TR201815892T4 - Rekombinant proteinlerin mannoz içeriğinin arttırılmasına yönelik yöntemler. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, rekombinant proteinlerin mannoz içeriğinin ayarlanmasına yönelik yöntemler ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME REKOMBINANT PROTEINLERIN MANNOZ IÇERIGININ AR1TIRILMASINA YÖNELIK YÖNTEMLER ÖNCEKI TEKNIK Memeli hücre kültürlerinde üretilen IgG antikorlarEIMannozS (Man5), Mannozö (Man6), glikoformlarII çesitli seviyelerini içerebilmektedir. Terapötik proteinler ve antikorlarI yüksek mannoz glikoform içerigi, belirli terapötik antikorlarI farmakokinetik özelliklerini etkilediginin bulunmasEok önemli bir kalite niteligidir (Goetze, ve ark, (2011) Glycobiology Çin hamster yumurtaIIKI (CHO) konak hücresi tarafIan eksprese edilen bir antikorun glikoformlarü hücre dizi olusumu ve klon seçimi sßsIa büyük oranda belirlenmektedir.

Bununla birlikte, HM içerigi, hücre kültürü kosullarIan etkilenebilmektedir (Pacis, ve ark., degisiklikleri, ölçek büyütme, gelistirmeler veya mevcut antikor kalite niteliklerinin eslestirilmesi ihtiyacIan dolayÇlbir antikor ürünü için HM içeriginin istenen bir araliglll arastEllEîasDyayglEdB Simdiye kadar, hücre kültüründe bir antikorun HM içeriginin yönlendirilmesine yönelik uygulanan yöntemler, ortam bilesimleri, ozmolalite, pH, lelakllEl ve ark, yukari, Pacis ve ark, yukari, Chee Furng Wong ve ark, (2005) Biotechnol Bioeng hücre dizileri, molekül türü ve ortam içinde bulunan sartlar için spesifiktir. Ilave olarak, bu yöntemler, antikor üretkenligi, hücre kültür davranlSElve diger antikor kalite niteliklerinin ayrlaa degistirilmesine meyillidir. Bu yöntemlerin etkililigi, deneysel olarak elde edilmektedir.

Bu yüzden, terapötik proteinler ve antikorlarI yüksek mannoz glikoform içeriginin ayarlanmaslîliçin bir yönteme ihtiyaç vardlE Bulus, bir alternatif karbon kaynagEIile kombinasyon halinde sIlîlllZl glikoz araclllljllsîla yüksek mannoz glikoform içeriginin arttlEIlBrasI yönelik bir yöntem saglamaktadß BU LUSUN KISA AÇIKLAMASI Bulus, 5 ila 8 g/L glikoz içeren bir serumsuz belirlenen kültür ortamEille bir biyoreaktörde bir memeli hücresi kültürünün olusturulmasIES ila 8 g/L glikoza sahip bir serumsuz belirlenen besleme ortamII kapsül beslemeleri ile hücre kültürünün bir büyüme fazElve takviyesi süsia memeli hücrelerin büyümesini; 5 ila 15 g/L glikoza sahip bir serumsuz perfüzyon ortam ile perfüzyon araclIEglýla hücre kültüründe bir üretim fazII baslatllüiasllîlüretim fazü slüsia daha önceden belirlenmis bir zaman noktasIa azaltllîhlgbir miktarda glikoz içeren veya glikoz ile takviye edilmis bir düsük glikoz perfüzyon ortamEliIe hücre kültürünün serpilmesiyle sIlHlaylEElkonsantrasyonlara glikoz konsantrasyonunun düsürülmesini içeren memeli hücre kültürü süleUa bir rekombinant protein üzerinde bir veya daha fazla yüksek mannoz glikan türlerinin ayarlanmalela yönelik bir yöntem saglamaktadß burada söz konusu perfüzyon ortamüyrlîla galaktoz içermektedir veya galaktoz ile takviye edilmektedir.

Bir yapllândlîilnada, glikozun azaltllüilgl miktarÇlyaklasllZl 0 g/L'de tüketilmis ortamda glikozun bir konsantrasyonuyla sonuçlanmaslîçin yeterlidir.

Bir yapllândlünada, düsük glikoz perfüzyon ortamIa azaltHBiEl glikoz miktarII konsantrasyonu, 0 ila 3 g/L'dir. Bir yapllândlElnada, düsük glikoz perfüzyon ortamIa azaltüîhlglglikoz miktarII konsantrasyonu, 2 ila 3 g/L; 2.5 g/L veya 0 g/L'dir.

Bir yapllând lîrlnada, perfüzyon ortamIa galaktoz konsantrasyonu 10 ila 20 g/L'dir. Ilgili bir yapllând Ünada, düsük glikoz perfüzyon ortamlEJda galaktoz konsantrasyonu 10 ila 15 g/L; 10 ila 12 g/L veya 11.5 g/L'dir.

Bir yapuândlîrlnada, perfüzyon, hücre kültürünün yaklasllîl gün 5'i veya civarlEUa ila yaklas[lZl gün 9'u ve civarlEkzla baslamaktadE Bir yapllândünada, perfüzyon, hücre kültürünün yaklaslla gün 5'i veya civarIa ila yaklasElZJ gün 7'si ve civarIa baslamaktadE Diger ilgili yapllând lîrlnada, hücreler bir üretim faz. ulastlglIa, perfüzyon baslamaktadlEl Diger yapilândünada, perfüzyon sürekli perfüzyon içermektedir. Ilgili bir yapilândlülnada, perfüzyon oranlîslabittir.

Bir yapllândlîrlnada, perfüzyon, günlük 1.0 çallglna hacmine esit veya ondan daha az bir oranda gerçeklestirilmektedir. Ilgili bir yapilândlülnada, perfüzyon, hücre kültürü sßslübla günlük 0.25 çallgfna hacmi ila günlük 1.0 çallgna hacminin üretim fazESlüsIa artan bir oranda gerçeklestirilmektedir. Diger ilgili yapllândlîrlnada, perfüzyon, hücre kültürünün gün 9'u ila gün 11'inde günlük 1.0 çalisma hacmine ulasan bir oranda gerçeklestirilmektedir.

Diger ilgili yapUândlElnada, perfüzyon, hücre kültürünün gün 10'una günlük 1.0 çallgtna hacmine ulasan bir oranda gerçeklestirilmektedir.

Bir yapllândlünada, serumsuz besleme ortamII kapsül beslemeleri hücre kültürünün gün 3'ünde veya gün 4'ünde baslamaktadlü Bir yapllândlîilnada, memeli hücre kültürü, bir serumsuz kültür ortamIda en az 0.5 x 106 ila 3.0 x 106 hücreler/mL ile biyoreaktörün asllânmaslýla olusturulmaktadE Ilgili bir yapllândünada, memeli hücre kültürü, bir serumsuz kültür ortamIa en az 0.5 x 106 ila 1.5 x 106 hücreler/mL ile biyoreaktörün asllânmaslsîla olusturulmaktadlü Bir yapllând [Binada, yüksek mannoz glikan türleri Mannoz 5'dir.

Bir yapllândlElnada, yukar- açlElanan yöntem ayrIEla 36°C ila 31°C arasIa lelakllKJ kaymasIEiÇermektedir.

Bir yapllândlîilnada, yukarlöh açllZIanan yöntem ayrl& 36°C ila 33°C arasIEUa slîlakllß kaymasIülçermektedir. Ilgili bir yapHândlElnada, süaklüîlkaymasübüyüme fazljl'e üretim fazEl araslîiblaki geçiste meydana gelmektedir. Ilgili bir yapllândlîilnada, lelakllEl kaymasÇIüretim Bir yapHândlEnada, yukar-ki yöntem ayrüa, 5 mM veya daha aItIa bir L-asparajin konsantrasyonuna sahip bir serumsuz perfüzyon ortamEile perfüzyon ile takip edilen L- asparajin açlllg ile hücre kültürü-durdurmasII baslatüîhasllîliçermektedir. Ilgili bir yapllândlElnada, serumsuz perfüzyon ortamIa L-asparajinin konsantrasyonu, 5mM'ye esit veya daha azdIEl Ilgili bir yapUândlElnada, serumsuz perfüzyon ortamIa L-asparajinin konsantrasyonu, 4.0 mM'ye esit veya daha azdlB Ilgili bir yapüândlEmada, serumsuz perfüzyon ortamIa L-asparajinin konsantrasyonu, 3.0 mM'ye esit veya daha azdlE Ilgili bir yapllând [Binada, serumsuz perfüzyon ortamIa L-asparajinin konsantrasyonu, 2.0 mM'ye esit veya daha azdlEl Ilgili bir yapllândlünada, serumsuz perfüzyon ortam-a L-asparajinin konsantrasyonu, 1.0 mM'ye esit veya daha azdIB Ilgili bir yapllândlElnada, serumsuz perfüzyon ortamIa L-asparajinin konsantrasyonu, 0 mM'dir. Baska bir yapllândlîilnada, hücre kültürü ortamII L-asparajin konsantrasyonu, L-asparajin açl[g]l:öncesinde ve slBisIa izlenmektedir.

Bir yapllândlülnada, yukaridaki yöntem, ayrlîla, bir üretim fazÜslîasIa paketlenmis hücre hacminin %35'ine esit veya daha az oldugunu içermektedir. Bir yapllândlîilnada, paketlenmis hücre hacmi %30'a esittir veya daha azdlEl Bir yapllând Binada, %35'e esit veya daha az bir paketlenmis hücre hacminde memeli hücre yapllândülnada, memeli hücre kültürünün canlEliiücre yogunlugu, 20x106 canlEliiücreler/ml ila Bir yapllândlîilnada, perfüzyona, tegetsel aklglülül degistirilmesiyle ulasllfnaktadlEl Ilgili bir yapllândlîilnada, perfüzyon, bir ultrafiltre veya mikrofiltre kullanllârak tegetsel akElEl degistirilmesiyle ulasllîhaktadlü Bir yapllândlülnada, biyoreaktör en az 500L kapasiteye sahiptir. Ilgili bir yapllândlElnada, biyoreaktör en az 500L ila 2000L kapasiteye sahiptir. Ilgili bir yapüândünada, biyoreaktör en az 1000L ila 2000L kapasiteye sahiptir.

Bir yapllând [Binada, memeli hücreleri Çin Hamster Yumurtal[lZl(CHO) hücreleridir.

Bir yapllândlîilnada, rekombinant protein, bir insan antikoru, bir insanlastlEllBIIgl antikor, bir kimerik antikor, bir rekombinant füzyon proteini veya bir sitokinden olusan gruptan seçilmektedir.

Bir yapilândlElnada, yukarlâlaki yöntem ayrlîla hücre kültürü ile üretilen rekombinant proteinin toplanmasi. bir adIiIEiÇermektedir.

Bir yapllândûnada, yukarlki yöntem ayrlEh hücre kültürü ile üretilen rekombinant protein, saflastlEIBiaktadIElve bir farmasötik olarak uygun formülasyonda formüle edilmektedir.

Bir yapllândlEnada, yüksek mannoz glikan türlerinde rekombinant protein üretimi, hücrelerin galaktoz ile kombinasyon halinde sIlEllEl glikoza maruz bükllß'iad [glEl bir kültürle külasland [giülda arttlElIBiaktadB SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1. Bir beslemeli kesikli proseste hücre kültürü ve Man5 profilleri. (A) Kültür süpernatanIa glikoz konsantrasyonu (g/L). (B) Kültür süpernatanlEda galaktoz konsantrasyonu (g/L). (C) CanlElHücre Yogunlugu. (D) CanIiEEl (E) Titre. (F) Man5. Glikoz 1 g/L, galaktoz 0 g/L (açllZl üçgen). Glikoz 1 g/L, galaktoz 4 g/L (koyu üçgen). Glikoz 2 g/L, galaktoz 0 g/L (açlEl daire). Glikoz 2 g/L, galaktoz 4 g/L (koyu üçgen). Glikoz 3 g/L, galaktoz 0 g/L (açllg kare). Glikoz 3 g/L, galaktoz 4 g/L (koyu kare).

Sekil 2. Perfüzyon prosesinde hücre kültürü ve amino asit profilleri. (A) CanIEI-lücre Yogunlugu (B) CanliIJE (C) Tüketilmis ortam analizinde Gln (glutamin) konsantrasyonu (g/L), (D) Paketlenmis Hücre Hacmi AyarlanmlSJTitre, (E) Tüketilmis ortam analizinde Glc (glikoz) konsantrasyonu (g/L), (F) tüketilmis ortam analizinde galaktoz konsantrasyonu (g/L). Glikoz Zg/L, galaktoz ög/L ve glutamin 10 mM (koyu üçgen). Glikoz 4g/L, galaktoz 69/L ve glutamin 10 mM (koyu daire). Glikoz 4g/L, galaktoz ög/L ve glutamin 5 mM (açlla Sekil 3. Perfüzyon prosesine hücre kültür profilleri. (A) Tüketilmis ortam analizinde GIu (glikoz) konsantrasyonu (g/L), (B) Tüketilmis ortam analizinde Gal (galaktoz) konsantrasyonu (g/L), (C) Laktat konsantrasyonu, (D) Amonyak konsantrasyonu (E) CanIIZI hücre yogunlugu, (F) CanliEEl (G) Paketlenmis hücre hacmi ayarlanmlgltitre. Glikoz 3g/L, galaktoz 13 g/L (koyu kare). Glikoz Og/L, galaktoz 10 g/L (açlß daire). Glikoz Og/L, galaktoz 13 g/L (koyu daire). Glikoz 1.5 g/L, galaktoz 11.5 g/L (yIlî). Glikoz 3 g/L, Sekil 4. Perfüzyon prosesinin JMP istatistiksel analizi. (A) Paketlenmis Hücre Hacmi AyarlanmlSTitre, (B) Man5.

Sekil 5. Man5 türlerinin yüzdesindeki artlgljgösteren zaman aklgîl/erileri. - Og/L glikoz lûg/L galaktoz; -+ 0 g/L glikoz 13 g/L galaktoz; +1 3 g/L glikoz 10 g/L galaktoz; ++ 3 BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Uygun ve yeniden üretilebilir rekombinant glikoprotein glikoform profillerinin üretimi biyofarmasötik endüstri için önemli bir zorluk olarak kalmaktadlE Hücre kültürü proseslerindeki varyasyonlar, antikor glikozilasyon profillerinde önemli bir tol oynamaktadE pH, lelakllKl hücre kültürü ortam bilesimi, ham malzeme Iottan lota varyasyon, ortam filtrasyon malzemesi, biyoreaktör ölçek farkü gazlama stratejisini (hava, oksijen, karbon dioksit) kapsayan hücre kültürü proses fizikokimyasal çevrede potansiyel degiskenlik, glikozilasyon profillerini potansiyel olarak degistirebilen sadece birkaç örnektir.

Düsük veya sIlEllEglikozun kosullarDaltIa, artmlglrekombinant proteininin yüksek mannoz glikoform içerigi, bununla birlikte, volumetrik üretkenlik, hücre canlllglÜe/veya yogunluk gibi hücre kültürünün nitelikleri azaltllBraktadlB Glikoz konsantrasyonunun artmaslZI kültür niteliklerini gelistirmistir, ancak yüksek mannoz glikoform içerigini azaltmStlE Bulus, bir alternatif karbon kaynag Çlözellikle galaktoz ile kombinasyon halinde glikozun düsük veya sIIIlHlElkonsantrasyonlar kullan llîhaslîaraclllgllîla, volumetrik üretkenlik, hücre canlll]glü ve/veya yogunlugu gibi belirli hücre kültürü parametrelerinin istenen seviyeleri sürdürülürken, yüksek mannoz glikoformlarÇlözellikle MannozS (Man5) artmaleb yönelik, istenen ürün kalite niteliklerine ulasmak için bir yöntem saglamaktadlEl Burada açlEIand[glI:l gibi, glikozun hücre kültürü ortamlEda bir alternatif karbon kaynagEilIe kombinasyon halinde glikoz konsantrasyonunun düsürülmesiyle sIlIIlandilglEl bir hücre kültürü ortamlEUa hücrelerin kültürlenmesi, yüksek mannoz glikoformlarII artmElbir konsantrasyonuna sahip bir rekombinant protein ile sonuçlanlElken, hücre büyümesi, canllügüle titre uygun seviyelerde sürdürülmektedir.

Bir hücre kültürünün üretim fazElsüsIa, canIlZhcüre yogunlugu, hücre canlElglÇIyüzde paketlenmis hücre hacmi, titre ve/veya paketlenmis hücre hacmi ayarlanmlgltitre gibi istenen kültür parametreleri, bu parametreleri olusturmak ve sürdürmek için yeterli glikoz (5 g/L ila g/L veya daha fazla) içeren bir hücre kültürü ortamII hücre kültürünün beslenmesiyle olusturulabilmektedir. Hücre kültür üretim çallglnaslîlsüisüzamania, üretilen rekombinant proteinin yüksek mannoz glikoform içeriginin arttlEIBiasüirzu edildiginde, hücre kültürü daha sonra bir hücre kültürü ortamElIe beslenmektedir, burada glikoz konsantrasyonu, yüksek mannoz içeriginde istenen artSlile sonuçlanacak sekilde indirgenmektedir. Bu tür bir hücre kültürü ortamügalaktoz gibi bir alternatif karbon kaynagüle kombinasyonunda daha düsük bir glikoz konsantrasyonu (0 ila 8 g/L) ile karakterize edilmektedir.

Glikoz konsantrasyonunun düsürülmesi gerektigi dereceyi belirleyen faktörler hangi alternatif karbon kaynagII kullanIIlglEl/e ne kadar kullanIIlglü hücre kültürü üretim prosesini; hücre türü ve kütlesi ve glikoz tüketimini kapsamaktadlü Biyoreaktörde hücre kütlesi arttiEt;a, hücre kültürü ile glikoz tüketimi artmaktadlü ve dolaylîlýla beslenebilen glikoz miktarEl artmaktadlB buna ragmen, istenen artlglManS glikoform konsantrasyonunu üretecek bir sIIBIIZI glikoform durumu korunmaktadlEl Glikozun hücre kültürüne beslendigi durum, Man5 glikoform konsantrasyonunda istenen artEELiretecek bir sIlEliEglikoz durumunu sürdürmek için gerekli glikoz miktarIElayrEa etkileyebilmektedir. Örnegin, bir beslemeli kesikli hücre kültüründe, glikoz hücre kültürü ortamEiçine formüle edilebilmektedir ve kapsül beslemeleri ile takviye edilebilmektedir. Bir perfüzyon hücre kültürü prosesinde, glikoz konsantrasyonu, perfüzyon ortamII besleme oranli-ala (g/L/gün) bagllîlolacaktlü Bu iki örnek burada saglanmaktadlB Buna ek olarak, üretim sßasia hücre kültüründe glikoz miktarÇIperfüzyon kültürleri için mesela tüketilmis ortam analizi araclHgllýla ölçülebilmektedir. Tüketilmis ortamda glikoz miktarElO g/L veya civarIda oldugunda Man5 seviyelerinin artt[g]ü gözlemlenmistir.

Glikoz konsantrasyonlarII azaItI[giI:l durumda, yüksek mannoz glikoform üretimi arttlEIlBiEtlE Bununla birlikte, düsük glikoz seviyeleri, hücre kültürü sistemlerinde rekombinant proteinlerinin üretimini etkileyebilmektedir. Volumetrik üretim, hücre canllllKl ve canlEhücre yogunlugu, glikozun sIEliand-Igilîdurumlarda tamamen olumsuz bir sekilde etkilenebilmektedir. Galaktoz gibi bir alternatif karbon kaynagII düsük veya sIlEllEglikoz periyodu süleUa hücre kültürüne eklenmesinin, yavas olmadfgiEi veya artan Man5 glikoformlarElsürdürülürken volumetrik üretim, hücre canIlIIglÜie canlljîücre yogunlugundaki azalmalarElstabilize etmedigi bulunmustur. Ürün titre kaybIIIi'ninimuma indirirken, hücre kültürü süsIa bir rekombinant proteinin yüksek mannoz glikoform içerigini yönlendirme ve sürdürme yetenegine sahiptir ve ticari terapötik protein üretimi için hücre canll[[g]|]1egerli ve kolay uygulanabilir yöntem sunmaktadE Yüksek mannoz glikoformlarIlEl, bir alternatif karbon kaynagÇl özellikle galaktoz ile kombinasyon halinde bir sIlBlaylEErniktarda glikozun kullanllIhaslsîla uygun ürün titresi ve hücre canllügiüsürdürülürken, özellikle Man 5'in, istenen ürün kalite niteliklerine arttlEIIhasEl için memeli hücrelerinin kültürlenmesine yönelik bir yöntem burada saglanmaktadEl Yöntem, ya kapsül veya sürekli beslemeler aracHJgilîLla takviye edilen ortam formülasyonuna birlestirilmis ya da her iki sekilde de 5 ila 15 g/L glikoz arallglia bir yüksek, sIlHlaylEEl olmayan glikoz konsantrasyonuna sahip bir hücre kültürü ortam a büyüme ve/veya üretim fazlarElsEsIa memeli hücrelerin kültürlenmesini saglamaktadlEl CanlEhücre yogunlugu, hücre canliElgiEi/e/veya titre istenen seviyelere ulastigilütla, hücre kültürü ortamiaki glikoz miktarÇlörnegin perfüzyon ortamIa, tüketilmis ortamda ölçülen glikoz miktarED g/L veya hemen üzerinde olacak sekilde bir sIlEJayIEErniktara düsürülmektedir. Glikoz tüketiminin oranüglikoz ilavesinin oranEl/e/veya hücre kültürünün kütlesi ile belirlenmektedir. Glikoz 8 g/L'ye beslenebilmektedir. Bir yapilândlülnada, glikoz 6 g/L'ye kadar beslenmektedir. Diger bir yapllândünada, glikoz 4 g/L'ye kadar beslenmektedir. Diger bir yapllândülnada, glikoz 3 g/L'ye kadar beslenmektedir. Diger bir yapüândlünada, glikoz 2 ila 3 g/L'ye kadar beslenmektedir. Diger bir yapllândlîilnada, glikoz 2.5 g/L'ye kadar beslenmektedir. Diger yapilând Binada, glikoz 0 g/L'dir.

Düsürülmüs glikoz konsantrasyonu ile kombinasyon halinde, hücre kültürü ortamüZO g/L'ye kadar olan bir konsantrasyonda galaktoz içermektedir veya galaktoz ile takviye edilmektedir.

Bir yapüândlülnada, galaktoz konsantrasyonu 10 ila 15 g/L'dir. Diger bir yapilândlîilnada, galaktoz konsantrasyonu 11.5 g/L'dir.

Karbonhidrat parçalarlÇl oligosakkaritler için yaygI bir sekilde kullanlßn adlandlülnaya referans ile burada açiElanmaktadlE Bu adlandlElnayleullanan karbonhidrat kimyasII bir bulunabilmektedir. Bu adlandlElna, örnegin, mannozu temsil eden Man, galaktozu temsil eden Gal; ve glikozu temsil eden Glc içermektedir. büyümesi ve yayIIBiasElanIamlEb gelmektedir. Memeli hücreler için uygun kültür kosullarlîl teknikte bilinmektedir. Ela/(W örnegin, Animal cell culture: A Practical Approach, D.

Rickwood, baskÇIOxford University Press, New York (1992). Memeli hücreler süspansiyonda kültürlenebilmektedir veya buna ragmen bir katlîsubstrata eklenebilmektedir. Mikrotasülîllâr olmadan veya mikrotaslýlîllâr ile birlikte aklgkanlastßlüilgl yatak biyoreaktörleri, oyuk fiber biyoreaktörleri, silindir siseler, çalkalama siseleri veya karlStlEllBiE tank biyoreaktörleri kullanliâbilmektedir.

Memeli hücre kültürü, bir biyoreaktörde büyütülmektedir. Bir yapllândlElnada, 500L ila biyoreaktörler kullanilßîaktadlü ötesinde asliânmaktadß Tercih edilen bir yapilândlîiînada, asllâma 1.0x106 canllZl hücreler/ mL'dir. Üretim biyoreaktörü içine asilândlglliîha, memeli hücreler bir üssel büyüme gazlEb girmektedir. Büyüme fazÇlS ila 8 g/L glikozuna sahip bir serumsuz besleme ortamII kapsül beslemeleri ile bir beslemeli kesikli proses kullanilârak sürdürülebilmektedir. Bu takviye kapsül, hücre kültürünün beslenmeye Ihtiyaclîloldugu belirlendigi veya öngörüldügü bir zamanda, hücreler biyoreaktör içine aslEindlKtan sonra klglaca tipik olarak baslamaktadlEJ Örnegin, takviye beslemeleri kültürün yaklasllZlgün 3 veya 4'ünde veya civarIda veya bir gün veya iki gün öncesinde veya sonrasIda baslayabilmektedir. Kültür, büyüme fazlEßlebla iki, üç veya daha fazla kapsül beslemelerini alabilmektedir. Ne bazal hücre kültür ortamüie de kapsül besleme ortam lîçlialaktoz içermektedir.

Hücreler, hareketsiz veya üretim faz. girdiklerinde, veya hücre kültürü istenen canlDiücre yogunluguna ve/veya hücre titresine ulastiglIa, beslemeli kesikli kapsül beslemeleri sürekli olmamaktadlîlve perfüzyon baslatllîhaktadlü Perfüzyon kültürü, eszamanllîblarak tüketilmis ortam uzaklastIElIJHken, hücre kültürünün taze perfüzyon besleme ortamIlEl alilgilîlbir kültürdür. Perfüzyon, bunlarlEl sürekli, adIi adl, kesikli veya bunlarlEl tümü ya da kombinasyonu olabilmektedir. Perfüzyon oranlarügünlük birçok çalgma hacminde bir çallgtna hacminden daha az olabilmektedir. Tercihen hücreler, kültürde tutulmaktadlîlve ortamdan uzaklastlEIlân tüketilmis ortam büyük oranda hücresizdir veya kültürden büyük oranda daha az hücreye sahiptir. Perfüzyona santrifüjlenme, sedimentasyon veya ültrasyon içeren birkaç araç ile ulasüâbilmektedir, Bakßß örnegin, filtrasyon yöntemi, degisken tegetsel aklgl filtrasyondur. Degisken tegetsel aklgl oyuk-fiber filtre modülleri araciüglîcla ortamI pompalanmaslýla sürdürülmektedir. BakZEEörneg/n, US Patent No. 6,544,424. Oyuk fiber modüller, mikrofiltreler veya ultrafiltreler olabilmektedir.

Beslemeli kesikli kültür, istenen hücre canlülgiÇlhücre yogunlugu, yüzde paketlenmis hücre hacmi, titre, paketlenmis hücre hacmi ayarlanmEtitre, yas veya benzerleri gibi önceden belirlenmis tetik noktasi ulastiglEtla, beslemeli kesikli ve perfüzyon arasiaki bir kayma meydana gelebilmektedir. Örnegin, bu kayma kültürün gün 7'sinde veya civar-a meydana gelebilmektedir, ancak bir gün veya iki gün erken veya geç meydana gelebilmektedir.

Perfüzyon besleme formülasyonu 15 g/L veya daha fazla bir konsantrasyonda glikoz içermektedir, ancak galaktoz içermemektedir. Bir yapllândlEnada, perfüzyon ortamEllS g/L glikoz içermektedir.

Perfüzyon kültürü önceden belirlenmis bir tetik noktaslüla Örnegin istenen hücre canllllgiü hücre yogunlugu, yüzde paketlenmis hücre hacmi, titre, paketlenmis hücre hacmi ayarlanmlgl titre, yas ve benzerine ulastlglIa, hücre kültüründeki glikoz konsantrasyonu düsürülmektedir. Örnegin, bu kayma kültürün gün 11'inde baslatilâbilmektedir, ancak bir gün veya ikin gün önce veya sonra meydana gelebilmektedir. AynElzamanda hücre kültürü, glikozun düsük bir konsantrasyonunu içeren hücre kültürü ortamEiIe serpilmektedir. Bu tür bir düsük konsantrasyondaki glikoz, 0 g/L'de veya civarIda tüketilmis ortamda ölçülen daha düsük glikoz konsantrasyonu ile sonuçlanacaktlEl Glikoz 8 g/L'ye beslenebilmektedir.

Bir yapllândlElnada, glikoz 6 g/L'ye kadar beslenmektedir. Diger bir yapüândlEinada, glikoz 4 g/L'ye kadar beslenmektedir. Diger bir yapllând [anada, glikoz 3 g/L'ye kadar beslenmektedir.

Diger yapHândlElnada, glikoz 2 ila 3 g/L'dir. Diger bir yapüândlîilnada, glikoz 2.5 g/L'dir. Diger yapllând Hnada, glikoz 0 g/L'dir.

Hücre kültüründeki sIlEllElinkoz durumu, tüketilmis ortamda glikoz konsantrasyonunun ölçülmesiyle ve tüketilmis ortamda 0 g/L'de veya civarIaki bir seviyede sürdürülmesi için perfüzyon ortam formülasyonunda glikoz konsantrasyonunun ayarlanmasEl gibi hücre kültüründe glikoz konsantrasyonunun izlenmesiyle sürdürülmektedir.

Düsük konsantrasyonlarda glikoz içeren hücre kültürü ortamÇl 20 g/L'ye kadar bir konsantrasyonda galaktoz ile takviye edilebilmektedir. Bir yapliândlünada, galaktoz konsantrasyonu 10 ila 15 g/L'dir. Diger bir yapilândlEtnada, galaktoz konsantrasyonu 11.5 Hücre kültürü, galaktoz ile takviye edilen bir sIlîllIZIinkoz durumunda sürekli olarak sürdürülebilmektedir. Hücre kültürü, toplanana kadar galaktoz ile takviye edilen sIlEIIEbir glikoz durumunda sürdürülebilmektedir. Hücre kültürü, galaktoz takviyeleri ve tüm proses tekrar baslamadan, bir glikozsuz sIIEIllîilurumda iyilestirilebilmektedir.

Hücre kültürü, hem büyüme hem de üretim fazlarljiçin bir perfüzyon kültür sisteminde sürdürülebilmektedir. Üretim biyoreaktörü içine asilândlglliîtla, memeli hücreler, hücre kültürünün 5 ila 15 g/L glikoz ile takviye edilmis serumsuz ve/veya kimyasal olarak belirlenen hücre kültürü ortamEiIe serpildigi zaman sßshîlja bir üssel büyüme faz. girmektedir. Hücre kültürü ortamÇIgalaktoz Içermemektedir. Kültür, bir Istenen tetik noktaslîbrnegin istenen canlEl hücre yogunlugu, hücre canIUIglÇl yüzde paketlenmis hücre hacmi, titre, paketlenmis ayarlanmlg hacim titresi, yasElveya benzerlerine ulasllâna kadar sürdürülmektedir. Aynü zamanda hücre kültürü, glikozun sIlHlaylajhir konsantrasyonunu içeren hücre kültürü ortamEl ile serpilmektedir. Bu tür bir sIlEIlayEEkonsantrasyondaki glikoz, 0 g/L'de veya civarlBkla tüketilmis ortamda bir glikoz konsantrasyonu ile sonuçlanacaktlEl Glikoz 8 g/L'ye beslenebilmektedir. Bir yapilândünada, glikoz 6 g/L'ye kadar beslenmektedir. Diger bir yapllândlünada, glikoz 4 g/L'ye kadar beslenmektedir. Diger bir yapüândlünada, glikoz 3 g/L'ye kadar beslenmektedir. Diger yapllândlîilnada, glikoz 2 ila 3 g/L'dir. Diger bir yapllând Binada, glikoz 2.5 g/L'dir. Diger yapllândlEinada, glikoz 0 g/L'dir.

SIlîllaylEEglikoz miktarElçeren hücre kültürü ortamüZO g/L'ye kadar bir konsantrasyonda galaktor içerebilmektedir. Bir yapllândlülnada, galaktoz konsantrasyonu 10 ila 15 g/L'dir.

Diger bir yapllândlîrlnada, galaktoz konsantrasyonu 11.5 g/L'dir.

Buna ek olarak, sIlEllaylElIbir miktarda glikoz Içeren hücre kültürü ortamügalaktoza ek olarak glutamin de içerebilmektedir. Glutamin, galaktoz ile konsantrasyonunda 1 ila 20 mM konsantrasyonundadlEi Bir yapilândlElnada, glutamin konsantrasyonu 5 ila 10 mM'dir.

CanIIZIhücre yogunlugu, hücre kültürü ortamüîda üretim fazlEla veya daha düsük glikoz konsantrasyonuna geçis için bir sinyal olabilmektedir. Üretim fazEtüsIda, belirli bir aralllîl veya seviyede canlEl hücre yogunlugunun sürdürülmesi arzu edilebilmektedir. Bir canIIZIhücreIer/mL'dir. Bir diger yapllândlünada, canli] hücre yogunlugu 10x106 canIIII hücreler/mL ila 50x106 canlEliiücreler/mL'dir. Bir diger yapllândlîrlnada, canlElhücre yogunlugu hücreler/mL'dir. Tercih edilen bir diger yapUândlElnada, canlEhücre yogunlugu 20x106 canllîl hücreler/mL ila 30x106 canlEhücreIer/mL'dir. Tercih edilen bir diger yapllândlElnada, canlEl bir diger yapllândIElnada, canIEliiücre yogunlugu en az yaklasllZl20x106 canlEBiücreler/mL'dir.

Yüzde paketlenmis hücre hacmi (%PCV), üretime fazlZl/eya glikozun bir sIIlHlaylEüniktarEl Içeren bir hücre kültürü ortamEille hücre kültürünün beslenmesinin baslamasi geçis için bir sinyal olarak ayrlBa kullanllâbilmektedir. Hücre kültürü, ayrlîla üretim fazlîglüsia Istenen bir paketlenmis hücre hacminde sürdürülebilmektedir. Bir yapllândlElnada, paketlenmis hücre hacmi %30'a esittir veya daha azdlü Tercih edilen bir yapllândünada, paketlenmis hücre hacmi en az yaklaslla %15 ila 30'dur. Tercih edilen bir yapllândlElnada, paketlenmis hücre hacmi en az yaklaslElO/oZO ila 25'dir. Bir diger tercih edilen yapHândlEilnada, paketlenmis hücre hacmi %25'e esittir veya daha azdlEl Bir diger tercih edilen yapllândlülnada, paketlenmis hücre hacmi %15'e esittir veya daha azdE Bir diger tercih edilen yapllândünada, paketlenmis hücre hacmi %20'ye esittir veya daha azdlEl Bir diger tercih edilen yapüând lElnada, paketlenmis hücre hacmi %15'e esittir veya daha azdE Bir indirgenmis asparajin konsantrasyonuna sahip bir perfüzyon hücre kültürü, üretim fazü süsia üretkenlik ve canIUJEEI korurken hücre büyümesini durdurmak için kullanllâbilmektedir. Tercih edilen bir yapllândlîilnada, asparajin konsantrasyonu en az yaklasüîl 0 mM ila en az yaklasElZl 5 mM asparajin'dir, bakim WIPO YayI No. WO Burada kullanIlglEgibi, “perfüzyon akü oranEJ belirli bir zamanda çalisma hacminin bazEl bölümleri veya çogu bölümü olarak tipik olarak eksprese edilen bir biyoreaktörden geçirilen (eklenen ve çlKbrtllân) ortam miktarIIEl "Çallgma hacmi”, hücre kültürü için kullanllân biyoreaktör hacminin miktarIElfade etmektedir. Bir yaplIândlElnada, perfüzyon aklSl oranÇl günlük bir çallgna hacmi veya daha azElolan bir oranIIE Perfüzyon besleme ortaml:l perfüzyon oranIElninimuma indirmek için perfüzyon besi konsantrasyonunu maksimuma çikarmak için formüle edilebilmektedir.

Burada kullan-[glügibi, “hücre yogunlugu", kültür ortamII belirli bir hacminde hücre say-[ifade etmektedir. “CanIlJhücre yogunlugu”, standart canlüleneyler ile belirlendigi gibi (triptan mavi boya dlSlama yöntemi), kültür ortamII belirli bir hacminde canIEhücrelerin say-[Ifade etmektedir.

Burada kullanIlglgibi, “paketlenmis hücre hacmi" (PCV), ayriEla, “paketlenmis hücre hacmi yüzdesi” (%PCV) olarak da ifade edilmektedir, hücreler tarafIan doldurulan hacmin yüzde olarak ifade edilen toplam hücre kültürü hacmine 0ranIIE(bakEJ Stettler, ve ark., (2006) hücre çapli bir fonksiyonudur; paketlenmis hücre hacmindeki artlglar, ya hücre yogunlugu veya hücre çapEya da her ikisindeki artlglardan ortaya çilZlabilmektedir. Paketlenmis hücre hacmi, hücre kültüründe katEliçerigin bir ölçümüdür. Katüâr, toplanma ve asagüaklg saflastlîilnaslîlslüsia ortamdan uzaklastlEllBwaktadlE Daha katü toplanma ve asagElaklgl saflastlEIna adIiBtÜsIa istenen üründen katlîilnalzemeyi aylîilnaya yönelik daha fazla çaba anlam. gelmektedir. AyrEh, istenen ürün, katllârda yakalanmaya baslanabilmektedir ve bir azaltllîhlgl ürün verimiyle sonuçlanan, toplanma prosesi slBisIa kaybolabilmektedir. Konak hücreler boyut olarak degiskenlik gösterdikleri ve hücre kültürleri ayrlEla ölmüs ve ölen hücreler ve diger hücresel kaIlEtllâr içerdiklerinden dolayüpaketlenmis hücre hacmi, hücre yogunlugu veya canlühücre yogunlugundan ziyade bir hücre kültürü içinde katEliçerigi tanIiIamak için daha dogru bir yoludur.

Bu bulusun amaçlarEîÇin, hücre kültürü ortamü/'n vitro hücre kültüründe memeli hücreler gibi hayvan hücrelerinin büyümesi için uygun bir ortadel Hücre kültürü ortam formülasyonlarü teknikte iyi bilinmektedir. Tipik olarak hücre kültürü ortamlarÇl tamponlar, tuzlar, karbonhidratlar, amino asitler, vitaminler ve eser miktarda önemli elemanlardan olusmaktadlB "Serumsuz", fetal slgilE serum gibi hayvan serumlarIEiçermeyen bir hücre kültürü ortamIEIiçermektedir. Belirlenen kültür ortamlükapsayan çesitli doku kültür ortamlarÇl asaglûhki hücre kültürü ortamII biri veya bir kombinasyonunun örnegin kullanliâbildigi gibi ticari olarak mevcuttur: RPMI-1640 Ortami: RPMI-1641 Ortamü Dulbecco'nun Modifiye Eagle OrtamEfDMEM), Minimum Gerekli Ortam Eagle, F-12K Ortamü Ham's F12 OrtamüIscove'nun Modifiye Ettigi Dulbecco'nun OrtamüMcCoy'un 5A OrtamÇl Leibovitz'in L-15 Ortam Eve digerleri arasIa EX-CELLTM 300 Dizisi (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas) gibi serumsuz ortam. Bu tür kültür ortamIlEl serumsuz versiyonlarEIda ayrlîla mevcuttur. Hücre kültür ortamü kültürlenecek hücrelerin gerekliliklerine ve/veya istenen hücre kültürü parametrelerine bagllîlolarak, amino asitler, tuzlar, sekerler, vitaminler, hormonlar, büyüme faktörleri, tamponlar, antibiyotikler, lipitler, eser elementler ve benzerleri gibi artan veya ilave konsantrasyonlarda bilesenler ile takviye edilebilmektedir.

Hücre kültür ortamÇlserumsuz, proteinsiz ve/veya peptonsuz olabilmektedir. “Serumsuz”, fetal s[g]lEserum gibi hayvan serumlarIEiçermeyen bir hücre kültürü ortamIEiçermektedir. eklenmis proteinden arümghücre kültürü ortam übermektedir. Proteinsiz ortam, peptonlarEI Içerebilmektedir veya içeremeyebilmektedir. “Peptonsuz”, hayvan ve bitki protein hidrolizatlarEgibi ekzojen olmayan protein hidrolizatlarIElçermeyen hücre kültürü ortamIEl içermektedir. Hücre kültürü besi yeri veya benzer terminoloji, diger seyler arasIda, canIü/e canlüblmayan memeli hücreler, hücre metabolitleri ve nükleik asitler, proteinler ve lipozomlar gibi hücresel kallEtHârüberen hücre kültürü ortamlarlElüfade etmektedir.

Hücre kültürleri, hücre kültürünün üretim fazII süresi boyunca tüketilen besinler ve amino asitler gibi bilesenler içeren konsantre besleme ortamEüe takviye edilebilmektedir. Konsantre besleme ortamÇl yaklasilZl olarak sadece hücre kültürü ortameormülasyonuna baglü olabilmektedir. Bu tür bir konsantre besleme ortamlîörnegin kendi normal miktarII yaklasllîl hatta 1000X'inde hücre kültürü ortamII bilesenlerinin neredeyse tümü veya birini herhangi Mevcut bulusa göre yöntem, çoklu faz kültür proseslerinde rekombinant proteinlerin üretimini gelistirmek için kullanll'a`bilmektedir. Bir çoklu asama prosesinde, hücreler iki veya daha fazla ayrElfazlarlIiha kültürlenmektedir. Örnegin hücreler hücre proliferasyonu ve canIIHglI maksimuma çlElaran çevre kosullarIa, bir veya daha fazla büyüme fazlarIa ilk olarak kültürlenebilmektedir, daha sonra protein üretimini maksimuma çllöartan kosullar altIa bir üretim fazEla aktarllâbilmektedir. Memeli hücreler taraflEUan bir proteinin üretilmesine yönelik bir ticari proseste, örnegin bir son üretim kültüründen önce farklEkültür kaplarIa meydana gelen yaygI bir sekilde çoklu en az yaklaslKlZ, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 veya 10 büyüme faktörü fazlarEl/ardlEl Büyüme ve üretim fazlarübir veya daha fazla geçis fazII önünde olabilmektedir veya ayrllâbilmektedir. Çoklu faz proseslerinde, mevcut bulusa göre yöntem, en azIan bir ticari hücre kültürünün son üretim fazII büyümesi ve üretilmesi fazßlüslda kullanüâbilirken, bu, bir önceki büyüme fazIa kullanllâbilmektedir. Bir üretim fazübüyük yürütülmektedir. Bir büyüme fazlZlbir üretim fazIdan daha yüksek bir lebkllKta meydana gelebilmektedir. Örnegin, bir büyüme ortamEl/aklaslla 35°C ila yaklaslla 38°C araleUa bir birinci slîaklllîta meydana gelebilmektedir ve bir üretim fazElZ9°C ila yaklaslIZl 37°C, istege bagllZblarak yaklasllZl 30°C ila yaklasllZl 36°C veya yaklasllZJ 30°C ila yaklasllZl 34°C arasIa meydana gelebilmektedir. Buna ek olarak, örnegin kafein, bütirat ve hekzametilen bisasetamid (HMBA) gibi bu tür protein üretimi kimyasal indükleyicileri, aynlîtamanda, bir slîlaklllîl kaymasIan önce ve/veya sonra eklenebilmektedir. Indükleyiciler bir leakllKl kaymasIan sonra eklenirse, lelakIlEl kaymasIan bir saat ile bes gün sonra eklenebilmektedir, istege baglEl olarak lelaklllZl kaymasIian bir ila iki gün sonra eklenebilmektedir. Hücre kültürleri, hücreler istenen protein(ler)i üretirken, günler veya daha fazla haftalar için sürdürülebilmektedir.

Tipik olarak, son üretim kültüründen (N-x ila N-1) önce gelen hücre kültürleri, üretim biyoreaktörü, N-1 kültürünü asllâmak için kullanllâcak tohum hücrelerini üretmek amaclsîla kullanilîhaktadIEI Tohum hücre yogunlugu, üretilen rekombinant protein seviyesi üzerinde olumlu bir etkiye sahip olabilmektedir. Ürün seviyeleri, artan tohum yogunlugu ile artmaya meyillidir. Titredeki gelismeler sadece daha yüksek tohum yogunluguna baglülegildir, ancak üretim içine yerlestirilen hücrelerin metabolik ve hücre döngüsü durumu tarafIan muhtemelen etkilenmeyecektir.

Tohum hücreleri, herhangi bir kültür ortamlEUa üretilebilmektedir. Bir tercih edilen yöntem, degisken tegetsel akEfiItrasyonunu kullanan bir perfüzyon kültürüdür. Bir N-1 biyoreaktörü, bir üretim biyoreaktörünü asllâmaslîliçin yüksek yogunlukta hücreler saglamaya yönelik degisken tegetsel akgl filtrasyonu kullanilârak çallgtlîllâbilmektedir. Bir N-1 asamasü>90 x 106 hücreler/mL yogunluklarlEb hücreleri büyütmek için kullanllâbilmektedir. N-1 biyoreaktörü, kapsül tohum kültürlerini üretmek için kullanllâbilmektedir veya yüksek tohum hücre yogunlugunda çoklu üretim biyoreaktörlerini tohumlamak için sürdürülebilen bir rulo tohum stok kültürü olarak kullanüâbilmektedir. Üretimin büyüme asamasII süresi 7 ila 14 gün arallgilda olabilmektedir ve üretim biyoreaktörünün asllânmasIan önce üssel büyümede hücreleri sürdürmek amaclýla tasarlanabilmektedir. Perfüzyon oranlarÇl ortam formülasyonu ve zamanlama hücrelerin büyümesi ve kendi üretimlerini optimize etmeye en çok yardIicüilan bir durumda üretim biyoreaktöre bunlarEliasIiak için optimize edilmektedir. >15 x 106 hücreler/mL tohum hücre yogunluklar., üretim biyoreaktörlerinin tohumlanmaleb yönelik ulasllâbilmektedir.

Bulusta kullanllân hücre dizileri (ayrlîla “konak hücreler” olarak ifade edilmektedir), ticari veya bilimsel ilginin bir polipeptidini eksprese etmesi için genetik olarak tasarlanmaktadE Hücre dizileri tipik olarak, bir sIlEklîl zaman için kültürde sürdürülebilen bir birincil kültürden meydana gelen bir soydan türetilmektedir. Genetik olarak tasarlanan hücre dizisi, konak hücrenin istenen bir rekombinant polipeptiti eksprese etmesi amaclýla bir rekombinant polinükleotit molekülü ile hücreye nükleik asitin verilmesi, hücrelerin dönüstürülmesi veya kalltîlaktarlih'iasüxe/veya aksi durumda degistirilmesini (örnegin, homolog rekombinasyon ve gen aktivasyonu veya bir rekombinant olmayan hücre ile bir rekombinant hücrenin füzyonu) içermektedir. Ilgili bir polipeptiti eksprese etmek için genetik olarak tasarlanan hücreler ve/veya hücre dizileri için yöntemler ve vektörler teknikte uzman kisiler tarafian çok iyi bilinmektedir; örnegin çesitli teknikler Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel ve ark., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, ve üç aylilZl güncellemeler); Sambrook ve ark., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory BaskEI1989); Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, sf. 15-69'da tarif edilmektedir.

Hayvan hücre dizileri, progenitörlerinin birçok hücreli hayvanlarIan türetilmis oldugu hücrelerden türetilmektedir. Hayvan hücre dizisinin bir türü, bir memeli hücre dizisidir.

Kültürde büyümesi için uygun memeli hücre dizilerinin birçok çesidi Amerikan Türü Kültür Koleksiyonu (Manassas, Va.) ve ticari tedarikçilerden temin edilmektedir. Endüstride yaygI bir sekilde kullaniiân hücre dizilerinin örnekleri, VERO, BHK, HeLa, CV1 (Cos içeren), MDCK, yumurtalllZl (CHO) hücrelerini içermektedir. CHO hücreleri, örnegin, sitokinler, pllîtllâsma faktörleri ve antikorlar gibi kompleks rekombinant proteinlerinin üretilmesine yönelik yaygI Wood ve ark. ( eksik mutant hücre dizileri (Urlaub ve ark. ( , DXBll ve DG-44 arzu edilen CHO konak hücre dizileridir, çünkü etkili DHFR seçilebilir ve büyütülebilir gen ekspresyon sistemi, bu hücrelerde yüksek seviyede rekombinant protein olarak, bu hücrelerin, yaplgkan veya süspansiyon kültürleri olarak yönlendirilmesi kolaydlîlve göreceli olarak iyi genetik stabilite göstermektedir. Bunlarda rekombinant olarak eksprese edilen CHO hücreleri ve proteinler, kapsamlllir sekilde karakterize edilmistir ve düzenleyici kuruluslar taraflEtlan klinik olarak ticari üretimde kullanIia yönelik onaylanmlStE Bulusun yöntemleri, ilgili rekombinant proteinlerini eksprese eden kültür hücrelerine kullanllâbilmektedir. Eksprese edilen rekombinant proteinler, kurtarilâbilen ve/veya toplanabilen kültür ortamlîliçine salgilânabilmektedir. Buna ek olarak, proteinler, ticari tedarikçilerden temin edilebilen bilinen prosesler ve ürünler kullanilârak saflastlîllâbilmektedir veya bu tür kültür veya bilesenden (örnegin, kültür ortam-an) kEini olarak saflastlEIâbilmektedir. SaflastlEllIhE proteinler daha sonra bir son kullanEÜçin degistirilmis, sterilize edilmis, ylgl paketlenmis ve/veya ambalajlanmEtampon anlam. gelerek “formüle edilebilmektedir”. Farmasötik bilesimler için uygun formülasyonlar, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. baskÇl 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA'da açilZIananlarEiçermektedir.

Burada kullanIiglD gibi “peptit”, “polipeptit” ve “protein” degistirilebilir sekilde kullanilüîaktadlîl ve peptit baglarEIle her birine baglanan iki veya daha fazla amino asit kaIlEtllârlElülçeren bir molekülü ifade etmektedir. Peptitler, polipeptitler ve proteinler, sadece bunlarla sIlHllZblmamak kaydlEa glikozilasyon, Iipid baglanmasÇlsülfatIasma, glutamik asit kallütllârII gama-karboksilasyonu, hidroksilasyon ve ADP-ribozillesmesini içeren modiükasyonlarükapsamaktadü “GIikoprotein”, mannoz kallütilârIEliçeren en az bir oligosakkarit yan zincirine sahip peptitler, polipeptitler ve proteinleri ifade etmektedir.

Glikoproteinler konak hücreye homolog olabilmektedirler veya örnegin, bir Çin hamster yumurtaIlKl (CHO) konak hücresi tarafIdan üretilen bir insan glikoproteini gibi kullanüân konak hücreye örnegin yabanclîgibi heterolog olabilmektedirler. Polipeptitler, protein bazlEl ilaçlarEiçeren bilimsel veya ticari ürün olabilmektedir. Polipeptitler, diger seyler arasIa antikorlar, füzyon proteinleri ve sitokinler içermektedir. Peptitler, polipeptitler ve proteinler, hücre kültürü yöntemleri kullanilârak rekombinant hayvan hücre dizileri ile üretilmektedir ve edilebilmektedir. Eksprese edilen protein(ler), intraselüler olarak uygulanabilmektedir veya kuitarliâbilen ve/veya toplanabilen kültür ortamlEla salgllânabilmektedir.

Bulusun yöntemleri ile üretilebilen polipeptit örnekleri su proteinlerin tümü veya bir kismi büyük oranda benzer veya özdes olan amino asit sekanslarIljlçeren proteinleri içermektedir: tümör nekroz faktörü (TNF), flt3 IigandEl(WO 94/28391), eritropoeitin, trombopoeitin, kappa B'nin reseeptör aktivatörü için Iigand (RANKL, WO 01/36637), tümör nekroz faktörü (TNF)-ilgili apoptoz indükleyici Iigand (TRAIL, WO 97/01633), timik stroma-türevli lenfopoietin, granülosit koloni uyarlEEfaktör, granülosit-makrofaj koloni uyarlElZfaktör (GM- CSF, Avusturalya Patent No. 588819), mast hücresi büyüme faktörü, kök hücre büyüme faktörü (US Patent No.6,204,363), epidermal büyüme faktörü, keratinosid büyüme faktörü, megakaryot büyüme ve gelistirme faktörü, RANTES, insan fibrinojen benzeri 2 protein (FGL2; insülin, insülinotropin, insülin-benzeri büyüme faktörleri, paratiroid hormon, o-interferonlarEl içeren interferonlar, y-interferon, ve konsensus interferonlarüUS Patent Nolar. 4,695,623 ve 4,897471), sinir büyüme faktörü, beyin türevli nötrofik faktör, sinaptotagmin-benzeri proteinler (SLP 1-5), nörotrofin-3, glukagon, interlökinler, koloni uyarlEIZliaktörIer, Ienfotoksin- ß, lösemi inhibe edici faktör, ve onkostatin-M. Diger glikoproteinlerin açlElamaIarDörnegin Insan Sitokinlerinde bulunabilmektedir: Temel ve Klinik ArastBna için El kitapçlglü tüm hacimler (Aggarwal ve Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay ve Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); ve The Cytokine Handbook, Cilt. 1 ve 2 (Thompson ve Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003).

Ek olarak, bulusun yöntemleri, yukari deginilen proteinleri herhangi biri için bir reseptörün amino asit sekansII tümü veya bir klîlnIÇlyukarEla deginilen proteinlerin bir reseptörü veya herhangi biri gibi bir antagonist, ve/veya bu tür reseptörler veya antagonistlere büyük oranda benzer proteinleri içeren proteinleri üretmek için faydallîblabilmektedir. Bu reseptörler ve antagonistler sunlarEiçermektedir: tümör nekroz faktör reseptörünün her iki formu (p55 Interlökin-l (IL-1) reseptörler (türler I ve II; EP Patent No. 0460846, US Patent No. granülosit-makrofaj koloni uyarlîlîllaktör reseptörü, granülosit koloni uyarlEEliaktör reseptörü, onkostatin-M ve lösemi inhibe edici faktör için reseptörler, NF-kappa B'nin reseptör akvitatörü Apoptoz-UyarlEEReseptör (AIR) gibi ölüm alanlarlüberen reseptörler.

Bulus kullanilârak üretilebilen diger proteinler, farklllâsma antijenlerinin amino asit sekanslarII tümü veya bir kElnIHCD proteinleri olarak ifade edilmektedir) veya bunlari herhangi birine büyük oranda benzer kendi Iigandlarlîlveya proteinlerini içeren proteinleri içermektedir. Bu tür antijenler Lökosit Türlemesi VI'da açlKIanmaktadlEl(VI. UluslararasEl Atölye ve Konferans Bildirileri, Kishimoto, Kikutani ve ark., eds., Kobe, Japan, 1996). Benzer CD proteinleri, sonraki çallSh-ialarda açllZlanmaktadlEl Bu tür antijen örnekleri CD22, CD27, Birçok CD antijeni, 41BB ve OX40 de içeren TNF reseptör ailesinin üyeleridir. Ligandlar, genel olarak 4188 Iigand Ele OX40 ligand Elarak TNF ailesinin üyeleridir.

Enzimatik olarak aktif proteinler veya bunlari IigandlarÇlbulus ile ayrlEla üretilebilmektedir. Örnekler, su proteinlerin veya bunlari IigandlarlEllEl veya bunlari herhangi birine büyük oranda benzer sekilde bir proteinin tümü veya bir kEtnIElçeren proteinleri içermektedir: TNF-alfa Dönüstürme Enzimini Içeren bir disintegrin ve metalloproteinaz alan aile üyeleri, çesitli kinazlar, glukoserebrosidaz, süperoksit dismutaz, doku plazminojen aktivatörü, Faktör VIII, Faktör IX, apolipoprotein E, apolipoprotein A-I, globinler, bir IL-2 antagonisti, alfa-1 antitripsin, yukarldla deginilen enzimlerin herhangi biri için Iigandlar, ve çesitli diger enzimler ve kendi IigandlarEl veya herhangi izotip veya altsI- immünoglobülinlere referanslIl içermektedir, aksi belirtilmedigi takdirde, insan, insanlasmlgl kimerik, çoklu-spesifik monoklonal, poliklonal ve oligomerler veya bunlari antijen baglama fragmentlerini içermektedir. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diyakorlar, Fd, dAb, maksikorlar, tek Zincirli antikor molekülleri, tamamlaylîllllîibelirleme bölgesi (CDR) fragmentleri, scFv, diakorlar, triakorlar, tetrakorlar ve bir hedef polipeptite spesiûk antijen baglamasII sunulmaslZilçin yeterli bir immünoglobulinin en az bir bölümünü içeren polipeptitler gibi bir antijen baglama fragmentleri veya bölgelerine sahip proteinler de dahildir. “Antikor” terimi, bunlarla sIlHlüJlmamak kaydMa, antikoru eksprese etmek için bir hücreye nükleik asit verildigi bir konak hücreden izole edilen antikorlar gibi rekombinant araçlar ile hazülanan, eksprese edilen, olusturulan veya izole edilenleri kapsamaktadlEI Antikor örnekleri, sadece bunlarla lellElEblmamak kaydüla, yukari deginilen proteinleri ve/veya asagübki antijenleri içeren proteinlerin herhangi biri veya bir kombinasyonunu 6,235,883) VEGF reseptörü, hepatosit büyüme faktörü, osteoprotegerin IigandÇIinterferon gamma, B Ienfosit stimülatörü (BAFF olarak da bilinen BIyS, THANK, TALL-l, ve 2TNF4; tamamlayiElZlIgE, tümör antijeni CA125, tümör antijeni MUC1, PEM antijeni, LCG (akciger kanseri ile iliskili eksprese edilen bir gen Ürünü olan), HER-2, HER-3, bir tümörle iliskili glikoprotein TAG-72, SK-l antijeni, kolon ve/veya pankreas kanserine sahip hastalar. serumlaria yükseltilmis seviyelerde bulunan tümörle iliskili epitoplar, meme, kolon, yassü hücre, prostat, pankreas, akciger ve/veya karaciger kanser hücreleri üzerinde ve/veya melanom, gliyoma, veya nöroblastom hücreleri üzerinde eksprese edilen kanserle iliskili epitoplar veya proteinler, bir tümörün nekrotik çekirdegi, integrin alfa 4 beta 7, integrin VLA- 4, B2 integrinleri, TRAIL reseptörleri 1, 2, 3, ve 4, RANK, RANK IigandÇlTNF-a, adhezyon molekülü VAP-1, epitel hücre adhezyon molekülü (EpCAM), interselüler adhezyon molekülü-3 (ICAM-3), lökointegrin adhezyon, platelet glikoprotein gp IIb/IIIa, kardiyak miyozin aglEl zincir, paratiroid hormonu, rNAPcZ (faktör VIIa-doku faktörünün bir inhibitörü olan), MHC I, karsinoembriyonik antijen (CEA), alfa-fetoprotein (AFP), tümör nekroz faktörü (TNF), CT LA-4 (bir sitotoksik T lenfositle iliskili antijen), Fc-y-l reseptör, HLA-DR 10 beta, HLA-DR antijen, sklerostin, L-selektin, Respiratuvar Sinsitiyal Virüs, insan immünyetmezlik virüsü (HIV), hepatit B virüsü (HBV), Streptococcus mutans, ve Staph/ycoccus aureus. Bulusun yöntemleri kullanHârak üretilebilen bilinen antikorlarlEl spesifik örnekleri arasIia, bunlarla sIlHJEI olmamak kaydlýla, adalimumab, bevakizumab, infliksimab, abciksimab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliksimab, belimumab, briakinumab, kanakinumab, kertolizumab pegol, setuksimab, konatumumab, denosumab, ekulizumab, gemtuzumab ozogamisin, golimumab, ibritumomab tiuksetan, Iabetuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, ranibizumab, rituksimab, rovelizumab, tokilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab ve zanolimumab bulunmaktadE Bulus, örnegin yukarlEIia deginilen proteinleri herhangi birini içeren rekombinant füzyon proteinlerini üretmek için kullanilâbilmektedir. Örnegin, yukarlöh deginilen proteinler artEIbsin fermuarl:l bir sarilmgl bobin, bir immünoglobulinin bir Fc bölümü veya büyük oranda bir benzer protein gibi bir multimerlesme alanIlEl birini içeren rekombinant füzyon proteinleri, bulusun yöntemleri kullan llârak üretilebilmektedir. BakZE/Eömegin, WO94/ 10308; Lovejoy ve olarak, bu tür rekombinant füzyon proteinleri arasIa bir reseptörün bir bölümünün etanersept (bir p75 TNFRzFc) ve belatasept (CTLA4:Fc) gibi bir antikorun bir Fc bölümüne birlestirildigi proteinler bulunmaktadß Diger yapilândlElna, antikor-ilaç konjugatlarIlEI Bu uygulamada kullanllân terminoloji teknik dahilinde standart oldugunda, belirli terimlerin tanIiIarüburada istemlerin anlam. açlElilZl ve kesinligin garanti edilmesi saglanmaktadlEI Birimler, önekler ve semboller, kendi SI kabul edilen formlarlEIda simgelendirilebilmektedir.

Burada belirtilen saylglal aralilZlar, aralglîbelirleyen sayHârEiçermektedir ve belirlenen aralllZJ içinde her tamsaylsîükapsamaktadlüve onlarI yardIic-lE Aksi belirtilmedigi takdirde, terim organizasyonel amaçlar içindir ve açlKIanan konuyu sIlEIlamamathedeflemektedir. Burada açiKlanan yöntemler ve teknikler genel olarak teknikte iyi bilinen konvansiyonel yöntemlere göre gerçeklestirilmektedir ve aksi belirtilmedigi takdirde mevcut açilZJama ile belirtilen ve açEElanan çesitli genel ve daha spesifik referanslarda açllZlandlglEgibidir. BakIlîl örnegin, Sambrook ve ark. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. basküCold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) ve Ausubel ve ark., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), ve Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990).

Mevcut bulus, bulusun ayrElyönlerinin tekli gösterimi olarak amaçlanan burada açllglanan spesifik yapllândlîilnalar ile kapsamlBIlEllamayacaktlEl Asag-ki örnekler, açlKlanan yöntemlerin yapllândlîn'nalarIÜ/e yönlerini göstermektedir ve sIlEllaylEßlmamayElhedeflemektedir. ÖRNEKLER Yüksek mannoz glikoform içerigi ve toplam proteinin yönlendirilmesi amaçlarlîliçin bir biyoreaktör sistem içinde glikoz için alternatif karbonhidrat türlerinin yer degistirdigi belirtilmektedir.

Sürekli glikoz beslemesi ve kapsül galaktoz beslemesi ile beslemeli kesikli kültür Hücre kültürü büyümesi üzerindeki indirgenmis glikoz ve bir alternatif karbon kaynagII etkileri, titre ve ürün kalitesi, özellikle Man5 seviyeleri, bir beslemeli kesikli proses kullanllârak farkllîglikoz ve galaktoz konsantrasyonlarlîtest edilerek degerlendirilmistir. Deneyin amacÇl hücre kültürü ortamIa glikoz miktarElazaltlIiElken, bir galaktoz beslemesinden bir farklEI karbon kaynag saglanmasIlB On iki 2L Applikon biyoreaktörleri, bir serumsuz hücre kültürü ortamII bir çallgma hacminde (1L) 20e5 canlElliücreler/ml'de bir rekombinant IgGZ antikorunu eksprese eden CHO hücreleri ile aslßnmlSIlEl Kültürler 36°C'de, %30 çözündürülmüs oksijende (DO), 290 dds çalkalamada ve 6.95 pH'ta tutulmustur. Bir tirozin-sistein takviyesi, baslangiç] hacmine dayanarak volumetrik olarak %0.36'da günler 2 ve S'te beslenmistir. C0; ve 1M sodyum karbonat bazlarÇlpH kontrolü için gerektigi gibi eklendi.

Kültür ortamII kapsül beslemesi, baslanglgl hacminin %9'una dayanarak volumetrik olarak, günler 2, 5 ve 9'da idi.

Bir iki faktörlü deney tasarÇl hücre kültürü ortamIda degisken miktarlarda glikoz ve galaktoz ile hücre kültürü performanslîlve ürün kalitesi niteliklerini degerlendirmek Için seçilmistir. Deney tasarIilJ6 tedaviden, Tablo 1'de gösterildigi gibi her tedavi için çift biyoreaktörden olusmustur. Birinci faktör, gün Z'den baslayarak 3, 2 veya 1 g/gün glikozu tasIiak için sürekli glikoz beslemesi (sürekli glikoz) idi. 3 g/gün glikozlu tedaviler ayrß, 3 g/L glikoz konsantrasyonunu sürdürmek için ilave kapsül glikoz beslemeleri almEtlE Amaç, asla bir glikoz sIEIbmaslîila sahip olmayarak, pozitif kontroller olarak 3 g/gün tedavilerinin sürdürülmesini garanti etmektir.

Ikinci faktör, (1+, 2+, 3+) ile kapsül beslemeleri idi ve (1-, 2-, 3-) galaktoz (kapsül galaktoz) yoktu. Amaç, gün Z'den baslayarak 4 g/L üzerinde hücre kültürü ortamIa galaktoz konsantrasyonunun sürdürülmesidir.

Tablo 1 Beslemeli kesikli deney için 2-faktörlü deneysel tasarIi Çalisma Sürekli Glikoz, g/gün Kapsül Galaktoz g/L 719 2 O 720 3 + kapsül glu O 721 3 + kapsül glu 4 722 1 0 723 1 4 724 2 0 725 2 4 726 3 + kapsül glu 0 727 2 4 728 1 0 729 3 + kapsül glu 4 730 1 4 Kültür çallgtnasüsßsia, günlük numuneler kültüre erisim için allEtnlStlEl CanlElhücre yogunlugu (VCD) ve canllIJE) Vi-Hücresi kullanan kesikli ölçekte belirlenmistir (Beckman Coulter, Brea, CA). Paketlenmis hücre hacmi VquPAC (Sartorius, Goettingen, Almanya) kullanüârak belirlenmistir. pH, çözündürülmüs karbon dioksit (pCOZ), ve çözündürülmüs oksijen (pOZ), bir Siemens (Chiron Diagnostics, CA. kullanilârak belirlenmistir. Galaktoz konsantrasyonu, bir YSI Model 2700 Select Biochemistry Analizörü (YSI Incorporated, Yellow Springs, OH) kullanllârak elde edilmistir. Metabolit verileri (glikoz, ozmometresi kullanilârak belirlenmistir (Advanced Instruments, Norwood, MA). Süpernatan numuneler -80°C'de depolanmlgtß Deneylerin sonunda, dondurulmus hücresiz Süpernatan numuneler eritilmistir ve titre ve glikan analizi içine toplu olarak sunulmustur.

Titre, HPLC analizi kullanüârak belirlendi. FarkllZl zaman noktalarIan hücre kültürü Süpernatan numuneleri eritilmis ve 0.2 pm membran ile bir 96 kuyucuklu plakada yeniden filtrelenmistir. Numuneler 2 mL/dk akE oranIa Poros® A/20 2.1 mm D x30 mm L kolon (Applied Biosystems, Foster City, CA) kullan [lârak 280 nm'de UV tespiti ile donatllân bir HPLC mM sodyum klorit ve %2 Asetik asit/100 mM glisin kullanilârak gradyan yöntem, her 5 dakika boyunca her protein numunesini ayrlgtünaslîçin kullanianlSIB Glikan analizi için, hücre kültürü Süpernatan numuneleri toplanmStlEl ve Protein A ile saflastlEllBilStlE Saflastlîllân numuneler PNGase-F ile islem görmüstür ve N-baglEglikanlarI saIlEmasEIçin 2 saat boyunca 37°C'de asilânmlgtlEl Enzimatik olarak saIlErnISIinkanlar, 75 dakika boyunca 80°C'de 2-aminoben20ik asit (2-AA) ile isaretlenmistir. AslEID-AA etiketi daha sonra bir Glycoclean S kartusu ile uzaklast-ElNumuneler bir gece buharlastlîllîhlgtßve elde edilen kuru pelet, sonraki HILIC (hidrofilik etkilesim slîEkromatografisi) analizi için su ile sulandlEEhEtlEl Glikanlar enjekte edilmistir ve yüksek organik kosullarda kolona baglanmlgtß ve bir sulu amonyak format tamponunun bir artan gradyanlZIile ayrlgtlülhßtß Floresan tespiti, glikan elüsyonunu izlemek için kullanllîhlgtlîl ve major ve minör glikan türlerinin göreceli yüzdesi hesaplanmlgtE Sürekli glikoz beslemesi ve kapsül galaktoz beslemesi ile beslemeli kesikli prosesten elde edilen sonuçlar tedavileri ayrlEh kendi seviyelerini 3 g/L yukar- tutmak için kapsül glikoz beslemesi almlgtlü Hiç kapsül galaktoz beslemesi almayan Çallgrnalar 720 ve 726, rutin olarak glikoz kapsül beslemesi gerektirirken, galaktoz (çallgmalar 721 ve 729) alan çallglnalar ise lel sila kapsül glikoz beslemeleri gerektirmemistir. 1 veya 2 g/gün sürekli glikoz beslemesi alan hücre kültürleri, ilave kapsül glikoz beslemeleri almamlglEI Bu kültürlerin tüketilmis ortam analizi, kültürün kapsül galaktoz beslemelerinin alIlEi allEmadigilEUan bagislîl olarak glikoz konsantrasyonunun, gün 4'te 0 g/L oldugunu göstermistir. (Sekil 1A). 730), orijinal hedef 4 g/L üzerinde olurken, galaktoz seviyeleri 2.5 g/L üzerinde sürdürülmüstür. (Sekil 18) Galaktoz tüketim numaralarljanaliz edildiginde, sIlEJIZIglikozlu kültürler için veya sIlBJEglikoz olmadan (3 g/gün sürekli glikoz beslemesi artD beslemesi alan Çallginalar) kültürlerde ne kadar galaktoz tüketildigi (2 g/gün veya 1 g/gün sürekli glikoz beslemesi alan Çallginalar) hakkIa istatistiksel olarak anlamIEfark oldugu bulunmustur. SIIEliElinkozIu kültürler, toplam galaktozun ortalama bir 4.60 gramIEI tüketirken, glikoz üzerinde sIlEIbma olmadan bunlar ortalama bir 3.81 gram tüketmistir.

Sürekli glikoz beslemesi ve kapsül galaktoz beslemesi, canlEhücre yogunlugu ve canlIDEI üzerinde önemli bir etkiye sahipti. Bir kapsül galaktoz beslemesi ile birlikte sIlEIIElinkoz kütürleri (2 g/gün veya 1 g/gün sürekli glikoz beslemesi alan Çallgmalar), iyi canlEhücre yogunlugu ve canlEigiEtürdürmüstür. Bununla birlikte, kapsül galaktoz beslemelerini almamlgl olan sIlEIlÜinkozlu kültürler (2 g/gün veya 1 g/gün sürekli glikoz beslemesi alan Çallgnalar), gün 4'te glikoz bir sIlEIlamaya ulastigilEUa canIIZI hücre yogunlugunu ve canIIIJgiEl sürdüremeyebilmektedir. (Sekiller 1C ve 10) Yukarlabki veriler, galaktozun, glikoz hücre kültürü ortamlEUa sIlfllEdildugunda, bir alternatif karbon kaynaglîblarak kullanüâbilecegini göstermistir. Kapsül galaktoz beslemesi ile birlikte sIlEllEglikoza (2 g/gün veya 1 g/gün sürekli glikoz beslemesi alan Çallginalar) sahip kültürler iyi canIElhücre yogunlugu ve canlmljlßürdürebilirken, glikozsuz sIIBlamaya sahip bu kültürler ile karsüâst-Igilîida titre önemli oranda indirgenmistir (3 g/gün sürekli glikoz beslemesi alan Çalismalar), bakIlîl Sekil IE. Istatistiksel analiz, sürekli glikoz besleme seviyesinin titrede en fazla etkiye sahip oldugunu; kapsül galaktoz beslemesinin önemli fakat daha az derecelerde önemli oldugunu göstermistir.

Gün 7'de Man5 seviyeleri, bir galaktoz beslemesinden bagIislîI olarak 1 g/gün ila 3 g/gün arasIa glikoz beslemesi artEEIIe orant[[l]blarak indirgenmistir. Sllüiügilikoz, kültürdeki Man5 artlîile sonuçlanmlglolan sadece istatistiksel olarak önemli faktörler idi. (Sekil IF) SIlîllElglikoz, alternatif karbon kaynagElolarak galaktoza sahip perfüzyon prosesi ve glutaminin eklenmesi YukarIki beslemeli kesikli çalisma, sadece sIlîllaylEIglikozun Man5 artlglýla sonuçlanan bir faktör degildir, bununla birlikte, sIIEliaylElîgilikozlu kültürler canllîlhücre yogunlugu veya hücre canIIJJEI sürdüremeyebilmektedir. Alternatif karbon kaynaglî.] galaktoz, Man5 artlglile sonuçlanmamlgtlü ancak CHO hücreleri taraflian katabolize edilmistir ve eklendikleri bu kültürlerde iyi canlEliiücre yogunlugu ve hücre canlElglI sürdürmüstür. Bununla birlikte, titre, mevcut alternatif karbon kaynagüle sIElilIglikoz seviyeleri ile önemli oranda indirgenmistir.

Titrede önemli gelistirme olmadan istenen ürün kalitesine ulasllBiasÇlkarsllâstlElâbilir ürün kalitesi olmadan titrede önemli gelistirmeye ulasllmaslîgibi aynlIiHurumda ticari olarak uygun degildir.

Titrenin sürdürülmesi veya gelistirilmesine ve istenen ürün kalitesine ulasilüîaslüb yönelik amaçlara ulasmak için, hücre kültürü performansüie Man5 seviyelerin üzerine düsük glikoz ve bir alternatif karbon kaynagII etkileri, bir perfüzyon hücre kültüründe test edilmistir.

Deney tasarilZB tedaviden, her tedavi için çift biyoreaktörden olusmustur.

Gün 0'da, bir rekombinant IgG2 antikorunu eksprese eden CHO hücreleri, 5 ila 8 g/L glikoz içeren bir 1300 ml serumsuz belirlenen hücre kültürünün bir çalisma hacminde 1x106 canIEl hücreler/mL'de 3L üretim biyoreaktörleri içine asllânmlgtlü Kültürler 36°C'de tutulmustur ve 400 DDS'de çalkalama ile %30 oksijende çözündürülmüstür. Kültür, üç gün boyunca kesikli modda büyütüldü. Tüketilmis ortam analizindeki glikoz konsantrasyonu 1 ila 8 g/L arallgllda Günler 3 ve 6'da, kültür, bir konsantre serumsuz belirlenen besi ortamII kapsül beslemelerini gün 3'te %8 baslanglÇlçallglna hacmi ve gün 6'da %8 baslangüçallgma hacmi ile almlgtlü Kapsül glikoz beslemeleri kültürde bir hedef konsantrasyonu 8 g/L'yi sürdürmek için günler 3, 4, 5, 6 ve 7'de yapilBilStE Tüketilmis ortam analizindeki glikoz 1 ila 8 g/L arallglIa idi.

Perfüzyon, 0.48 Hac/gün bir perfüzyon oranIa gün 7'de basladDPerfüzyona bir degisken tegetsel ak& perfüzyon ve bir 30 kDa oyuk fiber filtre (GE Healthcare, Uppsala, Isveç) ile filtrasyon sistemi (Refine Technologies, Hanover, NJ) kullanllârak ulasllüîlSIlEl Serumsuz belirlenen perfüzyon ortamIZIpH 7.0'da 15 g/L glikoz içermekteydi. Tüketilmis ortam analizindeki glikoz 3 ila 8 g/L araligan idi.

Gün 11'de, kayma, galaktoz içeren ve bir indirgenmis glikoz miktarlEla sahip bir serumsuz, belirlenmis perfüzyon ortam. yapüüilgtlîl bakIlîl Tablo 2a. Perfüzyon ortamIda glikoz konsantrasyonu, 2 g/L ila 4 g/L'ye azaltüüilgtß Galaktoz, 6 g/L'de ortam içine birlestirilmektedir. %30 galaktoz stok çözeltisinin kapsül beslemeleri, yukar-ki hücre kültüründe veya 4 g/L konsantrasyonunda galaktozu sürdürme ihtiyaclîilarak kullanHBwlStE Bu deney için, perfüzyon kültür ortamÇIglikoz gibi glutamin, glutamin sIElhmasÜlurumunda canlEhücre yogunlugu, hücre canlilIgütitre ve/veya ManS seviyeleri üzerine herhangi bir etkiye sahip oldugunda, 5 veya 10 mM'de glutamin içermistir. Literatür, düsük glutamin konsantrasyonlarII hücre kültürü üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabildigini ileri sürmüstür. Kültürler, gün 17'de toplanana kadar, bu hücre kültürü ortamEIIe serpilmistir.

Tablo Za. Gün 11'de serumsuz belirlenen perfüzyon kültür ortam [iha glikoz, galaktoz ve glutamin konsantrasyonu ÇallSlna Glikoz g/L Galaktoz g/L Glutamin mM Hücre kültür profilleri Sekil 2'de gösterilmektedir. CanlElhücre yogunlugu ve canl[[[El profilleri, karsllâstlîllâbilir trendleri göstermektedir (Sekiller 2A ve 28). Düsük glikoz (2 g/L) ve düsük glutamin (5 mM) kosullarII canlüglügünler 15 ve 17 araleUa bir düsme trendi göstermistir.

Bununla birlikte, tüketilmis ortam analizinde glutamin konsantrasyonu, glutaminin test edilen herhangi bir kosul altIa sIIthndlElIhadgllîgöstermistir (Sekil ZC).

SaslElllEEbulgu, Sekil 2D'de gösterilen paketlenmis hücre hacmi ayarlanmlgl Titrenin (PCV Titresi), glikoz sIlElllIcblmayan bir perfüzyon prosesi için görülen degerlere yakI olmasIIE Bu örnekte perfüzyon deneylerinden titre, sadece %50 titre ortaya çlKlarmlgÖrnek 1'in beslemeli kesikli prosesinde görülenden daha büyük idi. Bu veriler, glikoz, bir perfüzyon prosesinde bir beslemeli kesikli proseste olandan daha sIlEllDoIdugunda, farkIElbir fizyolojik durumu gösterdigini ortaya koymaktadlB Tüketilmis ortam analizi, ÇallSina 83 dlSlEUa, perfüzyon ortamia 2 g/L glikoz ile islem gören kültür süpernatanlarIa glikoz konsantrasyonunun gün 12'de slfJEia ulastlg1II3'e 4 g/L glikoz ile islem gören kültür süpernatanlarIa glikoz konsantrasyonunun gün 13'te sm ulast[glIEl göstermektedir (Sekil 2E). Tüketilmis ortam analizi, kültürlerin sIlEllEbir glikoz durumunda oldugunu onaylamlStlE Genel olarak, kültürdeki galaktoz konsantrasyonu, 4 g/L üzerinde kalan tüketilmis ortam analizi ile belirlenmistir (Sekil 2F).

Tablo 2b, perfüzyon ortam-a glikoz konsantrasyonu 2 g/L'ye düsürüldügünde, Man5 türlerinin arttlglllîgöstermektedir. Zaman aklglJManS türlerinin kültür süresinde bir artlglile artt-IlgllîdGün 15 ila Gün 17) göstermektedir. Perfüzyon ortamIa glikoz konsantrasyonu 4 g/L'ye ant-@lida her sey esit oldugunda, Man5 türleri buna göre artmlgtlü Bu sonuçlar, sIlEIlaylEllilikozun Man5 seviyelerinde bir artSla sonuçland[gllEll]/e sIlEllÜlurumun perfüzyon hücre kültürü ortamIa glikoz konsantrasyonunu 2 g/L'ye düsürerek ve tüketilmis ortam analizi ile onaylayarak baslatllâbildigini göstermektedir. Bununla birlikte, proses varyasyonu Man5 sIIlEIlamasü ve modifikasyonunu etkileyebilmektedir. Çallgina 83, 4g/L glikoz alan diger çallginadan daha yüksek bir Man5 degeri göstermistir. Bu durumda Çallgma 83, 2 g/L glikoz alan kültürlerin herhangi biri ve hücre kütlesi, türlerindeki glikoz (Çallgl'nalar 79 ve 81) yerine daha yüksek canlühücre yogunlugu ve paketlenmis hücre hacmi ayarlanmßtitreye (Sekiller 2A ve 2D) sahipti, ancak ÇallStnalar 79 ve 81 gibi, gün 12'de tüketilmis ortam analizi ile ölçüldügü gibi daha düsük bir glikoz konsantrasyonuna ulasmlgtlîi Bu, 4g/L'de glikoz alan herhangi bir kültürden daha erken idi (Sekil 2E). Bu yüzden, hücre kütlesi ve/veya proses varyasyonu gibi faktörler, sIlEHEbir glikoz durumu ile sonuçlanan glikoz besleme konsantrasyonunu etkileyebilmektedir. Hücre yogunlugunun tüketilmis ortamda 0 g/L'ye yaklE] glikoz konsantrasyonuna yol açan gün 12'de daha yüksek (Sekil 2A) oldugu durumda, hücre kültürü bir yüksek glikoz (4g/L) perfüzyon besleme ortamElile beslenirken bir sIlEIJÜgilikoz durumu baslatllßîaktadlü Glikoz bir kere sIlEIIand-[gilöba, Man5 seviyeleri artmlgtß Tablo 2b. Gün 11'de perfüzyon ortam formülasyonundaki degisikligi takiben gün 15 ve 17'de Man5 Çallgina Glikoz g/L Galaktoz g/L Glutamin mM Gün 15 % Man5 Gün 17 % Man5 Indirgenmis glikoz ve yüksek galaktozun bir kombinasyonu ile perfüzyon prosesi Bir deney, 0, 1.5 veya 3 g/L glikoz konsantrasyonlaria formüle edilen serumsuz belirlenen bir perfüzyon ortamlZ(pH 7.0) ile gerçeklestirilmistir. Galaktoz, yukari açlKlanan deneyin toplam tüketim oranlEla baglEblarak 10, 11.5 veya 13 g/L'de eklenmistir. Hem glikoz hem galaktoz, perfüzyon ortamlEEi birlestirilmistir, bu yüzden kültür ya glikoz ya da galaktozun kapsül beslemeleri olmadan sürdürülebilmektedir. Birlesme prosesin karmasllZHglIEihdirgemis ve uygunlugunu gelistirmistir. Deney, yukarda açllZIand[gll:gibi, gün 0 ila 10'da aynüaesleme stratejileri kullanilârak gerçeklestirilmistir. Tablo 3, günler 11 ila 17 arasia kullanllân perfüzyon ortam formülasyonlarII kombinasyonlarlßaglamaktadlE Tablo 3. Perfüzyon ortamIEUa glikoz ve galaktozun deney tasarlü Çallgina Glikoz g/L Galaktoz g/L 103 3 13 104 0 10 105 0 13 106 0 10 107 1.5 11.5 108 0 13 109* 3 10 111 3 13 112 3 10 113 1.5 11.5 * Çallglna (109), biyoreaktör isletim hatasUan dolaylîlsekillere dahil edilmemistir.

Sekil 3'teki hücre kültürü profilleri, test edilen tüm hücre kültürü kosullarII gün 11 kaymasIEtakiben glikoz sIlEIllZbldugunu (Sekil 3A) ve tüketilmis ortam deneyinde ölçülen galaktoz konsantrasyonlarIlEl, perfüzyon ortamia birlesen galaktoz konsantrasyonlar- orantlIJIloldugu 4 ila 8 g/L'de sürdürüldügünü (Sekil 38) göstermektedir. Laktat seviyesi, glikoz gün 12'de bir sIlBhmaya ulastlgllüda sm düsmüstür (Sekil 3C). Amonyak seviyesi, glikoz bir sIlEllamaya ulasmadan önce gün 10'dan baslayarak artm lgtlEI(Sekil 3D). Gün 11'de baslayarak düsen glikoz konsantrasyonunun düsük büyüme, canIIIJIZl ve titre ile sonuçlandlg1II görülmesi çok ilginç idi (Sekiller 3E ila 3G). Bu sonuçlar, sIlEllZglikoz, sIlBID olmayan glutaminin, bir perfüzyon prosesinde hatta Örnek 1'de beslemeli kesikli proseste titre indirgemesine neden olmaktadlü AyrlEla, 2 ila 3 g/ ve hatta 4g/L'ye kadar glikoz seviyesi Man5 seviyelerindeki artlg ile sonuçlanmßtlîl glikoz seviyeleri ayrlEla, daha yüksek titre seviyelerinin sürdürülmesine yardIi saglamlgtlEl JMP yazEllîliIEUMP Inc. Cary, NC) kullanarak istatistiksel analiz, glikoz konsantrasyonunun titreyi etkiledigi sadece istatistiksel olarak önemli bir faktör (p degeri = 0.032) oldugunu göstermistir. Galaktoz titre için istatistiksel olarak önemli faktör degildi (Sekil 4A). Diger bir yandan hem glikoz hem de galaktoz Man5 türlerini etkilemis istatistiksel olarak anlamlEl faktörler idi, ancak glikoz ve galaktoz arasIaki etkilesim istatistiksel olarak anlamlEidi (p degeri = 0.0613). (Sekil 48). Galaktoz konsantrasyonu ne kadar yüksek oldukça, Man5 türleri üzerindeki sIlEllÜgialaktoz etkisi de artmaktadlEl Toplam Man5 seviyeleri, glikoz 0 ila 3 g/L aral[g]Ia oldugunda artmlStlElve düzeltilmistir ve glikoz seviyeleri 4 g/L veya daha fazla oldugunda azalmlStlE Sekil 5, günler 11, 13, 15 ve 17'de Man5 türlerinin yüzdesindeki artlglîgöstermektedir. Tüm kültür kosullarEIçin, yüzde Man5 türleri, gün 11'de yaklasilZlO/oZ'de baslamlgtEve ardIan yavas yavas gün 17'de %10 üzerine artmlStE Yüzde Man5 türlerindeki en önemli artis] glikoz sIlElllZblmaya basladlgllîida, günler 11 ila 13'te olmustur.

Glikoz titreyi etkilediginden dolayühücre kütlesi, hücre kültürü prosesi ve kullanllân alternatif karbon kaynag @ibi hücre kültürü kosullar. bagIlJJlarak bir uygun seviyede hücre canIUJIjlÇl yogunlugu ve titresi sürdürülürken, Man5'teki bir artlSEl destekleyecek en yüksek konsantrasyonda glikoz beslenmelidir. Örnegin, 15 ila 25 x 106 hücreler/ml'ye sahip bir perfüzyon hücre kültürü için, 10 ila 13g/L galaktoz ile kombinasyon halinde 0 ila 4g/L glikoz konsantrasyonlarüManS artlglîle sonuçlanmlstE Glikoz (g/I) Kültür süresi (Gün) Sekil 1A Galaktoz (gl L) 2 3 4 5 6 7 8 Kültür Süresi (Gün) Kültür Süresi (Gün) Sekil ic Canlmli (0/0) 1 0080 8888' Kültür Süresi (Gün) Sekil 1D Titre ( mg/ L) 2 3 4 5 6 7 8 Kültür Süresi (Gün) Sekil 1E 1.5 2 2.5 Sürekli Glikoz, 9/ gün (p = 0.0466) Sekil 1F 355.209_ mo: 560› 9.55.28 Kültür Süresi (Gün) Sekil 2A 80 .503010 Kültür Süresi (Gün) Glutamin [GLN] (uM) 2000 ` Kültür Süresi (Gün) Sekil 2c PCV Adi Titre (9/ L) /32 Kültür Süresi (Gün) Glikoz (gIL) O-INÇOAUIOÖNIGDCO 11/32 Kültür Süresi (Gün) Sekil 2E Galaktoz 12/32 Kültür Süresi (Gün) Sekil 2i= Glikoz (g/L) Kültür Süresi (Gün) Sekil 3A 13/32 Galaktoz (g/L) 14/32 Kültür Süresi (Gün) Kültür Süresi (Gün) Sekil 3c /32 Amonyak (mM) 16/32 Kültür Süresi (Gün) Sekil 3D 17/32 383.90:: mo: amigo› Euaügu Kültür Süresi (Gün) Sekil 3E CanIUJM (°/o) 18/32 Kültür Süresi (Gün) Sekil 3i= 19/32 PCV Adi Titre (9/ L) Kültür Süresi (Gün) /32 Di7Adj .84' 77 Terim_ Tahmin Std Hata t OranEl Prob› |t| Sekil 4A 21/32 g : 12-: .J ,o «I E '1_._-.-'..a' "i-__in 8-4 i' 'p _. 4" I I I 1 I I I I | I I I OOFnNnmnFnNni-i C) 7_ N 1- O 1* .'. 1- “ '- Glikoz Galaktoz | Paraihetre Tahminleri ] Terim Tahmin Std HataTOI'aI'IEProb› ItI 22/32 Model ile Man5 karsI Gün Man5 Glikoz (g/L) U'IONWGJ Kültür Süresi (Gün) Sekil 6A 23/32 24/32 Sükroz (9/ L) o 1 . . _ ._ _ Kültür Süresi (Gün) Sekil GB /32 0 5 O 5 0 5 3 2 2 ..I ..I Kültür Süresi (Gün) Sekil ac 26/32 Kültür Süresi (Gün) Sekil 6D Amonvak (mM) 27/32 Kültür Süresi (Gün) Sekil 6E 28/32 Kültür Süresi (Gün) Sekil 6F PCV Adi Titre (9/ L) 29/32 Kültür Süresi (Gün) Sekil GG /32 3 i: @15- Glikoz Sükroz Sekil 7A 31/32 2 n 13* . ?5 w 0 $ 10~ 8-11 ' I Y I ' 1 I (11 m `t in !0 Glikoz Terim Tahmin Std HatatOranEProb>ltl 32/32 E ?35" E 65' ,i .._ N D 'I' 0 WNDODFNHG Glikoz Sükroz Ü'arametre Tahminleri _] Terim Tahmin Std Hata T OranüProb› |t|

Claims (3)

1. ISTEMLER 1. Memeli hücre kültürü slßslßha bir rekombinant protein üzerinde bir veya daha fazla yüksek mannoz glikan türünün ayarlanmasi yönelik bir yöntem olup, asaglkileri içermektedir: 5 ila 8 g/L glikoz içeren bir serumsuz belirlenen kültür ortamlZile bir biyoreaktörde bir memeli hücre kültürünün olusturulmasEI bir büyüme fazEsBasIa memeli hücrelerin büyütülmesi ve 5 ila 8 g/L glikoza sahip bir serumsuz belirlenen besleme ortamII kapsül beslemeleri ile kültür ortamII takviye edilmesi; 5 ila 15 g/L glikoza sahip bir serumsuz perfüzyon ortamElle perfüzyon aracliglüla hücre kültüründe bir üretim fazlEllEl baslatllüiaslîlve üretim fazlîlslâsüda daha önceden belirlenmis bir zaman noktasIEUa, azaltmg bir miktarda glikoz içeren veya bununla takviye edilen bir düsük glikoz perfüzyon ortamEl ile hücre kültürünün serpilmesi araclIJgilýla glikoz konsantrasyonunun sIlEllaylEEI konsantrasyonlara düsürülmesi, burada söz konusu perfüzyon ortamlâyrEh galaktoz içermektedir veya galaktoz ile takviye edilmektedir.
2. 2. Azaltllüîlgl glikoz miktarIlEl, 0 g/L'de veya civarIda tüketilmis ortamda bir glikoz konsantrasyonuna yol açmasügin yeterli oldugu, Istem 1'e göre yöntem.
3. 3. Düsük glikoz perfüzyon ortamIa azaltlßiElglikoz miktarII konsantrasyonunun 0 ila 3 g/L, 2 ila 3 g/L arallglIa oldugu, 2.5 g/L oldugu veya 0 g/L oldugu, Istem 1 veya 2'ye göre yöntem. g/L arallgllda oldugu, veya 11.5 g/L oldugu, Istemler 1 veya 3'ten herhangi birine göre yöntem. 5. Perfüzyonun (a) hücre kültürünün gün 5'inde veya civaria veya gün 9'unda veya civarIda veya (b) hücre kültürünün gün 5'inde veya civarIia veya gün 7'sinde veya civarlElda baslad [giüIstemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre yöntem. 6. Istemler 1 ila 5'ten herhangi birine göre yöntem olup, burada: (a) hücreler bir üretim faz. ulastlglliîha, perfüzyon baslamaktadlEl (b) perfüzyon, sürekli perfüzyon içermektedir; (c) perfüzyon oranßabittir; (d) perfüzyon, günlük 1.0 çallgma hacmine esit veya daha az bir oranda gerçeklestirilmektedir; (e) perfüzyon, hücre kültürü slßslia günlük 0.25 çallglna hacminden günlük 1.0 çallgina hacmine üretim fazßüsia artan bir oranda gerçeklestirilmektedir; (f) perfüzyon, hücre kültürünün gün 9 ila gün 11'inin günlük 1.0 çallgtna hacmine ulasan bir oranda gerçeklestirilmektedir; veya (9) perfüzyon, hücre kültürünün gün 10'unda günlük 1.0 çallgna hacmine ulasan bir oranda gerçeklestirilmektedir. Istemler 1 ila 6'dan herhangi birine göre yöntem olup, burada (a) serumsuz besleme ortamII kapsül beslemeleri, hücre kültürünün gün 3 veya gün 4'ünde baslamaktadlÜ ve/veya (b) memeli hücre kültürü, bir serumsuz kültür ortamlEUa en az 0.5 x 106 ila 3.0 x asllânmasEIJe olusturulmaktadE AyrlEla 36°C ila 31°C araleUa veya 36°C ila 33°C araslfitla bir slîlaklllZl kaymasEiçeren, Istemler 1 ila 7'den herhangi birine göre yöntem. Sükllß kaymasIlEl, (a) büyüme fazü/e üretim fazllrasüdaki geçiste veya (b) üretim fazßüslühla meydana geldigi, Istem 8'e göre yöntem. Istemler 1 ila 9'dan herhangi birine göre yöntem olup, ayrlaa hücre büyümesi- durdurmasII asaglfllakiler ile indüklenmesini içermektedir: (a) L-asparajin açl[gllElEllakiben 5 mM veya daha az bir L-asparajin konsantrasyonuna sahip bir serumsuz perfüzyon ortamljle perfüzyon, veya (b) 5 mM veya daha az bir L-asparajin konsantrasyonuna sahip bir serumsuz perfüzyon ortam [ile perfüzyon. Serumsuz perfüzyon ortam a L-asparajin konsantrasyonunun 5 mM'ye esit veya daha az, 4.0 mM'ye esit veya daha az, 3.0 mM'ye esit veya daha az, 2.0 mM'ye esit veya daha az, 1.0 mM'ye esit veya daha az oldugu veya 0 mM oldugu, Istem 10'a göre yöntem. Hücre kültürü ortamII L-asparajin konsantrasyonunun, L-asparajin açllgllîöncesinde ve leileUa izlendigi, Istem 10 veya 11'e göre yöntem. Ayrlîb bir üretim fazßßsia paketlenmis hücre hacminin %35'e esit veya daha az, veya %30'a esit veya daha az olmasIEliçeren, Istege baglElolarak memeli hücre 1 ila 12'den herhangi birine göre yöntem. Perfüzyonun, bir degisken tegetsel aklgl ile, istege baglEblarak bir ultrafiltre veya bir mikrofiltre kullanilarak gerçeklestirildigi, Istemler 1 ila 13'ten herhangi birine göre yöntem. kapasiteye sahip oldugu, Istemler 1 ila 14'ten herhangi birine göre yöntem. Yüksek mannoz glikan türlerinin Mannoz 5 oldugu, önceki Istemlerden herhangi birine göre yöntem. Memeli hücrelerinin Çin Hamster Yumurtalilg (CHO) hücreleri oldugu, önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem. Rekombinant proteinin bir insan antikoru, bir insanlastlüliilgl antikor, bir kimerik antikor, bir rekombinant füzyon proteini veya bir sitokin oldugu, önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem. AyrlEla hücre kültürü tarafIan üretilen rekombinant proteininin toplanmasi yönelik bir adli Içeren, önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem. Hücre kültürü tarafIdan üretilen rekombinant proteinin saflast-[glü/e bir farmasötik olarak uygun formülasyonda formüle edildigi, önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem. Hücrelerin galaktoz ile kombinasyon halinde sIIEIiÜinkoza maruz bükllüiadglîbir kültür ile klýbslandgiia, yüksek mannoz içerikli türlerin rekombinant protein üretiminin artt-[glüönceki istemlerden herhangi birine göre yöntem. Rekombinant proteinin bir antikor oldugu, memeli hücrelerin CHO hücreleri oldugu, yüksek mannoz glikan türlerinin Mannoz 5 oldugu, ve Mannoz 5 türlerinin antikor üretiminin, CHO hücrelerinin galaktoz ile kombinasyon halinde sIlEllüglikoza maruz büküßîad Igilîbir kültür ile klýbslandgllda artt-lgiü Istemler 1 ila 15 ve 19 ila 20'den herhangi birine göre yöntem.