ES2949507T3

ES2949507T3 - Procedimientos para aumentar el contenido de manosa de proteínas recombinantes

Info

Publication number: ES2949507T3
Application number: ES18194714T
Authority: ES
Inventors: Jian Wu; Sean Davern; Simina Petrovan; Michael Brandenstein; Katherine Lindahl; Shawn Lillie
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2034-03-10
Also published as: HUE063435T2; EP2970874B1; US20180002733A1; EP2970874A1; HRP20230667T1; TWI625390B; SI3434760T1; TWI832345B; TW201831677A; US11319568B2; WO2014159259A1; RS64326B1; US11952605B2; TWI720289B; TW201441368A; LT3434760T; US20220136026A1; CY1120824T1; ES2691801T3; AR095418A1

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para modular el contenido de manosa de proteínas recombinantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para aumentar el contenido de mañosa de proteínas recombinantes

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos IgG producidos en cultivos de células de mamífero pueden contener diferentes niveles de glicoformas de alta manosa (HM), tales como manosa5 (Man5), manosa6 (Man6), manosa7 (Man7), manosa8 (Man8) y manosa9 (Man9). El contenido de glicoformas de alta manosa de proteínas terapéuticas y anticuerpos es un atributo de calidad crucial que se ha descubierto que afecta a las propiedades farmacocinéticas de determinados anticuerpos terapéuticos (Goetze, et al., (2011) Glycobiology 21,949-59; Yu, et al., (2012) MAbs 4, 475-87).

Las glicoformas de un anticuerpo expresado por células huésped de ovario de hámster chino (CHO) se determinan en gran medida durante la generación de líneas celulares y la selección de clones. Sin embargo, el contenido de HM también puede verse afectado por las condiciones del cultivo celular (Pacis, et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108, 2348 2358). Es habitual en la industria de anticuerpos terapéuticos buscar un intervalo deseado de contenido de HM para un producto anticuerpo debido a cambios en el proceso, aumento de escala, mejoras o la necesidad de igualar los atributos de calidad de anticuerpos existentes. Hasta la fecha, los procedimientos aplicados para manipular el contenido de HM de un anticuerpo en un cultivo celular incluyen cambios en la composición de los medios, la osmolalidad, el pH, la temperatura, etc. (HIlls et al. (2001) Biotechnol Bioeng 75(2), 239-251, Yu, et al., anteriormente, Pacis et al., anteriormente, Chee Furng Wong et al., (2005) Biotechnol Bioeng 89, 164-177; Ahn, et al., (2008) Biotechnol Bioeng 101, 1234-44). La eficacia de estos procedimientos es específica de las líneas celulares, los tipos de moléculas y el entorno de los medios. Además, estos procedimientos tienden a alterar también la productividad del anticuerpo, el comportamiento del cultivo celular y otros atributos de calidad del anticuerpo. La eficacia de estos procedimientos se obtiene empíricamente.

Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento para la modulación del contenido de glicoformas de alta manosa de proteínas terapéuticas y anticuerpos. La invención proporciona un procedimiento para aumentar el contenido de manosa 5 por medio de glucosa limitada en combinación con una fuente de carbono alternativa, en particular galactosa.

Sumario de la invención

La invención proporciona un procedimiento para la modulación de manosa 5 en una proteína recombinante durante un proceso de cultivo de células de mamífero que comprende limitar la cantidad de glucosa en el medio de cultivo celular, en el que la concentración de glucosa es de aproximadamente de 0 a 3 g/l, y complementar el medio de cultivo celular con galactosa, en el que la concentración de galactosa es de 10-15 g/l, y en el que el proceso de cultivo celular es un proceso de perfusión.

En una forma de realización, la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular es suficiente para dar como resultado una concentración de glucosa en el medio gastado de, o aproximadamente, 0 g/l.

En formas de realización relacionadas, la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular es de 1 a 3 g/l; de 2 a 3 g/l; de 2,5 g/l o de 0 g/l.

En formas de realización relacionadas, la concentración de galactosa es de 10 a 12 g/l o de 11,5 g/l.

En una forma de realización, la cantidad limitante de glucosa se añade durante una fase de producción.

En una forma de realización, la perfusión comienza en, o aproximadamente, el día 5 a, o aproximadamente, el día 9 del cultivo celular. En una forma de realización relacionada, la perfusión comienza en, o aproximadamente, el día 5 a, o aproximadamente, el día 7 del cultivo celular. En otra forma de realización relacionada, la perfusión comienza cuando las células han alcanzado una fase de producción.

En otra forma de realización, la perfusión comprende perfusión continua. En una forma de realización relacionada, la velocidad de perfusión es constante.

En una forma de realización, la perfusión se realiza a una velocidad inferior o igual a 1,0 volúmenes de trabajo por día. En una forma de realización relacionada, la perfusión se realiza a una velocidad que aumenta durante la fase de producción de 0,25 volúmenes de trabajo por día a 1,0 volúmenes de trabajo por día durante el cultivo celular. En otra forma de realización relacionada, la perfusión se realiza a una velocidad que alcanza 1,0 volúmenes de trabajo por día el día 9 al día 11 del cultivo celular. En otra forma de realización relacionada, la perfusión se realiza a una velocidad que alcanza 1,0 volúmenes de trabajo por día el día 10 del cultivo celular.

En una forma de realización, las alimentaciones en bolo de medio de alimentación carente de suero comienzan el día 3 o el día 4 del cultivo celular.

En una forma de realización, el cultivo de células de mamífero se establece inoculando el biorreactor con al menos de 0,5 x 106 a 3,0 x 106 células/ml en un medio de cultivo carente de suero. En una forma de realización relacionada, el cultivo de células de mamífero se establece inoculando el biorreactor con al menos de 0,5 x 106 a 1,5 x 106 células/ml en un medio de cultivo carente de suero.

En una forma de realización, el procedimiento descrito anteriormente comprende además un cambio de temperatura de 362C a 31 °C.

En una forma de realización, el procedimiento descrito anteriormente comprende además un cambio de temperatura de 36 °C a 33 °C. En una forma de realización relacionada, el cambio de temperatura se produce en la transición entre la fase de crecimiento y la fase de producción. En una forma de realización relacionada, el cambio de temperatura se produce durante la fase de producción.

En una forma de realización, el procedimiento anterior comprende además inducir la detención del crecimiento celular mediante privación de L-asparagina seguida de perfusión con un medio de perfusión carente de suero que tiene una concentración de L-asparagina de 5 mM o inferior. En una forma de realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión carente de suero es inferior o igual a 5 mM. En una forma de realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión carente de suero es inferior o igual a 4,0 mM. En otra forma de realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión carente de suero es inferior o igual a 3,0 mM. En otra forma de realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión carente de suero es inferior o igual a 2,0 mM. En otra forma de realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión carente de suero es inferior o igual a 1,0 mM. En otra forma de realización relacionada más, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión carente de suero es de 0 mM. En otra forma de realización relacionada más, la concentración de L-asparagina del medio de cultivo celular se supervisa antes y durante la privación de L-asparagina.

En una forma de realización, el procedimiento anterior comprende además que el volumen celular empaquetado durante una fase de producción sea inferior o igual al 35%. En una forma de realización relacionada, el volumen celular empaquetado es inferior o igual al 30%.

En una forma de realización, la densidad de células viables del cultivo de células de mamífero en un volumen celular empaquetado inferior o igual al 35% es de 10 x 106 células viables/ml a 80 x 106 células viables/ml. En una forma de realización relacionada, la densidad de células viables del cultivo de células de mamífero es 20 x 106 células viables/ml a 30 x 106 células viables/ml.

En una forma de realización, la perfusión se realiza mediante flujo tangencial alterno. En una forma de realización relacionada, la perfusión se realiza mediante flujo tangencial alterno utilizando un ultrafiltro o un microfiltro.

En una forma de realización, el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l. En una forma de realización relacionada, el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l a 2000 l. En una forma de realización relacionada, el biorreactor tiene una capacidad de al menos 1000 l a 2000 l.

En una forma de realización, las células de mamífero son células de ovario de hámster chino (CHO).

En una forma de realización, la proteína recombinante se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, una proteína de fusión recombinante o una citoquina.

En una forma de realización, el procedimiento anterior comprende además una etapa de recolección de la proteína recombinante producida por el cultivo celular.

En una forma de realización, la proteína recombinante producida por el cultivo celular se purifica y se formula en una formulación farmacéuticamente aceptable.

En una forma de realización, la producción de proteína recombinante en la manosa 5 se incrementa en comparación con un cultivo en el que las células no se someten a glucosa limitada en combinación con galactosa.

En una forma de realización, la concentración del medio de perfusión es de 15 g/l.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Perfiles de cultivo celular y Man5 en un proceso semicontinuo (fed-batch). (A) Concentración de glucosa en g/l en sobrenadante de cultivo. (B) Concentración de galactosa en g/l en sobrenadante de cultivo. (C) Densidad de células viables. (D) Viabilidad. (E) Título. (F) Man5. 1 g/l de glucosa, 0 g/l de galactosa (triángulo blanco). 1 g/l de glucosa, 4 g/l de galactosa (triángulo negro). 2 g/l de glucosa, 0 g/l de galactosa (círculo blanco). 2 g/l de glucosa, 4 g/l de galactosa (triángulo negro). 3 g/l de glucosa, 0 g/l de galactosa (cuadrado blanco). 3 g/l de glucosa, 4 g/l de galactosa (cuadrado negro).

Figura 2. Perfiles de cultivo celular y aminoácidos en un proceso de perfusión. (A) Densidad de células viables (B) Viabilidad, (C) Concentración de Gln (glutamina) en g/l en el análisis de medios gastados, (D) Título ajustado de volumen celular empaquetado, (E) Concentración de Glc (glucosa) en g/l en el análisis de medios gastados, (F) Concentración de galactosa en g/l en el análisis de medios gastados. 2 g/l de glucosa, 6 g/l de galactosa y glutamina 10 mM (triángulo negro). 4 g/l de glucosa, 6 g/l de galactosa y glutamina 10 mM (círculo negro). 4 g/l de glucosa, 6 g/l de galactosa y glutamina 5 mM (círculo blanco).

Figura 3. Perfiles de cultivo celular en un proceso de perfusión. (A) Concentración de Glu (glucosa) en g/l en el análisis de medios gastados, (B) Concentración de Gal (galactosa) en g/l en el análisis de medios gastados, (C) Concentración de lactato, (D) Concentración de amoniaco, (E) Densidad de células viables, (F) Viabilidad, (G) Título ajustado de volumen celular empaquetado. 3 g/l de glucosa, 13 g/l de galactosa (cuadrado negro). 0 g/l de glucosa, 10 g/l de galactosa (círculo blanco). 0 g/l de glucosa, 13 g/l de galactosa (círculo negro). 1,5 g/l de glucosa, 11,5 g/l de galactosa (estrella). 3 g/l de glucosa, 10 g/l de galactosa (cuadrado blanco).

Figura 4. Análisis estadístico JMP del proceso de perfusión. (A) Título ajustado de volumen celular empaquetado, (B) Man5.

Figura 5. Datos del transcurso temporal que muestran un aumento en el porcentaje de especies de Man5. - 0 g/l de glucosa, 10 g/l de galactosa; -+ 0 g/l de glucosa, 13 g/l de galactosa; 13 g/l de glucosa ,10 g/l de galactosa; + 3 de g/l glucosa, 13 g/l de galactosa; OO 1,5 g/l de glucosa, 11,5 de galactosa.

Descripción detallada de la invención

La producción de perfiles de glicoformas de glicoproteínas recombinantes coherentes y reproducibles continúa siendo un desafío considerable para la industria biofarmacéutica. Las variaciones en los procesos de cultivo celular desempeñan un papel importante en los perfiles de glicosilación de anticuerpos. La variabilidad potencial en el entorno fisicoquímico del proceso de cultivo celular, incluidos el pH, la temperatura, la composición de los medios de cultivo celular, la variación de lote a lote de las materias primas, el material de filtración del medio, la diferencia de escala del biorreactor, la estrategia de gasificación (aire, oxígeno, dióxido de carbono) son solo algunos ejemplos que potencialmente pueden alterar los perfiles de glicosilación.

Se ha observado que en condiciones de baja glucosa o de glucosa limitada, el contenido de glicoformas de alta manosa en la proteína recombinante aumentaba, pero, sin embargo, los atributos del cultivo celular, tales como la productividad volumétrica, la viabilidad celular y/o la densidad, disminuían. El aumento de la concentración de glucosa mejoraba los atributos del cultivo, pero disminuía el contenido de glicoformas de alta manosa.

La invención proporciona un procedimiento para incrementar la manosa5 (Man5), para lograr los atributos de calidad del producto deseados manteniendo a la vez los niveles deseables de determinados parámetros de cultivo celular, tales como la productividad volumétrica, la viabilidad celular y/o la densidad, mediante el uso de concentraciones bajas o limitadas de glucosa en combinación con una fuente alternativa de carbono, en particular, galactosa. Tal como se describe en el presente documento, el cultivo de células en un medio de cultivo celular en el que la glucosa se limita mediante la reducción de la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular, en combinación con una fuente de carbono alternativa, dio como resultado una proteína recombinante que tiene una mayor concentración de glicoformas de alta manosa, a la vez que se mantienen el crecimiento celular, la viabilidad y el título a niveles aceptables.

Durante la fase de producción de un cultivo celular, los parámetros de cultivo deseables, tales como la densidad de células viables, la viabilidad celular, el porcentaje de volumen celular empaquetado, el título y/o el título ajustado de volumen celular empaquetado se pueden establecer alimentando el cultivo celular con un medio de cultivo celular que contenga suficiente glucosa (de 5 g/l a 15 g/l o más) para establecer y mantener estos parámetros. En ese momento, durante el desarrollo de la producción del cultivo celular, cuando es deseable aumentar el contenido de glicoformas de alta manosa de la proteína recombinante que se está produciendo, el cultivo celular se alimenta con un medio de cultivo celular en el que la concentración de glucosa se ha reducido de tal manera que dará como resultado el aumento deseado en el contenido de Man5. Dicho medio de cultivo celular se caracteriza por una menor concentración de glucosa (0 - 3 g/l) en combinación con una fuente de carbono alternativa, tal como galactosa.

Los factores que determinan el grado al que será necesario reducir la concentración de glucosa incluyen qué fuente de carbono alternativa se usa y cuánto se usa, el proceso de producción de cultivos celulares, el tipo y la masa celular y el consumo de glucosa. Cuanto mayor sea la masa celular en el biorreactor, mayor será el consumo de glucosa por parte del cultivo celular y, por lo tanto, mayor será la cantidad de glucosa que se puede alimentar manteniendo a la vez un estado de glucosa limitada que producirá el aumento deseado de la concentración de glicoforma Man5. La manera en la que se alimenta la glucosa al cultivo celular también puede influir en la cantidad de glucosa necesaria para mantener un estado de glucosa limitada que producirá el aumento deseado de la concentración de glicoforma de Man5. Por ejemplo, en un cultivo celular semicontinuo, la glucosa puede formularse en el medio de cultivo celular y complementarse con alimentaciones en bolo. En un proceso de cultivo celular por perfusión, la concentración de glucosa dependerá de la tasa de alimentación (g/l/día) del medio de perfusión. En el presente documento se proporcionan ejemplos de ambos. Además, se puede medir la cantidad de glucosa en el medio de cultivo durante la producción, por ejemplo mediante análisis de medios gastados para cultivos de perfusión. Se observó que los niveles de Man5 aumentaban cuando la cantidad de glucosa en el medio gastado era de 0 g/l o de casi 0 g/l.

La producción de glicoformas de alta manosa se incrementó en situaciones en las que se redujeron las concentraciones de glucosa. Sin embargo, los niveles bajos de glucosa pueden afectar a la producción de proteínas recombinantes en sistemas de cultivo celular. La producción volumétrica, la viabilidad celular y la densidad de células viables pueden verse afectadas negativamente en situaciones en las que la glucosa está limitada. Se ha descubierto que la adición de una fuente alternativa de carbono, tal como la galactosa, al cultivo celular durante un periodo de baja glucosa o de glucosa limitada no disminuía o estabilizaba los descensos en la producción volumétrica, la viabilidad celular y la densidad de células viables, al tiempo que se conservaba el aumento de glicoformas de Man5. Tener la capacidad de manipular y mantener el contenido de glicoformas de alta manosa de una proteína recombinante durante el cultivo celular mientras se minimiza la pérdida del título del producto y se mantiene la viabilidad celular representa un procedimiento valioso y fácil de implementar para la producción comercial de proteínas terapéuticas.

En el presente documento se proporciona un procedimiento de cultivo de células de mamífero que es útil para aumentar las glicoformas de alta manosa, en particular, Man 5, para lograr los atributos de calidad del producto deseados mientras se mantiene un título del producto y una viabilidad celular aceptables utilizando una cantidad limitante de glucosa en combinación con una fuente alternativa de carbono, en particular, galactosa. El procedimiento proporciona el cultivo de células de mamífero durante las fases de crecimiento y/o producción en un medio de cultivo celular que tiene una concentración de glucosa alta no limitante, de 5 a 15 g/l de glucosa, ya sea combinada en la formulación del medio, complementada a través de alimentaciones en bolos o continuas o ambas. Cuando la densidad de células viables, la viabilidad celular y/o el título alcanzan los niveles deseados, la cantidad de glucosa en el medio de cultivo celular se reduce a una cantidad limitante, de tal manera que en la alimentación del medio de perfusión, por ejemplo, la cantidad de glucosa medida en el medio gastado es de, o justo por encima de, 0 g/l. La tasa de consumo de glucosa se determina mediante la tasa de adición de glucosa y/o la masa del cultivo celular. La glucosa se puede alimentar hasta una cantidad de 3 g/l. En otra forma de realización, la glucosa se alimenta hasta una cantidad de 2-3 g/l. En otra forma de realización más, la glucosa se alimenta hasta una cantidad de 2,5 g/l. En otra forma de realización, la cantidad de glucosa es de 0 g/l.

En combinación con la concentración de glucosa reducida, el medio de cultivo celular contiene o se complementa con galactosa, a una concentración de 10 a 15 g/l. En otra forma de realización la concentración de galactosa es de 11,5 g/l.

Los restos de carbohidratos se describen en el presente documento con referencia a la nomenclatura comúnmente utilizada para oligosacáridos. Se puede encontrar una revisión de la química de los carbohidratos que utiliza esta nomenclatura, por ejemplo, en Hubbard e Ivatt, Ann. Rev. Biochem. 50:555-583 (1981). Esta nomenclatura incluye, por ejemplo, Man, que representa manosa; Gal que representa galactosa; y Glc, que representa glucosa.

Por "cultivo celular" o "cultivo" se entiende el crecimiento y la propagación de células fuera de un organismo multicelular o tejido. Las condiciones de cultivo adecuadas para células de mamífero son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo: Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, Nueva York (1992). Las células de mamífero pueden cultivarse en suspensión o unidas a un sustrato sólido. Se pueden utilizar biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibra hueca, botellas giratorias, matraces de agitación o biorreactores de tanque agitado, con o sin microportadores.

El cultivo de células de mamífero se realiza en un biorreactor. En una forma de realización se utilizan biorreactores de 500 l a 20.000 l. En una forma de realización preferida, se utilizan biorreactores de 1000 l a 2000 l.

El biorreactor se inocula con al menos de 0,5 x 106 a 3,0 x106 o más células viables/ml en un medio de cultivo carente de suero. En una forma de realización preferida, la inoculación es de 1,0 x 106 células viables/ml.

Una vez inoculado el biorreactor de producción, las células de mamífero experimentan una fase de crecimiento exponencial. La fase de crecimiento se puede mantener mediante un proceso semicontinuo con alimentación en bolo de un medio de alimentación carente de suero que tenga de 5 a 8 g/l de glucosa. Estas alimentaciones en bolo complementarias normalmente comienzan poco después de inocular las células en el biorreactor, en un momento en el que se prevé o se determina que el cultivo celular necesita alimentación. Por ejemplo, la alimentación complementaria puede comenzar en, o aproximadamente, el día 3 o 4 de cultivo o uno o dos días antes o después. El cultivo puede recibir dos, tres o más bolos durante la fase de crecimiento. Ni el medio de cultivo celular basal ni el medio de alimentación en bolo contienen galactosa.

Cuando las células entran en la fase estacionaria o de producción, o el cultivo celular ha alcanzado una densidad de células viables y/o un título de células deseados, se interrumpe la alimentación en bolo semicontinua y se inicia la perfusión. El cultivo de perfusión es aquel en el que el cultivo celular recibe medio de alimentación de perfusión nuevo mientras se elimina simultáneamente el medio gastado. La perfusión puede ser continua, por etapas, intermitente o una combinación de cualquiera de las mismas o de todas ellas. Las tasas de perfusión pueden ser desde menos de un volumen de trabajo hasta muchos volúmenes de trabajo por día. Preferentemente, las células se retienen en el cultivo y el medio gastado que se elimina está sustancialmente desprovisto de células o tiene significativamente menos células que el cultivo. La perfusión se puede realizar por varios medios que incluyen centrifugación, sedimentación o filtración; véase, por ejemplo, Voisard et al., (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751-65. Un procedimiento de filtración preferido es la filtración de flujo tangencial alterno. El flujo tangencial alterno se mantiene bombeando el medio a través de módulos de filtro de fibra hueca. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.544.424. Los módulos de fibra hueca pueden ser microfiltros o ultrafiltros.

Cuando el cultivo semicontinuo alcanza un punto de activación predeterminado, tal como una viabilidad celular, una densidad celular, un porcentaje de volumen celular empaquetado, un título, un título ajustado de volumen celular empaquetado, una edad o similares deseados, se produce un cambio entre semicontinuo y perfusión. Por ejemplo, este cambio puede tener lugar en, o aproximadamente, el día 7 del cultivo, pero puede tener lugar uno o dos días antes o después. La formulación de alimentación para perfusión contiene glucosa en una concentración de hasta 15 g/l o más, pero no contiene galactosa. En una forma de realización, el medio de perfusión contiene 15 g/l de glucosa.

Cuando el cultivo de perfusión alcanza un punto de activación predeterminado, tal como una viabilidad celular, una densidad celular, un porcentaje de volumen celular empaquetado, un título, un título ajustado de volumen celular empaquetado, una edad o similares deseados, la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular se reduce. Por ejemplo, este cambio puede iniciarse el día 11 del cultivo, pero puede tener lugar uno o dos días antes o después. En ese momento, el cultivo celular se perfunde con medio de cultivo celular que contiene una concentración inferior de glucosa. Una concentración de glucosa inferior de este tipo dará como resultado una concentración de glucosa inferior medida en el medio gastado de, o casi, 0 g/l. La glucosa se puede alimentar hasta una cantidad de 3 g/l. En otra forma de realización, la cantidad de glucosa es de 2 a 3 g/l. En otra forma de realización más, la cantidad de glucosa es de 2,5 g/l. En otra forma de realización, la cantidad de glucosa es de 0 g/l.

El estado de glucosa limitada en el cultivo celular se mantiene supervisando la concentración de glucosa en el cultivo celular, por ejemplo midiendo la concentración de glucosa en el medio gastado y ajustando la concentración de glucosa en la formulación del medio de perfusión para mantener un nivel de, o casi, 0 g/l en el medio gastado.

El medio de cultivo celular que contiene la concentración inferior de glucosa también puede complementarse con galactosa a una concentración de 10 a 15 g/l. En otra forma de realización la concentración de galactosa es de 11,5 g/l.

El cultivo celular se puede mantener continuamente en un estado de glucosa limitada complementado con galactosa. El cultivo celular se puede mantener en un estado de glucosa limitada complementado con galactosa hasta la recolección. El cultivo celular se puede restaurar a un estado de glucosa no limitada sin suplementos de galactosa y todo el proceso puede comenzar de nuevo.

El cultivo celular también podría mantenerse en un sistema de cultivo de perfusión para las fases tanto de crecimiento como de producción. Una vez inoculadas en el biorreactor de producción, las células de mamífero experimentan una fase de crecimiento exponencial durante la cual el cultivo celular se perfunde con medio de cultivo celular carente de suero y/o químicamente definido complementado con de 5 a 15 g/l de glucosa. El medio de cultivo celular no contiene galactosa. El cultivo se mantiene hasta que se alcanza un punto de activación deseado, por ejemplo, una viabilidad celular, una densidad celular, un porcentaje de volumen celular empaquetado, un título, un título ajustado de volumen celular empaquetado, una edad o similares deseados. En ese momento, el cultivo celular se perfunde con un medio de cultivo celular que contiene una concentración limitante de glucosa. Dicha concentración limitante de glucosa dará como resultado una concentración de glucosa en el medio gastado de, o casi, 0 g/l de glucosa. La glucosa se puede alimentar hasta una cantidad de 3 g/l. En otra forma de realización, la cantidad de glucosa es de 2 a 3 g/l. En otra forma de realización más, la cantidad de glucosa es de 2,5 g/l. En otra forma de realización, la cantidad de glucosa es de 0 g/l.

El medio de cultivo celular que contiene la cantidad limitante de glucosa también puede contener galactosa en una concentración de 10 a 15 g/l. En otra forma de realización la concentración de galactosa es de 11,5 g/l.

Además, el medio de cultivo celular que contiene la cantidad limitante de glucosa también puede contener glutamina además de galactosa. La glutamina se encuentra a una concentración de 1 a 20 mM en combinación con galactosa. En una forma de realización, la concentración de glutamina es de 5 a 10 mM.

La densidad de células viables puede ser una señal para la transición a la fase de producción o para reducir la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular. También puede ser deseable mantener un determinado intervalo o nivel de densidad de células viables durante la fase de producción. En una forma de realización, la densidad de células viables es de 10 x 106 células viables/ml a al menos aproximadamente 60 x 106 células viables/ml. En otra forma de realización, la densidad de células viables es de 10 x 106 células viables/ml a 50 x 106 células viables/ml. En otra forma de realización, la densidad de células viables es de 10 x 106 células viables/ml a 40 x 106 células viables/ml. En una forma de realización preferida, la densidad de células viables es de 10 x 106 células viables/ml a 30 x 106 células viables/ml. En otra forma de realización preferida, la densidad de células viables es de 10 x 106 células viables/ml a 20 x 106 células viables/ml. En otra forma de realización preferida, la densidad de células viables es de 20 x 106 células viables/ml a 30 x 106 células viables/ml. En otra forma de realización preferida, la densidad de células viables es de 20 x 106 células viables/ml a 25 x 106 células viables/ml. En una forma de realización aún más preferida, la densidad de células viables es de al menos aproximadamente 20 x 106 células viables/ml.

El porcentaje de volumen celular empaquetado (%PCV) también se puede usar como una señal para la transición a la fase de producción o para comenzar a alimentar al cultivo celular un medio de cultivo celular que contenga una cantidad limitante de glucosa. El cultivo celular también se puede mantener en un volumen celular empaquetado deseado durante la fase de producción. En una forma de realización, el volumen celular empaquetado es igual o inferior al 30%. En una forma de realización preferida, el volumen celular empaquetado es al menos aproximadamente del 15-30%. En una forma de realización preferida, el volumen celular empaquetado es al menos aproximadamente del 20-25%. En otra forma de realización preferida, el volumen celular empaquetado es igual o inferior al 25%. En otra forma de realización preferida, el volumen celular empaquetado es igual o inferior al 15%. En otra forma de realización preferida, el volumen celular empaquetado es igual o inferior al 20%. En otra forma de realización preferida más, el volumen celular empaquetado es igual o inferior al 15%.

Se puede usar un medio de cultivo celular de perfusión que tenga una concentración reducida de asparagina para detener el crecimiento celular mientras se mantiene la productividad y la viabilidad durante la fase de producción. En una forma de realización preferida, la concentración de asparagina es de al menos aproximadamente 0 mM a al menos aproximadamente 5 mM de asparagina, véase la publicación WIPO N° WO 2013/006479.

Tal como se usa en el presente documento, "caudal de perfusión" es la cantidad de medios que se hacen pasar (añadidos y retirados) a través de un biorreactor, generalmente expresada como alguna porción o múltiplo del volumen de trabajo, en un tiempo dado. "Volumen de trabajo" se refiere a la cantidad de volumen del biorreactor utilizado para el cultivo celular. En una forma de realización, el caudal de perfusión es de un volumen de trabajo o menos por día. El medio de alimentación de perfusión se puede formular para maximizar la concentración de nutrientes de perfusión para minimizar la tasa de perfusión.

Tal como se usa en el presente documento, "densidad celular" se refiere al número de células en un volumen dado de medio de cultivo. "Densidad de células viables" se refiere al número de células vivas en un volumen determinado de medio de cultivo, determinado mediante ensayos de viabilidad convencionales (tales como el procedimiento de exclusión del colorante azul de tripán).

Tal como se usa en el presente documento, "volumen celular empaquetado" (PCV), también denominado "porcentaje de volumen celular empaquetado" (%PCV), es la relación entre el volumen ocupado por las células y el volumen total del cultivo celular, expresado como porcentaje (véase Stettler, et al., (2006) Biotechnol Bioeng. 20 de diciembre: 95 (6): 1228-33). El volumen celular empaquetado es una función de la densidad celular y el diámetro celular; los aumentos en el volumen celular empaquetado podrían producirse mediante aumentos en la densidad celular o en el diámetro celular o ambos. El volumen celular empaquetado es una medida del contenido sólido en el cultivo celular. Los sólidos se eliminan durante la recolección y la purificación posteriores. Más sólidos significan más esfuerzo para separar el material sólido del producto deseado durante las etapas de recolección y purificación posteriores. Además, el producto deseado puede quedar atrapado en los sólidos y perderse durante el proceso de recolección, lo que da como resultado una reducción en el rendimiento del producto. Dado que las células huésped varían en tamaño y los cultivos celulares también contienen células muertas y moribundas y otros desechos celulares, el volumen celular empaquetado es una forma más precisa de describir el contenido sólido dentro de un cultivo celular que la densidad celular o la densidad de células viables.

Para los fines de la presente invención, el medio de cultivo celular es un medio adecuado para el cultivo de células animales, tales como células de mamífero, en cultivo celular in vitro. Las formulaciones de medios de cultivo celular son bien conocidas en la técnica. Por lo general, los medios de cultivo celular se componen de tampones, sales, carbohidratos, aminoácidos, vitaminas y oligoelementos esenciales. "Carente de suero" se aplica a un medio de cultivo celular que no contiene sueros animales, tales como suero bovino fetal. Varios medios de cultivo de tejidos, incluidos los medios de cultivo definidos, están disponibles comercialmente; por ejemplo, se puede usar cualquiera o una combinación de los siguientes medios de cultivo celular: medio RPMI-1640, medio RPMI-1641, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio mínimo esencial de Eagle, medio F-12K, medio F12 de Ham, medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio 5A de McCoy, medio L-15 de Leibovitz y medios carente de suero tales como EX-CELL™ 300 Series (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), entre otros. También están disponibles versiones carentes de suero de dichos medios de cultivo. Los medios de cultivo celular pueden complementarse con concentraciones adicionales o aumentadas de componentes tales como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, tampones, antibióticos, lípidos, oligoelementos y similares, según los requerimientos de las células que se van a cultivar y/o los parámetros de cultivo celular deseados.

Los medios de cultivo celular pueden ser carentes de suero, de proteína y/o de peptona. "Carente de suero" se aplica a un medio de cultivo celular que no contiene sueros animales, tales como suero bovino fetal. "Carentes de proteína" se aplica a los medios de cultivo celular carentes de proteínas añadidas exógenamente, tales como transferrina, factores de crecimiento de proteínas IGF-1 o insulina. Los medios carentes de proteína pueden o no contener peptonas. "Carentes de peptona" se aplica a los medios de cultivo celular que no contienen hidrolizados de proteínas exógenas, tales como hidrolizados de proteínas animales y/o vegetales. Caldo de cultivo celular o terminología similar se refiere al medio de cultivo celular que contiene, entre otras cosas, células de mamífero viables y no viables, metabolitos celulares y desechos celulares tales como ácidos nucleicos, proteínas y liposomas.

Los cultivos celulares también se pueden complementar con un medio de alimentación concentrado que contiene componentes, tales como nutrientes y aminoácidos, que se consumen durante el transcurso de la fase de producción del cultivo celular. El medio de alimentación concentrado puede estar basado en casi cualquier formulación de medio de cultivo celular. Dicho medio de alimentación concentrado puede contener en cualquier parte de uno o casi todos los componentes del medio de cultivo celular, por ejemplo, aproximadamente 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, o incluso aproximadamente 1000X de su cantidad normal, véase, por ejemplo, la publicación WIPO N° WO2012/145682.

El procedimiento según la presente invención puede usarse para mejorar la producción de proteínas recombinantes en procesos de cultivo de múltiples fases. En un proceso de múltiples etapas, las células se cultivan en dos o más fases distintas. Por ejemplo, las células pueden cultivarse en primer lugar en una o más fases de crecimiento, en condiciones ambientales que maximicen la proliferación y la viabilidad celular, después transferirse a una fase de producción, en condiciones que maximicen la producción de proteínas. En un proceso comercial para la producción de una proteína por células de mamífero, comúnmente hay múltiples, por ejemplo, al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, fases de crecimiento que tienen lugar en diferentes recipientes de cultivo precediendo a un cultivo de producción final. Las fases de crecimiento y producción pueden estar precedidas o separadas por una o más fases de transición. En procesos de múltiples fases, el procedimiento según la presente invención puede emplearse al menos durante la fase de crecimiento y producción de la fase de producción final de un cultivo celular comercial, aunque también puede emplearse en una fase de crecimiento anterior. Una fase de producción puede llevarse a cabo a gran escala. Se puede realizar un proceso a gran escala en un volumen de al menos aproximadamente 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10.000, 15.000, 20.000 litros. En una forma de realización preferida, la producción se lleva a cabo en biorreactores de 500 l, 1000 l y/o 2000 l. Una fase de crecimiento puede tener lugar a una temperatura más alta que una fase de producción. Por ejemplo, una fase de crecimiento puede tener lugar a una primera temperatura de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 38 °C, y una fase de producción puede tener lugar a una segunda temperatura de aproximadamente 29 °C a aproximadamente 37 °C, opcionalmente de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 36 °C o de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 34 °C. Además, pueden añadirse inductores químicos de la producción de proteínas, tales como, por ejemplo, cafeína, butirato y hexametilenbisacetamida (HMBA), al mismo tiempo, antes y/o después de un cambio de temperatura. Si se añaden inductores después de un cambio de temperatura, se pueden añadir de una hora a cinco días después del cambio de temperatura, opcionalmente de uno a dos días después del cambio de temperatura. Los cultivos celulares se pueden mantener durante días o incluso semanas mientras las células producen la(s) proteína(s) deseada(s).

Normalmente, los cultivos celulares que preceden al cultivo de producción final (N-x a N-1) se utilizan para generar las células de siembra que se utilizarán para inocular el biorreactor de producción, el cultivo N-1. La densidad de células de siembra puede tener un efecto positivo sobre el nivel de proteína recombinante producida. Los niveles de producto tienden a aumentar con el aumento de la densidad de siembra. La mejora en el título está ligada no solo a una mayor densidad de siembra, sino que probablemente esté influenciada por el estado metabólico y del ciclo celular de las células que se disponen en la producción.

Las células de siembra se pueden producir mediante cualquier procedimiento de cultivo. Un procedimiento preferido es un cultivo de perfusión utilizando filtración de flujo tangencial alterno. Se puede operar un biorreactor N-1 utilizando filtración de flujo tangencial alterno para proporcionar células a alta densidad para inocular un biorreactor de producción. La etapa N-1 se puede utilizar para hacer crecer células a densidades de > 90 x 106 células/ml. El biorreactor N-1 se puede utilizar para generar cultivos de siembra en bolo o se puede usar como un cultivo madre de siembra rodante que podría mantenerse para sembrar biorreactores de producción múltiple a una alta densidad de células de siembra. La duración de la etapa de crecimiento de producción puede oscilar entre 7 y 14 días y puede diseñarse para mantener las células en crecimiento exponencial antes de la inoculación del biorreactor de producción. Las tasas de perfusión, la formulación del medio y la sincronización se optimizan para hacer crecer las células y enviarlas al biorreactor de producción en el estado más propicio para optimizar su producción. Se pueden lograr densidades de células de siembra de > 15 x 106 células/ml para sembrar biorreactores de producción.

Las líneas celulares (también denominadas "células huésped") utilizadas en la invención se modifican por ingeniería genética para que expresen un polipéptido de interés comercial o científico. Las líneas celulares normalmente se derivan de un linaje que surge de un cultivo primario que se puede mantener en cultivo durante un tiempo ilimitado. Modificar por ingeniería genética la línea celular implica transfectar, transformar o transducir las células con una molécula polinucleotídica recombinante y/o alterarlas de otro modo (por ejemplo, mediante recombinación homóloga y activación génica o fusión de una célula recombinante con una célula no recombinante) para hacer que la célula huésped exprese un polipéptido recombinante deseado. Los procedimientos y vectores para modificar por ingeniería genética células y/o líneas celulares para que expresen un polipéptido de interés son bien conocidos por los expertos en la técnica; por ejemplo, varias técnicas se ilustran en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, Nueva York, 1988y actualizaciones trimestrales); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, páginas 15 69.

Las líneas celulares de animales se derivan de células cuyos progenitores se derivaron de un animal multicelular. Un tipo de línea celular de animal es una línea celular de mamífero. Una amplia diversidad de líneas celulares de mamíferos adecuadas para el crecimiento en cultivo están disponibles en la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (Manassas, Va.) y proveedores comerciales. Los ejemplos de líneas celulares comúnmente utilizadas en la industria incluyen VERO, BHK, HeLa, CV1 (que incluye Cos), MDCK, 293, 3T3, líneas celulares de mieloma (por ejemplo, NSO, NS1), PC12, células WI38 y células de ovario de hámster chino (CHO). Las células CHO se utilizan ampliamente para la producción de proteínas recombinantes complejas, por ejemplo, citoquinas, factores de coagulación y anticuerpos (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufmann et al. (1988), J. Biol Chem 263:6352-6362; Mc Kinnon et al. (1991), J. Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol. 145:3011-3016). Las líneas celulares mutantes deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220), DXB11 y DG-44, son líneas de células huésped CHO deseables porque el eficaz sistema de expresión génica seleccionable y ampliable de DHFR permite la expresión de proteínas recombinantes de alto nivel en estas células (Kaufman R. J. (1990), Meth Enzymol 185: 537-566). Además, estas células son fáciles de manipular como cultivos adherentes o en suspensión y muestran una estabilidad genética relativamente buena. Las células CHO y las proteínas expresadas de forma recombinante en las mismas se han caracterizado ampliamente y las agencias reguladoras han aprobado su uso en la fabricación comercial clínica.

Los procedimientos de la invención pueden utilizarse para cultivar células que expresan proteínas recombinantes de interés. Las proteínas recombinantes expresadas pueden secretarse en el medio de cultivo, del que pueden recuperarse y/o recolectarse. Además, las proteínas se pueden purificar totalmente o parcialmente a partir de dicho cultivo o componente (por ejemplo, a partir del medio de cultivo) utilizando procesos y productos conocidos disponibles de proveedores comerciales. A continuación, las proteínas purificadas se pueden "formular", lo que significa que se someten a un intercambio de tampones, se esterilizan, se envasan a granel y/o se envasan para un usuario final. Las formulaciones adecuadas para composiciones farmacéuticas incluyen las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Tal como se utilizan en el presente documento, "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente a lo largo de todo el documento y se refieren a una molécula que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Los péptidos, polipéptidos y proteínas también incluyen modificaciones que incluyen, pero sin limitación, glicosilación, unión lipídica, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación. "Glicoproteína" se refiere a péptidos, polipéptidos y proteínas que tienen al menos una cadena lateral de oligosacárido que incluye residuos de manosa. Las glicoproteínas pueden ser homólogas a la célula huésped, o pueden ser heterólogas, es decir, extrañas, a la célula huésped que se utiliza, tal como, por ejemplo, una glicoproteína humana producida por una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO). Los polipéptidos pueden ser de interés científico o comercial, incluidos fármacos basados en proteínas. Los polipéptidos incluyen, entre otras cosas, anticuerpos, proteínas de fusión y citoquinas. Los péptidos, polipéptidos y proteínas se producen por líneas celulares de animales recombinantes utilizando procedimientos de cultivo celular y pueden denominarse "péptido recombinante", "polipéptido recombinante" y "proteína recombinante". La(s) proteína(s) expresada(s) puede(n) producirse intracelularmente o secretarse en el medio de cultivo, del que puede recuperarse y/o recolectarse.

Los ejemplos de polipéptidos que se pueden producir con los procedimientos de la invención incluyen proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas o sustancialmente similares a la totalidad o parte de una de las siguientes proteínas: factor de necrosis tumoral (TNF), ligando flt3 (documento WO 94/28391), eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, IL-2, angiopoyetina-2 (Maisonpierre et al. (1997), Science 277 (5322): 55-60), ligando para receptor activador de NF-kappa B (RANKL, documento WO 01/36637), ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL, documento WO 97/01633), linfopoyetina derivada del estroma tímico, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, patente australiana N° 588819), factor de crecimiento de mastocitos, factor de crecimiento de células madre (patente de Estados Unidos N° 6.204.363), factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos, RANTES, proteína similar a fibrinógeno humana 2 (FGL2; número de acceso de NCBI NM_00682; Rüegg y Pytela (1995), Gene 160:257-62) hormona del crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similares a la insulina, hormona paratiroidea, interferones, incluidos los interferones a, interferón y e interferones de consenso (patentes de Estados Unidos N° 4.695.623 y 4.897471), factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado del cerebro, proteínas similares a la sinaptotagmina (SLP 1-5), neurotrofina-3, glucagón, interleucinas, factores estimulantes de colonias, linfotoxina-p, factor inhibidor de la leucemia y oncostatina-M. Las descripciones de otras glicoproteínas se pueden encontrar en, por ejemplo, Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, todos los volúmenes (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay y Leigh, eds., Oxford University Press Inc., Nueva York, 1993); y The Cytokine Handbook, Volúmenes 1 y 2 (Thompson and Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003).

Además, los procedimientos de la invención serían útiles para producir proteínas que comprenden la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de un receptor para cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente, un antagonista de dicho receptor o cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente, y/o proteínas sustancialmente similares a dichos receptores o antagonistas. Estos receptores y antagonistas incluyen: ambas formas del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR, denominado p55 y p75, patente de Estados Unidos N° 5.395.760 y patente de Estados Unidos N° 5.610.279), receptores de interleucina-1 (IL-1) (tipos I y II; patente EP N° 0460846, patente de Estados Unidos N° 4.968.607 y patente de Estados Unidos N° 5.767.064), antagonistas de los receptores de IL-1 (patente de Estados Unidos N° 6.337.072), antagonistas o inhibidores de IL-1 (patentes de Estados Unidos N° 5.981.713, 6.096.728 y 5.075.222), receptores de IL-2, receptores de IL-4 (patente EP N° 0 367 566 y patente de Estados Unidos N° 5.856.296), receptores de IL-15, receptores de IL-17, receptores de IL-18, receptores de Fc, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos, receptores para oncostatina-M y factor inhibidor de la leucemia, receptor activador de NF-kappa B (RANK, documento WO 01/36637 y patente de Estados Unidos N° 6.271.349), osteoprotegerina (patente de Estados Unidos N° 6.015.938), receptores para TRAIL (incluidos los receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4) y receptores que comprenden dominios de muerte, tales como Fas o el receptor inductor de apoptosis (AIR).

Otras proteínas que se pueden producir utilizando la invención incluyen proteínas que comprenden la totalidad o parte de las secuencias de aminoácidos de antígenos de diferenciación (denominados proteínas CD) o sus ligandos o proteínas sustancialmente similares a cualquiera de las mismas. Dichos antígenos se divulgan en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japón, 1996). Proteínas CD similares se divulgan en seminarios posteriores. Los ejemplos de dichos antígenos incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 y ligandos de los mismos (ligando de CD27, ligando de CD30, etc.). Varios de los antígenos CD son miembros de la familia de receptores TNF, que también incluye 41BB y OX40. Los ligandos son a menudo miembros de la familia TNF, al igual que el ligando de 41BB y el ligando de OX40.

También pueden producirse proteínas enzimáticamente activas o sus ligandos por medio de la invención. Los ejemplos incluyen proteínas que comprenden la totalidad o parte de una de las siguientes proteínas o sus ligandos o una proteína sustancialmente similar a una de las mismas: una desintegrina y miembros de la familia de dominios de metaloproteinasas que incluyen la enzima convertidora de TNF-alfa, varias quinasas, glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa, activador tisular del plasminógeno, factor VIII, factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, un antagonista de IL-2, alfa-1 antitripsina, ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente y muchas otras enzimas y sus ligandos.

El término "anticuerpo" incluye la referencia a inmunoglobulinas de cualquier isotipo o subclase o a una región de unión a antígeno del mismo que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica, a menos que se especifique lo contrario, incluidos los humanos, humanizados, quiméricos, multiespecíficos, monoclonales, policlonales y oligómeros o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. También se incluyen proteínas que tienen un fragmento o región de unión a antígeno tales como Fab, Fab', F(ab')², Fv, diacuerpos, Fd, dAb, maxicuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenarias, fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir una unión a antígeno específica a un polipéptido diana. El término "anticuerpo" incluye, pero sin limitación, aquellos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula huésped transfectada para expresar el anticuerpo.

Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero sin limitación, aquellos que reconocen una cualquiera o una combinación de proteínas, incluidas, pero sin limitación, las proteínas mencionadas anteriormente y/o los antígenos siguientes: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), ^cD147, IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL- 3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, subunidades del receptor de IL-18, FGL2, PDGF-p y sus análogos (véanse las patentes de Estados Unidos N° 5.272.064 y 5.149.792), VEGF, TGF, TGF-p2, TGF-p1, receptor de EGF (véase la patente de Estados Unidos N° 6.235.883) receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, estimulador de linfocitos B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1 y zTNF4; véase Do y Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25), complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con cáncer de pulmón), HER-2, HER-3, una glicoproteína asociada a tumores TAG-72, el antígeno SK-1, epítopos asociados a tumores que están presentes en niveles elevados en el suero de pacientes con cáncer de colon y/o de páncreas, epítopos o proteínas asociados a cáncer expresados en células de cáncer de mama, de colon, de células escamosas, de próstata, de páncreas, de pulmón y/o de riñón y/o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, receptores de TRAIL 1,2, 3, y 4, RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3), leucointegrina adhesina, glicoproteína plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-factor tisular), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos), receptor de Fc-y-1, HLA-DR 10 beta, antígeno de HLA-DR, esclerostina, L-selectina, virus respiratorio sincitial, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), Streptococcus mutans, y Staphlycoccus aureus. Los ejemplos específicos de anticuerpos conocidos que se pueden producir utilizando los procedimientos de la invención incluyen, pero sin limitación, adalimumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, eculizumab, gemtuzumab ozogamicina, golimumab, ibritumomab tiuxetan, labetuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, rovelizumab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab y zanolimumab.

La invención se puede utilizar para producir proteínas de fusión recombinantes que comprenden, por ejemplo, cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, se pueden producir proteínas de fusión recombinantes que comprenden una de las proteínas mencionadas anteriormente más un dominio de multimerización, tal como una cremallera de leucina, una hélice enrollada, una porción Fc de una inmunoglobulina o una proteína sustancialmente similar, utilizando los procedimientos de la invención. Véanse, por ejemplo, el documento WO94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hákansson et al. (1999), Structure 7:255-64. Específicamente incluidas entre dichas proteínas de fusión recombinantes se encuentran las proteínas en las que una porción de un receptor se fusiona con una porción Fc de un anticuerpo tal como etanercept (un p75 TNFR:Fc) y belatacept (CTLA4:Fc). En otra forma de realización son conjugados de anticuerpo-fármaco.

Si bien la terminología utilizada en la presente solicitud es la convencional dentro de la técnica, se proporcionan en el presente documento definiciones de determinados términos para garantizar la claridad y la precisión del significado de las reivindicaciones. Las unidades, los prefijos y los símbolos pueden indicarse en su forma del SI aceptada Los intervalos numéricos mencionados en el presente documento incluyen los números que definen el intervalo e incluyen y respaldan cada número entero dentro del intervalo definido. A menos que se indique lo contrario, los términos "un" o "una" deben interpretarse en el sentido de "al menos uno de". Los encabezamientos de las secciones se utilizan en el presente documento con fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del objeto descrito. Los procedimientos y técnicas descritos en el presente documento se realizan generalmente según procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y se comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990).

El alcance de la presente invención no está limitado por las formas de realización específicas descritas en el presente documento, que pretenden ser simples ilustraciones de aspectos individuales de la invención.

Los siguientes ejemplos demuestran formas de realización y aspectos de los procedimientos divulgados y no pretenden ser limitantes.

Ejemplos

Se aborda la sustitución de glucosa por especies alternativas de carbohidratos dentro de un sistema de biorreactor con el fin de manipular el contenido de glicoformas de alta manosa y la calidad general de la proteína.

Ejemplo 1

Cultivo semicontinuo con alimentación continua de glucosa y alimentación en bolo de galactosa

Los efectos de la glucosa reducida y una fuente de carbono alternativa en el crecimiento del cultivo celular, el título y la calidad del producto, en particular los niveles de Man5, se evaluaron por medio de análisis de diferentes concentraciones de glucosa y galactosa mediante un proceso semicontinuo. El objetivo del experimento era reducir la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo celular, proporcionando al mismo tiempo una fuente de carbono diferente por medio de una alimentación de galactosa.

Se inocularon doce biorreactores Applikon de 2 l con células CHO que expresan un anticuerpo IgG2 recombinante a 20e5 células viables/ml en un volumen de trabajo de 1 l de un medio de cultivo celular carente de suero. Los cultivos se mantuvieron a 36 °C, oxígeno disuelto (OD) al 30%, agitación a 290 rpm y pH de 6,95. Se alimentó un suplemento de tirosina-cistina los días 2 y 5, volumétricamente al 0,36% basándose en el volumen inicial. Se añadieron CO²y base de carbonato de sodio 1 M según fuera necesario para el control del pH.

La alimentación en bolo de los medios de cultivo se realizó los días 2, 5 a 9, volumétricamente basándose en el 9% del volumen inicial.

Se eligió un diseño de experimento de dos factores para evaluar el rendimiento del cultivo celular y los atributos de calidad del producto con cantidades variables de glucosa y galactosa en el medio de cultivo celular. El diseño del experimento consistió en 6 tratamientos, biorreactores duplicados para cada tratamiento tal como se muestra en la tabla 1. El primer factor fue la alimentación continua de glucosa (glucosa continua) para administrar 3, 2 o 1 g/día de glucosa a partir del día 2. Los tratamientos con 3 g/día de glucosa también recibieron alimentaciones de glucosa en bolo adicionales para mantener la concentración de glucosa a 3 g/l. El propósito era asegurar que los tratamientos de 3 g/día se mantuvieran como controles positivos, no teniendo nunca una limitación de glucosa.

El segundo factor fue la alimentación en bolo con (1+, 2+, 3+) y sin (1-, 2-, 3-) galactosa (bolo de galactosa). El objetivo era mantener la concentración de galactosa en los medios de cultivo celular por encima de 4 g/l a partir del día 2.

Tabla 1: Diseño experimental de 2 factores para el experimento semicontinuo

Durante el desarrollo del cultivo, se tomaron muestras diarias para evaluar el cultivo. La densidad de células viables (VCD) y la viabilidad se determinaron a escala de laboratorio utilizando Vi-C₆ll (Beckman Coulter, Brea, CA). El volumen celular empaquetado se determinó utilizando VoluPAC (Sartorius, Goettingen, Alemania). El pH, el dióxido de carbono disuelto (pCO₂) y el oxígeno disuelto (pO₂) se determinaron utilizando un analizador de gases en sangre (BGA) Siemens 248 (Chiron Diagnostics, CA). La concentración de galactosa se obtuvo utilizando un analizador de bioquímica YSI modelo 2700 Select (YSI Incorporated, Yellow Springs, OH). Los datos de metabolitos (glucosa, lactato y amoniaco) se obtuvieron utilizando un analizador Polymedco Polychem (Polymedco Inc., Cortland Manor, NY). La osmolalidad se determinó utilizando un microosmómetro Advanced Instruments modelo 2020 (Advanced Instruments, Norwood, MA). Las muestras de sobrenadante se almacenaron a -80 °C. Al final de los experimentos, las muestras de sobrenadante carentes de células congeladas se descongelaron y se sometieron colectivamente a análisis de título y de glicano.

El título se determinó utilizando análisis por HPLC. Las muestras de sobrenadante de cultivo celular de diferentes puntos temporales se descongelaron y se volvieron a filtrar en una placa de 96 pocillos con una membrana de 0,2 gm. Las muestras se inyectaron en un sistema HPLC (Hewlett Packard 1100) equipado con detección UV a 280 nm utilizando una columna Poros® N20 de 2,1 mm D x 30 mm L (Applied Biosystems, Foster City, CA) a un caudal de 2 ml/min. Se usó un procedimiento en gradiente utilizando como fase móvil fosfato de sodio 100 mM/clorito de sodio 250 mM y ácido acético al 2%/glicina 100 mM para eluir cada muestra de proteína durante cada 5 min.

Para el análisis de glicanos, las muestras de sobrenadante de cultivos celulares se recolectaron y se purificaron mediante proteína A. Las muestras purificadas se trataron con PNGasa-F y se incubaron a 37 °C durante 2 horas para liberar los glicanos N-enlazados. Los glicanos liberados enzimáticamente se marcaron con ácido 2-aminobenzoico (2-AA) a 80 °C durante 75 minutos. A continuación, se eliminó el exceso de marcador 2-AA con un cartucho Glycoclean S. Las muestras se evaporaron durante la noche y el sedimento seco resultante se reconstituyó con agua para el posterior análisis por HILIC (cromatografía líquida de interacción hidrófila). Los glicanos se inyectaron y se unieron a la columna en condiciones altamente orgánicas y se eluyeron con un gradiente creciente de un tampón de formiato de amonio acuoso. Se usó detección de fluorescencia para supervisar la elución de glicanos y se calculó el porcentaje relativo de las especies de glicanos principales y secundarias.

Resultados del proceso semicontinuo con alimentación continua de glucosa y alimentación en bolo de galactosa.

Los tratamientos de cultivo celular que recibieron 3 g/día de alimentación continua de glucosa (procesos 720, 721,726 y 729), también recibieron alimentación en bolo de glucosa para mantener su nivel por encima de 3 g/l. Los procesos 720 y 726, que no recibieron alimentación en bolo de galactosa, requirieron rutinariamente alimentaciones en bolo de glucosa, mientras que los procesos que recibieron galactosa (procesos 721 y 729) no requirieron alimentaciones en bolo de glucosa con tanta frecuencia. Los cultivos celulares que recibieron 1 o 2 g/día de alimentación continua de glucosa no recibieron ninguna alimentación adicional en bolo de glucosa. El análisis de los medios gastados de estos cultivos mostró que la concentración de glucosa era de 0 g/l el día 4 independientemente de si el cultivo recibió o no alimentaciones en bolo de galactosa. (Figura 1A).

Los cultivos celulares que recibieron alimentaciones en bolo de galactosa (procesos 721, 723, 725, 727, 729 y 730) mantuvieron los niveles de galactosa por encima de 2,5 g/l, aunque el objetivo original se encontraba por encima de 4 g/l. (Figura 1B) Cuando se analizaron las cifras de consumo de galactosa, se encontró que había una diferencia estadísticamente significativa en la cantidad de galactosa que consumían los cultivos para los cultivos con glucosa limitada (procesos que recibieron 2 g/día o 1 g/día de glucosa continua) o sin glucosa limitada (procesos que recibieron alimentación continua de glucosa de 3 g/día más alimentación en bolo de glucosa). Los cultivos con glucosa limitada consumieron un promedio de 4,60 gramos de galactosa total, mientras que aquellos sin limitación de glucosa consumieron un promedio de 3,81 gramos.

Las alimentaciones continuas de glucosa y las alimentaciones en bolo de galactosa tuvieron un efecto significativo sobre la densidad de células viables y la viabilidad. Los cultivos con glucosa limitada (procesos que recibieron 2 g/día 0 1 g/día de alimentación continua de glucosa), junto con una alimentación en bolo de galactosa, mantuvieron unas buenas densidad de células viables y viabilidad. Sin embargo, los cultivos con glucosa limitada (procesos que recibieron 2 g/día o 1 g/día de alimentación continua de glucosa) que no recibieron alimentación en bolo de galactosa no pudieron mantener la densidad de células viables y la viabilidad una vez que la glucosa alcanzó un límite el día 4. (Figuras 1C y 1D).

Los datos anteriores indicaron que la galactosa podría usarse como una fuente de carbono alternativa cuando la glucosa estaba limitada en el medio de cultivo celular. Aunque los cultivos con glucosa limitada (procesos que recibieron 2 g/día o 1 g/día de alimentación continua de glucosa), junto con alimentación en bolo de galactosa, mantuvieron unas buenas densidad de células viables y viabilidad, el título se redujo significativamente en comparación con aquellos cultivos sin limitación de glucosa (procesos que recibieron alimentación continua de glucosa de 3 g/día), véase la figura 1E. El análisis estadístico mostró que el nivel de alimentación continua de glucosa tuvo el mayor efecto sobre el título; la alimentación en bolo de galactosa también fue significativa, pero en menor grado.

Los niveles de Man5 en las muestras del día 7 se redujeron en proporción al aumento de alimentación de glucosa de 1 g/día a 3 g/día independientemente de si había alimentación de galactosa. La glucosa limitada fue el único factor estadísticamente significativo que dio como resultado un aumento de Man5 en cultivo. (Figura 1F).

Ejemplo 2

Proceso de perfusión con glucosa limitada, galactosa como fuente alternativa de carbono y adición de glutamina

El estudio semicontinuo anterior mostró que la glucosa limitante fue el único factor que dio como resultado un aumento de Man5; sin embargo, los cultivos con glucosa limitada no pudieron mantener una densidad de células viables o viabilidad celular. La fuente de carbono alternativa, la galactosa, no dio como resultado un aumento de Man5, pero fue catabolizada por las células CHO y mantuvo una buena densidad de células viables y viabilidad celular en aquellos cultivos a los que se añadió. Sin embargo, el título se redujo significativamente con niveles de glucosa limitados incluso con la presencia de una fuente de carbono alternativa. Lograr una calidad de producto deseable sin una mejora significativa en el título no es comercialmente viable, que es el mismo caso que lograr una mejora significativa en el título sin una calidad de producto comparable.

Para lograr los objetivos de mantener o mejorar el título y lograr la calidad deseada del producto, se analizaron los efectos de la glucosa baja y una fuente alternativa de carbono sobre el rendimiento del cultivo celular y los niveles de Man5 en un cultivo celular de perfusión. El diseño del experimento consistió en 3 tratamientos, biorreactores duplicados para cada tratamiento.

El día 0, se inocularon células CHO que expresaban un anticuerpo IgG2 recombinante en biorreactores de producción de 3 l a 1 x 106 células viables/ml en un volumen de trabajo de 1300 ml de un medio de cultivo celular definido carente de suero que contenía 5-8 g/l de glucosa. Los cultivos se mantuvieron a 36 °C, oxígeno disuelto al 30%, agitación a 400 rpm. El cultivo se cultivó en modo discontinuo durante tres días. La concentración de glucosa en el análisis del medio gastado osciló entre 1 y 8 g/l.

Los días 3 y 6, el cultivo recibió alimentación en bolo de un medio de alimentación definido carente de suero concentrado, volumen de trabajo inicial del 8% el día 3 y volumen de trabajo inicial del 8% el día 6. Las alimentaciones de glucosa en bolo se realizaron los días 3, 4, 5, 6, 7 para mantener una concentración diana de 8 g/l de glucosa en el cultivo. La glucosa en el análisis del medio gastado osciló entre 1 y 8 g/l.

La perfusión se inició el día 7 a una velocidad de perfusión de 0,48 vol/día. La perfusión se realizó utilizando un sistema de perfusión y filtración de flujo tangencial alterno (Refine Technologies, Hanover, NJ) con un filtro de fibra hueca de 30 kDa (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). El medio de perfusión definido carente de suero, pH 7,0, contenía 15 g/l de glucosa. La glucosa en el análisis del medio gastado osciló entre 3 y 8 g/l.

El día 11 se realizó el cambio a un medio de perfusión definido carente de suero que ahora contenía galactosa y que tenía una cantidad reducida de glucosa, véase la tabla 2a. La concentración de glucosa en el medio de perfusión se redujo a 2 g/l o 4 g/l. La galactosa estaba combinada en el medio a 6 g/l. Se usaron alimentaciones en bolo de una solución madre de galactosa al 30% según fuera necesario para mantener la galactosa a una concentración de 4 g/l o superior en el cultivo celular.

Para este experimento, el medio de cultivo de perfusión también incluyó glutamina 5 o 10 mM para determinar si la glutamina, como la glucosa, tenía algún efecto sobre la densidad de células viables, la viabilidad celular, el título y/o los niveles de Man5 en una situación de limitación de glutamina. La literatura sugería que bajas concentraciones de glutamina podrían tener un efecto negativo sobre el cultivo celular. Los cultivos se perfundieron con este medio de cultivo celular hasta la recolección el día 17.

Tabla 2a: Concentración de glucosa, galactosa y glutamina en el medio de cultivo de perfusión definido carente de suero el día 11 (pH 7,0)

Los perfiles de cultivo celular se muestran en la figura 2. Los perfiles de densidad de células viables y de viabilidad muestran tendencias comparables (figuras 2A y 2B). La viabilidad de las condiciones de glucosa baja (2 g/l) y glutamina baja (5 mM) mostraron una tendencia a la baja entre los días 15 y 17. Sin embargo, la concentración de glutamina en el análisis de los medios gastados indicó que la glutamina no estaba limitada en ninguna de las condiciones sometidas a ensayo (figura 2C).

El hallazgo sorprendente fue que el título ajustado de volumen celular empaquetado (título de PCV) que se muestra en la figura 2D estaba cerca de los valores observados para un proceso de perfusión que no estaba limitado en glucosa. El título de los experimentos de perfusión en este ejemplo fue muy superior al observado en el proceso semicontinuo del ejemplo 1, que solo produjo un título del 50%. Estos datos indican que las células muestran un estado fisiológico diferente cuando la glucosa se limita en un proceso de perfusión que en un proceso semicontinuo.

El análisis de medios gastados muestra que la concentración de glucosa en los sobrenadantes de cultivo tratados con 2 g/l de glucosa en el medio de perfusión llegó a cero el día 12 y la concentración de glucosa en los sobrenadantes de cultivo tratados con 4 g/l de glucosa llegó a cero el día 13, excepto para el proceso 83 (figura 2E). El análisis de medios gastados confirmó que los cultivos se encontraban en un estado de glucosa limitada.

En general, la concentración de galactosa en cultivo determinada por el análisis de medios gastados se mantuvo por encima de 4 g/l (figura 2F).

La tabla 2b muestra que las especies de Man5 aumentaron cuando la concentración de glucosa en el medio de perfusión se redujo a 2 g/l. Los datos del transcurso temporal muestran que la especie Man5 aumentó al aumentar la duración del cultivo (de día 15 a día 17). En igualdad de condiciones, cuando la concentración de glucosa en el medio de perfusión se aumentó a 4 g/l, las especies de Man5 disminuyeron en consecuencia. Estos resultados indican que la glucosa limitante dio como resultado un aumento en los niveles de Man5 y que el estado limitado podría iniciarse reduciendo la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular de perfusión a 2 g/l o inferior y confirmando con análisis de medios gastados. Sin embargo, la variación del proceso y la masa celular pueden afectar a la limitación de glucosa y a la modificación en las especies de Man5. El proceso 83 mostró un valor de Man5 más alto que cualquier otro proceso que recibió glucosa a 4 g/l. En este caso, el proceso 83 tuvo una densidad de células viables y un título ajustado de volumen celular empaquetado superiores (figuras 2A y 2D) a cualquiera de los cultivos que recibieron 2 g/l de glucosa (procesos 79 y 81), pero al igual que los procesos 79 y 81, alcanzó una concentración de glucosa inferior a la medida por el análisis del medio gastado el día 12. Esto fue antes que cualquier cultivo que recibiera glucosa a 4 g/l (figura 2E). Por lo tanto, factores tales como la masa celular y/o la variación del proceso pueden afectar a la concentración de alimentación de glucosa, lo que da como resultado una situación de glucosa limitada. En este caso, en el que la densidad celular fue superior el día 12 (figura 2A), lo que llevó a una concentración de glucosa cercana a 0 g/l en el medio gastado, se inició un estado de glucosa limitada a pesar de que el cultivo celular se alimentó con un medio de alimentación de perfusión de alta glucosa (4 g/l). Una vez se limitó la glucosa, los niveles de Man5 aumentaron.

Tabla 2b: % de Man5 los días 15 y 17 después del cambio en la formulación del medio de perfusión el día 11

Ejemplo 3

Proceso de perfusión con una combinación de glucosa reducida y alta galactosa

Se realizó un experimento con un medio de perfusión definido carente de suero (pH 7,0) formulado con glucosa a concentraciones de 0, 1,5 o 3 g/l. Se añadió galactosa a 10, 11,5 o 13 g/l, basándose en la tasa de consumo total del experimento descrito anteriormente. Tanto la glucosa como la galactosa se combinaron en medios de perfusión para que el cultivo pudiera mantenerse sin alimentación en bolo de glucosa o galactosa. La composición redujo la complejidad del proceso y mejoró la regularidad. El experimento se realizó tal como se ha descrito anteriormente; utilizando las mismas estrategias de alimentación en los días 0 a 10. La tabla 3 proporciona las combinaciones de formulaciones de medio de perfusión utilizadas en los días 11 a 17.

Tabla 3: Diseño de experimentos de glucosa y galactosa en medios de perfusión

Los perfiles de cultivo celular en la figura 3 muestran que todas las condiciones de cultivo celular sometidas a ensayo eran de glucosa limitada después del cambio del día 11 (figura 3A) y las concentraciones de galactosa medidas en el ensayo del medio gastado se mantuvieron entre 4 y 8 g/l (figura 3B) que eran proporcionales a las concentraciones de galactosa combinadas en el medio de perfusión. El nivel de lactato descendió a cero una vez que la glucosa alcanzó un límite el día 12 (figura 3C). El nivel de amoniaco aumentó a partir del día 10, antes de que la glucosa alcanzara una limitación (figura 3D). Fue muy interesante observar que la reducción de la concentración de glucosa a partir del día 11 dio como resultado un crecimiento, una viabilidad y un título inferiores (figuras 3E-3G). Estos resultados indican que la glucosa limitada, no la limitación de glutamina, provoca una reducción del título en un proceso de perfusión, así como en el proceso semicontinuo del ejemplo 1. Además, dado que los niveles de glucosa de 2-3 g/l, e incluso hasta 4 g/l, dieron como resultado el aumento de los niveles de Man5, los niveles de glucosa también ayudaron a mantener niveles de títulos superiores.

El análisis estadístico utilizando el programa informático JMP (JMP Inc. Cary, NC) reveló que la concentración de glucosa era el único factor estadísticamente significativo (valor de p = 0,032) que afectaba al título. La galactosa no fue un factor estadísticamente significativo para el título (figura 4A). Por otra parte, ni la glucosa ni la galactosa fueron factores estadísticamente significativos que afectaron a las especies de Man5, pero la interacción entre la glucosa y la galactosa fue estadísticamente significativa (valor de p = 0,0613). (Figura 4B). Cuanto mayor sea la concentración de galactosa, mayor será el efecto de la glucosa limitada sobre especies de Man5.

En general, los niveles de Man5 aumentaron y se estabilizaron cuando la glucosa osciló entre 0 y 3 g/l y disminuyeron cuando los niveles de glucosa eran de 4 g/l o superiores. La figura 5 muestra el aumento en el porcentaje de especies de Man5 los días 11, 13, 15 y 17. Para todas las condiciones de cultivo, el porcentaje de especies de Man5 comenzó en aproximadamente el 2% el día 11 y después aumentó gradualmente a más del 10% el día 17. El aumento más significativo en el porcentaje de especies de Man5 fue los días 11 a 13 cuando la glucosa llegó a estar limitada.

Dado que la glucosa afecta el título, la glucosa debe alimentarse a la concentración más alta que aún permita un aumento en Man5 mientras se mantiene la viabilidad celular, la densidad y el título a un nivel aceptable, según las condiciones del cultivo celular, tales como la masa celular, el proceso de cultivo celular y la fuente alternativa de carbono utilizada. Por ejemplo, para un cultivo celular de perfusión que tenga de 15 a 25 x 106 células/ml, concentraciones de glucosa de 0-4 g/l en combinación con galactosa a 10-13 g/l dieron como resultado un aumento de Man5.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la modulación de mañosa 5 en una proteína recombinante durante un proceso de cultivo células de mamífero que comprende limitar la cantidad de glucosa en el medio de cultivo celular, en el que la concentración de glucosa es de aproximadamente 0 a 3 g/l, y complementar el medio de cultivo celular con galactosa, en el que la concentración de galactosa es de 10-15 g/l, y en el que el proceso de cultivo celular es un proceso de perfusión.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular es suficiente para dar como resultado una concentración de glucosa en el medio gastado de, o de aproximadamente, 0 g/l.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular es de 1 a 3 g/l.

4. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular es de 2 a 3 g/l.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular es de 2,5 g/l.

6. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la concentración de glucosa en el medio de cultivo celular es de 0 g/l.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en el que la concentración de galactosa en el medio de cultivo celular es de 10 a 12 g/l.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en el que la concentración de galactosa en el medio de cultivo celular es de 11,5 g/l.

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la cantidad limitante de glucosa se añade durante una fase de producción.

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que las células de mamífero son células de ovario de hámster chino (CHO).

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la proteína recombinante se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, una proteína de fusión recombinante o una citoquina.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además una etapa de recolección de la proteína recombinante producida por el cultivo celular.

13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, en el que la proteína recombinante producida por el cultivo celular se purifica y se formula en una formulación farmacéuticamente aceptable.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 -13, en el que la producción de proteína recombinante en la especie manosa 5 se incrementa en comparación con un cultivo en el que las células no se someten a glucosa limitada en combinación con galactosa.

15. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el medio de cultivo celular contiene glutamina en el intervalo de 1 a 20 mM o en el intervalo de 5 a 10 mM.

16. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la perfusión se realiza mediante flujo tangencial alterno.

17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que la perfusión se realiza mediante flujo tangencial alterno utilizando un ultrafiltro o un microfiltro.

18. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y 12-17, en el que la proteína recombinante es un anticuerpo.

19. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que la proteína recombinante se selecciona del grupo de anticuerpos que consiste en: adalimumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, eculizumab, gemtuzumab ozogamicina, golimumab, ibritumomab tiuxetan, labetuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, rovelizumab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab y zanolimumab.