JP2023109835A - 連続的採取を行い細胞流出を行わない強化灌流による細胞培養法 - Google Patents

Abstract

【課題】バイオリアクタでの細胞培養物の灌流培養によって生体物質を製造する方法を提供する。
【解決手段】（ａ）細胞培地と細胞とを含む細胞培養物を培養すること、（ｂ）前記細胞培養物を基礎培地および流加培地とともにバイオリアクタにて灌流させること、および（ｃ）生体物質を採取することを含む生体物質の製造方法であって、前記基礎培地が、０．１から２．０以下の１日当たりのワーキングボリューム（ＶＶＤ）の灌流速度で供給され、前記流加培地の前記灌流が、前記基礎培地の前記灌流速度の０．１％から２０％の範囲の速度であり、前記細胞培養物を分離システムに連続的に通して前記生体物質を採取し、前記細胞を、流出させずに前記バイオリアクタに保持する方法とする。
【選択図】図１６

Description

相互参照
本出願は、２０１８年１１月２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１３７７６号、および２０１９年６月４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０８９９９３号の優先権を主張するものである。両出願の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本開示は、細胞を培養し、生体物質を採取する方法およびシステムに関する。より詳細には、本開示は、連続的採取を行い細胞流出を行わない強化灌流による細胞培養法に関する。

発明の背景
１９８０年代にバイオ医薬の製造が始まって以来、治療用組換えタンパク質の量の増大化の要望が高まり続けている。組換えタンパク質または他の生体生成物を製造する製造法の開発は、多くの可変要素のバランスを取らなければならない複雑な企てである。

典型的な灌流法では、細胞に新鮮な培地を連続的に供給し、細胞を流出させて高い細胞生存率を維持することによって長時間にわたり細胞を培養する。典型的には、連続的な製造でバイオリアクタから細胞を定期的に流出させることが求められるが、それは、細胞および対象となる生体生成物の損失を招くため非効率的である。

典型的な細胞培養法では、細胞が分泌する生体生成物を、使用する保持システムに応じて細胞培養時に保持または採取する。特定の状況では、細胞および生体生成物が、培養処理時にバイオリアクタに残留する。例えば、米国特許第９，４６９，８６５号には、生体物質および細胞培養物を含む細胞培養物を分離システムに還流させる灌流法であって、培養が終了したときに生体物質をリアクタに保持し、またはリアクタに戻し、生成物を採取する灌流法が開示されている。充填細胞量が多いと、採取時に、細胞と生体生成物の両方の混合物を浄化するのが困難になり、全体収率が低下する。他の特定の状況では、細胞と生体生成物が培養処理時にバイオリアクタにて分離される。

より高い生成物の収率をもたらすことができる細胞培養法へと向上させ、生成物の品質を向上させ、コストを低減することがなお要望されている。本開示は、連続的採取を行い細胞流出を行わない強化灌流による細胞培養方法およびシステムを提供することによって、これらの要望の少なくとも１つを満たす。

概要
本開示は、バイオリアクタでの細胞培養物の灌流培養によって生体物質を製造する方法であって、基礎培地および流加培地を異なる速度で細胞培養物に供給し、細胞培養物を分離システムに通して生体物質を連続的に採取する方法を対象とする。培養処理時に、細胞を流出させずにバイオリアクタに保持する。本開示の方法は、ＰＶＣＤ（最大生存細胞密度）およびＱｐ（細胞特異的生産性）の点で大きな利点をもたらす。その結果、本方法によって、所望の生体物質の生産性を向上させることができる。

基礎培地および流加培地を異なる速度で細胞培養物に供給すること、培養時に温度を変化させること、および細胞培養物を流出させないことによって、初期段階ではバイオマスの量を多くし、後段階では生産性を高めることができることを見いだした。また、生体物質を連続的に採取する調和的分離システムも、高いＱｐ、生体物質のより良好な品質および／または高い精製収率を達成するのに役立つ。本開示の方法は、灌流法を連続採取法と調和させ、流出法を除外した強化灌流培養（ＩＰＣ）法と称する。

具体的には、本開示は、（ａ）細胞培地と細胞とを含む細胞培養物を培養すること、（ｂ）細胞培養物を基礎培地および流加培地とともにバイオリアクタにて灌流させること、および（ｃ）生体物質を採取することを含む生体物質の製造方法であって、基礎培地および流加培地を異なる速度で細胞培養物に供給し、細胞培養物を分離システムに連続的に通し、細胞を、培養処理全体を通じて流出させずにバイオリアクタに保持する方法を提供する。

少なくとも１つの実施形態において、細胞培養物は、対象となる生体物質を発現する細胞をバイオリアクタに接種することによって確立される。別の実施形態において、細胞培養物は、少なくとも０．１×１０^６個／ｍＬの生存細胞をバイオリアクタに接種することによって確立される。別の実施形態において、細胞培養物は、約０．７～０．８×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．８～１．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、または約１．０～４．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞を接種することによって確立される。別の実施形態において、細胞培養物は、約０．１～４．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．１～０．５×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．５～１．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．０～１．５×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．５～２．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約２．０～２．５×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約２．５～３．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約３．０～３．５×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約３．５～４．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．２～０．４×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．４～０．６×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．６～０．８×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．８～１．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．０～１．２×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．２～１．４×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．４～１．６×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．６～１．８×１０^６個／ｍＬの生存細胞、または約１．８～２．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞を接種することによって確立される。

細胞培養は、基礎培地および流加培地を異なる速度で灌流することによって維持される。本開示の少なくとも１つの実施形態において、流加培地の灌流速度は、基礎培地の灌流速度の約０．１～２０％、例えば基礎培地の灌流速度の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％である。流加培地の灌流速度は、細胞密度、生存率およびオスモル濃度に応じて調整される。いくつかの実施形態において、基礎培地は、２．０ＶＶＤ以下、例えば約０．１から２．０ＶＶＤ以下、約０．１から１．５ＶＶＤ、約０．３から１．２ＶＶＤ、または約０．５から１．０ＶＶＤの灌流速度で供給される。いくつかの実施形態において、基礎培地は、２．０ＶＶＤ以下、例えば約０．１から２．０ＶＶＤ、約０．１から０．３ＶＶＤ、約０．３から０．６ＶＶＤ、約０．６から０．９ＶＶＤ、約０．９から１．２ＶＶＤ、約１．２から１．５ＶＶＤ、約１．５から１．８ＶＶＤ、約１．８から２．０ＶＶＤ、約０．５から１．０ＶＶＤ、約０．７から１．２ＶＶＤ、または約１．０～１．５ＶＶＤの灌流速度で供給される。いくつかの実施形態において、流加培地の灌流速度は、基礎培地の灌流速度の約１～１５％、好ましくは約１～１０％、より好ましくは約１～９％である。いくつかの実施形態において、流加培地の灌流速度は、基礎培地の灌流速度の約１～１５％、約１～１４％、約１～１３％、約１～１２％、約１～１１％、約１～１０％、約１～９％
、約１～８％、約１～７％、約１～６％、約１～５％、約１～４％、約１～３％、約１～２％、約２～９％、約３～９％、約４～９％、約５～９％、約６～９％、または約７～９％である。基礎培地の供給速度は、細胞密度の増加に従って増大されてもよく、細胞密度が最大に達する前に（例えば３日目から６日目に）目標供給速度に達してもよく、その後目標供給速度は、培養終了まで一定であってもよい。本開示の少なくとも１つの実施形態において、基礎培地の供給速度は、培養処理の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、または８日目に増大される。流加培地の供給速度は、通常２日目から４日目に、十分な栄養を供給するために、細胞密度の増加に従って増大されてもよく、６日目から１０日目に最大に達してもよく、場合によっては細胞密度または生存率の低下に従って細胞培養時に低減されてもよい。本開示の少なくとも１つの実施形態において、流加培地の供給速度は、培養処理の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、または８日目に増大される。別の実施形態において、流加培地の供給速度は、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、または１４日目に最大に達する。

少なくとも１つの実施形態において、本明細書に開示した方法は、細胞培養物を温度変化させることをさらに含む。温度変化の目的は、ＶＣＤが最大に達する前に細胞の過剰増殖を抑制することである。本開示の少なくとも１つの実施形態において、温度変化は、最大ＶＣＤなどの所定のパラメータに応答する。別の実施形態において、温度変化は、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、または１４日目に生じる。少なくとも１つの実施形態において、温度変化は、例えば３５～３７℃付近から２８～３３℃付近、または３４～３６℃付近から２７～３４℃付近、または３６～３８℃付近から２９～３４℃付近、または３６～３９℃付近から３０～３５℃付近、または３３～３５℃付近から２６～３１℃付近への温度変化であってもよい。

少なくとも１つの実施形態において、製造された生体物質は、中空繊維フィルタを有する分離システムによって連続的に採取される。少なくとも１つの実施形態において、中空繊維フィルタの孔径または分画分子量は、中空繊維フィルタが対象となる生体物質を保持せず、細胞を保持するように選択される。したがって、細胞によって製造された生体物質は採取され、細胞は培養物に保持される。いくつかの実施形態において、中空繊維フィルタの孔径は、約０．０８μｍから約０．５μｍ、好ましくは約０．１μｍから約０．５μｍ、より好ましくは約０．２μｍまたは約０．４５μｍである。少なくとも１つの実施形態において、中空繊維フィルタの孔径は、約０．０８μｍから約１．０μｍ、例えば約０．１μｍから約０．８μｍ、約０．１μｍから約０．６μｍ、約０．１μｍから約０．５μｍ、約０．１μｍから約０．４μｍ、約０．１μｍから約０．３μｍ、約０．２μｍから約０．８μｍ、約０．２μｍから約０．８μｍ、約０．３μｍから約０．８μｍ、約０．４μｍから約０．８μｍ、約０．２μｍから約０．６μｍ、または約０．２μｍから約０．５μｍである。少なくとも１つの実施形態において、中空繊維フィルタの孔径は、約０．２μｍまたは約０．４５μｍである。

少なくとも１つの実施形態において、中空繊維フィルタを有する分離システムは、交互接線流（ＡＴＦ）または接線流ろ過（ＴＦＦ）装置である。

少なくとも１つの実施形態において、細胞は、培養処理全体を通じて流出することなくバイオリアクタに保持される。流出システムを除くことによって高度の細胞密度を得ることが可能であることを見いだした。

少なくとも１つの実施形態において、採取物は、クロマトグラフィー工程による連続的な生成物獲得処理が施された。意外にも、連続的な生成物獲得処理を採用することによっ
て、高生産性（例えば超高生産性）細胞培養を達成できることを見いだした。

ａ）細胞培養物を基礎培地と流加培地とともにバイオリアクタにて異なる速度で灌流するためのモジュールと、（ｂ）生体物質を連続的に採取するためのモジュールであって、対象となる生体物質を、保持せず細胞を保持するようにある孔径、または生体物質の分子量より大きな分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する中空繊維フィルタを含むモジュール（好ましくは、生体物質を連続的に採取するためのモジュール交互接線流（ＡＴＦ）装置であるモジュール）と、（ｃ）場合により、採取物から生体物質を連続的に獲得するためのモジュールとを含む生体物質製造システムをも本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、該システムは、細胞培養用バイオリアクタおよび／またはマイクロスパージャをさらに含む。

本開示の少なくとも１つの実施形態に係る培養システムの概略図である。 本開示の少なくとも１つの実施形態に係る連続的生成物獲得システムの概略図である。 実施例１における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（集中流加）についての生存細胞密度（１０^６個／ｍＬ）対処理時間（日）のグラフを示す。 実施例１における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（集中流加）についての生存率（％）対処理時間（日）のグラフを示す。 実施例１における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（集中流加）についての累積体積生産性（Ｐｖ）（ｇ／Ｌ）対処理時間（日）のグラフを示す。 実施例１における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（集中流加）についてのグルコース濃度を示す。 実施例１における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（集中流加）についての乳酸の生成または蓄積を示す。 実施例１における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（集中流加）についてのｃＩＥＦ（キャピラリ等電点電気泳動）の結果を示す。 実施例１における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（集中流加）についてのＳＥＣおよびＳＤＳ＿キャリパ＿ＮＲの結果を示す。 実施例２における実験ＩＰＣ－１からＩＰＣ－８についての生存細胞密度（１０^６個／ｍＬ）対処理時間（日）のグラフを示す。 実施例２における実験ＩＰＣ－１からＩＰＣ－８についての細胞の生存率を示す。 実施例２における実験ＩＰＣ－１からＩＰＣ－８についての累積体積生産性（Ｐｖ）を示す。 実施例２における実験ＩＰＣ－１からＩＰＣ－８についてのグルコース濃度を示す。 実施例２における実験ＩＰＣ－１からＩＰＣ－８についての乳酸濃度を示す。 実施例３における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（灌流細胞培養）についての生存細胞密度（１０^６個／ｍＬ）対処理時間（日）のグラフを示す。 実施例３における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（灌流細胞培養）についての生存率（％）対処理時間（日）のグラフを示す。 実施例３における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（灌流細胞培養）についての累積Ｐｖ（ｇ／Ｌ）対処理時間（日）のグラフを示す。 実施例３における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（灌流細胞培養）についてのグルコース濃度を示す。 実施例３における処理Ａ（従来の流加）、処理Ｂ（強化灌流培養）および処理Ｃ（灌流細胞培養）についての乳酸の生成または蓄積を示す。 実施例４における処理ＡとＢについての生存細胞密度（１０^６個／ｍＬ）対処理時間（日）のグラフを示す。 実施例４における処理ＡとＢについての生存率（％）対処理時間（日）のグラフを示す。 実施例４における処理ＡとＢについての累積Ｐｖ（ｇ／Ｌ）対処理時間（日）のグラフを示す。 実施例４における処理ＡとＢについてのグルコース濃度を示す。 実施例４における処理ＡとＢについての乳酸濃度を示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての生存細胞密度（１０^６個／ｍＬ）と処理時間（日）とのグラフを示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての生存率（％）対処理時間（日）のグラフを示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての細胞平均直径対処理時間（日）のグラフを示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての培養物のグルコース濃度対処理時間（日）のグラフを示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての培養物の乳酸濃度対処理時間（日）のグラフを示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての培養物のアンモニウム濃度対処理時間（日）のグラフを示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての培養物のオンラインｐＨ対処理時間（日）のグラフを示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての培養物のオフラインｐＨ対処理時間（日）のグラフを示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての培養物のｐＣＯ２レベル対処理時間（日）のグラフを示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての培養物のオスモル濃度対処理時間（日）のグラフを示す。 異なるスケールでの処理Ａ（従来の流加）と処理Ｂ（強化灌流培養）についての累積Ｐｖ（ｇ／Ｌ）対処理時間（日）のグラフを示す。 実験４における１５Ｌと２５０Ｌのスケールでの処理Ｂ（強化灌流培養）についてのＳＥＣの結果および獲得工程の収率を示す。 実験４における１５Ｌと２５０Ｌのスケールでの処理Ｂ（強化灌流培養）についてのｃＩＥＦ（キャピラリ等電点電気泳動）の結果を示す。

詳細な説明
Ｉ 定義
他に特に規定がなければ、本明細書に用いられている全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同様の意味を有する。本明細書で参考にされる全ての特許、出願、公開出願および他の出版物は、その全体が参照により組み込まれている。本項に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれている特許、出願、公開出願および他の出版物に記載の定義と矛盾するか、さもなければ整合性がとれていない場合は、本項に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれている定義に優先する。

本明細書に用いられているように、単数形（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、他に特に指定がなければ、複数形を包含する。例えば、「単数の」生体物質は、１つまたは複数の生体物質を包含する。

本明細書に用いられている「バイオリアクタ」は、細胞培養物を含むことができるシステムであり、一方、細胞培養物は、細胞および細胞培地を含む。いくつかの実施形態において、エアフィルタなどの無菌バリアを設けて、他の細胞が所望の細胞を汚染することを防止する。いくつかの実施形態において、混合、温度、ｐＨ、酸素濃度等の培養条件を好適にすることによって細胞にとって良好な環境を維持する。

「細胞培養」または「培養」とは、多細胞生物または組織の外部で細胞を増殖および繁殖させることを意味する。「細胞培養物」は、細胞培地、細胞および生体物質を含む液体を含み、液体は、細胞をリアクタにて細胞培地中で培養する処理の結果であり、細胞によって生体物質が製造される。哺乳動物細胞の好適な培養条件は、当該技術分野で公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ編， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）を参照されたい。哺乳動物細胞を懸濁液中で、または固体基質に付着させて培養してもよい。

「細胞」は、対象となる生体物質を製造する細胞、例えば生成物をコードする遺伝子を発現する能力を有する細胞などを意味する。生成物をコードする遺伝子を発現する能力を有する細胞は、例えば、細胞生成物をコードする遺伝子および適切な選択マーカーをコードする遺伝子を含有するプラスミドを細胞にトランスフェクトすることによって調製してもよい。生成物の製造に使用可能な細胞は、原則として、生体生成物を製造する能力を有することが当業者に公知の全ての細胞である。細胞は、動物細胞、特に哺乳動物細胞であってもよい。哺乳動物細胞の例として、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ハイブリドーマ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、骨髄腫細胞、ヒト細胞（例えばＨＥＫ－２９３細胞）、ヒトリンパ芽球様細胞、Ｅ１不死化ＨＥＲ細胞、マウス細胞（例えばＮＳ０細胞）が挙げられる。

本明細書に用いられている、「細胞培地」（「培地（culture medium）」「細胞培地（cell culture media）」とも呼ばれる）という用語は、細胞（例えば動物細胞または哺乳動物細胞など）の増殖に使用され、一般的に次に挙げる少なくとも１つまたは複数の成分を提供する栄養溶液を指す：エネルギー源（通常は例えばグルコースなどの炭水化物の形態を取る）；全ての必須アミノ酸の１種または複数種、および一般的に２０種類の塩基性アミノ酸に加え、システイン；典型的に低濃度で要求されるビタミン類および／または他の有機化合物；脂質または遊離脂肪酸；および微量元素、例えば、典型的に超低濃度、通常はミクロモルの範囲で要求される無機化合物または天然元素。

「基礎細胞培地」は、典型的には細胞培養を開始するのに使用され、細胞培養物を支持するのに十分完成された細胞培地を指す。市販の基礎培地を使用することができ、例として、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ ＡＧＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｄｙｎａｍｉｓ ＡＧＴ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳＦＭ４ＣＨＯ ＡＤＣＦ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＨｙＣｅｌｌ ＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＣＤＭ４ＭＡＢ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＤＰＭ Ｈｙｃｌｏｎｅ
ＡｃｔｉＰｒｏ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ
Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）が挙げられるが、それらに限定されない。

「流加」細胞培地または流加培地は、典型的に指数増殖期、すなわち「増殖期」に細胞培養に使用され、この期間中に細胞培養物を支持するのに十分完成された細胞培地を指す
。増殖細胞培地は、宿主細胞株に組み込まれた選択可能マーカーに抵抗力または生存力を与える１種または複数種の選択剤を含有してもよい。そのような選択剤の例として、ジェネティシン（Ｇ４１１８）、ネオマイシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、メチオニンスルホキシミン、メトトレキサート、グルタミンフリー細胞培地、グリシン欠乏細胞培地、ヒポキサンチン／チミジン、または単独のチミジンなどが挙げられるが、それらに限定されない。市販の流加培地を使用することができ、例として、ＣＨＯ
ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＦｅｅｄＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＦｅｅｄＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＦｅｅｄＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｓｈｅｆｆ－ＣＨＯ ＰＬＵＳ ＰＦ ＡＣＦ（ＦＭ０１２）（Ｋｅｒｒｙ）、ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｂ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＰＭ－Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＤＰＭ－
Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ｂ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、またはＦＡＡ０１Ａ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）が挙げられるが、それらに限定されない。

細胞培地は、特定の実施形態において、血清を含有しない、および／または動物由来の生成物もしくは構成要素を含有しない。細胞培地は、特定の実施形態において、化学的に定義され、化学成分の全てが公知である。市販の培地を使用することができ、それらは当業者に公知である、または当業者が常套的技量を用いて実践すると予想されるとおり、任意選択の成分を含め、適切な濃度または量の補完的な成分または構成要素を必要または要望に応じて添加してもよい。

本開示に関して、「生成物」、「生体物質（biologic）および「生体物質（biological
substance）」という用語は、互換可能である。したがって、例えば、（組換え）遺伝子符号化を発現することによって細胞により製造されてもよい生成物は、例えば（組換え）タンパク質、特に、受容体、酵素、融合タンパク質、血液凝固カスケードによるタンパク質などの血液タンパク質、例えばワクチンに使用されるエリスロポエチン、ウイルスまたは細菌タンパク質などの多機能タンパク質、抗体、例えばＩｇＧまたはＩｇＭなどの免疫グロブリン、二重特異性抗体などの多重特異性抗体等である。好ましくはタンパク質が、より好ましくは抗体が細胞によって製造される。

「抗体」という用語は、アイソタイプもしくはサブクラスを問わないグリコシル化免疫グロブリンおよび非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及、または、特異的結合について無傷の抗体（別段に指定される場合を除き、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびオリゴマーまたはそれらの抗原結合性フラグメントを含む）と競合する、それらの抗原結合性領域への言及を包含する。また、抗原結合性のフラグメントまたは領域を有するタンパク質、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、Ｆｄ、ｄＡｂ、マキシボディ、一本鎖抗体分子、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよび標的ポリペプチドに特異的抗原結合性を与えるのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドなどのも含まれる。「抗体」という用語は、例えば抗体を発現させるためにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体など、組み換え手段によって調製、発現、創出または単離された抗体を包含するが、それらに限定されない。

抗体の例として、上述のタンパク質および／または次に挙げる抗原を含む（ただしそれらに限定されない）タンパク質のいずれか１つまたは組合せを認識する抗体が挙げられるが、それらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、
ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１３受容体、ＩＬ－１８受容体サブユニット、ＦＧＬ２、ＰＤＧＦ－βおよびそれらの類似体（米国特許第５，２７２，０６４号および第５，１４９，７９２号を参照されたい）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β１、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３号を参照されたい）、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞増殖因子、破骨細胞分化抑制因子リガンド、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ－１、およびｚＴＮＦ４としても公知である（Ｄｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ－Ｋｉａｎｇ（２００２年）， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３（１）： １９－２５を参照されたい））、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺がんに伴って発現する遺伝子生成物）、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ－７２、ＳＫ－１抗原、結腸がんおよび／または膵臓がんの患者の血清で濃度が増大する腫瘍関連エピトープ、胸部、結腸、扁平上皮、前立腺、膵臓、肺および／または腎臓のがん細胞および／または黒色腫、神経膠腫または神経芽腫細胞に発現するがん関連のエピトープまたはタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ－４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ－α、接着分子ＶＡＰ－１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子－３（ＩＣＡＭ－３）、ロイコインテグリン付着因子、血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（第ＶＩＩａ因子／組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ Ｉ、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原）、Ｆｃ－γ－１受容体、ＨＬＡ－ＤＲ１０ベータ、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、スクレロスチン、Ｌ－セレクチン、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ミュータンス連鎖球菌、および黄色ブドウ球菌。本開示の方法を用いて製造可能な公知の抗体の具体例として、アダリムマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、ラベツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、ロベリズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスズマブ、ウステキヌマブ、ベドリゾマブ、ザルツムマブ、およびザノリムマブが挙げられるが、それらに限定されない。

いくつかの実施形態において、細胞によって製造されるタンパク質またはワクチンなどの生成物を、医薬調製物の活性成分として使用することができる。生成物の非限定的な例として以下が挙げられる：抗ｈＴＮＦα（アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））、融合タンパク質標的ＶＥＧＦ（アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（商標））、エリスロポエチンアルファ（Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標））、リンパ芽球様インターフェロンα－ｎ１（Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ（商標））、（組換え）凝固因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（商標））、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｚ（商標））、（組換え）凝固因子ＩＸ（Ｂｅｎｅｆｉｘ（商標））、グルコセレブロシダーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標））、インターフェロンベータ１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標））、Ｇ－ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、インターフェロンアルファ－２ｂ（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標））、組換えインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標））、インターフェロンベータ１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標））、第ＶＩＩＩ因子（ＫｏＧＥＮａｔｅ
（登録商標））、テネクテプラーゼ（ＴＮＫａｓｅ（商標））、（組換え）抗血友病因子（ＲｅＦａｃｔｏ（商標））、ＴＮＦアルファ受容体（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、卵胞刺激ホルモン（Ｇｏｎａｌ－Ｆ（登録商標））、Ｍａｂアブシキシマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、Ｍａｂリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、組織プラスミノゲン活性化因子（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）、Ａｃｔｉｌｙａｓｅ（登録商標））、ヒト成長ホルモン（Ｐｒｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、ＧｅｎｏＴｒｏｐｉｎ（商標））。さらに、「抗体コンストラクト」という用語の定義は、一価、二価および多価のコンストラクトを包含し、したがって、２個の抗原性構造に限り特異的に結合する二重特異性コンストラクト、ならびに３個以上の、例えば３個、４個またはそれ以上の抗原性構造に特徴的な結合性ドメインを介して特異的に結合する多重特異性コンストラクトを包含する。加えて、「抗体コンストラクト」という用語の定義は、１個のポリペプチド鎖だけから成る分子、ならびに同一の鎖（ホモ二量体、ホモ三量体またはホモオリゴマー）または異なる鎖（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロオリゴマー）のいずれであってもよい複数のポリペプチド鎖から成る分子を包含する。上記で特定された抗体およびそれらの変形または誘導体の例は、特に、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）およびＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）， Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， 第２版， ２０１０年およびＬｉｔｔｌｅ， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９年に記載されている。

本明細書に用いられている「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても公知である）によって直線的に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成された分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸から成る鎖を指し、特定の長さの生成物を指さない。したがって、２個以上のアミノ酸から成る鎖を指すために使用される、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲に含まれ、「ポリペプチド」という用語はこれらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語のどれとでも互換的に使用可能である。「ポリペプチド」という用語は、公知の保護／ブロック基によるグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然アミノ酸による修飾を制限なく含め、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指す目的でも使用される。ポリペプチドは、自然な生物学的起源から導出、または組み換え技術によって製造され得るが、必ずしも、指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成を含め、どのような形で生成されてもよい。本開示のポリペプチドのサイズは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸であってもよい。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有し得るが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。定義された三次元構造を有するポリペプチドは折り畳み型と呼ばれ、定義された三次元構造を有さず、むしろ多数の異なる配座を導入し得るポリペプチドは非折り畳み型と呼ばれる。

「凝集」という用語は一般的に、分子間における、例えばファンデルワールス力または化学結合を介した直接相互誘引を指す。特に、凝集は、タンパク質が蓄積し一体的に集塊した状態、すなわち「凝集体」および「フラグメント」として理解される。凝集体は不定形の凝集体、オリゴマーおよびアミロイド線維を含む場合があり、典型的に高分子量（ＨＭＷ）種、すなわち、本明細書では低分子量（ＬＭＷ）種またはモノマーと呼ばれる非凝集分子である純粋な生成物分子より分子量が高い分子と呼ばれる。

「マイクロスパージャ」という用語は一般的に、バイオリアクタタンク内の細胞培養物に酸素および／または他の気体を提供するよう構成されたスパージャを指す。曝気装置またはマイクロスパージャは、酸素または他の気体の発生源に連結してもよく、また、細胞培養物中で気体が泡立ち、それによって細胞培養物を曝気するよう、気体を細胞培養物に仕向けてもよい。いくつかの実施例において、マイクロスパージャを穿孔チューブスパージャと組み合わせて使用してもよい。

本明細書に記載のとおり調製される生体物質を、例えば高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの当該技術分野において公知の技法によって精製してもよい。特定のタンパク質の精製に用いられる実際の条件は、部分的に、正味荷電、疎水性、親水性などの要因に左右されるが、当業者にとっては明白である。親和性クロマトグラフィー精製の場合、抗体、リガンド、受容体または抗原を、生体物質の結合対象として使用してもよい。例えば、本開示の生体物質（例えば免疫複合体）の親和性クロマトグラフィー精製の場合、マトリックスをタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇとともに使用してもよい。例えば実施例に記載のように、例えば免疫複合体などの生体物質を単離させるために連続的なタンパク質ＡまたはＧの親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いてもよい。生体物質（例えば免疫複合体）の純度を、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーおよび類似の方法を含め、多様な周知の分析方法のいずれかによって判定することができる。

ＩＩ 灌流培養処理
「灌流」培養処理は、細胞培養物が新鮮な培地の添加を受け入れ、使用済み培地がバイオリアクタから除去される処理である。灌流は、連続的、段階的、断続的、またはこれらのいずれかの一部もしくは全部の組合せであってもよい。

様々な実施形態において、細胞培養物は、対象となる生体物質を発現する細胞をバイオリアクタにて、例えば、少なくとも０．１×１０^６個／ｍＬの生存細胞、例えば、約０．７～０．８×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．８～１．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．０～４．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞で接種することによって確立される。少なくとも１つの実施形態において、細胞培養物は、対象となる生体物質を発現する細胞をバイオリアクタにて、例えば少なくとも０．１×１０^６個／ｍＬの生存細胞、例えば、約０．１～４．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、０．１～０．５×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．５～１．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．０～１．５×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．５～２．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約２．０～２．５×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約２．５～３．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約３．０～３．５×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約３．５～４．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．２～０．４×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．４～０．６×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．６～０．８×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約０．８～１．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．０～１．２×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．２～１．４×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．４～１．６×１０^６個／ｍＬの生存細胞、約１．６～１．８×１０^６個／ｍＬの生存細胞、または約１．８～２．０×１０^６個／ｍＬの生存細胞で接種することによって確立される。

細胞培養は、基礎培地および流加培地を供給することによって維持される。培地を供給する前に、細胞を基礎培地中で１日間培養してもよい。例えば、基礎培地の灌流を２日目から開始し、流加培地の灌流を３日目から開始してもよい。あるいは、基礎培地の灌流を１日目から開始してもよい。別の例として、基礎培地の灌流を１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、または７日目に開始し、流加培地の灌流を２日目、３日目、４
日目、５日目、６日目、または７日目に開始してもよい。

「灌流速度」という用語は、バイオリアクタから通される（添加および除去される）培地の量であり、典型的に、所定の時間内でのワーキングボリュームの割合または倍数として表される。「ワーキングボリューム」は、細胞培養に使用されるバイオリアクタの容積の量を指す。少なくとも１つの実施形態において、基礎培地の灌流速度は、２．０ワーキングボリューム／日（ＶＶＤ）以下、例えば約０．１から１．５ＶＶＤ、約０．３から１．２ＶＶＤ、または約０．５から１．０ＶＶＤであってもよい。

培養物への細胞培地添加速度は、細胞の生存率および密度に影響を及ぼし得る。意外にも、基礎培地と流加培地の供給速度を調整し、それらを異なる段階で供給することによって、高い生存細胞密度（ＶＣＤ）および生存率を達成できることを見いだした。「生存細胞密度」という用語は、所定の体積の培地における、標準的な生存率アッセイ（例えばトリパンブルー色素排除法）によって判定される生細胞の数を指す。

様々な実施形態において、基礎培地および流加培地は異なる灌流速度で細胞培地に供給され、ただし、流加培地の灌流速度は基礎培地の灌流速度の約０～２０％、例えば流加培地の灌流速度は基礎培地の灌流速度の約０．１～２０％、例えば基礎培地の灌流速度の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％である。本開示の少なくとも１つの実施形態において、基礎培地の灌流速度は、約２．０ＶＶＤ以下、例えば約０．１から１．５ＶＶＤ、約０．３から１．２ＶＶＤ、または約０．５から１．０ＶＶＤである。例えば、基礎培地の灌流を１日目から約０．４ＶＶＤの速度で開始してもよく、速度を３日目に約１．５ＶＶＤに増大し、培養終了まで約１．５ＶＶＤに維持してもよい。流加培地の灌流を４日目から基礎培地の約２．０％の速度で開始し、７日目に基礎培地の約４．０％に増大し、８日目から徐々に低下させ、１７日目に約１％になるようにしてもよい。別の実施形態において、基礎培地の灌流を１日目から約０．４ＶＶＤの速度で開始してもよく、速度を４日目に約１．５ＶＶＤに増大し、培養終了まで約１．５ＶＶＤに維持してもよい。流加培地の灌流を５日目から基礎培地の約２．０％の速度で開始し、１２日目に基礎培地の約９％に増大し、１８日目に約７％に低下させ、１９日目から終了まで約６％に維持してもよい。別の実施形態において、基礎培地の灌流を２日目から約０．６ＶＶＤの速度で開始してもよく、速度を６日目に約０．８８ＶＶＤに増大し、培養終了まで約０．８８ＶＶＤに維持してもよい。流加培地の灌流を２日目から基礎培地の約６．７％の速度で開始し、１２日目に基礎培地の約１６％に増大し、終了まで約１６％に維持してもよい。

ＩＩＩ 細胞培養制御
本開示の方法に適する細胞培養条件は、細胞の灌流培養向けに典型的に採用される公知の条件、またはそれらの方法の任意の組合せであり、ｐＨ、溶解酸素（Ｏ_２）と二酸化炭素（ＣＯ_２）、撹拌と曝気、および温度に注意が払われる。

組換えタンパク質または生体物質の製造時には、細胞が所望の期間にわたり、または所望の密度まで増殖し、その後、細胞の生理学的状態が増殖制限型に切り替わるまたは抑止され、細胞が細胞密度の増大に有利な形で組換えタンパク質を製造するためにエネルギーと基質を使用する高生産性状態になる、制御型システムを有することが望ましいと考えられる。商業的規模の細胞培養および生物学的治療薬製造の場合、細胞増殖を制限または抑止する能力および製造期に細胞を増殖制限または抑止の状態に維持する能力が非常に望ましい。そのような方法の例として温度変化が挙げられる。

増殖を制限または抑止するためのそのようなメカニズムの１つは、細胞培養時に温度を
変化させることである。例えば、増殖期は比較的高い温度で発生してもよく、より低い温度への変化が製造段階の開始および／または維持の契機となってもよい。例えば、増殖期は約３５℃から約３７℃の第１の温度設定点で発生してもよく、製造期は約２８℃から約３３℃の第２の温度設定点で発生してもよい。関連する実施形態において、温度変化は、最大ＶＣＤなどの所定のパラメータに応答する。少なくとも１つの実施形態において、温度変化は、例えば３５～３７℃付近から２８～３３℃付近への温度変化であってもよい。少なくとも１つの実施形態において、増殖期は、約３０℃から約３８℃の範囲、例えば約３１℃から約３７℃、約３２℃から約３６℃、約３３℃から約３５℃、約３３℃から約３４℃、約３２℃から約３５℃、または約３１℃から約３４℃の範囲の第１の温度設定点で発生してもよい。少なくとも１つの実施形態において、製造期は、約２５℃から約３５℃の範囲、例えば２５℃から約３０℃、３０℃から約３５℃、２６℃から約３１℃、２７℃から約３２℃、２８℃から約３３℃、または２９℃から約３４℃の第２の温度設定点で発生してもよい。別の実施形態において、温度変化は、最大ＶＣＤなどの所定のパラメータに応答する。少なくとも１つの実施形態において、温度変化は、例えば３５～３７℃付近から２８～３３℃付近の範囲、例えば３４～３６℃付近から２７～３４℃付近、３６～３８℃付近から２９～３４℃付近、３６～３９℃付近から３０～３５℃付近、または３３～３５℃付近から２６～３１℃付近への温度変化であってもよい。

温度設定点の切り替えは手動で行ってもよい、またはバイオリアクタ制御システムの活用によって自動で行ってもよい。温度設定点は、所定の時点で切り替える、あるいは細胞密度、滴定濃度、または１種もしくは複数種の培地成分の濃度などの１つまたは複数の細胞培養パラメータに応答する形で切り替えてもよい。

本開示の処理における１つの利点は、流出工程が不要ということである。意外にも、基礎培地および流加培地を異なる速度で細胞培養物に供給し、温度変化戦略を採用すること、および細胞流出を除くことによって、初期段階ではバイオマスの量を多くし、後段階では生産性を高めることができることを見いだした。流出工程を除くことによって、細胞は非定常状態に維持され、細胞密度は非常に高いレベルに押し上げられる。高いＶＣＤと生存率を維持するため、本開示の処理では温度変化および基礎培地と流加培地とで異なる供給速度を活用する。

本開示の少なくとも１つの実施形態において、細胞を接種する前に、脱泡剤をバイオリアクタに添加する。本開示の少なくとも１つの実施形態において、細胞を接種する前に、約５から２０ｐｐｍ、約８から１５ｐｐｍ、約９から１２ｐｐｍ、または約１０ｐｐｍの脱泡剤をバイオリアクタに添加する。本開示の少なくとも１つの実施形態において、培養時に、約５から２００ｐｐｍ、約８から１５０ｐｐｍ、約９から１２０ｐｐｍ、約１０から１００ｐｐｍの脱泡剤を培地に添加する。脱泡剤は、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、または１回だけ添加してもよい。

本開示に関して、「脱泡剤（anti-foaming agent）」および「脱泡剤（defoamer）」という用語は、互換的に使用可能である。本開示の少なくとも１つの実施形態において、脱泡剤は、培養物における泡の形成を低減および阻害するどのような物質であってもよい。本開示では、接種前の脱泡剤の添加によって、培養時の気泡破裂に起因する細胞損傷が軽減される。本開示の少なくとも１つの実施形態において、本出願の技術的効果を達成し得るどのような脱泡剤を使用してもよい。本開示の少なくとも１つの実施形態において、脱泡剤の例として、油系脱泡剤、粉末脱泡剤、水系脱泡剤、シリコーン系脱泡剤、ＥＯ／ＰＯ系脱泡剤、またはアルキルポリアクリレートが挙げられるが、それらに限定されない。本開示のさらなる実施形態において、油系脱泡剤中の油は、シリコーン油を除き、発泡性培地に不溶性である鉱物油、植物油、ホワイトオイルまたは他の油であってもよい。本開示のさらなる実施形態において、油系脱泡剤は、性能を引き上げるワックスおよび／また
は疎水性シリカも含有する。典型的なワックスは、エチレンビスステアラミド（ＥＢＳ）、パラフィンワックス、エステルワックスおよび脂肪アルコールワックスである。本開示の少なくとも１つの実施形態において、粉末脱泡剤は原則として、シリカなどの粒子担体に担持させた油系脱泡剤をである。これらはセメント、石膏および洗剤などの粉末状製品に添加される。本開示の少なくとも１つの実施形態において、水系脱泡剤は、異なる種類の油およびワックスを水ベース中で分散させたものであり、油は多くの場合、鉱物油または植物油であり、ワックスは長鎖脂肪アルコール、脂肪酸石鹸またはエステルである。本開示の少なくとも１つの実施形態において、シリコーン系脱泡剤は、シリコーンバックボーンを有するポリマーであり、シリコーン化合物は、疎水性シリカをシリコーン油中で分散させたものから成り、シリコーングリコールおよび他の変性シリコーン流体を含有してもよい。本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＥＯ／ＰＯ系脱泡剤は、良好な分散特性を有し、また堆積が問題となる場合に十分に適することが多い、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールコポリマーを含有する。本開示の少なくとも１つの実施形態において、アルキルポリアクリレートは、表面の泡の破壊より排気が重要である非水溶液系における脱泡剤としての使用に適する。

本開示の少なくとも１つの実施形態において、マイクロスパージャを、本開示の方法に使用する。本開示のさらなる実施形態において、要求される酸素流速が約０．２ＶＶＭに達する場合、マイクロスパージャを使用する。本開示では、マイクロスパージャの実装によって、培養時の気泡破裂に起因する細胞損傷が軽減される。

ＩＶ 連続採取
様々な実施形態において、細胞は培養物中に保持される一方、対象となる、細胞によって製造される生体物質は細胞培養物から連続的に採取される。これに関して、中空繊維フィルタを有する分離システムを灌流システムに接続する。中空繊維フィルタの孔径または分画分子量は、中空繊維フィルタが対象となる生体物質を保持せず、細胞を保持するように選択される。細胞培養物が、細胞培地、細胞（例えば全細胞および溶解細胞）、可溶性の発現組換えタンパク質、宿主細胞タンパク質、老廃物などを含め、フィルタに導入される際、中空繊維材料は、内腔側の特定の細胞培養成分を保持し、対象となる生体物質がフィルタを通過できるようにし得る。保持された細胞はバイオリアクタに戻される。細胞培養物を中空繊維の内腔側に通すポンピングシステムによって、細胞培養物をバイオリアクタから引き出してフィルタに送り込んでもよい。

様々な実施形態において、対象となる生体物質ではなく細胞が保持されるように孔径または分画分子量（ＭＷＣＯ）が選択される限り、どのようなフィルタでも分離システムとして使用してもよい。本開示での使用に適するフィルタの非限定的な例として、膜フィルタ、セラミックフィルタおよび金属フィルタが挙げられる。フィルタはどのような形状で使用してもよく、例えば、フィルタは渦巻き状または管状であってもよく、またはシートの形で使用してもよい。様々な実施形態において、使用するフィルタは膜フィルタである。少なくとも１つの実施形態において、フィルタは中空繊維フィルタである。少なくとも１つの実施形態において、中空繊維フィルタの孔径は、約０．０８μｍから約０．５μｍ、約０．１μｍから約０．５μｍ、約０．２μｍまたは約０．４５μｍである。少なくとも１つの実施形態において、中空繊維フィルタの孔径は、約０．０８μｍから約１．０μｍ、例えば約０．１μｍから約０．８μｍ、約０．１μｍから約０．６μｍ、約０．１μｍから約０．５μｍ、約０．１μｍから約０．４μｍ、約０．１μｍから約０．３μｍ、約０．２μｍから約０．８μｍ、約０．２μｍから約０．８μｍ、約０．３μｍから約０．８μｍ、約０．４μｍから約０．８μｍ、約０．２μｍから約０．６μｍ、または約０．２μｍから約０．５μｍである。少なくとも１つの実施形態において、中空繊維フィルタの孔径は、約０．２μｍまたは約０．４５μｍである。中空繊維を含むフィルタモジュールは、例えばＲｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販されている。

生体物質、細胞および細胞培地を含む細胞培養物を分離システム上で循環させることによって、細胞はリアクタに保持され、対象となる生体物質が採取される。細胞培養物の循環は、灌流処理の開始時、例えば２日目または３日目に開始してもよい。

フィルタ上での細胞培養物の循環は、フィルタ表面に対して実質的に直角の流動（終端流としても公知である）またはフィルタ表面に対して実質的に平行な流動（接線流としても公知である）、例えば一方向接線流（ＴＦＦ）または交差流であってもよい。交差流の好適な一例は交互接線流（ＡＴＦ）であり、ＡＴＦに関しては、たとえ細胞密度が非常に高くてもフィルタの目詰まりが（素早く）発生しないことを見いだした。

「交互接線流」とは、フィルタ表面と同じ方向（すなわち接線方向）に、往復する１つの流れが存在すること、および前記フィルタ表面に対して実質的に直角の方向に別の流れが存在することを意味する。交互接線流は、当業者に公知の方法に従って達成可能である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，５４４，４２４号に記載）。

少なくとも１つの実施形態において、細胞によって製造された生体物質は、孔径が約０．０８μｍから０．５μｍ、約０．１μｍから０．５μｍ、約０．２μｍまたは約０．４５μｍである中空繊維フィルタを有する分離システムによって連続的に採取される。少なくとも１つの実施形態において、細胞によって製造された生体物質は、孔径が約０．０８μｍから約１．０μｍ、例えば、約０．１μｍから約０．８μｍ、約０．１μｍから約０．６μｍ、約０．１μｍから約０．５μｍ、約０．１μｍから約０．４μｍ、約０．１μｍから約０．３μｍ、約０．２μｍから約０．８μｍ、約０．２μｍから約０．８μｍ、約０．３μｍから約０．８μｍ、約０．４μｍから約０．８μｍ、約０．２μｍから約０．６μｍ、または約０．２μｍから約０．５μｍの中空繊維フィルタを有する分離システムによって連続的に採取される。少なくとも１つの実施形態において、中空繊維フィルタの孔径は、約０．２μｍまたは約０．４５μｍである。

Ｖ 下流精製
本開示の処理において製造される生体物質を、いわゆる下流処理において採取物からさらに獲得することができる。下流処理は通常、組合せや順序が異なる複数の精製工程を包含する。下流処理における精製工程の非限定的な例は、分離工程（例えば、親和性クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーおよび／または水性二相系による抽出および／または例えば硫酸アンモニウムによる沈殿）、生体物質を濃縮する工程（例えば限外ろ過または透析ろ過による）、緩衝液を交換する工程および／またはウイルスを除去または不活性化する工程（例えばウイルスろ過、ｐＨ変化または溶媒洗浄剤処理による）である。

本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＡＴＦ装置からの採取物は、クロマトグラフィー工程による連続的な生成物獲得処理を施される。例えば、疑似移動床（ＳＭＢ）、周期的向流クロマトグラフィー（ＰＣＣ）および２カラムクロマトグラフィー（ＴＣＣ）などの多カラムクロマトグラフィーシステムを、連続的生成物獲得に用いてもよい。本開示のいくつかの実施形態において、ＡＴＦ装置からの採取物は、獲得する生成物の性質に応じて適切な樹脂（タンパク質Ａ、ＩＥＸ、ＨＩＣ、混合モード、ＩＭＡＣなどの異なる官能性リガンドを有する）を充填された、例えば２～１６個のカラム、好ましくは３～８個のカラム、より好ましくは３個のカラムを使用するクロマトグラフィー工程による連続的な生成物獲得処理を施される。負荷段階および負荷後洗浄段階では、２個以上（２～１５個）のカラムを縦一列に接続する一方、他の段階では、残りのカラムを異なる段階によって異なる緩衝液で処理する。特に、２カラム処理の場合、開始時に１個のカラムを使
用して採取物を収集する一方、２個目のカラムを非負荷段階に使用する。非負荷段階を行う際、第２のカラムを第１のカラムの出口に接続して、負荷段階および負荷後洗浄段階の分画を通じて流れを捕捉する。これらのラインは全て、ＢｉｏＳＭＢ（Ｐａｌｌ）、ＡＫＴＡ ｐｃｃ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＢｉｏＳＣ（Ｎｏｖａｓｅｐ）、Ｃｏｎｔｉｃｈｒｏｍ（ＣｈｒｏｍａＣｏｎ）などの連続クロマトグラフィーシステム上で並行して処理される。本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＡＴＦ装置からの採取物は、例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ樹脂を充填された１．１／５ｃｍ（内径／床高）の３個のカラムを使用する連続的生成物獲得処理を施される。負荷段階および負荷後洗浄段階では、２個のカラムを縦一列に接続する一方、他の段階では、１個のカラムのみ処理する。これら２つの流路はＢｉｏＳＭＢ ＰＤシステム上で並行して処理され、３個のカラム間で自動的に切り替わる。連続直接生成物獲得処理は、従来のバッチ処理よりはるかに効率的である。

ＶＩ 実施例
以上概略説明した本開示は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解される。これらの実施例は、例示を目的として示されるもので、本開示を限定することを意図するものではない。

Ａ 細胞株および培養条件
クローンＸについて、ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ６１）から購入し、バイアルを解凍し、１００バイアルのマスターセルバンク（ＭＣＢ）を生成した後に、１３６バイアルのワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を生成した。次いで、ＷＣＢバイアルを解凍し、無血清培地を有する懸濁培養物に適応させた。懸濁物適応クローンＣＨＯ－Ｋ１－Ａ４を含む６０バイアルのＰＣＢ、１７０バイアルのＭＣＢおよび２３０バイアルのＷＣＢを生成した。ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－Ａ４）の１本のＷＣＢバイアルを、安定なトランスフェクションのために解凍した。

米国特許第６，０９０，３８２号に開示されているとおり、抗ｈＴＮＦαを発現するｃＤＮＡ配列を２つのベクターに分けてクローン化し、これらはそれぞれＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎおよびＺｅｏｃｉｎの耐性マーカーを含有した。安定なトランスフェクションを、リポソームを使用して実施した。トランスフェクション後、プール選択のために細胞を選択培地（９μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎおよび４００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含有するＣＤ ＣＨＯ培地）に通した。プール選択の約２週間後、ＦＡＣＳ選別によってプールをクローン化した。クローンを、スピンチューブ内の流加培地によってスクリーニングした。１つの高生産クローンを選択し、クローンＸと命名した。

クローンＹについて、ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ６１）から購入し、バイアルを解凍し、１００バイアルのＭＣＢを生成した後に、１３６バイアルのＷＣＢを生成した。次いで、ＷＣＢバイアルを解凍し、無血清培地を有する懸濁培養物に適応させた。懸濁物適応クローンＣＨＯ－Ｋ１－Ａ４を含む６０バイアルのＰＣＢ、１７０バイアルのＭＣＢおよび２３０バイアルのＷＣＢを生成した。ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－Ａ４）の１本のＷＣＢバイアルを、安定なトランスフェクションのために解凍した。

米国特許第７，０７０，９５９Ｂ１号に開示されているとおり、融合タンパク質標的ＶＥＧＦを発現するｃＤＮＡ配列を２つのベクターに分けてクローン化し、これらはそれぞれＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎおよびＺｅｏｃｉｎの耐性マーカーを含有した。安定なトランスフェクションを、リポソームを使用して実施した。トランスフェクション後、ミニプール選択のため、細胞を９６ウェルプレートに収めて選択培地（９μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔ
ｉｃｉｄｉｎおよび４００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含有するＣＤ ＣＨＯ培地）に入れた。ミニプール選択の約２週間後、高生産ミニプールを拡張および混合した。混合したミニプールを２回にわたりＣｌｏｎｅＰｉｘによってクローン化し、クローンを、スピンチューブ内の流加培地によってスクリーニングした。１つの高生産クローンを選択し、クローンＹと命名した。

クローンＺについて、ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ６１）から購入し、バイアルを解凍し、１００バイアルのＭＣＢを生成した後に、１３６バイアルのＷＣＢを生成した。次いで、ＷＣＢバイアルを解凍し、無血清培地を有する懸濁培養物に適応させた。懸濁物適応クローンＣＨＯ－Ｋ１－Ａ４を含む６０バイアルのＰＣＢ、１７０バイアルのＭＣＢおよび２３０バイアルのＷＣＢを生成した。ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－Ａ４）の１本のＷＣＢバイアルを、安定なトランスフェクションのために解凍した。

国際公開２０１９／０５７１２４Ａ１に開示されているとおり、二重特異性抗ＣＤ３ｘＣＤ１９抗体を発現するｃＤＮＡ配列を２つのベクターに分けてクローン化し、これらはそれぞれＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎおよびＺｅｏｃｉｎの耐性マーカーを含有した。安定なトランスフェクションを、リポソームを使用して実施した。トランスフェクション後、ミニプール選択のため、細胞を９６ウェルプレートに収めて選択培地（９μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎおよび４００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含有するＣＤ ＣＨＯ培地）に入れた。ミニプール選択の約２週間後、高生産ミニプールを個別に拡張した。ミニプールを１回のＦＡＣＳによってクローン化し、クローンを、スピンチューブ内の流加培養によってスクリーニングした。１つの高生産クローンを選択し、クローンＺと命名した。

Ｂ 実施例１
この実施例では、クローンＸを使用して、強化灌流培養処理（Ｂ）の性能を、従来の流加処理（Ａ）および集中流加処理（Ｃ）の性能と直接比較した。

従来の流加処理Ａ：
処理Ａを、振とうフラスコ内で実行した。従来の流加処理Ａを、容積２５０ｍＬの容器における初期ワーキングボリュームを５０ｍＬで実行した。細胞を、４．０ｍＭのＬグルタミンを補ったＣＤＭ４培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に０．４０×１０^６個／ｍＬにて接種し、その後、１４日間培養した。培養中、３．００％の基礎培地ＣＢ７ａおよび０．３０％の流加培地ＣＢ７ｂを別々に、３日目、６日目、８日目および１０日目に供給した。５日目に温度を３６．５℃から３１．０℃に変化させた。培養処理全体にわたり４００ｇ／ｋｇのグルコース貯蔵液を供給することによって、グルコース濃度を４．０ｇ／Ｌ超に維持した。

強化灌流培養処理Ｂ：
処理Ｂを、３ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ容器内で、デルタＶ制御装置を使用して温度を３６．５℃、ｐＨを約７．２から６．８の範囲、およびＤＯを４０％の空気飽和度に制御しながら実施した。ＡＴＦ－２Ｈシステム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と併せてＡＴＦフローモードで操作する０．２μｍの分画の中空繊維ろ過（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｓ）を使用して、細胞を保持した。

培養を、４．０ｍＭのＬグルタミンを補ったＣＤＭ４培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で０．８０～１．００×１０^６個／ｍＬの条件で開始した。３日目から毎日、約１０～１００ｐｐｍの脱泡剤を添加した。基礎培地（ＣＤＭ４、Ｈｙｃｌｏｎｅ）の灌流を１日目から０．４ＶＶＤの速度で開始し、速度を３日目に１．５ＶＶＤに増大した。流加培地（ＣＢ７ａ／ＣＢ７ｂ）の灌流を４日目に基礎培地の２．０％の速度で開始し、７日目に速度を基
礎培地の４．０％に増大した。８日目から、細胞の密度と生存率が低下したため、流加培地の灌流速度を徐々に減少させ、１７日目に１％まで減少させた。

３日目から培養終了まで、ＣＤＭ４培地の灌流速度を１．５ＶＶＤに維持した。マイクロスパージャを使用して、酸素を流速０．５ＶＶＭで送達した。５日目に温度を３６．５℃から３１．０℃に変化させ、培養終了まで３１．０℃に維持した。細胞培養物をＡＴＦ経由で連続的に採取した。培養処理全体にわたり、細胞を流出させずにバイオリアクタに保持した。

集中流加処理Ｃ：
処理Ｃを、デルタＶ制御装置を使用して温度を３６．５℃、ｐＨを約７．２から６．８の範囲、およびＤＯを４０％の空気飽和度に制御しながら実施した。集中流加処理の操作は処理Ｂと整合的であったが、例外として、分画中空繊維ろ過（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｓ）の孔は、細胞と生体生成物の両方を培養液中に保持するよう５０ＫＤであった。

処理の比較：
図２は、より高い最大生存細胞密度が処理ＢおよびＣで達成され、従来の流加処理Ａと比較すると３倍近くであったことを示す。

図３は、細胞の生存率を、処理ＢおよびＣでより長く維持できることを示し、処理Ｂおよび処理Ｃは１９日間にわたり稼働状態を維持した。

図４は、処理Ｂからの累積Ｐｖが、処理Ａおよび処理Ｃと比較すると最も高いことを示す。処理Ｂからの累積Ｐｖは、従来の流加処理Ａおよび集中流加処理Ｃそれぞれの最終濃度と比べ、約９．４１倍および１．２９倍である。ここでの集中流加処理Ｃにおける最終濃度は、充填細胞量によって調整される。

図５は、処理Ｂおよび集中流加処理Ｃにおいて、従来の流加処理Ａと比べ、よりスムーズなグルコース濃度制御が達成されることを示す。

図６は、処理Ｂおよび処理Ｃでは乳酸の生成または蓄積に明白な問題が観察されない一方、処理Ａの乳酸濃度が１０日目から上昇傾向を示したことを示す。

図７は、処理Ｂでは処理Ａおよび処理Ｃと比べ、酸性ピークの減少に伴うｃＩＥＦの主ピークの増大が達成されることを示す。

図８は、処理Ｂおよび他の２つの処理ＡとＣによって生じる凝集体およびフラグメントの比較を示す。処理ＢからのＳＥＣの主ピークは集中流加処理Ｃと同等で、いずれも従来の流加処理Ａより高い。処理ＢからのＳＤＳ＿キャリパ＿ＮＲの純度は、処理Ａおよび処理Ｃと比較しても明白な差がない。

処理Ｂからの採取物を９日目から２１日目にかけて収集し、３つの袋に分けてそれぞれ９日目から１３日目まで、１３日目から１７日目まで、および１７日目から２１日目まで保存した。各採取プールについて、小型カラム上でのバッチモード評価向けに約１００ｍＬの試料を取得し、残りをＢｉｏＳＭＢシステムによって連続モードで処理した。従来のバッチ処理および連続処理の収率および生産性を比較した一方、生成物の品質属性、ＳＥＣ純度およびＨＣＰ含有量も評価した。

従来のバッチ直接生成物獲得処理：
バッチモードクロマトグラフィーを、ＡＫＴＡピュアシステム上で、０．５／５．６ｃ
ｍ（内径／床高）のカラムにＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ樹脂を充填した状態で実施した。表１は、クロマトグラフィーの各工程の処理パラメータを示す。

負荷容量は６５ｇ／Ｌの樹脂、負荷滞留時間は５分間であった。クロマトグラフィー工程は室温（１８℃から２６℃）で行った。負荷体積をクロマトグラフィーシステムの体積合計装置によって判定した一方、溶出プール体積は収集試料の正味重量によって判定した。溶出プール中の生成物量を負荷プール中の生成物量で割った値に基づいて、収率を計算した。溶出プールの濃度を波長２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって判定した一方、負荷プールの濃度をタンパク質ＡのＨＰＬＣによって判定した。処理後の生成物量を処理時間および樹脂体積で割った値に基づいて、生産性を計算した。

溶出プールをｐＨ５．５に中和し、次いで溶出後に０．２μｍのＰＥＳシリンジフィルタでろ過した。中和後のプールのＳＥＣ純度およびＨＣＰ含有量を、それぞれＳＥＣ ＨＰＬＣおよび市販のＣＨＯ細胞用ＥＬＩＳＡキットによって判定した。

連続直接生成物獲得処理：
連続モードクロマトグラフィーを、ＢｉｏＳＭＢ ＰＤシステム上で、３個の１．１／５ｃｍ（内径／床高）のカラムにＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ樹脂を充填した状態で実施した。表３は、クロマトグラフィーの各工程の詳細な処理パラメータを示す。負荷段階および負荷後洗浄段階では、２個のカラムを縦一列に接続した一方、他の段階では、１個のカラムのみ処理した。これら２つの流路をＢｉｏＳＭＢ ＰＤシステム上で並行処理し、３個のカラム間で自動的に切り替えた。

連続処理の負荷容量および滞留時間を、異なる滞留時間および負荷濃度での漏出曲線に基づいて計算し、結果は表４に記載のように、材料の滴定濃度の違いによって異なった。指定のない他の操作条件は、上述のバッチ処理と同様であった。

バッチ処理および連続処理それぞれの収率、生産性、ＳＥＣ純度およびＨＣＰ含有量を、表２および表４に示すように要約した。培養時間にまたがって一貫した収率および生成物品質属性データは、強化灌流培養処理Ｂからの出発物質の変化は下流処理に及ぼす影響が軽微であり、連続生成物獲得処理はバッチ処理と同等であることを明らかにするものである。７７％高い生産性は、連続直接生成物獲得処理が従来のバッチ処理と比べ、獲得工程の生産性を著しく改善し得ることを意味する。強化灌流培養処理Ｂは安定性があると捉えられ、連続直接生成物獲得処理は、従来のバッチ処理よりはるかに効率的である。

Ｃ 実施例２
この実施例では、クローンＸを使用し、強化灌流培養処理（Ｂ）の性能を評価した。
強化灌流培養処理
実験ＩＰＣ－１からＩＰＣ－８を、デルタＶ制御装置を使用して温度を約３６．５℃、ｐＨを約７．２から６．８の範囲、およびＤＯを約４０％の空気飽和度に制御しながら実施した。ＡＴＦ－２Ｈシステム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と併せてＡＴＦフローモードで操作する全ての処理について（分画中空繊維ろ過の孔が０．４５μｍであった処理５を除く）、０．２μｍの分画の中空繊維ろ過（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｓ）を使用して、細胞を保持した。

実験ＩＰＣ－１、ＩＰＣ－２およびＩＰＣ－３を、７ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ容器内で実施し、実験ＩＰＣ－４、ＩＰＣ－５、ＩＰＣ－６、ＩＰＣ－７およびＩＰＣ－８を、３ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ容器内で実施した。

実験ＩＰＣ－１からＩＰＣ－８における培養を、４．０ｍＭのＬグルタミンを補ったＣＤＭ４培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に約０．９０～１．１０×１０^６個／ｍＬで開始し、０日目から毎日、約１０～１００ｐｐｍの脱泡剤を添加した。

実験ＩＰＣ－１、ＩＰＣ－４およびＩＰＣ－５では、基礎培地（ＣＤＭ４、Ｈｙｃｌｏｎｅ）の灌流を２日目に０．４ＶＶＤの速度で開始し、速度を４日目に１．０ＶＶＤに増大した。実験ＩＰＣ－２およびＩＰＣ－３では、基礎培地（ＣＤＭ４、Ｈｙｃｌｏｎｅ）の灌流を１日目に０．４ＶＶＤの速度で開始し、速度を２日目に１．０ＶＶＤに増大した。実験ＩＰＣ－６では、基礎培地（ＣＤＭ４、Ｈｙｃｌｏｎｅ）の灌流を２日目から０．４ＶＶＤの速度で開始し、速度を４日目に１．５ＶＶＤに増大した。実験ＩＰＣ－７およびＩＰＣ－８では、基礎培地（ＣＤＭ４、Ｈｙｃｌｏｎｅ）の灌流を１日目から０．４ＶＶＤの速度で開始し、速度を３日目に１．５ＶＶＤに増大した。実験ＩＰＣ－１からＩＰＣ－５では、ＣＤＭ４培地の灌流速度を５日目から培養終了まで１．０ＶＶＤに維持した。実験ＩＰＣ－６からＩＰＣ－８では、ＣＤＭ４培地の灌流速度を５日目から培養終了まで１．５ＶＶＤに維持した。

実験ＩＰＣ－１、ＩＰＣ－２、ＩＰＣ－３、ＩＰＣ－４、ＩＰＣ－５、ＩＰＣ－６およびＩＰＣ－８では、６日目に温度を約３６．５℃から約３１．０℃に変化させ、培養終了まで約３１．０℃に維持した。実験ＩＰＣ－７では、６日目に温度を約３６．５℃から約３３．０℃に変化させ、培養終了まで約３３．０℃に維持した。

実験ＩＰＣ－１からＩＰＣ－８では、流加培地（ＣＢ７ａ／ＣＢ７ｂ）の灌流を３日目から開始し、灌流速度を毎日、前日のグルコース活用状況に応じて調整して、最も低い供給速度でもグルコース濃度が２．０ｇ／Ｌを超える状態を維持した。マイクロスパージャを使用して、酸素を流速０．５ＶＶＭで送達した。細胞培養物をＡＴＦ経由で連続的に採取した。培養処理全体にわたり、細胞を流出させずにバイオリアクタに保持した。

図９は、全ての処理が高い最大生存細胞密度（３０×１０^６個／ｍＬ超）を達成し、また５～６日間にわたり高いレベルを維持可能であることを示す（ただし６日目以後に温度を３３．０℃に維持した処理７を除く）。

図１０は、全ての処理における細胞生存率を、２０日間近くに及ぶ培養全体にわたり５０％超に維持可能であることを示す（ただしエンドポイント生存率が４０％である処理７を除く）。

図１１は、全ての処理からの累積体積生産性（Ｐｖ）が１２ｇ／Ｌを超え、最高が２３ｇ／Ｌであることを示す。

図１２は、ほとんどの処理のグルコース濃度が培養期間全体にわたり２ｇ／Ｌ超に制御されていることを示す。

図１３は、指数増殖期における典型的な乳酸生成期間とそれに続く乳酸消費が全ての処理において観察されることを示す。

Ｄ 実施例３
この実施例では、クローンＹを使用して、強化灌流培養処理（Ｂ）の性能を、従来の流加処理（Ａ）および灌流処理（Ｃ）の性能と直接比較した。

従来の流加処理Ａ：
処理Ａを、振とうフラスコ内で、容積２５０ｍＬの容器における初期ワーキングボリュームを５０ｍＬとして実行した。細胞を、６ｍＭのＬグルタミンを補ったＥｘｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ）に０．４０×１０^６個／ｍＬにて接種し、その後、１４日間培養した。培養中、３．００％の基礎培地ＣＢ７ａおよび０．３０％の流加培地ＣＢ７ｂを別々に、３日目、６日目、８日目および１０日目に供給した。５日目に温度を３６．５℃から３３．０℃に変化させた。４００ｇ／ｋｇのグルコース貯蔵液を供給することによって、グルコース濃度を２．０ｇ／Ｌ超に維持した。

強化灌流培養処理Ｂ
処理Ｂを、デルタＶ制御装置を使用して温度を約３６．５℃、ｐＨを約７．２から６．８の範囲、およびＤＯを約４０％の空気飽和度に制御しながら実施した。処理Ｂを、３ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ容器内で実施し、ＡＴＦ－２Ｈシステム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と併せてＡＴＦフローモードで操作する０．２μｍの分画の中空繊維ろ過（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｓ）を使用して、細胞を保持した。培養を、６．０ｍＭのＬグルタミンを補ったＥｘｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ）中で０．７０～０．８０×１０^６個／ｍＬの条件で開始した。５日目から培養処理終了まで毎日、約１０から１００ｐｐｍの脱泡剤を添加した。基礎培地（Ｅｘｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ培地、Ｓｉｇｍａ）の灌流を１日目から０．４ＶＶＤの速度で開始し、速度を４日目に１．５ＶＶＤに増大した。流加培地（ＣＢ７ａ／ＣＢ７ｂ）の灌流を５日目に基礎培地の２．０％の速度で開始し、１２日目に速度を基礎培地の９．０％に増大した。１８日目に、流加培地の灌流速度を基礎培地の７％に減少させ、１９日目から培養終了まで基礎培地の６％に維持した。４日目から培養終了まで、基礎培地の灌流速度を１．５ＶＶＤに維持した。マイクロスパージャを使用して、酸素を流速０．５ＶＶＭで送達した。５日目に温度を約３６．５℃から約３３．０℃に変化させ、培養終了まで３３．０℃に維持した。細胞培養物をＡＴＦ経由で連続的に採取した。培養処理全体にわたり、細胞を流出させずにバイオリアクタに保持した。

灌流細胞培養処理Ｃ：
灌流処理Ｃを、デルタＶ制御装置を使用して温度を３４．５℃、ｐＨを約７．１から６．７の範囲、およびＤＯを４０％の空気飽和度に制御しながら探究した。処理Ｃを、７ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ容器内で実施し、ＡＴＦ－２Ｈシステム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と併せてＡＴＦフローモードで操作する０．２μｍの分画の中空繊維ろ過（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｓ）を使用して、細胞を保持した。培養を、６．０ｍＭのＬグルタミンおよび追加の２．５ｇ／Ｌのグルコースを補ったＥｘｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ）中で約０．５０～０．６０×１０^６個／ｍＬの条件で開始した。４日目から毎日、約１０～１００ｐｐｍの脱泡剤を添加した。基礎培地（Ｅｘｃｅ
ｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ培地、Ｓｉｇｍａ）の灌流を２日目から０．５ＶＶＤの速度で開始し、速度を５日目に１．５ＶＶＤに増大した。流加培地（ＣＢ７ａ／ＣＢ７ｂ）の灌流を３７日目に基礎培地の２．０％の速度で開始し、この速度を培養終了まで維持した。５日目から培養終了まで、基礎培地の灌流速度を１．５ＶＶＤに維持した。マイクロスパージャを使用して、酸素を流速０．５ＶＶＭで送達した。培養処理全体にわたり、温度を３４．５℃に設定した。細胞培養物をＡＴＦ経由で連続的に採取した。培養処理全体にわたり、余分な細胞を除去する流出によって、ＶＣＤの目標を５０．００×１０^６個／ｍＬとした。

図１４は、より高い最大生存細胞密度が処理Ｂで達成され、従来の流加処理Ａと比較すると７倍近くであったことを示す。処理Ｂは灌流処理Ｃと比べ、同じ培養期間中により多くのバイオマスを得ることができる。

図１５は、期間が１４日間である従来の流加処理Ａと比べ、処理Ｂはより長い２１日間にわたり、より高い生存率を維持可能であることを示す。

図１６は、処理Ｂからの累積Ｐｖが、処理Ａおよび処理Ｃそれぞれの最終濃度と比べ、約１８．４９倍および１．３９倍高いことを示す。１日当たりのワーキングボリューム単位当たりの生産性によって定義される容量を考察すると、処理Ｂ（２．４８ｇ／Ｌ／日）は灌流処理Ｃ（０．８３ｇ／Ｌ／日）より３倍近く高い。

図１７は、グルコース制御戦略が異なる別々の処理において、グルコースプロファイルも異なることを示す。

図１８は、指数増殖期における典型的な乳酸生成期間とそれに続く乳酸消費が、処理Ｂでは処理ＡおよびＣと比べ、培養の後段階で乳酸濃度が上昇する状態で観察されることを示す。

Ｅ 実施例４
この実施例では、クローンＺを使用して、強化灌流培養処理（Ｂ）の性能を、従来の流加処理（Ａ）の性能と直接比較した。

従来の流加処理Ａ：
従来の流加処理を３Ｌのスケールで開発し、１５Ｌにスケールアップした。従来の流加処理Ａを、３ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ容器における初期ワーキングボリュームを２．０Ｌとして実行した。細胞を、４ｍＭのＬグルタミン、１％（ｖ／ｖ）のヒポキサンチンモノナトリウムおよび１％（ｖ／ｖ）のチミジンを補ったＡｃｔｉｐｒｏ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に０．６０×１０^６個／ｍＬにて接種し、その後、１４日間培養した。培養中、３．００％、５．００％、５．００％および５．００％の流加培地ＣＢ７ａを０．３０％、０．５０％、０．５０％および０．５０％の流加培地ＣＢ７ｂと組み合わせたものを、別々に３日目、５日目、７日目および１０日目に供給した。５日目に温度を３６．５℃から３１．０℃に変化させた。４００ｇ／ｋｇのグルコース貯蔵液を供給することによって、グルコース濃度を１ｇ／Ｌ超に維持した。

強化灌流培養処理Ｂ：
処理Ｂを３Ｌのスケールで開発し、１５Ｌおよび２５０Ｌにスケールアップした。３Ｌのスケールの処理について、１．５Ｌのワーキングボリュームを３ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ容器で培養した。１５Ｌのスケールの処理について、１０Ｌのワーキングボリュームを１５ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ容器で培養した。２５０Ｌのスケールについて、１５０ＬのワーキングボリュームをＳＵＢ ２５０Ｌの使い捨てバイオリアクタで培養した。ＡＴＦシス
テム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と併せてＡＴＦフローモードで操作する０．２μｍの中空繊維ろ過（Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓ／Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、細胞を保持した。処理Ｂを、デルタＶ制御装置を使用して温度を約３６．５℃、ｐＨを約７．２から６．８の範囲、およびＤＯを約４０％の空気飽和度に制御しながら実施した。

３Ｌのスケールの実験について、培養を、４ｍＭのＬグルタミン、１％（ｖ／ｖ）のヒポキサンチンモノナトリウムおよび１％（ｖ／ｖ）のチミジンを補ったＡｃｔｉｐｒｏ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に１．１０～１．３０×１０^６個／ｍＬの条件で開始した。２日目から毎日、約１０～１００ｐｐｍの脱泡剤を添加した。基礎培地（Ａｃｔｉｐｒｏ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）の灌流を２日目から０．６ＶＶＤの速度で開始し、速度を６日目に０．８８ＶＶＤに増大した。流加培地ＣＢ７ａの灌流を２日目に基礎培地の６．７％の速度で開始し、基礎培地の１５．９％に増大した。流加培地ＣＢ７ｂの灌流を２日目に開始し、０．００５ＶＶＤの速度を培養終了まで維持した。６日目から培養終了まで、基礎培地の灌流速度を０．８８ＶＶＤに維持した。マイクロスパージャを使用して、酸素を流速０．３３ＶＶＭで送達した。５日目に温度を３６．５℃から３１．０℃に変化させ、培養終了まで３１．０℃に維持した。細胞培養物をＡＴＦ経由で連続的に採取した。培養処理全体にわたり、細胞を流出させずにバイオリアクタに保持した。

２５０Ｌのスケールの実験について、培養を、４ｍＭのＬグルタミン、１％（ｖ／ｖ）のヒポキサンチンモノナトリウムおよび１％（ｖ／ｖ）のチミジンを補ったＡｃｔｉｐｒｏ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に０．８０～１．４０×１０^６個／ｍＬの条件で開始した。２日目から毎日、約１０～１００ｐｐｍの脱泡剤を添加した。基礎培地（Ａｃｔｉｐｒｏ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）の灌流を２日目から０．６ＶＶＤの速度で開始し、速度を６日目に０．８８ＶＶＤに増大した。流加培地ＣＢ７ａの灌流を２日目に基礎培地の６．７％の速度で開始し、基礎培地の１５．９％に増大した。流加培地ＣＢ７ｂの灌流を２日目に開始し、０．００５ＶＶＤの速度を培養終了まで維持した。６日目から培養終了まで、基礎培地の灌流速度を０．８８ＶＶＤに維持した。マイクロスパージャを使用して、４日目から酸素を送達した。５日目に温度を３６．５℃から３１．０℃に変化させ、培養終了まで３１．０℃に維持した。細胞培養物をＡＴＦ経由で連続的に採取した。培養処理全体にわたり、細胞を流出させずにバイオリアクタに保持した。

同じ処理を１５Ｌのバイオリアクタおよび２５０Ｌのバイオリアクタにそれぞれスケールアップした。１５Ｌのバイオリアクタでの培養について、２つのＡＴＦ－２Ｈシステム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と併せてＡＴＦフローモードで操作する０．２μｍの分画の中空繊維ろ過（Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓ）を使用して、細胞を保持した。２５０Ｌのバイオリアクタでの培養について、２つのＡＴＦ－６システム（Ｒｅｆｉｎｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と併せてＡＴＦフローモードで操作する０．２μｍの分画の中空繊維ろ過（Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓ）を使用して、細胞を保持した。

図１９は、より長い指数増殖期および２倍近く高い最大生存細胞密度が、処理Ｂにおいて、同じ３Ｌのスケールの従来の流加処理Ａと比較すると実証されることを示す。

図２０は、処理Ｂは同じ３Ｌのスケールにおいて、１４日目より前に処理Ａと同等の細胞生存率を持続可能であることを示す。

図２１は、処理Ｂからの累積Ｐｖが、同じ３Ｌのスケールの従来の流加処理Ａにおける最終濃度と比べ、約６．５６倍高いことを示す。

図２２は、同じ３Ｌのスケールにおいて、処理Ａおよび処理Ｂについてグルコース濃度
制御が同等であることを示す。

図２３は、指数増殖期における典型的な乳酸生成期間とそれに続く乳酸消費が、同じ３Ｌのスケールの処理ＡとＢの両方で観察されることを示す。

図２４は、より長い指数増殖期および２倍近く高い最大生存細胞密度が、処理Ｂにおいて、従来の流加処理Ａと比較すると実証されることを示す。処理Ｂの生存細胞密度の結果は、１５Ｌおよび２５０Ｌのスケールにスケールアップしても３Ｌのスケールと同等であった。

図２５は、処理Ｂが処理Ａと同等の細胞生存率を持続可能であることを示す。処理Ｂの生存率の結果は、１５Ｌおよび２５０Ｌのスケールにスケールアップしても３Ｌのスケールと同等であった。

図２６は、処理Ｂの細胞平均直径が従来の流加処理の場合より大きかったことを示す。
図２７は、グルコース制御戦略の違いを背景に、異なる処理間でグルコースプロファイルも異なることを示す。

図２８は、指数増殖期における典型的な乳酸生成期間とそれに続く乳酸消費が、処理Ａと処理Ｂの両方で観察されることを示す。

図２９は、処理Ｂのアンモニウム濃度が従来の流加処理の場合より高かったことを示す。

図３０と３１は、処理Ａと処理Ｂの両方でｐＨが適切に制御され、処理をスケールアップするとｐＨが若干低くなったことを示す。

図３２は、処理ＢのｐＣＯ_２プロファイルは同じスケールの処理Ａと同等であったことを示す。ｐＣＯ_２レベルは処理をスケールアップすると増大する。

図３３は、処理Ｂのオスモル濃度は処理Ａより若干高かったが、４００ｍＯｓｍ／ｋｇの条件下で適切に制御されたことを示す。

図３４は、処理Ｂからの累積Ｐｖが、従来の流加処理Ａにおける最終濃度と比べ、約４．５倍高いことを示す。処理Ｂの累積Ｐｖは、スケールが異なっても全て、２０ｇ／Ｌ超に達した。

図３５は、１５Ｌのスケールおよび２５０Ｌのスケールで処理Ｂによって生じる凝集体およびフラグメントの比較を示す。処理ＢのＳＥＣの主ピークは、両方のスケールで同等である。

図３６は、処理Ｂでは処理Ａおよび処理Ｃと比べ、酸性ピークの減少に伴うｃＩＥＦの主ピークの増大が達成されることを示す。

次に、強化灌流培養処理Ｂからの材料の直接生成物獲得処理について、連続処理を評価した。処理Ｂからの採取物を７日目から１８日目にかけて収集し、４つの袋に分けてそれぞれ７日目から１０日目まで、１０日目から１３日目まで、１３日目から１６日目まで、および１６日目から１８日目まで保存した。連続処理の収率および生産性を計算した一方、生成物の品質属性、ＳＥＣ純度およびＨＣＰ含有量も評価した。

連続直接生成物獲得処理：
連続モードクロマトグラフィーを、３個の１．１／５．０ｃｍ（内径／床高）カラムを使用するＢｉｏＳＭＢ ＰＤシステムおよび３個の１０．０／５．２ｃｍ（内径／床高）カラムを使用するＢｉｏＳＭＢ Ｐｒｏｃｅｓｓシステム上で、それぞれ１５Ｌのスケールと２５０Ｌのスケールで実施した。両方のカラムにＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ樹脂を充填した。負荷段階および負荷後洗浄段階では、２個のカラムを縦一列に接続した一方、他の段階では、１個のカラムのみ処理した。これら２つの流路をＢｉｏＳＭＢシステム上で並行処理し、３個のカラム間で自動的に切り替えた。

連続処理の負荷容量および滞留時間を、異なる滞留時間および負荷濃度での漏出曲線に基づいて計算した。クロマトグラフィー工程は室温（１８℃～２６℃）で行った。溶出プール中の生成物量を負荷プール中の生成物量で割った値に基づいて、収率を計算した。溶出プールの濃度を波長２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって判定した一方、負荷プールの濃度をタンパク質ＡのＨＰＬＣによって判定した。負荷体積をクロマトグラフィーシステムの体積合計装置によって判定した一方、溶出プール体積は収集試料の正味重量によって判定した。処理後の生成物量を処理時間および樹脂体積で割った値に基づいて、生産性を計算した。

溶出プールをｐＨ５．５に中和し、次いで溶出後に０．２μｍのＰＥＳシリンジフィルタでろ過した。中和後のプールのＳＥＣ純度およびＨＣＰ含有量を、それぞれＳＥＣ ＨＰＬＣおよび市販のＣＨＯ細胞用ＥＬＩＳＡキットによって判定した。これら２回の処理における収率および生成物品質属性（ＳＥＣ純度、ｃＩＥＦ純度およびＨＣＰ含有量を含む）を表６に要約した。培養時間およびスケールにまたがって一貫した収率および生成物品質属性データは、強化灌流培養処理Ｂが頑健であることを明らかにするものである。

Claims (50)

1. （ａ）細胞培地と細胞とを含む細胞培養物を培養すること、
   （ｂ）前記細胞培養物を基礎培地および流加培地とともにバイオリアクタにて灌流させること、および
   （ｃ）生体物質を採取すること
   を含む生体物質の製造方法であって、
   前記基礎培地および前記流加培地を異なる速度で前記細胞培養物に供給し、前記細胞培養物を分離システムに連続的に通し、前記細胞を、流出させずに前記バイオリアクタに保持する方法。
2. 前記分離システムが、交互接線流（ＡＴＦ）装置または接線流ろ過（ＴＦＦ）装置である、請求項１に記載の方法。
3. 前記分離システムが、中空繊維フィルタを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記中空繊維フィルタの分画分子量（ＭＷＣＯ）が、前記生体物質の分子量より大きい、請求項３に記載の方法。
5. 前記中空繊維フィルタの孔径が、約０．０８μｍから約０．５μｍである、請求項４に記載の方法。
6. 前記中空繊維フィルタの前記孔径が、約０．１μｍから約０．５μｍである、請求項４に記載の方法。
7. 前記孔径が、約０．２μｍまたは約０．４５μｍである、請求項４に記載の方法。
8. 前記基礎培地が、約０．１から約２．０以下の１日当たりのワーキングボリューム（ＶＶＤ）の灌流速度で供給される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記基礎培地が、約０．１から約１．５（ＶＶＤ）の灌流速度で供給される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記基礎培地が、約０．３から約１．２（ＶＶＤ）の灌流速度で供給される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記基礎培地が、約０．５から約１．０（ＶＶＤ）の灌流速度で供給される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記流加培地の前記灌流が、前記基礎培地の前記灌流速度の約０．１％から約２０％の範囲の速度である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記流加培地の灌流が、前記基礎培地の前記灌流速度の約１％から約１５％の範囲の速度である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記流加培地の灌流が、前記基礎培地の前記灌流速度の約１％から約１０％の範囲の速度である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記流加培地の灌流が、前記基礎培地の前記灌流速度の約１％から約９％の範囲の速度である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記細胞が、約３５℃から約３７℃の範囲で培養される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記細胞培養物を約２８℃から約３３℃の範囲の温度に温度変化させることをさらに含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記温度変化が、所定の最大生存細胞密度（ＶＣＤ）に対応する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 最大ＶＣＤが達成される前に前記温度を低下させる、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記バイオリアクタに脱泡剤を加える、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記脱泡剤が、油系脱泡剤、粉末脱泡剤、水系脱泡剤、シリコーン系脱泡剤、ＥＯ／ＰＯ系脱泡剤、アルキルポリアクリレート、およびそれらの組合せから選択される、請求項２０に記載の方法。
22. マイクロスパージャを使用する、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記マイクロスパージャが、約０．２から約０．５ＶＶＭの範囲の流速で酸素を送達する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記細胞が、哺乳動物の細胞を含む、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記哺乳動物の細胞が、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ハイブリドーマ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞または骨髄腫細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記生体物質が、受容体、酵素、融合タンパク質、血液タンパク質、多機能タンパク質、ウイルスまたは細菌タンパク質および免疫グロブリンから選択される、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記血液タンパク質が、血液凝固カスケードによるものである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記多機能タンパク質が、エリスロポエチンである、請求項２６に記載の方法。
29. 前記ウイルスまたは細菌タンパク質が、ワクチンに使用される、請求項２６に記載の方法。
30. 前記免疫グロブリンが、抗体または多重特異性抗体である、請求項２６に記載の方法。
31. 前記抗体が、ＩｇＧまたはＩｇＭである、請求項３０に記載の方法。
32. 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項３０に記載の方法。
33. 約１０ｇ／Ｌ以上の累積体積生産性（Ｐｖ）を達成する、請求項１から３２のいずれか
    １項に記載の方法。
34. 約１５ｇ／Ｌ以上の累積体積生産性（Ｐｖ）を達成する、請求項１から３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 約２０ｇ／Ｌ以上の累積体積生産性（Ｐｖ）を達成する、請求項１から３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 採取された前記生体物質に少なくとも１つのクロマトグラフィー工程による連続的な生成物獲得処理を施すことをさらに含む、請求項１から３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 採取された前記生体物質に少なくとも２個のクロマトグラフィーカラムを用いた連続的な生成物獲得処理を施すことをさらに含む、請求項１から３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 採取された前記生体物質に２から１６個のクロマトグラフィーカラムを用いた連続的な生成物獲得処理を施すことをさらに含む請求項１から３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 採取された前記生体物質に３から８個のクロマトグラフィーカラムを用いた連続的な生成物獲得処理を施すことをさらに含む請求項１から３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 採取された前記生体物質に少なくとも３個のクロマトグラフィーカラムを用いた連続的な生成物獲得処理を施すことをさらに含む請求項１から３９のいずれか１項に記載の方法。
41. 請求項１から４０のいずれか１項により製造された生体物質。
42. （ａ）細胞培養物を基礎培地および流加培地とともにバイオリアクタにて灌流させるためのモジュールと、
    （ｂ）生体物質を連続的に採取するためのモジュールであって、ある孔径または前記生体物質の分子量より大きい分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する中空繊維フィルタを含むモジュールと
    を含む生体物質製造システム。
43. 前記採取物から前記生体物質を連続的に獲得するためのモジュールをさらに含む請求項４２に記載のシステム。
44. 前記生体物質を連続的に採取するための前記モジュールが、交互接線流（ＡＦＴ）装置または接線流ろ過（ＴＦＦ）装置である、請求項４２に記載のシステム。
45. 前記基礎培地および前記流加培地が、異なる速度で供給される、請求項４２に記載のシステム。
46. 前記中空繊維フィルタの前記孔径が、約０．０８μｍから０．５μｍである、請求項４２に記載のシステム。
47. 前記中空繊維フィルタの前記孔径が、約０．１μｍから０．５μｍである、請求項４２に記載のシステム。
48. 前記孔径が、約０．２μｍである、請求項４２に記載のシステム。
49. 前記孔径が、約０．４５μｍである、請求項４２に記載のシステム。
50. 細胞培養用バイオリアクタおよび／またはマイクロスパージャをさらに含む、請求項４２に記載のシステム。
    

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