수도 있다. 과거 기준 데이터를 사용하면 미래의 락테이트 농도의 계산을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 기준 데이터(72)는 락테이트 영향 파라미터가 크게 변해서 제어기(60)의 예측성을 향상시킬 수 있는 세포 배양물에서의 락테이트 농도 궤적을 포함할 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 제어기(60)는 목표 락테이트 프로파일로 프로그램될 수 있다. 제어기(60)는 하나 이상의 제어 모델(74)을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제어기는 분류 모델 및 예측 모델을 포함할 수 있다. 분류 모델은 세포 배양물의 배양 기간이 락테이트를 축적하는 상태 또는 락테이트를 소비하는 상태로 종료될 퍼센트 확률을 생성할 수 있다. 분류 모델은 부분 최소 제곱 분석을 단독으로 또는 선형 판별 분석도 함께 포함하여 다양한 다변량 방법을 사용할 수 있다. 또한, 분류 모델은 분류 트리, 서포트 벡터 머신 등을 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 각 분류 모델로부터 생성된 퍼센트 확률의 중앙값을 세포 배양물에 대한 최종 퍼센트 확률로서 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 세포 배양물의 배양 기간이 원하는 락테이트 농도 한계로 종료되는 것을 보장하도록 세포 배양물의 성장 동안 개입이 필요한지를 사용자가 결정할 수 있게 하기 위해서, 세포 배양물이 락테이트를 축적하는 상태로 종료될 퍼센트 확률을 사용자에게 제시할 수 있다.
제어기(60)는 예측 모델을 포함할 수도 있다. 예측 모델은 전체 배양 기간에 걸쳐서 미래의 락테이트 농도 궤적을 결정할 수 있다. 또한, 예측 제어기는 특정 제어 수평선 상의 생물 반응기(10)내 하나 이상의 조건의 변화가 특정 예측 수평선(prediction horizon) 상에서 락테이트 농도에 얼마나 영향을 주는지를 예측할 수 있다. 예를 들어, 도 2에 도시된 바와 같이, 예측 모델(74)은 최적화기(optimizer)(76)와 통신할 수 있다. 최적화기(76)는 하나 이상의 조건이 변하면, 생물 반응기(10) 내에서 결과를 시뮬레이션할 수 있다. 조건은 영양 배지 공급 속도의 변화 및 그에 따른 포도당 농도, 글루타메이트 농도, 아스파라긴 농도 등의 변화를 포함할 수 있다. 영양분 공급 속도에 추가하여, 최적화기(76)는 pH 및 기체 속도 추가를 포함하여 여러 다른 조건을 변화시킬 수 있다. 최적화기(76)는 세포 배양물 내에서 교정 조치가 필요한지를 결정하기 위해 다수의 시뮬레이션 및 다수회 반복을 수행할 수 있으며, 그 경우에, 생물 반응기에서 변화하는 최상의 조건뿐만 아니라 변화의 크기를 결정할 수 있다. 예측 모델은 궁극적으로, 특정된 기준 궤적으로부터 미래의 락테이트 농도의 편차를 최소화하기 위해 조작 변수의 변동을 결정한다. 미래 데이터가 제어기(60)에 공급됨에 따라, 최적화기(76)는 조작 변수를 추가로 변경 또는 수정하여 세포 배양물 내에서 하나 이상의 조건을 변화시키기 위해, 전체 배양 기간에 걸쳐서 계속 시뮬레이션을 실행할 수 있다.
도 3은 예측 모델(74) 및 최적화기(76)가 제어기(60) 내에서 동작할 수 있는 일 구현예를 도시한다. 도 3에 도시된 바와 같이, 세포 배양물의 다양한 측정이 이루어진 다음 제어기에 공급된다. 예를 들어, 제어기는 락테이트 농도 정보, pH 정보 및 영양분 공급 정보를 수신할 수 있다. 다음에, 예측 모델은 예측 수평선을 가져오는 락테이트 농도 궤적을 계산하거나 결정한다. 도 3에 도시된 바와 같이, 제어기(60)는 락테이트 농도 설정점으로 미리 프로그램될 수 있다. 설정점은 세포 배양물이 락테이트 축적 상태에 있지 않음을 나타내는 세포 배양물 내에서 원하는 최종 락테이트 농도일 수 있다.
도 3에 도시된 바와 같이, 최적화기(76)는, 이 구현예에서 세포 배양물 내에서 pH 및 영양분 공급을 변화시킴으로써 시뮬레이션을 실행한다. 예를 들어, 최적화기는 제어된 수평선 상에서 pH 및 영양분 공급의 조작에 기반하여 시뮬레이션을 실행할 수 있다. pH 및 영양분 공급의 변화에 기반하여, 락테이트 농도 레벨을 원하는 한계 내에서 유지하도록 세포 배양물 내에서 하나 이상의 조건을 변화시킬 필요가 있는지를 결정하기 위해, 예측 수평선 상에서 락테이트 궤적을 다시 계산한다. 이 과정은 전체 배양 기간 동안 연속적으로 또는 주기적으로 일어날 수 있다. 전술한 바와 같이, 제어기(60)는 생물 반응기 내의 조건을 자동으로 제어할 수 있거나 사용자가 수동으로 변경을 수행할 수 있게 사용자에게 경고하도록 설계할 수 있다.
예측 모델은 다양한 다변량 방법의 사용에 기반하여 시뮬레이션을 실행하고 결정을 내릴 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들어, 미리 정해진 기준 궤적, 가중 제곱 편차 및 각각의 조작 변수의 변화로부터의 락테이트 농도 예측의 가중 제곱 편차를 최소화하기 위해 예측 모델에서 락테이트 영향 파라미터의 변동을 최소화하거나 최적화함으로써, 락테이트 농도 궤적을 결정할 수 있다. 이 최적화는 시간에 따라 변화할 수 있는 각 조작 변수의 양에 따라 선형 불균등 제약(linear inequality constraint)을 조건으로 수행할 수 있다.
일 구현예에서, 예측 모델은 감소 차수 변화 회귀 외인성 모델(reduced order time varying autoregressive exogenous model, ARX 모델) 같은 감소 차수 모델을 사용하는 예측 제어 알고리즘을 포함할 수 있다. 예측 모델에 사용할 수 있는 기술은 신경망, 서포트 벡터 머신, 부분 최소 제곱 분석을 포함한 잠재 변수 모델링을 포함한다. 또한, 의사결정 트리 및 선형 판별 분석을 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 2가지 이상의 다변량 방법이 예측 모델에 통합된다. 예를 들어, 예측 모델은 락테이트 농도 예측결정에서 신경 네트워크 모델, 서포트 벡터 머신, 및 잠재 변형 모델 중 2개 이상을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 예측 모델은 모델 리그레서(model regressor)와 비선형성 추정기를 포함하는 비선형 ARX 모델이다. 비선형성 추정기는 모델 리그레서에 작용하여 모델 출력을 제공하는 선형 및 비선형 함수를 모두 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제어될 시스템의 입출력 동역학을 적절하게 나타내는 감소 차수 모델이 설계된다. 관심 출력에 큰 영향을 주는 조작 변수 세트를 식별할 수 있다. 이전 출력 값의 지식과 함께 조작 변수 값에 대한 지식을 이용하여 미래의 행동을 예측할 수 있다. 일 구현예에서, 다중 입력 단일 출력 ARX 공식에서 입력과 출력 간의 관계는 다음과 같은 형태이다:
여기서 y(t)는 출력/제어 변수이고, uj(t)는 ni 조작 변수 중 하나를 나타내고, nk는 시간 지연, na는 극의 수, nb는 제로의 수, ai 및 bji는 식별 공정을 통해 결정되는 계수이다. 시변(time-varying) ARX 모델에서, 각 파라미터의 영향을 나타내는 계수는 시간(즉, 일)에 따라 변화되므로, 모델은 시간에 따라 변한다. 식 (1)에 기재된 바와 같은 ARX 모델은 1 단계 사전 예측기(one-step ahead predictor)이며; t일에서의 출력에 관한 값은 조작 변수의 현재 및 이전 값뿐만 아니라, 출력의 이전 값으로부터 결정된다. 이 모델은 제어 전략에 의해 결정되는 조작 변수에 대해 미리 정해진 값과 함께 전날의 출력 예측을 사용하여 미래 출력값을 예측하는 다단계 사전 예측기로 확장될 수 있다.
일 구현예에서, 모델 파라미터는 반복에 걸친 임의의 다단계 부트스트랩 제곱 평균 제곱근 예측 오차(multi-step bootstrap root mean square prediction error)를 최소화함으로써 결정될 수 있다. 이들 다단계 시뮬레이션에서, 기록된 공정 데이터는 조작 변수에 대해 사용할 수 있는 한편, 상기 방정식으로부터 예측된 출력 값은 후속 예측 일에 사용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 일 구현예에서, 본 발명의 시스템 및 방법은 조작 변수 세트를 사용하여 락테이트 농도를 조절하는 것에 관한 것이다. 일 구현예에서, 모델 예측 제어기는 원하는 락테이트 농도, 기록된 조작 변수 및 락테이트 농도의 이전 값에 대한 지식으로부터 제어 수평선에 걸쳐서 조작 변수에 대한 값을 규정할 수 있다. 모델 예측 제어기는 역사적인 공정 데이터에서 개발된 시변 ARX 모델을 사용하여 결과적으로 락테이트 농도가 미래에 원하는 값에 도달하게 되는 조작 변수의 값을 결정할 수 있다. 락테이트 예측값은 제어 수평선에 걸쳐서 조작 변수에 대한 일련의 값으로부터 예측 수평선에 걸쳐서 다단계 방식으로 생성된다. 조작 변수에 대한 최적의 값은 제어 수평선 상에서 결정되어, 예측 수평선 상의 원하는 궤적으로부터 모델 출력 예측의 편차를 수반하는 목적 함수를 최소화한다. 일단 조작 변수에 대한 최적의 순서가 결정되면, 일 구현예에서, 이들 값 중 첫 번째 값만이 생물 반응기에서 사용할 수 있다. 이러한 방식으로, 다음 샘플링 순간에, 락테이트 농도가 측정되고 공정이 반복된다. 후속의 각 최적화 사이클에서는 예측보다는 기록된 락테이트 농도가 사용되기 때문에, 다단계 예측에서 축적될 수 있는 예측 오차는 제어기 구현에서의 이들의 영향이 제한된다.
일 구현예에서, 모델 예측 제어기의 설계는 다수의 설계 파라미터를 특정하여 제어기 동작 동안 최적화된 목적 함수를 계산하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 최소 평균 제곱에 기반하여 다음의 알고리즘을 사용할 수 있다:
여기서:
· P는 예측 수평선에서의 일수(the number of days)이다
· 는 감소 차수 모델로부터의 락테이트 농도의 예측값이다
· r은 원하는 기준 궤적에 대한 락테이트 농도의 값이다
· 는 예측 수평선에서 매일 예측된 출력과 기준 궤적 간의 차에 적용할 가중치이다
· n mv 는 조작 변수의 수이다
· u j 는 특정 일에 조작 변수 j의 값이다
· 는 i번째 예측 수평선 날에 조작 변수 j에 대한 후속의 조작 변수 값의 차에 적용되는 가중치이다
· 는 조작 변수 간의 스케일 차를 처리하기 위한 j번째 조작 변수에 대한 스케일링 계수이다.
일 구현예에서, 상기 식의 우측에 있는 계수는 0으로 설정되어 다음의 간단한 식을 제공할 수 있다.
여기서: P는 예측 기간의 일수이다. 는 감소 차수 모델로부터의 락테이트 농도의 예측된 값이고; r은 원하는 기준 궤적에 대한 락테이트 농도의 값이고; 는 예측 수평선에서 매일 예측 출력과 기준 궤적 간의 차이에 적용되는 가중치이다.
목적 함수는 기준 궤적으로부터 예측한 출력의 차에 패널티를 준다. 먼 미래에 감소 차수 모델의 다단계 예측 정확도와 관련한 우려가 존재할 경우는, 예측 수평선의 날들에 걸쳐서 상이한 가중치를 사용할 수 있다. 제어 수평선 상의 조작 변수에 대한 최적의 값은 조작 변수의 바운드 및 속도 제약 조건 모두에 대해 목적 함수를 최소화함으로써 달성된다.
특히 유리하게도, 본 발명의 제어기(60)는 세포 배양물이 락테이트를 축적하는 상태로 종료될 것인지를 배양 기간의 초기에 제공할 수 있다. 예를 들어, 예측 모델은 역가 농도를 증가시켜 제품 품질을 향상시키기 위해, 교정 조치를 취할 수 있는 충분한 기회를 제공하는 공정에서 초기에 락테이트 농도에 대해 정확하게 예측할 수 있을 만큼 강력한 것이 밝혀졌다.
예를 들어, 제어기는 배양 시간의 약 40% 미만, 예컨대 배양 시간의 약 30% 미만, 예컨대 배양 시간의 약 20% 미만, 예컨대 배양 시간의 약 15% 미만, 예컨대 배양 시간의 약 10% 미만, 예컨대 배양 시간의 약 5% 미만 후에 락테이트 농도에 관한 초기 예측을 할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제어기는 세포 배양물 내에서 주기적인 락테이트 농도 정보 및 세포 배양의 초기 12 시간 동안, 예컨대 세포 배양의 초기 2 일 동안, 예컨대 세포 배양의 초기 4일 동안 하나 이상의 다른 락테이트 영향 파라미터에 관한 데이터를 수신할 수 있으며, 교정 조치가 필요한지를 결정하기 위해 락테이트 농도 궤적을 정확하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제어기(60)는 데이터 수신의 약 12 시간 내지 약 4일 후에, 데이터가 예측 모델 내에서 얼마나 적합한지에 기반하여, 생물 반응기에서 하나 이상의 조건에 대한 선택적인 조정을 시작할 수 있다.
미래의 락테이트 농도를 제어하기 위해, 생물 반응기 내에서 하나 이상의 조건을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 락테이트 농도를 제어하기 위해 생물 반응기 내에서 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터를 선택적으로 제어할 수 있다. 변화되는 상태는 pH, 포도당 농도 같은 탄수화물 농도, 글루타메이트 농도 같은 아미노산 농도 및/또는 아스파라긴 농도 등을 포함할 수 있다. 세포 배양물의 pH는, 예컨대 스파저를 통해 이산화탄소 기체를 공급하고/하거나 탄산 수소 나트륨을 세포 배양물에 첨가하는 것과 같이, 세포 배양물에 산 또는 염기를 첨가함으로써 변화시킬 수 있다. 세포 배양물 내에서 탄수화물 농도 및/또는 아미노산 농도는 생물 반응기(10)에 공급되는 영양 배지를 변화시킴으로써 변화 및 변형시킬 수 있다.
일 구현예에서, 예를 들어, 락테이트 농도에 추가하여, 글루타메이트 농도가 모니터링되어 제어기(60)에 공급될 수 있다. 배양 기간에 걸친 예측 락테이트 궤적에 기반하여, 이후 락테이트 농도를 원하는 한계 내에서 유지하기 위해 글루타메이트 농도를 선택적으로 제어할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 락테이트 농도와 함께 아스파라긴 농도를 모니터링할 수 있다. 락테이트 농도를 미리 선택한 한계 내에서 유지하기 위해 교정 조치가 필요한 경우, 영양 배지의 유량을 제어하거나 자체적으로 아스파라긴을 별도 제어함으로써, 생물 반응기로의 아스파라긴의 유량을 증가 또는 감소시켜 아스파라긴의 농도를 제어할 수 있다. 일 구현예에서, 글루타메이트 농도, 아스파라긴 농도, 또는 글루타메이트 농도와 아스파라긴 농도 모두는 pH 모니터링 및 제어에 추가하여 공정 동안 모니터링된다. 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 탄수화물에 추가하여 pH를 모니터링 및 제어하는 경우, 면밀하게 제어된 한계 내에서 락테이트 농도를 효과적으로 유지하는 것으로 밝혀졌다.
전술한 바와 같이, 일 구현예에서, 모니터링되는 락테이트 영향 파라미터는 락테이트 농도에 바람직한 효과를 갖도록 제어할 수 있다. 그러나, 대안적인 구현예에서, 제 1 락테이트 영향 파라미터는 모니터링될 수 있는 반면, 제 2 락테이트 영향 파라미터는 공정 동안 락테이트 농도에 영향을 주도록 제어할 수 있다.
본 발명의 시스템 및 방법은 세포 배양물 내에서 락테이트 농도를 효과적으로 제어하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 통해, 세포 배양물의 배양 기간은 락테이트를 소비하는 상태로 종료될 수 있고 락테이트를 축적하는 상태로 종료되는 것을 방지할 수 있다. 세포 배양물의 최종 락테이트 농도는 수많은 인자에 의존하게 되고 주로 증식되는 세포의 유형에 의존한다. 일 구현예에서, 세포 배양물의 최종 락테이트 농도는 일반적으로 약 3 g/L 미만, 예컨대 약 2.5 g/L 미만, 예컨대 약 2 g/L 미만, 예컨대 약 1.5 g/L 미만, 예컨대 약 1 g/L 미만일 수 있다.
특히 유리하게는, 제어기(60)는 상이한 생물 반응기 유형 및 생물 반응기 용적에 대해 스케일링 가능할 뿐만 아니라, 다수의 다양한 세포주에 대해 효과적일 수 있는 강력한 예측 모델을 포함할 수 있다. 예를 들어, 예측 모델이 2가지 다변량 기법 또는 3가지 다변량 기법을 사용할 때와 같이, 예측 모델이 2가지 이상의 다변량 기법을 사용하는 경우, 다중 세포주에 대해 사용하기 적합하다는 것을 알게 되었다.
하나 이상의 락테이트 영향 파라미터를 모니터링하는 것에 추가하여, 제어기는 여러 다른 공정 조건을 제어할 수 있다. 예를 들어, 제어기는 열순환기, 로드 셀, 제어 펌프와 통신하여 이를 제어할 수 있으며, 다양한 센서 및 프로브로부터 정보를 수신할 수 있다. 예를 들어, 제어기는 산소 장력, 온도, 교반 조건, 압력, 기포 레벨 등을 제어 및/또는 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 제어기는 온도 정보를 수신하고 온도를 증가 또는 감소시키기 위해 생물 반응기를 둘러싼 워터 재킷에 공급되는 유체를 제어할 수 있다.
본 발명의 방법을 통해, 세포 배양물은 우수한 산물 특성으로 성장할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양물은 우수한 생존력 특성으로 성장할 수 있다. 예를 들어, 생존 가능 세포수를 총 세포수로 나눔으로써 생존능력을 측정할 수 있으며, 이는 공정 동안 모두 측정될 수 있는 2개의 파라미터이다. 본 발명에 따르면, 세포 배양물은 약 0.6 초과, 예컨대 약 0.7 초과, 예컨대 약 0.8 초과, 예컨대 약 0.9 초과의 전술한 바와 같은 생존율을 갖고서 본 발명에 따라 성장할 수 있다. 실제로, 생존율은 약 0.94 초과, 예컨대 약 0.96 초과, 예컨대 약 0.98 초과일 수 있다.
또한, 본 발명의 시스템 및 방법이 역가 생산성을 증가시킬 수 있는 것을 예기치 않게 알게 되었다. 특히, 본 발명의 방법에 따라 제어된 세포 배양물은 본 발명에 따라 제어되지 않은 동일한 세포 배양물과 비교하여 증가된 산물 역가 농도를 가질 수 있으며, 두 세포 배양물은 정확하게 동일한 락테이트 농도 또는 서로 0.5 g/L 이내, 예를 들어 서로 약 0.25 g/l 이내의 락테이트 농도로 종료되는 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 극적인 것이며 예상치 못한 결과이다.
다음의 실시예를 참조하여 본 발명을 더 잘 이해할 수 있다.
실시예
5개의 클론에 걸친 유가식 공정 데이터를 사용하여 제어기에 프로그램된 예측 모델에서 사용하기 위한 시변 동적 모델을 생성함으로써, pH 및 영양분 용적의 미리 정해진 값으로부터 미래 날들의 락테이트 농도를 예측하였다. 배양 기간의 3 일 후에, 예측 모델이 pH 및 영양분 용적에 대한 최적의 값을 결정하고, 나머지 실행 동안 락테이트 농도를 미리 정해진 설정점으로 가장 잘 유도하는 제어 수평선에 걸쳐서 사용하였다. pH 및 영양분 용적에 대해 최적화된 이들 값을 다음 날에 사용하였다. 이어서, 락테이트 농도를 입력한 후, 매일 종료시에 프로세스를 반복하였다. 증식된 세포 배양물은 단백질 산물을 생성하는데 사용된 포유동물 세포 배양물이었다. 8개의 상이한 배양물을 증식하였다. 예측 모델을 사용하여 본 발명에 따라 4개의 세포 배양물을 제어하였다. 비교 목적으로 나머지 4개의 세포 배양물을 성장시켰다. 각 세포 배양물을 1 리터 교반 탱크 생물 반응기에서 성장시켰다. 그러나, 2개의 세포 배양물을 1.5 리터 교반 탱크 생물 반응기에서 성장시키고, 확장성을 입증하기 위해 본 발명에 따라 예측 모델로 제어하였다. 다음 8개의 샘플 세포 배양물이 증식되었다.
상기 표에 나타낸 바와 같이, 샘플 번호 3, 4, 7, 8은 본 발명에 따라 제어되었다.
보다 구체적으로, 재조합 단백질을 안정적으로 발현하는 CHO-K1SV-유래 클론을 상업적으로 구입할 수 있는 CD-CHO AGTTM를 사용하여 현탁액에서 일상적으로 배양하였다. 접종 물 트레인을 습도 조절없이 37℃, 5% CO2에서 Kuhner 인큐베이터의 진탕 플라스크에 유지하였다. 세포를 규칙적으로 통과시켜 지수 성장을 유지하고, 본원에 기재된 실험을 위해 벤치 스케일 생물 반응기를 접종하는데 필요한 만큼 확장시켰다.
2-L 스케일의 유리 생물 반응기(BroadleyJames)를 사용하여 유가식 실험을 수행하였다. pH, DO 및 온도 설정점 등의 생물 반응기 조건은 실험 계획에 따라 변화시켰다. CO2 스파징 및 염기 적정제(Titrant) 첨가를 사용하여 배양 pH를 제어하였다. 필요에 따라 산소 스파징을 사용하여 설정점에서 용존 산소를 유지했다. 가열 재킷을 사용하여 배양 온도를 제어하였다. 필요에 따라 농축된 포도당 원액을 첨가하여 생산이 실행되는 내내 0.5 g/L 이상의 잔류 포도당 농도를 유지하였다. 12 일 동안 반응기 실험을 수행하였다.
분류 모델을 개발하여 특정 종료일 (3, 4 및 5일)을 통해 존재하는 공정 데이터로부터 최종 락테이트 상태를 예측하였다. 각 종료일에 대해, 다음의 분류 모델, 즉: 선형 판별 분석(linear discriminant analysis, LDA), 분류 트리, 부분 최소 제곱 점수(partial least squares score, PLS-LDA)에 적용되는 선형 판별 분석, 서포트 벡터 머신(support vector machine, SVM) 및 로지스틱 회귀분석을 개발하였다. 각 개별 모델은 Matlab 통계 및 머신 학습 툴박스(R2016b)의 기능 (fitcdiscr, fitctree, plsregress, fitcsvm, fitglm)을 사용하여 교육 데이터 세트에 존재하는 배치 전개 공정 데이터(batch-unfolded process data)로부터 계산하였다. 분류 모델에 걸쳐서 0.5 (즉, 50%)의 클래스 임계 값 확률을 사용하였다.
모든 종료일에 걸쳐서 우수한 분류 정확도를 일관되게 산출하는 모델로는 PLS-LDA, LDA, 분류 트리 및 이들 모델의 앙상블을 포함하였다. 분류 모델은 83% (3일) 내지 88% (4일 및 5일) 범위의 검증 정확도로 유리(favorable) 및 불리한(unfavorable) 락테이트 실행을 정확하게 분류할 수 있었다. 4일 및 5일 모델이 전체적으로는 동등한 검증 분류 정확도를 달성했지만, 4일 앙상블 모델은 클론에 걸쳐서 보다 일관된 검증 성능을 생성했다. 모델 전반에 걸쳐서 일반적으로 나타나는 속성으로는 대사산물 (글루타메이트, 포도당 및 글루타민)과 pH 조절 (CO2 스파징 속도)과 관련된 속성을 포함한다.
사용된 Matlab 최적화 툴박스 (R2016b)의 fmincon과 함께 Matlab에 시변 ARX 모델을 사용하는 모델 예측 제어기(model predictive controller, MPC)를 구축하여 비용 함수를 최소화하였다. 제어기 설계 파라미터는 시뮬레이션에서 초기화했으며 예비 실험 실행 중에 조정했다. 구체적으로, 원하는 락테이트 기준 궤적은 모든 날들에 대해 0으로 설정하였다. 사용된 예측 및 제어 수평선은 각각 7일 및 1일이었다. 예측은 10일까지만 필요로 하였으므로, 3일 후에는 예측 수평선을 감소시켰다. 10일 후에 조작 변수의 값은 최종 제어기 규정 값들 (last controller-prescribed values)로 유지했다. 긴 예측 기간은 실행 종료를 통한 조작 변수내 변동의 전체 효과를 보장하는데 기여한 반면에, 짧은 제어 수평선은 조작 변수에서 공격적인 제어 작동을 보장했다. 더 긴 예측 수평선에 걸쳐서 예측 정확도가 크게 저하되지 않았으므로, 모든 예측 오류는 최소화된 비용 함수에 동일하게 기여하는 것으로 간주했다 (즉, 모든 는 일치시켜 설정하였다). 영양분 공급 용적은 1.8% 내지 3.6%으로 유지되도록 제한하였으며, 3 내지 6 일에 +/-1.8%로 제한하고 그렇지 않으면 +/-1.0%로 제한하였다. pH에 대한 경계 제약은 6.7 및 7.2에서 확립되었으며, 날들 간의 최대 pH 변동은 +/-0.5로 설정하였다.
생성된 MPC를 일련의 실험적인 생물 반응기 실행에서 사용하여 유리한 락테이트 종료 상태로 실행 구동시 그 효능을 결정하였다. 실험에 사용한 세포 배양물은 이전 공정 개발에서 락테이트 축적을 보이는 것으로 공지된 클론과 관련되었다. 실험적인 MPC 실행은 2가지 제어 실행, 즉: 공지된 락테이트 축적 거동을 갖는 기저 실행 및 공급물에 포함된 보충 아스파라긴이 정상적인 작동 조건 하에서 유리한 락테이트 종료 상태를 달성하는 두번째 실행을 함께 수행했다. 이 일련의 실험에서, pH 및 영양분 공급 용적의 변화는 1.5 L의 스케일-업 작업 용적뿐만 아니라, 원래 반응기 작업 용적(1 L)에서 이용하였다. 기저 실행 및 아스파라긴이 보충된 실행으로 각각 불리 및 유리한 락테이트 상태로 종료될 것으로 예상함에 따라, 2가지 제어 실행 모두를 수행하였다. 3 일의 종료시에 제어를 시작한 MPC 실행은 기저 실행보다 실질적으로 더 낮은 락테이트 농도로 유리한 락테이트 종료 상태를 달성하는 세포 배양물을 가져왔다.
또한, 일련의 실험에서는 pH 및 포도당 농도에서 락테이트 유도 교란을 보상하는 MPC의 능력도 평가하였다. 높은 pH 또는 포도당 레벨을 각 실행 초기에 사용하여 높은 락테이트 농도 레벨을 생성했다. 아스파라긴이 보충된 공급물을 이 실험의 모든 실행에서 사용하였다. 정상 pH 및 포도당 레벨을 갖는 첫번째 및 높은 pH 레벨을 갖는 두번째 (0.15 불감대를 갖는 7.2)의 2가지 제어 실행을 이용했다. 첫번째 MPC 실행은 상응하는 대조 실행에서와 같이 3 일 동안 동일하게 상승된 pH 레벨을 사용한 반면, 두번째 MPC 실행은 증가된 초기 포도당 농도를 가졌다. MPC 실행에서는 pH 및 포도당의 초기 교란을 불량 처리했으며, 두 실행 모두 상승된 pH 제어 실행보다 낮은 최종 락테이트 농도를 산출하였다. 다른 측정된 세포 배양물 파라미터의 변화는 초기 실험에서 입증된 것과 유사한 경향을 따랐다. 이전 실행과 대조적으로, MPC 실행에 대한 생존 세포 밀도는 증가된 pH 없이 제어 실행에 대해 입증된 것과 유사했다. MPC 실행에서 증가된 영양분 공급 용적은 암모늄 이온 농도를 증가시키고 글루타메이트 소모를 지연시키는 결과를 가져왔다.
도 4 및 5를 참조하면, 12 일의 배양 기간에 걸친 락테이트 농도가 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 제어가 없는 일반 영양 배지를 함유하는 샘플 번호 1은 매우 높은 락테이트 농도를 생성하였다. 따라서, 과거에는 락테이트 레벨을 제어하기 위해 영양 배지를 특정 세포 배양물에 맞게 변형시켜 최적화하였다. 예를 들어, 샘플 번호 2, 5 및 6의 영양 배지는 모두 변형시켰다.
샘플 번호 3 및 4는 세포 배양물에 일반 영양 배지만 공급했지만 본 발명에 따라 세포 배양물이 제어된 세포 배양 실행이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 락테이트 레벨은 특정 세포 배양물을 위한 영양 배지를 변경하지 않고도 조절할 수 있었다. 도 4와 5는 예측 모델이 배양 기간에 걸쳐서 락테이트 농도를 조절할 수 있음을 보여준다.
도 6 및 7을 참조하면, 12 일의 배양 기간에 걸친 영양분 공급 및 pH가 도시되어 있다.
도 8 및 9는 12 일의 배양 기간에 걸친 암모늄 농도, 글루타메이트 농도, 및 글루타민 농도를 보여준다. 한편, 도 10 및 11은 세포 배양물 내에서 포도당 공급 및 포도당 농도를 보여준다.
도 12 및 13은 산물 품질에 관한 것이다. 그래프는 세포 생존율 및 생존 세포 밀도를 나타낸다. 한편, 도 14 및 15는 적정제 공급 및 삼투압을 보여준다.
도 16 내지 19는 제어하지 않은 세포 배양물과 유사하게 종료 락테이트 농도가 유지되는 경우에도 어떻게 본 발명에 따라 제어된 세포 배양물이 실제로 더 큰 산물 농도를 만드는 지를 나타낸다.
역가 분석을 수행하기 위해, 표준 곡선을 3회 반복해서 실행하여 배양 기간 동안 확산시켰다. 이들 값을 평균화하여 평균화에 사용하는 표준 곡선을 구성하였다. 7일 내지 13일 또는 7일 내지 14일에 분석하였다.
도 16 및 17은 (정규화한) 산물의 역가를 나타낸다. 도시된 바와 같이, 본 발명에 따라 증식된 세포 배양물은 예기치 않게 극적으로 증가된 산물 역가 또는 농도를 가졌다. 유사한 결과가 도 18 및 19에 도시되어 있으며, 이는 하루에 생성된 세포의 양을 나타낸다.
본원에서 설명하는 장치, 설비 및 방법은 원핵 세포주 및/또는 진핵 세포주를 포함하는 임의의 원하는 세포주를 배양하기에 적합하다. 또한, 구현예에서, 상기 장치, 설비 및 방법은 현탁 세포 또는 정박-의존성 (부착성) 세포를 배양하기에 적절하며, 또한 약제 및 생물약제 산물 - 예컨대 폴리펩티드 산물, 핵산 산물 (예를 들어 DNA 또는 RNA), 또는 세포 및/또는 바이러스성 치료법 등에 사용되는 세포 및/또는 바이러스류 등의 제조를 위해 구성된 생산 운영에 적합하다.
어떤 구현예에서, 세포는 재조합 치료 산물 또는 진단 산물 등의 산물을 발현 또는 생성한다. 아래에서 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 세포에 의해 생성되는 산물의 예로는, 항체 분자 (가령, 단클론 항체, 이중-특이적 항체), 항체 모사물 (항원에 특이적으로 결합하나 구조적으로는 항체와 무관한 폴리펩티드 분자로서, 가령, DARPins, 어피보디, 어드넥틴 또는 IgNARs), 융합 단백질 (가령, Fc 융합 단백질, 키메릭 사이토킨), 기타 재조합 단백질 (가령, 글리코실화 단백질, 효소, 호르몬), 바이러스성 치료제 (가령, 항암성 온코겐 바이러스, 유전자 치료 및 바이러스성 면역요법용 바이러스성 벡터), 세포 치료제 (가령, 만능줄기세포, 중간엽 줄기세포 및 성체 줄기세포), 백신이나 지질-캡슐화 입자 (가령, 엑소좀, 바이러스 유사 입자), RNA (가령, siRNA 등) 또는 DNA (가령, 플라스미드 DNA), 항생제 또는 아미노산 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 어떤 구현예에서, 상기 장치, 설비 및 방법을 바이오시밀러의 제조에 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 구현예에서, 상기 장치, 설비 및 방법은 진핵세포, 가령, 포유동물 세포 또는 하등동물의 세포, 예컨대 이스트 세포나 섬유형 진균세포, 또는 그램-양성이나 그램-음성 세포 같은 원핵세포의 생산 및/또는 이러한 진핵세포나 원핵세포의 산물들, 가령, 진핵세포를 대규모 방식으로 합성하여 얻은 단백질, 펩티드, 항생제, 아미노산, 핵산 (DNA 또는 RNA 등)의 생산을 가능케 한다. 여기서 별도의 언급이 없는 한, 상기 장치, 설비 및 방법은 벤치-스케일, 파일럿-스케일 및 대량 생산 규모를 포함하여 어떤 원하는 규모나 생산 용량도 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본원에서 별도의 언급이 없으면, 상기 장치, 설비 및 방법은 교반 탱크, 에어리프트, 섬유, 마이크로섬유, 중공 섬유, 세라믹 매트릭스, 유동층, 고정층 및/또는 분출 유동층형 생물 반응기 등을 포함하여 어떤 적절한 반응기(들)도 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용한 바와 같이, "반응기"는 발효기나 발효 장치, 또는 임의의 다른 형태의 반응 용기 포함할 수 있으며, "반응기"는 "발효기"와 상호 교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 어떤 측면에서 예시적인 생물 반응기는 다음 중 하나 이상 또는 모든 종류의 작업을 수행할 수 있다: 영양분 및/또는 탄소 공급원의 공급, 적절한 기체 (가령, 산소)의 주입, 발효 배지나 세포 배지의 유입과 유출, 기상 및 액상의 분리, 온도 유지, 산소 및 CO2 레벨 유지, pH 레벨 유지, 교반 (가령, 진탕), 및/또는 세정/멸균 작업 등이다. 예시적인 반응기, 예컨대 발효 장치는 다수의 반응기를 하나의 유닛 내에 포함할 수 있으며, 예를 들면, 상기 유닛은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개나 그 이상의 생물 반응기를 각 유닛에 포함할 수 있고, 및/또는 하나의 설비가 다수의 유닛을 포함할 수 있으며, 이때 각 유닛은 설비 내에 단일 또는 다수의 반응기를 구비한다. 다양한 구현예에서, 생물 반응기는 회분식, 반 유가식(semi fed-batch), 유가식, 관류식 및/또는 연속식 발효 공정에 적합할 수 있다. 임의의 적절한 반응기 직경을 사용할 수 있다. 구현예에서, 생물 반응기는 약 100 mL 내지 약 50,000 L의 용적을 가질 수 있다. 비제한적인 예시로서, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 6 리터, 7 리터, 8 리터, 9 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 30 리터, 40 리터, 50 리터, 60 리터, 70 리터, 80 리터, 90 리터, 100 리터, 150 리터, 200 리터, 250 리터, 300 리터, 350 리터, 400 리터, 450 리터, 500 리터, 550 리터, 600 리터, 650 리터, 700 리터, 750 리터, 800 리터, 850 리터, 900 리터, 950 리터, 1000 리터, 1500 리터, 2000 리터, 2500 리터, 3000 리터, 3500 리터, 4000 리터, 4500 리터, 5000 리터, 6000 리터, 7000 리터, 8000 리터, 9000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터 및/또는 50,000 리터의 용적을 포함한다. 추가적으로, 적절한 반응기는 다수 사용, 단일 사용, 1회용 또는 다회용일 수 있으며, 스테인리스 스틸 (가령, 316L 또는 임의의 다른 적절한 스테인리스 스틸) 및 인코넬 같은 금속 합금, 플라스틱 및/또는 유리 재질을 포함하는 임의의 적절한 재료로 형성할 수 있다.
구현예에서 및 여기서 별도의 언급이 없는 한, 본원에서 설명하는 장치, 설비 및 방법은 또한 별도의 언급이 없는 임의의 적절한 유닛 조작 및/또는 장비, 예컨대 상기 산물을 분리, 정제 및 단리하기 위한 동작 및/또는 장비도 포함할 수 있다. 임의의 적절한 설비 및 환경을 이용할 수 있으며, 예컨대 전통적인 막대-탑재 설비, 모듈형, 이동식 및 가설 설비, 또는 임의의 다른 적절한 구조물, 설비 및/또는 레이아웃 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 어떤 구현예에서, 모듈형 클린룸을 사용할 수 있다. 부가적으로 또한 별도의 언급이 없는 한, 본원에서 설명한 장치, 시스템 및 방법을 단일 위치나 설비에 수용하거나 및/또는 수행할 수 있으며, 또는 별개로 또 다른 다수의 위치 및/또는 설비에 수용하거나 및/또는 수행할 수 있다.
비제한적이고 한정하지 않는 예시로서, 미국 공보 제2013/0280797호; 제2012/0077429호; 제2011/0280797호; 제2009/0305626호; 및 미국 특허 제8,298,054호; 제7,629,167호; 및 제5,656,491호가 있으며, 그의 전체 내용을 본원에 참조로서 수록한다. 상기 특허들은 적절할 수 있는 예시적인 설비, 장비 및/또는 시스템을 설명한다.
구현예에서, 세포는 진핵세포, 가령, 포유동물 세포이다. 포유동물 세포는 예를 들어, 인간이나 설치류 또는 소의 세포주이거나 세포 균주일 수 있다. 이러한 세포, 세포주 또는 세포 균주의 예로는, 가령 생쥐의 골수종 (NS0)-세포주, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO)-세포주, HT1080, H9, HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, NIH3T3, PC12, BHK (새끼 햄스터 신장세포), VERO, YB2/0, Y0, C127, L 세포, COS, 가령, COS1 및 COS7, QC1-3, HEK-293, VERO, PER.C6, HeLa, EBl, EB2, EB3, 온콜리틱 또는 하이브리도마-세포주 등이 있다. 바람직하게, 포유동물 세포는 CHO-세포주이다. 일 구현예에서, 상기 세포는 CHO 세포이다. 일 구현예에서, 상기 세포는 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO-유래 세포이다. CHO GS 녹아웃 세포 (가령, GSKO 세포)는, 예를 들어 CHO-K1 SV GS 녹아웃 세포이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는 예를 들어 Potelligent® CHOK1SV (Lonza Biologics, Inc.)이다. 진핵세포는 또한 조류 세포, 세포주 또는 세포 균주, 가령 EBx® 세포, EB14, EB24, EB26, EB66 또는 EBvl3 등일 수 있다.
일 구현예에서, 진핵세포는 줄기세포이다. 줄기세포는 예를 들어, 만능 줄기세포로서, 태아 줄기세포(embryonic stem cells, ESCs), 성체 줄기세포, 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs), 조직 특이적 줄기세포(가령, 조혈모 줄기세포) 및 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs) 등일 수 있다.
일 구현예에서, 세포는 본원에서 설명한 임의의 세포들의 분화된 형태이다. 일 구현예에서, 세포는 배양중인 임의의 초기 세포로부터 유래된 세포이다.
구현예에서, 세포는 인간 간세포, 동물 간세포 등의 간세포, 또는 비-연조직 세포이다. 예를 들어, 세포는 배양성 대사-수식된 인간 간세포, 배양성 유도-수식된 인간 간세포, 배양성 퀄리스트 트랜스포터 인증 (Qualyst Transporter Certified)TM 인간 간세포, 현탁-유도된 인간 간세포 (10개의 공여자 및 20개의 공여자 풀에 있는 간세포를 포함함), 인간 간 쿠퍼 세포, 인간 간 윤생형 세포, 개의 간세포 (단일 및 풀 형태의 비글 간세포를 포함함), 마우스 간세포 (CD-1 및 C57BI/6 간세포를 포함함), 쥐 간세포 (스프라그-다울리, 위스타 한, 및 위스타 간세포를 포함함), 원숭이 간세포 (사이노몰구스 또는 레수스 원숭이 간세포를 포함함), 고양이 간세포 (숏헤어 집고양이 간세포를 포함함), 및 토끼 간세포 (뉴질랜드 화이트의 간세포를 포함함) 등일 수 있다. 예시적인 간세포를 트라이앵글 리서치 연구소에서 구입할 수 있다(LLC, 6 Davis Drive Research Triangle Park, North Carolina, USA 27709).
일 구현예에서, 진핵세포는 하등동물의 진핵세포, 가령, 이스트 세포 (가령, 피치아속 (가령, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 클루이베리(Pichia kluyveri), 및 피치아 앙구스타(Pichia angusta)), 코마가타엘라속 (가령, 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris), 코마가타엘라 쉐도파스토리스(Komagataella pseudopastoris) 또는 코마가타엘라 파피 (Komagataella phaffii)), 사카로마이세스속 (가령, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum)), 클루이베로마이세스속 (가령, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르씨아누스 (Kluyveromyces marxianus)), 칸디다속 (가령, 칸디다 우틸리스(Candida utilis), 칸디다 카카오이(Candida cacaoi), 칸디다 보이디니(Candida boidinii)), 지오트리춤속 (가령, 지오트리춤 페르멘탄스(Geotrichum fermentans)), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로우이아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 또는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)) 등이다. 바람직하게는, 피치아 파스토리스 종이다. 피치아 파스토리스 균주의 예로는 X33, GS115, KM71, KM71H; 및 CBS7435가 있다.
일 구현예에서, 진핵세포는 진균류 세포 (가령, 아스페르길루스 (A. 니제르, A. 푸미가투스, A. 오리자이에, A. 니불라 등), 아크레모니움 (A. 테르모필룸 등), 차에토뮴(Chaetomium) (C. 테르모필룸 등), 크리소스포리움(Chrysosporium) (C. 테르모필레 등), 코르디셉스(Cordyceps) (C. 밀리타리스 등), 코리나스쿠스, 크테노마이세스(Ctenomyces), 푸사리움(Fusarium) (F. 옥시스포룸 등), 글로메렐라(Glomerella) (G. 그라미니콜라 등), 하이포크레아 (Hypocrea) (H. 제코리나 등), 마그나포르테(Magnaporthe) (M. 오리자이에 등), 마이셀리오프토라 (Myceliophthora) (M. 테르모필레 등), 네크트리아 (Nectria) (N. 헤아마토코카 등), 뉴로스포라(Neurospora) (N. 크라싸 등), 페니실리움(Penicillium), 스포로트리춤(Sporotrichum) (S. 테르모필레 등), 티엘라비아(Thielavia) (T. 테레스트리스, T. 헤테로탈리카 등), 트리코데르마(Trichoderma) (T. 레세이 등) 또는 베르티실리움(Verticillium) (V. 달리아 등)) 등이다.
일 구현예에서, 진핵 세포는 곤충 세포 (가령, Sf9, MimicTM Sf9, Sf21, High FiveTM (BT1-TN-5B1-4) 또는 BT1-Ea88 세포), 조류 세포 (가령, 암포라(Amophora)속, 바실라리파이시에(Bacillariophyceae), 두날리엘라(Dunaliella), 클로렐라(Chlorella), 클라마이도모나스(Chlamydomonas), 사이아노파이타(Cyanophyta)(사이아노박테리아), 난노클로로프시스(Nannochloropsis), 스피룰리나(Spirulina) 또는 오크로모나스(Ochromonas) 등), 또는 식물 세포 (가령, 외떡잎 식물의 세포 (가령, 옥수수, 쌀, 밀 또는 세타리아 등) 또는 쌍떡잎 식물의 세포 (가령, 카사바, 감자, 콩, 토마토, 담배, 알파파, 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) 또는 아라비돕시스(Arabidopsis)) 등이다.
일 구현예에서, 세포는 박테리아 세포 또는 원핵 세포이다.
구현예에서, 원핵 세포는 바실루스, 스트렙토마이세스, 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스, 또는 락토바실루스 등의 그램-양성 세포이다. 여기서 사용할 수 있는 바실루스는 가령, B. 섭틸리스, B. 아밀로리퀘파시엔스, B. 리체니포르미스, B. 나토 또는 B. 메가테리움 등이다. 구현예에서, 상기 세포는 B. 섭틸리스 3NA 및 B. 섭틸리스 168 같은 B. 섭틸리스이다. 바실루스는, 가령 바실루스 유전자 자원센터에서 수득할 수 있다 (Biological Sciences 556, 484 West 12th Avenue, Columbus OH 43210-1213).
일 구현예에서, 원핵 세포는 살모넬라 spp. 또는 대장균 같은 그램-음성 세포로서, 가령, TG1, TG2, W3110, DH1, DHB4, DH5a, HMS 174, HMS174 (DE3), NM533, C600, HB101, JM109, MC4100, XL1-Blue 및 오리가미 등과, 또한 가령 BL-21 또는 BL21 (DE3) 등의 대장균 B-균주에서 유래된 세포들이 있으며, 이들은 모두 상업적으로 구입할 수 있다.
적절한 숙주 세포는, 예를 들어 DSMZ (Deutsche Sammmlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH, Braunschweig, 독일) 또는 미국 균주 보관소 (American Type Culture Collection, ATCC) 등의 균주 보관 시설로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
구현예에서, 배양 세포는 단클론 항체 등의 항체 및/또는 재조합 단백질 같은 치료 용도의 단백질을 제조하는데 이용된다. 구현예에서, 배양 세포는 펩티드, 아미노산, 지방산 또는 기타 유용한 생화학적 중간체나 대사산물을 생성한다. 예를 들어, 구현예에서, 약 4000 달톤 내지 140,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 분자들을 제조할 수 있다. 구현예에서, 이들 분자는 일정 범위의 복잡성을 가질 수 있으며, 당화반응 등을 포함한 후-번역 변성 과정을 포함할 수 있다.
구현예에서, 단백질은 예를 들어 BOTOX, 미오블록, 뉴로블록, 다이스포트 (또는 보툴리눔 뉴로톡신의 기타 혈청형), 알글루코시다제 알파, 다프토마이신, YH-16, 코리오고나도트로핀 알파, 필그라스팀, 세트로렐릭스, 인터류킨-2, 알데스류킨, 테셀류신, 데니류킨 디프토톡신, 인터레폰 알파-n3 (주사액), 인터페론 알파-nl, DL-8234, 인터페론, 선토리(감마-1a), 인터페론 감마, 티모신 알파 1, 타소네르민, 디지파브(DigiFab), 비페라타브(ViperaTAb), 에치타브(EchiTAb), 크로타브(CroFab), 네시리타이드, 아바타셉트, 알레파셉트, 레비프(Rebif), 에프토테르민 알파, 테리파라타이드 (골다공성), 칼시토닌 주사제 (골질환), 칼시토닌 (비부동, 골다공성), 에타네르셉트, 헤모글로빈 글루타머 250 (소), 드로트레코긴 알파, 콜라게나제, 카르페리타이드, 재조합 인간 외피 성장인자 (국소용 겔, 상처 치료), DWP401, 다르베포에틴 알파, 에포에틴 오메가, 에포에틴 베타, 에포에틴 알파, 데시루딘, 레피루딘, 비발리루딘, 노나코그 알파, 모노닌, 에프타코그 알파 (활성화), 재조합 인자 VIII+VWF, 재조합체, 재조합 인자 VIII, 인자 VIII (재조합체), 알픈메이트, 옥토코그 알파, 인자 VIII, 팔리페르민, 인디키나제, 테넥테플라제, 알테플라제, 파미테플라제, 레테플라제, 나테플라제, 몬테플라제, 폴리트로핀 알파, rFSH, hpFSH, 미카푼긴, 페그필그라스팀, 레노그라스팀, 나르토그라스팀, 세르모렐린, 글루카곤, 엑세나타이드, 프람린타이드, 이니글루세라제, 갈수파제, 류코트로핀, 몰그라모스티린, 트립토렐린 아세테이트, 히스트렐린 (피하용 이식체,하이드론), 데스로렐린, 히스트렐린, 나파렐린, 류프롤라이드 서방형 저장체 (ATRIGEL), 류프롤라이드 이식체 (DUROS), 고세렐린, 에우트로핀, KP-102 프로그램, 소마트로핀, 메카세르민 (성장 부전), 엔엘파비르타이드, Org-33408, 인슐린 글라르진, 인슐린 글루리신, 인슐린 (흡입형), 인슐린 리스프로, 인슐린 데테르니르, 인슐린 (경구형, 고속분무형), 메카세르민 린파베이트, 아나킨라, 셀몰류킨, 99 mTc-아프시타이드 주사제, 미엘로피드, 베타세론, 글라티라머 아세테이트, 게폰, 사르그라모스팀, 오프렐베킨, 인간 백혈구-유래 알파 인터페론류, 빌리브, 인슐린 (재조합체), 재조합 인간 인슐린, 인슐린 아스파르트, 메카세닌, 로페론-A, 인터페론-알파 2, 알파페론, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파, 아보넥스' 재조합 인간 루테인 생성 호르몬, 도르나제 알파, 트라페르민, 지코노타이드, 탈티렐린, 디보테르미날파, 아토시반, 베카플레르민, 에프티피바타이드, 제마이라, CTC-111, 샨바크-B, HPV 백신 (4 원자가), 옥트레오타이드, 란레오타이드, 안세스티른, 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 라로니다제, 프레자타이드 아세트산 구리 (국소용 겔), 라스부리카제, 라니비주맙, 아크티무네, PBG-인트론, 트리코민, 재조합 집먼지 진드기 알레르기 민감소실 주사제, 재조합 인간 부갑상선 호르몬(PTH) 1-84 (sc. 골다공증), 에포데틴 델타, 유전자 전환된 항트롬빈 III, 그란디트로핀, 비트라제, 재조합 인슐린, 인터페론-알파 (경구용 캔디), GEM-21S, 바프레오타이드, 이두르설파제, 옴나파트릴라트, 재조합 혈청 알부민, 세트롤리주맙, 페골, 글루카르피다제, 인간 재조합 C1 에스테라제 저해제 (혈관부종), 라노테플라제, 재조합 인간 성장 호르몬, 엔푸비르타이드 (주사침 없는 주사제, 바이오젝터 2000), VGV-1, 인터페론 (알파), 루시안크탄트, 아비프타딜 (흡입제, 폐질환), 이카티반트, 에칼란타이드, 오미가난, 아우로그랍, 펙시가난 아세테이트, ADI-PEG-20, LDI-200, 데가렐릭스, 신트레델린 베수도톡스, 파블드, MDX-1379, ISAtx-247, 리라글루타이드, 테리파라타이드 (골다공증), 티파코긴, AA4500, T4N5 리포좀 로션, 카투막소맙, DWP413, ART-123, 크라이살린, 데스모테플라제, 아메디플라제, 코리폴리트로핀 알파, TH-9507, 테두글루타이드, 다이아미드, DWP-412, 성장 호르몬 (서방형 주사제), 재조합체 G-CSF, 인슐린 (흡입형, AIR), 인슐린 (흡입형, 테크노스페어), 인슐린 (흡입성, AERx), RGN-303, DiaPep277, 인터페론 베타 (C형 간염 바이러스 감염 (HCV)), 인터페론 알파-n3 (경구용), 벨라타셉트, 경피형 인슐린 패치, AMG-531, MBP-8298, 제레셉트, 오페바칸, AIDSVAX, GV-1001, 림포스칸, 란피르나제, 리폭시산, 루수풀타이드, MP52 (베타-트리칼슘 포스페이트 담체, 골 재생용), 흑색종 백신, 시풀레우셀-T, CTP-37, 인세지아, 비테스펜, 인간 트롬빈 (동결, 수술시 출혈), 트롬빈, 트랜스미드, 알피메프라제, 푸리카제, 테르리프레신 (정맥주사, 간장 신장형 증후군), EUR-1008M, 재조합 FGF-I (주사제, 혈관 질환), BDM-E, 로티가프타이드, ETC-216, P-113, MBI-594AN, 두라마이신 (흡입형, 낭포성 섬유증), SCV-07, OPI-45, 엔도스타틴, 안지오스타틴, ABT-510, 보브만 비르크 저해제 농축물, XMP-629, 99 mTc-하이닉-아넥신 V, 카할라라이드 F, CTCE-9908, 테베렐릭스 (연장 방출), 오자렐릭스, 로르니뎁신, BAY-504798, 인터류킨 4, PRX-321, 펩스칸, 이보크타데킨, 락토페린, TRU-015, IL-21, ATN-161, 실렌지타이드, 알부페론, 비파식스, IRX-2, 오메가 인터페론, PCK-3145, CAP-232, 파시레오타이드, huN901-DMI, 난소암 면역치료용 백신, SB-249553, 온코박스-CL, 온코박스-P, BLP-25, 세르박스-16, 다중-에피토프 펩티드 흑색종 백신 (MART-1, gp100, 티로시나제), 넴피타이드, rAAT (흡입형), rAAT (피부과용), CGRP (흡입형, 천식), 페그수네르셉트, 티모신베타4, 프리티뎁신, GTP-200, 라모플라닌, GRASPA, OBI-1, AC-100, 살몬 칼시토닌 (경구용, 엘리젠), 칼시토닌 (경구용, 골다공증), 엑사모렐린, 카프로모렐린, 카르데바, 벨라페르민, 131I-TM-601, KK-220, T-10, 울라리타이드, 데펠레스타트, 헤마타이드, 크리살린 (국소용), rNAPc2, 재조합 인자 V111 (PEG화 리포좀성), bFGF, PEG화 재조합 스타필로키나제 변이체, V-10153, 소노라이시스 프롤라이제, 뉴로박스, CZEN-002, 췌도세포 신생 요법, rGLP-1, BIM-51077, LY-548806, 엑세나타이드 (조절방출, 메디소브), AVE-0010, GA-GCB, 아보렐린, ACM-9604, 리나클로티드 에아세테이트, CETi-1, 헤모스판, VAL (주사제), 신속 작용 인슐린 (주사제, 비아델), 비강내 인슐린, 인슐린 (흡입형), 인슐린 (경구용, 엘리젠), 재조합 메티오닐 인간 렙틴, 피트라킨라 (피하주사, 습진), 피트라키나 (흡입형 건조 분말, 천식), 멀티킨, RG-1068, MM-093, NBI-6024, AT-001, PI-0824, Org-39141, Cpn10 (자가면역 질환/염증), 탈락토페린 (국소용), rEV-131 (안과용), rEV-131 (호흡기 질환), 경구용 재조합 인간 인슐린 (당뇨병), RPI-78M, 오프렐베킨 (경구용), CYT-99007 CTLA4-Ig, DTY-001, 발라테그라스트, 인터페론 알파-n3 (국소용), IRX-3, RDP-58, 타우페론, 담즙 염 자극 리파제, 메리스파제, 알라닌 포스파타제, EP-2104R, 멜라노탄-II, 브레멜라노타이드, ATL-104, 재조합 인간 마이크로플라스민, AX-200, SEMAX, ACV-1, Xen-2174, CJC-1008, 다이노르핀 A, SI-6603, LAB GHRH, AER-002, BGC-728, 말라리아 백신 (바이로좀, PeviPRO), ALTU-135, 파르보바이러스 B19 백신, 인플루엔자 백신 (재조합 뉴라미니다제), 말라리아/HBV 백신, 안트락스 백신, Vacc-5q, Vacc-4x, HIV 백신 (경구용), HPV 백신, 타트 톡소이드, YSPSL, CHS-13340, PTH(1-34) 리포좀 크림 (노바좀), 오스탈린-C, PTH 유사체 (경구용, 원포자충증), MBRI-93.02, MTB72F 백신 (폐결핵), MVA-Ag85A, 백신 (폐결핵), FARA04, BA-210, 재조합 플라그 FIV 백신, AG-702, OxSODrol, rBetV1, Der-p1/Der-p2/Der-p7 알레르겐-표적화 백신 (집먼지 진드기 알레르기), PR1 펩티드 항원 (백혈병), 돌연변이 라스 백신, HPV-16 E7, 리포펩티드 백신, 라비린틴 백신 (선암), CML 백신, WT1-펩티드 백신 (암), IDD-5, CDX-110, 펜트리스, 노렐린, 사이토파브, P-9808, VT-111, 이크로캅티드, 텔베르민 (피부과, 당뇨발 궤양)), 루핀트리비르, 레티쿨로스, rGRF, HA, 알파-갈락토시다제 A, ACE-011, ALTU-140, CGX-1160, 안지오텐신 치료 백신, D-4F, ETC-642, APP-018, rhMBL, SCV-07 (경구용, 폐결핵), DRF-7295, ABT-828, ErbB2-특이적 이뮤노톡신 (항암제), DT3SSIL-3, TST-10088, PRO-1762, 콤보톡스, 콜레사이스토키닌-B/가스트린-수용체 결합 펩티드, 111In-hEGF, AE-37, 트라스니주맙-DM1, 길항제 G, IL-12 (재조합체), PM-02734, IMP-321, rhIGF-BP3, BLX-883, CUV-1647 (국소용), L-19 계열 방사면역치료제 (암), Re-188-P-2045, AMG-386, DC/1540/KLH 백신 (암), VX-001, AVE-9633, AC-9301, NY-ESO-1 백신 (펩티드), NA17.A2 펩티드, 흑색종 백신 (펄스 항원 치료제), 전립선암 백신, CBP-501, 재조합 인간 락토페린 (안구건조증), FX-06, AP-214, WAP-8294A (주사제), ACP-HIP, SUN-11031, 펩티드 YY [3-36] (비만, 비강내 투여), FGLL, 아타시셉트, BR3-Fc, BN-003, BA-058, 인간 부갑상선 호르몬 1-34 (비강, 골다공증), F-18-CCR1, AT-1100 (복강 질환/당뇨병), JPD-003, PTH(7-34), 리포좀 크림 (노바좀), 두라마이신 (안과용, 안구건조증), CAB-2, CTCE-0214, 글리코 PEG화 에리드로포이에틴, EPO-Fc, CNTO-528, AMG-114, JR-013, 팩토 (XIII), 아미노칸딘, PN-951, 716155, SUN-E7001, TH-0318, BAY-73-7977, 테베렐릭스 (즉시 방출), EP-51216, hGH (조절 방출, 바이오스페어), OGP-I, 시푸비르타이드, TV4710, ALG-889, Org-41259, rhCC10, F-991, 티모펜틴 (폐질환), r(m)CRP, 간 선택적 인슐린, 수발린, L19-IL-2 융합 단백질, 엘라핀, NMK-150, ALTU-139, EN-122004, rhTPO, 트롬보포이에틴 수용체 작용제 (혈소판 감소성 장애), AL-108, AL-208, 신경 성장인자 길항제 (통증), SLV-317, CGX-1007, INNO-105, 경구형 테리파라타이드 (엘리젠), GEM-OS1, AC-162352, PRX-302, LFn-p24 융합 백신 (테라포어), EP-1043, S 폐렴 소아 백신, 말라리아 백신, 나이세리아 수막염 B군 백신, 신생아 B군 스트렙토코쿠스 백신, 탄저병 백신, HCV 백신 (gpE1+gpE2+MF-59), 중이염 치료, HCV 백신 (코어 항원+ISCOMATRIX), hPTH(1-34) (경피성, ViaDerm), 768974, SYN-101, PGN-0052, 아비스쿰닌, BIM-23190, 폐결핵 백신, 다중-에피토프 티로시나제 펩티드, 암 백신, 엔카스팀, APC-8024, GI-5005, ACC-001, TTS-CD3, 혈관-표적 TNF (고형 종양), 데스모프레신 (경구 조절-방출), 오네르셉트, 및 TP-9201 등이 있다.
어떤 구현예에서, 폴리펩티드는 아달리무맙 (HUMIRA), 인플릭시맙 (REMICADE TM), 리툭시맙 (RITUXANTM/MAB THERATM), 에타네르셉트 (ENBRELTM), 베바시주맙 (AVASTINTM), 트라스투주맙 (HERCEPTINTM), 페그릴그라스팀 (NEULASTATM), 또는 바이오시밀러 및 바이오베터를 포함한 임의의 다른 적절한 폴리펩티드이다.
다른 적합한 폴리펩티드는 하기의 표 및 US2016/0097074의 표 1에 열거한 것 들이다:
단백질 산물 참조약물 목록
인터페론 감마-1b 악티뮴(Actimmune)®
알테플라제, 조직 플라스미노겐 활성화제 악티바제(Activase)®/카트플로(Cathflo)®
재조합 항혈우병 인자 아드베이트(Advate)
인간 알부민 알부테인(Albutein)®
라로니다제 알두라자임(Aldurazyme)®
인터페론 알파-N3, 인간 백혈구 유래 알페론(Alferon) N®
인간 항혈우병 인자 알파네이트(Alphanate)®
바이러스-여과된 인간 응집 인자 IX 알파나인(AlphaNine)® SD
알레파셉트; 재조합 이량체 융합 단백질 LFA3-Ig 아메비브(Amevive)®
비발리루딘 안지오맥스(Angiomax)®
다르베포에틴 알파 아라네스프(Aranesp)TM
베바씨주맙 아바스틴(Avastin)TM
인터페론 베타-1a; 재조합체 아보넥스(Avonex)®
응집 인자 IX 베네픽스(BeneFix)TM
인터페론 베타-1b 베타세론(Betaseron)®
토시투모맙 벡사르(BEXXAR)®
항혈우병 인자 바이오클레이트(Bioclate)TM
인간 성장 호르몬 바이오트로핀(BioTropin)TM
보툴리눔 독소 A형 보톡스(BOTOX)®
알렘투주맙 캄파스(Campath)®
아크리투모맙; 테크네티움-99 표지됨 CEA-스칸(Scan)®
알글루세라제; 변성 형태의 베타-글루코세레브로시다제 세레다제(Ceredase)®
이미글루세라제; 재조합 형태의 베타-글루코세레브로시다제 세레자임(Cerezyme)®
크로탈리다제 다가 면역 파브 [양] 크로팝(CroFab)TM
디곡신 면역 파브 [양] 디지팝(DigiFab)TM
라스부리카제 엘리텍(Elitek)®
에타네르셉트 엔브렐(ENBREL)®
에포이에틴 알파 에포겐(Epogen)®
세툭시맙 에르비툭스(Erbitux)TM
알가시다제 베타 파브라자임(Fabrazyme)®
우르폴리트로핀 페리닉스(Ferinex)TM
폴리트로핀 베타 폴리스팀(Follistim)TM
테리파라타이드 포르테오(FORTEO)®
인간 소마트로핀 게노트로핀(GenoTropin)®
글루카곤 글루카젠(GlucaGen)®
폴리트로핀 알파 고날(Gonal)-F®
항혈우병 인자 헬릭사이트(Helixate)®
항혈우병 인자; 인자(XIII) 헤모필(HEMOFIL)
아데포비르 디피복실 헵세라(Hepsera)TM
트라스투주맙 헤르셉틴(Herceptin)®
인슐린 휴말로그(Humalog)®
항혈우병 인자/본 빌레브랜트 인자 복합체-인간 휴메이트(Humate)-P®
소마트로핀 휴마트로페(Humatrope)®
아달리무맙 휴미라(HUMIRA)TM
인간 인술린 휴물린(Humulin)®
재조합 인간 히알루로니다제 하일레넥스(Hylenex)TM
인터페론 알파콘-1 인페르젠(Infergen)®
에피티피바타이드 인테그릴린(Integrillin)TM
알파-인터페론 인트론(Intron) A®
팔리페민 케피반스(Kepivance)
아나킨라 키네렛(Kineret)TM
항혈우병 인자 코게네이트(Kogenate)®FS
인술린 글라진 란투스(Lantus)®
과립구 마크로파지 콜로니-모사 인자 류킨(Leukine)®/류킨(Leukine)®액상체
루트로핀 알파 주사제 루베리스(Luveris)
OspA 리포단백질 라이메릭스(LYMErix)TM
라니비주맙 루센티스(LUCENTIS)®
겜투주맙 오조가미신 마일로타르그(Mylotarg)TM
갈수파제 나글라자임(Naglazyme)TM
네시리타이드 나트레코르(Natrecor)®
페그필그라스팀 네우라스타(Neulasta)TM
오프렐베킨 네우메가(Neumega)®
필그라스팀 네우포젠(Neupogen)®
파놀레소맙 뉴트로스펙(NeutroSpec)TM(옛이름, 레우테크(LeuTech)®
소마트로핀 [rDNA] 노르디트로핀(Norditropin)®/노르디트로핀 노르디플렉스 (Norditropin Nordiflex)®
미톡산트론 노반트론(Novantrone)®
인슐린; 아연 현탁액 노볼린(Novolin) L®
인슐린; 이소판 현탁액 노볼린(Novolin) N®
인슐린, 일반형 노볼린(Novolin) R®
인슐린 노볼린(Novolin)®
응집 인자 VIIa 노보세븐(NovoSeven)®
소마트로핀 누트로핀(Nutropin)®
면역글로불린 정맥주사제 옥타감(Octagam)®
PEG-L-아스파라기나제 온카스파르(Oncaspar)®
아바타셉트, 완전 용해형 인간 융합 단백질 오렌시아(Orencia)TM
무로모맙-CD3 오르토클론(Orthoclone) OKT3®
고분자량 히알루론산 오르토비스크(Orthovisc)®
인간 융모막 고나드로핀 오비드렐(Ovidrel)®
체내 감퇴 바실러스 칼메트-구에린 파시스(Pacis)®
페그 인터페론 알파-2a 페가시스(Pegasys)®
인터페론 알파-2b의 페길레이트화 버전 PEG-인트론(Intron)TM
아바렐릭스(주사용 현탁액); 고나도트로핀-방출 호르몬 길항제 플레낙시스(Plenaxis)TM
에포이에틴 알파 프로크리트(Procrit)®
알데스류킨 프롤류킨(Proleukin), IL-2®
소마트렘 프로트로핀(Protropin)®
도르나제 알파 풀모자임(Pulmozyme)®
에팔리주맙; 선택형 가역성 T-세포 차단제 랍티바(RAPTIVA)TM
리바비린과 알파 인터페론의 조합물 레베트론(Rebetron)TM
인터페론 베타 1a 레비프(Rebif)®
항혈우병 인자 리콤비네이트(Recombinate)® rAHF
항혈우병 인자 레팍토(ReFacto)®
레피루딘 레풀루단(Refludan)®
인플릭씨맙 레미케이드(Remicade)®
아비식씨맙 레오프로(ReoPro)TM
레테플라제 레타바세(Retavase)TM
리툭시마 리툭산(Rituxan)TM
인터페론 알파-2a 로페론(Roferon)-A®
소마트로핀 세이젠(Saizen)®
합성 돼지 세크레틴 세크로플로(SecreFlo)TM
바실릭시맙 시물렉트(Simulect)®
에쿨리주맙 솔리리스(SOLIRIS)®
페그비소만트 소마베르트(SOMAVERT)®
팔리비주맙; 재조합 생성, 인간화 mAb 사이나기스(Synagis)TM
타이로트로핀 알파 타이로젠(Thyrogen)®
테네크테플라제 TNK카제(TNKase)TM
나탈리주맙 타이사브리(TYSABRI)®
인간 면역글로불린 정맥주사용 5% 및 10% 용액 베노글로불린(Venoglobulin)-S®
인터페론 알파-n1, 림프아구 웰페론(Wellferon)®
드로트레코긴 알파 자이그리스(Xigris)TM
오말루주맙; 재조합 DNA-유래의 인간화 단클론 항체 표적화 면역글로불린-E 졸라이르(Xolair)®
다클리주맙 제나팍스(Zenapax)®
이브리투모맙 티욱세탄 제발린(Zevalin)TM
소마토트로핀 조르브티브(Zorbtive)TM (세로스팀(Serostim)®)
구현예에서, 폴리펩티드는 표 2에 나타낸 바와 같이 호르몬, 혈전/응집인자, 사이토킨/성장인자, 항체 분자, 융합 단백질, 단백질 백신, 또는 펩티드 등이다.
예시적인 제품
치료제 종류 제품 상표명
호르몬 에리트로포이에틴, 에포에인-α
다르베포이에틴-α
성장 호르몬(Growth hormone, GH), 소마토트로핀

인간 각질-자극 호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH)
인간 융모막 고나도트로핀
루트로핀-α
글루카곤
성장 호르몬 방출 호르몬 (Growth hormone releasing hormone, GHRH)
세크레틴
갑상선 자극 호르몬 (Thyroid stimulating hormone, TSH), 타이로트로핀		 에포겐, 프로크리트
아라네스프
게노트로핀 , 휴마트로프, 노르디트로핀, 노브IV비트로핀, 뉴트로핀, 옴니트로프, 프로트로핀, 시아젠, 세로스팀, 발트로핀, 고날-F, 폴리스팀

오비드렐, 루베리스
GlcaGen
제레프
치로스팀 (인간 펩티드), 세크레플로 (돼지 펩티드)
타이로젠
혈전/응집 인자 인자 VIIa
인자 VIII

인자 IX
항트롬빈 III (AT-III)
단백질 C 농축물		 노보세븐
바이오클레이트, 헬릭세이트, 코제네이트, 리콤비네이트, 레팍토

베네픽스
트롬베이트 III
세프로틴
사이토킨/성장 인자 제 1형 알파-인터페론
인터페론-αn3 (IFNαn3)
인터페론-β1a (rIFN- β)
인터페론-β1b (rIFN- β)
인터페론-η1b (IFN η)
알데스류킨 (인터류킨 2(IL2),
표피 흉선세포 활성화 인자; ETAF
팔리페르민 (각질세포 성장 인자; KGF)
베카플레민 (혈소판-유래 성장 인자; PDGF)
아나킨라 (재조합체 IL1 길항제)		 인페르젠
알페론 N
아보넥스, 레비프
베타세론
악티뮴
프로류킨
케피반스
레그라넥스
안릴, 키네렛
항체 분자 베바시주맙 (VEGFA mAb)
세툭시맙 (EGFR mAb)
파니투무맙 (EGFR mAb)
알렘투주맙 (CD52 mAb)
리툭시맙 (CD20 키메릭 Ab)
트라스투주맙 (HER2/Neu mAb)
아바타셉트 (CTLA Ab/Fc 융합물)
아달리무맙 (TNFα mAb)
에타네르셉트 (TNF 수용체/Fc 융합물)
인플릭시맙 (TNFα 키메릭 mAb)
알레파셉트 (CD2 융합 단백질)
에팔리주맙 (CD11a mAb)
나탈리주맙 (인테그린 α4 서브유닛 mAb)
에쿨리주맙 (C5mAb)
무로모납-CD3		 아바스틴, 에르비툭스
벡티빅스
캄파스
리툭산
헤르셉틴, 오렌시아
휴미라, 엔브렐
레미케이드
아메비브
랍티바, 타이사브리
솔리리스, 오르토클론, OKT3
기타:
융합 단백질/단백질 백신/펩티드		 인슐린
헤파티티스 B 표면 항원 (HBsAg)
HPV 백신
OspA
항-붉은털 원숭이(Rh) 면역글로불린 G
엔푸비르타이드
스파이더 실크, 가령, 피브리온		 휴물린, 노볼린
엔제릭스, 레콤비박스 HB
가르다실
라임에릭스
로파일락
푸제온
QMONOS
구현예에서, 단백질은 표 3에 나타낸 바와 같은 다중특이적 단백질, 가령, 이중특이적 항체이다.
이중특이적 포맷
명칭 (다른 명칭, 공급 기관) BsAb 포맷 표적 소개된 반응기전 개발 단계 질환 (또는 건강한 지원자)
카투막소맙 (레모밥(Removab)®, 프레세니우스 바이오테크, 트리온 파마, 네오팜) BsIgG: Triomab CD3, EpCAM T 세포에서 종양으로 재표적화, Fc 매개 효능기의 작용 EU 승인 EpCAM 양성 종양에서의 심각한 다수
에르투막소맙 (네오비 바이오테크, 프레세니우스 바이오테크) BsIgG: Triomab CD3, HER2 T 세포에서 종양으로 재표적화 임상 I/II상 진행성 고형암
블리나투모맙 (블린사이토®, AMG 103, MT 103, MEDI 538, 암젠) BiTE CD3, CD19 T 세포에서 종양으로 재표적화 USA 승인
임상 II상 및 III상
임상 II상
임상 I상		 전구체 B-세포
전체
전체
DLBCL
NHL
REGN1979 (레제네론) BsAb CD3, CD20
솔리토맙(AMG 110, MT110, 암젠) BiTE CD3, EpCAM T 세포에서 종양으로 재표적화 임상 I상 고형암
MEDI 565 (AMG 211, 메드이뮴, 암젠) BiTE CD3, CEA T 세포에서 종양으로 재표적화 임상 I상 위선암
RO6958688 (로쉐) BsAb CD3, CEA
BAY2010112 (AMG 212, 바이에르; 암젠) BiTE CD3, PSMA T 세포에서 종양으로 재표적화 임상 I상 전립선암
MGD006 (마크로제닉스) DART CD3, CD123 T 세포에서 종양으로 재표적화 임상 I상 AML
MGD007 (마크로제닉스) DART CD3, gpA33 T 세포에서 종양으로 재표적화 임상 I상 대장암
MGD011 (마크로제닉스) DART CD19, CD3
스코르피온(에머전트 바이오솔루션즈, 트루비온) BsAb CD3, CD19 T 세포에서 종양으로의 재표적화
AFM11 (아피메드 테라페우틱스) TandAb CD3, CD19 T 세포에서 종양으로의 재표적화 임상 I상 NHL 및 전체
AFM12 (아피메드 테라페우틱스) TandAb CD19, CD16 NK 세포에서 종양세포로의 재표적화
AFM13 (아피메드 테라페우틱스) TandAb CD30, CD16A NK 세포에서 종양 세포로의 재표적화 임상 II상 호지킨 림프종
GD2 (바바라 앤 카르마노스 암연구소) BsAb가 사전적재된 T 세포 CD3, GD2 T 세포에서 종양으로의 재표적화 임상 I/II상 신경섬유종 및 골육종
pGD2 (바바라 앤 카르마노스 암연구소) BsAb가 사전 적재된 T 세포 CD3, Her2 T 세포에서 종양으로의 재표적화 임상 II상 전이성 유방암
EGFRBi-무장 자가유래 활성화 T 세포 (로저 윌리암스 메디칼 센터) BsAb가 사전 적재된 T 세포 CD3, EGFR EGFR-양성 종양에 대해 자가유래 활성화된 T 세포 임상 I상 폐암 및 기타 고형암
항-EGFR-무장 활성화 T-세포 (바바라 앤 카르마노스 암연구소) BsAb가 사전 적재된 T 세포 CD3, EGFR EGFR-양성 종양에 대해 자가유래 활성화된 T 세포 임상 I상 대장암 및 췌장암
rM28 (튜빙겐 대학병원) 직렬scFv CD28, MAPG T 세포에서 종양으로의 재표적화 임상 II상 전이성 흑색종
IMCgp100 (이뮤노코어) ImmTAC CD3, 펩티드 MHC T 세포에서 종양으로의 재표적화 임상 I/II상 전이성 흑색종
DT2219ARL (NCI, 미네소타 대학) 디프테리아 독소에 결합된 2 scFv CD19, CD22 단백질 독소에서 종양으로 표적화 임상 I상 B 세포 백혈병 또는 림프종
XmAb5871 (젠코르) BsAb CD19, CD32b
NI-1701 (노브이뮨) BsAb CD47, CD19
MM-111 (메리맥) BsAb ErbB2, ErbB3
MM-141 (메리맥) BsAb IGF-1R, ErbB3
NA (메루스) BsAb HER2, HER3
NA (메루스) BsAb CD3, CLEC12A
NA (메루스) BsAb EGFR, HER3
NA (메루스) BsAb PD1, 미발표
NA (메루스) BsAb CD3, 미발표
둘리고투주맙 (MEHD7945A, 제네테크, 로슈) DAF EGFR, HER3 2개의 수용체의 차단, ADCC 임상 I상 및 II상
임상 II상		 두경부암
대장암
LY3164530 (엘리 릴리) 미발표 EGFR, MET 2개의 수용체의 차단 임상 I상 진행성 또는 전이성 암
MM-111 (메리맥 파마슈티컬스) HSA 바디 HER2, HER3 2개의 수용체의 차단 임상 II상
임상 I상		 위암, 식도암
유방암
MM-141, (메리맥 파마슈티컬스) IgG-scFv IGF-1R, HER3 2개의 수용체의 차단 임상 I상 진행성 고형암
RG7221 (RO5520985, 로슈) CrossMab Ang2, VEGF A 2개의 전구 혈관 형성체의 차단 임상 I상 고형암
RG7716 (로슈) CrossMab Ang2, VEGF A 2개의 전구 혈관 형성체의 차단 임상 I상 습식 노인성 황반변성 (AMD)
OMP-305B83 (온코메드) BsAb DLL4/VEGF
TF2 (이뮤노메딕스) Dock and lock CEA, HSG PET 또는 방사선 영상을 위한 종양 사전표적화 임상 II상 대장암, 유방암 및 폐암
ABT-981 (애브비) DVD-Ig IL-1α, IL-1β 2개의 전염증성 사이토킨의 차단 임상 II상 골관절염
ABT-122 (애브비) DVD-Ig TNF, IL-17A 2개의 전염증성 사이토킨의 차단 임상 II상 류마티스 관절염
COVA322 IgG-fynomer TNF, IL17A 2개의 전염증성 사이토킨의 차단 임상 I/II상 판상 건선
SAR156597 (사노피) 4가 이중특이적 직렬
IgG		 IL-13, IL-4 2개의 전염증성 사이토킨의 차단 임상 I상 특발성 폐섬유화증
GSK2434735
(GSK)		 이중 표적 도메인 IL-13, IL-4 2개의 전염증성 사이토킨의 차단 임상 I상 (건강한 지원자)
Ozoralizumab (ATN103, 아블린크스) 나노바디 TNF, HSA 전염증성 사이토킨의 차단, HSA에 대한 결합을 통한 반감기 증가 임상 II상 류마티스 관절염
ALX-0761 (메르크 세로노, 아블린크스) 나노바디 IL-17A/F, HSA 2개의
전염증성 사이토킨의 차단, HSA에 대한 결합을 통한 반감기 증가
임상 I상 (건강한 지원자)
ALX-0061 (AbbVie, 아블린크스; 나노바디 IL-6R, HSA 전염증성 사이토킨의 차단, HSA에 대한 결합을 통한 반감기 증가 임상 I/II상 류마티스 관절염
ALX-0141 (아블린크스, 에딩팜) 나노바디 RANKL, HSA 골재흡수 차단, HSA에 대한 결합을 통한 반감기 증가 임상 I상 폐경기 골손실
RG6013/ACE910 (슈가이, 로슈) ART-Ig 인자 IXa, 인자 X 혈장 응집 임상 II상 혈우병
본 발명에 대한 이들 및 다른 수정과 변형은 본 발명의 기술적 사상 및 범위를 벗어나지 않고 당업자에 의해 실시될 수 있으며, 이는 첨부된 청구범위에 보다 구체적으로 설명되어 있다. 또한, 다양한 구현예의 측면들은 전체적으로 또는 부분적으로 상호 교환될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 당업자는 전술한 설명이 단지 예일 뿐이며, 첨부된 청구범위에 추가로 기재된 본 발명을 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다.

Claims (35)

  1. 세포 배양물에서 락테이트, 단백질, 글리칸, 전하 변동, 응집체, 디설파이드 산화, 및 디설파이드 셔플링 변동으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 품질 속성의 농도를 결정하는 단계;
    세포 배양물 내에서 하나 이상의 속성 영향 파라미터(attribute influencing parameter) 측정값을 측정하는 단계;
    품질 속성 농도 및 상기 하나 이상의 속성 영향 파라미터 측정값을 제어기로 전송하는 단계로, 제어기는 세포 배양물에서 적어도 하나의 속성 영향 파라미터 측정값에 대해 적어도 부분적으로 기반하여 미래의 품질 속성 농도를 계산하기 위하여 구성된 예측 모델을 포함하는 단계; 및
    최적화기에서 시뮬레이션을 실행하여 세포 배양물 내에서 속성 영향 파라미터의 조작을 기반으로 품질 속성의 미래 농도를 계산하는 단계를 포함하는 세포 배양물을 증식하는 방법으로서,
    상기 제어기는 미리 설정된 한계 내에서 품질 속성 농도를 유지하기 위해 세포 배양물에서 계산된 미래의 품질 속성 농도의 시뮬레이션에 기반하여 세포 배양물 내에서 하나 이상의 조건을 선택적으로 변화시키는 세포 배양물을 증식하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 속성 영향 파라미터는 pH, 글루타메이트 농도, 포도당 농도, 아스파라긴 농도, 온도, 및 영양분 공급 속도로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 예측 모델은 2가지 이상의 상이한 다변량 방법을 사용하여 미래의 농도를 계산하는 것인 방법.
  4. 세포 배양물에서 락테이트의 농도를 결정하는 단계;
    세포 배양물 내에서 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터 측정값을 측정하는 단계;
    락테이트 농도 및 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터 측정값을 제어기로 전송하는 단계로, 상기 제어기는 세포 배양물에서 적어도 하나의 속성 영향 파라미터 측정값에 대해 적어도 부분적으로 기반하여 미래의 락테이트 농도를 계산하기 위하여 구성된 예측 모델을 포함하는 단계; 및
    최적화기에서 시뮬레이션을 실행하여 세포 배양물 내에서 락테이트 영향 파라미터의 조작을 기반으로 미래의 락테이트 농도를 계산하는 단계를 포함하는 세포 배양물을 증식하는 방법으로서,
    상기 제어기는 미리 설정된 한계 내에서 락테이트 농도를 유지하기 위해 세포 배양물에서 계산된 미래의 락테이트 농도의 시뮬레이션에 기반하여 세포 배양물 내에서 하나 이상의 조건을 선택적으로 변화시키고,
    상기 세포 배양물은 수확되기 전에 배양 기간을 가지며, 예측 모델은 배양 기간의 종료 시 최종 락테이트 농도를 예측하는, 세포 배양물을 증식하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 락테이트 영향 파라미터는 pH, 글루타메이트 농도, 포도당 농도, 아스파라긴 농도, 온도, 영양분 공급 속도로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 2개 이상의 락테이트 영향 파라미터가 측정되고, 측정된 데이터는 제어기로 전송되어 세포 배양물에서 미래의 락테이트 농도를 계산하는데 사용되는 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 세포 배양물에 공급되는 영양 배지를 변화시킴으로써, 하나 이상의 조건을 선택적으로 변화시키는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 영양 배지는 탄수화물 공급원, 아미노산 공급원, 비타민, 지질, 단백질, 펩티드 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 세포 배양물로의 영양 배지의 유량을 변화시킴으로써, 세포 배양물로 공급되는 영양 배지를 변화시키는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 세포 배양물에 공급되는 영양 배지를 변화시키는 것에 추가하여, 락테이트 농도를 미리 설정된 한계 내에서 유지하기 위해 세포 배양물의 pH 역시 선택적으로 변화시키는 것인 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 세포 배양물은 수확되기 전에 배양 기간을 가지며, 예측 모델은 배양 기간 종료시에 최종 락테이트 농도를 예측하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 배양 기간의 종료시에 세포 배양물의 최종 락테이트 농도가 2 g/L 미만이 되도록, 배양 기간 동안 세포 배양물 내에서 하나 이상의 조건을 선택적으로 변화시키는 것인 방법.
  13. 제4항에 있어서, 상기 방법은 세포 배양물의 역가 농도의 증가를 가져오는 것인 방법.
  14. 제4항에 있어서, 상기 세포 배양물은 포유동물 세포를 함유하는 것인 방법.
  15. 제4항에 있어서, 상기 세포 배양물은 회분식 공정으로 12 시간 내지 28일 동안 증식된 후에 수확되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 제어기가 세포 배양물에서 미래의 락테이트 농도를 계산하기 전에, 세포 배양물에서 락테이트 농도는 12 시간 내지 4 일 동안 계산되는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 회분식 공정은 세포 배양물을 수확하기 전에 배양 시간을 포함하고, 제어기가 세포 배양물에서 미래의 락테이트 농도를 계산하기 전에, 락테이트 농도는 배양 시간의 5% 내지 40% 동안 측정되는 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 락테이트 농도는 적어도 12시간 마다 계산되고, 모든 락테이트 농도 데이터는 제어기로 공급되며, 제어기는 추가 데이터가 수신됨에 따라 세포 배양물에서 미래의 락테이트 농도를 반복적으로 계산하는 것인 방법.
  19. 제4항에 있어서, 상기 예측 모델은 락테이트 농도를 이전 기준 데이터와 비교하는 것을 기반으로 하는 것인 방법.
  20. 제4항에 있어서, 상기 미래의 락테이트 농도는 미리 정해진 기준 궤적으로부터 예측한 락테이트 농도의 제곱 편차로부터의 예측 모델에 의해 계산되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 락테이트의 예측 농도는 또한 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터의 변화의 제곱 편차에 기반해서 계산되는 것인 방법.
  22. 제4항에 있어서, 미래의 락테이트 농도는 부분 제곱 분석, 분류 트리, 지지 벡터 결정, 선형 판별 분석 또는 이들의 조합으로부터 선택된 한가지 이상의 기술을 이용하여 계산되는 것인 방법.
  23. 제4항에 있어서, 상기 미래의 락테이트 농도는 감소 차수 변화 회귀 외인성 모델을 사용하여 제어기에 의해 계산되는 것인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 예측 모델은 매일 예측 출력과 기준 궤적 간의 차에 가중치를 적용하는 것인 방법.
  25. 세포 배양물을 수용하기 위한 중공의 내부가 규정된 생물 반응기로, 생물 반응기는 중공의 내부에 물질을 공급하고/하거나 그로부터 제거하는 다수의 포트를 포함하는 생물 반응기;
    생물 반응기의 중공 내부에 영양 배지를 공급하는 영양 배지 공급부로, 영양 배지 공급부는 생물 반응기 상의 포트 중 하나 이상의 포트와 유체 연통되는 영양 배지 공급부;
    생물 반응기에 수용된 세포 배양물의 락테이트 농도 측정값을 수신하도록 구성되고, 또한 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터의 측정값도 수신하도록 구성되며, 생물 반응기에 수용된 세포 배양물에서 미래의 락테이트 농도를 계산하기 위하여 구성된 예측 모델을 포함하고,
    세포 배양물 내의 영양 배지의 조작에 근거하여 락테이트 농도의 시뮬레이트된 미래 농도를 계산하기 위해 최적화기 상에서 시뮬레이션을 실행하도록 구성되며,
    락테이트 농도를 미리 설정된 한계 내에서 유지하기 위해, 예측된 락테이트 농도의 시뮬레이션에 기반하여 영양 배지 공급부를 제어하기 위하여 구성되고, 생물 반응기 내로의 영양 배지의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시키는 제어기;
    를 포함하는 세포 배양물 증식 시스템.
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  32. 제1항에 있어서, 하나 이상의 속성 영향 파라미터의 시간에 따른 변화를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제4항에 있어서, 하나 이상의 락테이트 영향 파라미터의 시간에 따른 변화를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 제어기는 폐쇄 루프 제어 시스템에서 작동하고, 여기서 세포 배양물을 포함하는 생물 반응기에 연결된 입력 및/또는 출력 장치에 대한 조정은 완전 자동화되는 것인 방법.
  35. 제4항에 있어서, 상기 제어기는 폐쇄 루프 제어 시스템에서 작동하고, 여기서 세포 배양물을 포함하는 생물 반응기에 연결된 입력 및/또는 출력 장치에 대한 조정은 완전 자동화되는 것인 방법.
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