ES2691801T3 - Métodos para incrementar el contenido de manosa de proteínas recombinantes - Google Patents

Abstract

Un método para la modulación de una o más especies de glucano de alta manosa sobre una proteína recombinante durante el cultivo de célula mamífera que comprende: establecer un cultivo de célula mamífera en un biorreactor con un medio de cultivo definido libre de suero que contiene 5 a 8 g/l de glucosa; cultivar las células mamíferas durante una fase de crecimiento y complementar el medio de cultivo con alimentaciones por bolo de un medio de alimentación definido libre de suero de 5 a 8 g/l de glucosa; iniciar una fase de producción en el cultivo celular mediante perfusión con un medio de perfusión libre de suero que tiene 5 a 15 g/l de glucosa; y en un momento predeterminado durante la fase de producción, reducir la concentración de glucosa a concentraciones limitantes mediante perfusión del cultivo celular con un medio de perfusión de baja glucosa que contiene o está complementado con una cantidad disminuida de glucosa, en la que dicho medio de perfusión contiene además o está complementado con galactosa.

Description

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DESCRIPCION

Metodos para incrementar el contenido de manosa de proteinas recombinantes Antecedentes de la invencion

Los anticuerpos IgG producidos en cultivos de celula mamifera pueden contener niveles variados de glucoformas de alta manosa (AM) tales como Manosa5 (Man5), Manosa6 (Man6), Manosa7 (Man7), Manosa8 (Man8) y Manosa9 (Man9). El contenido de glucoforma de alta manosa de proteinas terapeuticas y anticuerpos es un atributo de calidad critico que se ha encontrado que afecta a las propiedades farmacocineticas de ciertos anticuerpos terapeuticos (Goetze y col., (2011) Glyoobiology 21,949-59; Yu y col. (2012) MAbs 4, 475-87).

Las glucoformas de un anticuerpo expresado por celula hospedadora de ovario de hamster chino (CHO) se determinan en gran medida durante la generacion de la linea celular y la seleccion del clon. Sin embargo, el contenido de AM tambien puede estar afectado por las condiciones del cultivo celular (Pacis, y col., (2011) Bioteohnol Bioeng 108, 2.348-2.358). Es comun en la industria de anticuerpo terapeutico buscar un intervalo deseado de contenido de AM para un producto anticuerpo debido a los cambios del proceso, aumento a escala, mejoramientos o la necesidad de igualarse a atributos de calidad de anticuerpo existente. Hasta ahora, los metodos aplicados para manipular el contenido de AM de un anticuerpo en el cultivo celular incluyen cambios en las composiciones de los medios, osmolaridad, pH, temperatura, etc. (Hills y col. (2001) Bioteohnol Bioeng 75(2), 239251; Yu y col., supra, Pacis y col., supra, Chee Furng Wong y col., (2005) Bioteohnol Bioeng 89, 164-177; Ahn, y col., (2008) Bioteohnol Bioeng 101, 1.234-44). La eficacia de estos metodos es especifica a las lineas celulares, tipos de molecula y entorno de los medios. Ademas estos metodos tienden a alterar tambien la productividad del anticuerpo, el comportamiento del cultivo celular y otros atributos de la calidad del anticuerpo. La eficacia de estos metodos se obtiene empiricamente.

Por lo tanto, hay una necesidad de un metodo para modular el contenido de glucoforma de alta manosa de proteinas terapeuticas y anticuerpos. La invencion proporciona un metodo para incrementar el contenido de glucoforma de alta manosa a traves de glucosa limitada en combinacion con una fuente de carbono alternativa.

Sumario de la invencion

La invencion proporciona un metodo para modular una o mas especies de glucano de alta manosa en una proteina recombinante durante el cultivo de celula mamifera que comprende; establecer un cultivo de celula mamifera en un biorreactor con un medio de cultivo definido libre de suero que contiene 5 a 8 g/l de glucosa; cultivar las celulas mamiferas durante una fase de crecimiento y complementar el medio de cultivo con alimentaciones por bolo de un medio de alimentacion definido libre de suero que tiene de 5 a 8 g/l de glucosa; iniciar una fase de produccion en el cultivo celular por perfusion con un medio de perfusion libre de suero que tiene 5 a 15 g/l de glucosa; en un momento predeterminado durante la fase de produccion, bajar la concentracion de glucosa a concentraciones limitantes sometiendo a perfusion el cultivo celular con un medio de perfusion de baja glucosa que contiene o complementado con una cantidad disminuida de glucosa, en el que dicho medio de perfusion contiene ademas o esta complementado con galactosa.

En una realizacion la cantidad disminuida de glucosa es suficiente para dar como resultado una concentracion de glucosa en el medio usado de o aproximadamente 0 g/l.

En una realizacion la concentracion de la cantidad disminuida de glucosa en el medio de perfusion de baja glucosa es de 0 a 3 g/l. En realizaciones relacionadas la concentracion de la cantidad disminuida de glucosa en el medio de perfusion de baja glucosa es de 2 a 3 g/l; 2,5 g/l o 0 g/l.

En una realizacion la concentracion de galactosa en el medio de perfusion es de 10 a 20 g/l. En realizaciones relacionadas la concentracion de galactosa en el medio de perfusion de baja glucosa es de 10 a 15 g/l; 10 a 12 g/l o 11,5 g/l.

En una realizacion la perfusion comienza en o aproximadamente el dia 5 a en o aproximadamente el dia 9 del cultivo celular. En una realizacion relacionada la perfusion comienza en o aproximadamente el dia 5 a en o aproximadamente el dia 7 del cultivo celular. En otra realizacion relacionada la perfusion comienza cuando las celulas han alcanzado una fase de produccion.

En otra realizacion la perfusion comprende perfusion continua. En una realizacion relacionada el indice de perfusion es constante.

En una realizacion la perfusion se realiza a un indice de menos de o igual a 1,0 volumen de trabajo por dia. En una realizacion relacionada la perfusion se realiza a un indice que incrementa durante la fase de produccion desde 0,25 volumen de trabajo por dia a 1,0 volumen de trabajo por dia durante el cultivo celular. En otra realizacion relacionada la perfusion se realiza a un indice que alcanza 1,0 volumen de trabajo por dia en el dia 9 al dia 11 del cultivo celular.

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En otra realizacion relacionada la perfusion se realiza a un indice que alcanza 1,0 volumen de trabajo por dia en el dia 10 del cultivo celular.

En una realizacion las alimentaciones por bolo del medio de alimentacion libre de suero comienzan el dia 3 o el dia 4 del cultivo celular.

En una realizacion el cultivo de celula mamifera se establece inoculando el biorreactor con al menos 0,5x106 a 3,0x106 celulas/ml en un medio de cultivo libre de suero. En una realizacion relacionada el cultivo de celula mamifera se establece inoculando el biorreactor con al menos 0,5x106 a 1,5x106 celulas/ml en un medio de cultivo libre de suero.

En una realizacion la especie de glucano de alta manosa es Manosa 5.

En una realizacion el metodo anteriormente descrito comprende ademas cambio de temperatura de 36 °C a 31 °C.

En una realizacion el metodo anteriormente descrito comprende ademas un cambio de temperatura de 36 °C a 33 °C. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura ocurre en la transicion entre la fase de crecimiento y la fase de produccion. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura ocurre durante la fase de produccion.

En una realizacion el metodo anterior que comprende ademas inducir la deteccion del crecimiento celular por privacion de L-asparagina seguido de perfusion con un medio de perfusion libre de suero que tiene una concentracion de L-asparagina de 5 mM o menos. En una realizacion relacionada la concentracion de L-asparagina en el medio de perfusion libre de suero es menos de o igual a 5 mM. En una realizacion relacionada la concentracion de L-asparagina en el medio de perfusion libre de suero es menos de o igual a 4,0 mM. En otra realizacion relacionada la concentracion de L-asparagina en el medio de perfusion libre de suero es menos de o igual a 3,0 mM. En otra realizacion relacionada la concentracion de L-asparagina en el medio de perfusion libre de suero es menos de o igual a 2,0 mM. En otra realizacion relacionada la concentracion de L-asparagina en el medio de perfusion libre de suero es menos de o igual a 1,0 mM. En otra realizacion relacionada mas la concentracion de L-asparagina en el medio de perfusion libre de suero es 0 mM. En otra realizacion relacionada mas se hace un seguimiento de la concentracion de L-asparagina del medio de cultivo celular antes de y durante la privacion de L-asparagina.

En una realizacion el metodo anterior, comprende ademas que el volumen celular empaquetado durante una fase de produccion es menos de o igual al 35 %. En una realizacion relacionada el volumen celular empaquetado es menos de o igual al 30 %.

En una realizacion la densidad celular viable del cultivo de celula mamifera en un volumen celular empaquetado menos de o igual al 35 % es de 10x106 celulas viables/ml a 80x106 celulas viables/ml. En una realizacion relacionada la densidad celular viable del cultivo de celula mamifera es de 20x106 celulas viables/ml a 30x106 celulas viables/ml.

En una realizacion la perfusion se consigue mediante flujo tangencial alterno. En una realizacion relacionada la perfusion se consigue mediante flujo tangencial alterno usando un ultrafiltro o un microfiltro.

En una realizacion el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l. En una realizacion relacionada el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l a 2.000 l. En una realizacion relacionada el biorreactor tiene una capacidad de al menos 1.000 l a 2.000 l.

En una realizacion las celulas mamiferas son celulas del ovario de hamster chino (CHO).

En una realizacion la proteina recombinante se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, una proteina de fusion recombinante o una citoquina.

En una realizacion el metodo anterior comprende ademas una etapa de recoleccion de la proteina recombinante producida por el cultivo celular.

En una realizacion la proteina recombinante producida por el cultivo celular se purifica y formula en una formulacion farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion la produccion de proteina recombinante en la especie de glucano de alta manosa se incrementa en comparacion con un cultivo en el que las celulas no se someten a glucosa limitada en combinacion con galactosa.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1. Perfiles de cultivo celular y Man5 en un proceso semicontinuo (fed batch). (A) Concentracion de glucosa g/l en el sobrenadante del cultivo. (B) Concentracion de galactosa g/l en el sobrenadante del cultivo. (C)

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Densidad celular viable. (D) Viabilidad. (E) Titulo. (F) Man5. 1 g/l de glucosa, 0 g/l de galactosa (triangulo en blanco). 1 g/l de glucosa, 4 g/l de galactosa (triangulo en negro). 2 g/l de glucosa, 0 g/l de galactosa (circulo en blanco). 2 g/l de glucosa, 4 g/l de galactosa (triangulo en negro). 3 g/l de glucosa, 0 g/l de galactosa (cuadrado en blanco). 3 g/l de glucosa, 4 g/l de galactosa (cuadrado en negro).

Figura 2. Perfiles de cultivo celular y aminoacidos en el proceso de perfusion. (A) Densidad celular viable, (B) Viabilidad, (C) concentracion de Gln (glutamina) g/l en el analisis de medios usados, (D) Titulo ajustado de volumen celular empaquetado, (E) concentracion de Glc (glucosa) g/l en el analisis de medios usados, (F) concentracion de galactosa g/l en el analisis de medios usados. 2 g/l de glucosa, 6 g/l de galactosa y glutamina 10 mM (triangulo en negro). 4 g/l de glucosa, 6 g/l de galactosa y glutamina 10 mM (circulo en negro). 4 g/l de glucosa, 6 g/l de galactosa y glutamina 5 mM (circulo en blanco).

Figura 3. Perfiles de cultivo celular en el proceso de perfusion. (A) concentracion de glucosa (Glu) g/l en el analisis de medios usados, (B) concentracion de Gal (galactosa) g/l en el analisis de medios usados, (C) concentracion de lactato, (D) concentracion de amoniaco, (E) Densidad celular viable, (F) Viabilidad, (G) Titulo ajustado de volumen celular empaquetado. 3 g/l de glucosa, 13 g/l de galactosa (cuadro en negro). 0 g/l de glucosa, 10 g/l de galactosa (circulo en blanco). 0 g/l de glucosa, 13 g/l de galactosa (circulo en negro). 1,5 g/l de glucosa, 11,5 g/l de galactosa (estrella). 3 g/l de glucosa, 10 g/l de galactosa, (cuadrado en blanco).

Figura 4. Analisis estadistico JMP del proceso de perfusion. (A) Titulo ajustado del volumen celular empaquetado, (B) Man5.

Figura 5. Datos del curso del tiempo que muestran el incremento en porcentaje de la especie Man5. -0 g/l de glucosa 10 g/l de galactosa; -+0 g/l de glucosa 13 g/l de galactosa; +13 g/l de glucosa 10 g/l de galactosa; ++3 g/l de glucosa 13 g/l de galactosa; OO 1,5 g/l de glucosa 11,5 de galactosa.

Descripcion detallada de la invencion

La produccion de perfiles de glucoforma de glucoproteina recombinante coherentes y reproducibles deja un reto considerable a la industria biofarmaceutica. Las variaciones en los procesos del cultivo celular juegan un papel significativo en los perfiles de glucosilacion de anticuerpo. La variabilidad potencial en el entorno fisicoquimico del proceso del cultivo celular incluyendo pH, temperatura, composicion de los medios de cultivo celular, variacion lote a lote de la materia prima, material de filtracion del medio, diferencia de escala del biorreactor, estrategia de gasificacion (aire, oxigeno, dioxido de carbono) son justo unos pocos ejemplos que pueden alterar potencialmente los perfiles de glucosilacion.

Se observo que bajo condiciones de baja glucosa o limitada, el contenido de la glucoforma de alta manosa de la proteina recombinante incrementaba, sin embargo, los atributos del cultivo celular, tales como la productividad volumetrica, viabilidad celular, y/o densidad, disminuian. Incrementar la concentracion de glucosa mejoraba los atributos de cultivo, pero disminuia el contenido de la glucoforma de alta manosa.

La invencion proporciona un metodo para incrementar las glucoformas de alta manosa, en particular, Manosa5 (Man5), para conseguir los atributos de calidad de producto deseados mientras que se mantienen los niveles deseables de ciertos parametros de cultivo celular tales como productividad volumetrica, viabilidad celular, y/o densidad, a traves del uso de bajas concentraciones o limitadas de glucosa en combinacion con una fuente de carbono alterna, en particular, galactosa. Como se describe en el presente documento, cultivar celulas en un medio de cultivo celular en el que la glucosa se limita reduciendo la concentracion de glucosa en el medio de cultivo celular, en combinacion con una fuente de carbono alternativa, dio como resultado una proteina recombinante que tenia una concentracion incrementada de glucoformas de alta manosa, mientras que se mantenia el crecimiento celular, la viabilidad y el titulo a niveles aceptables.

Durante la fase de produccion de un cultivo celular, parametros de cultivo deseables, tales como la densidad celular viable, la viabilidad celular, el volumen celular empaquetado en porcentaje, el titulo y/o titulo ajustado de volumen celular empaquetado se pueden establecer alimentando el cultivo celular con un medio de cultivo celular que contiene suficiente glucosa (de 5 g/l a 15 g/l o mas) para establecer y mantener estos parametros. En dicho momento durante el desarrollo de la produccion del cultivo celular, cuando es deseable incrementar el contenido de glucoforma de alta manosa de la proteina recombinante a producir, entonces el cultivo celular se alimenta con un medio de cultivo celular en el que la concentracion de glucosa se reduce de manera que dara como resultado el incremento deseado en el contenido de alta manosa. Tal medio de cultivo celular se caracteriza por una menor concentracion de glucosa (0 a 8 g/l) en combinacion con una fuente de carbono alternativa, tal como galactosa.

Los factores que determinan el grado al que la concentracion de glucosa necesitara ser reducida incluyen que fuente de carbono alterna se usa y cuanto se usa; el proceso de produccion de cultivo celular; el tipo celular y la masa y el consumo de glucosa. A mayor masa celular en el biorreactor, mayor consumo de glucosa por el cultivo celular y por lo tanto mayor cantidad de glucosa que se puede suministrar mientras aun se mantiene un estado de glucosa limitada que producira el incremento deseado de la concentracion de la glucoforma Man5. La manera en la que la

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glucosa se suministra al cultivo celular tambien puede influir en la cantidad de glucosa necesaria para mantener un estado de glucosa limitada que producira el incremento deseado de la concentracion de la glucoforma Man5. Por ejemplo, en un cultivo celular semicontinuo, la glucosa puede estar formulada dentro del medio de cultivo celular y complementada por alimentaciones por bolo. En un proceso de cultivo celular por perfusion, la concentracion de glucosa dependera de la tasa de alimentacion (g/l/dia) del medio de perfusion. En el presente documento se proporcionan ejemplos de ambos. Ademas, se puede medir la cantidad de glucosa en el medio de cultivo durante la produccion, tal como por analisis de medios usados para cultivos de perfusion. Se observo que los niveles de Man5 se incrementaban cuando la cantidad de glucosa en el medio usado era de o casi 0 g/l.

La produccion de glucoforma de alta manosa se incremento cuando las situaciones en las que las concentraciones de glucosa se disminuyeron. Sin embargo, bajos niveles de glucosa pueden impactar en la produccion de proteinas recombinantes en sistemas de cultivo celular. La produccion volumetrica, viabilidad celular y la densidad celular viable pueden estar todas negativamente impactadas en situaciones cuando la glucosa esta limitada. Se encontro que la adicion de una fuente de carbono alterna, tal como galactosa, a cultivo celular durante un periodo de baja glucosa o limitada no era reducida o estabilizo los descensos en la produccion volumetrica, viabilidad celular y densidad celular viable, mientras que se conservaba las glucoformas Man5 incrementadas. Tener la capacidad de manipular y mantener el contenido de la glucoforma de alta manosa de una proteina recombinante durante el cultivo celular mientras que se minimiza la perdida de titulo de producto y se mantiene la viabilidad celular representa un metodo valioso y facilmente implementado para la produccion de proteina terapeutica comercial.

En el presente documento se proporciona un metodo de cultivo de celulas mamiferas que es util para incrementar las glucoformas de alta manosa, en particular, Man5, para conseguir los atributos de calidad de producto deseados mientras que se mantiene el titulo de producto y la viabilidad celular aceptables mediante el uso de una cantidad limitante de glucosa en combinacion con una fuente de carbono alterna, en particular, galactosa. El metodo proporciona cultivar celulas mamiferas durante las fases de crecimiento y/o produccion en un medio de cultivo celular que tiene una alta concentracion de glucosa no limitante, de 5 a 15 g/l de glucosa, o bien compuesto dentro de la formulacion del medio, complementado a traves de alimentaciones por bolo o continuas o ambas. Cuando la densidad celular viable, viabilidad celular y/o titulo alcanzan los niveles deseados, la cantidad de glucosa en el medio de cultivo celular se reduce a una cantidad limitante, de manera que en la alimentacion de medio de perfusion, por ejemplo, la cantidad de glucosa medida en el medio usado es de o justo por encima de 0 g/l. La tasa de consumo de glucosa se determina mediante la tasa de adicion de glucosa y/o la masa del cultivo celular. Se puede suministrar glucosa a hasta 8 g/l. En una realizacion, se suministra glucosa hasta 6 g/l. En otra realizacion se suministra glucosa hasta 4 g/l. En otra realizacion, se suministra glucosa hasta 3 g/l. En otra realizacion se suministra glucosa hasta 2 a 3 g/l. En otra realizacion mas se suministra glucosa hasta 2,5 g/l. En otra realizacion, la glucosa es 0 g/l.

En combinacion con la concentracion de glucosa reducida, el medio de cultivo celular contiene o se complementa con galactosa, a una concentracion de hasta 20 g/l. En una realizacion la concentracion de galactosa es de 10 a 15 g/l. En otra realizacion la concentracion de galactosa es de 11,5 g/l.

Los restos de carbohidrato se describen en el presente documento en referencia a la nomenclatura normalmente usada para oligosacaridos. Una revision de la quimica de carbohidrato que usa esta nomenclatura se puede encontrar, por ejemplo, en Hubbard y Ivatt, Ann, Rev, Biochem. 50:555-583 (1981). Esta nomenclatura incluye, por ejemplo, Man, que representa manosa; Gal que representa galactosa; y Glc, que representa glucosa.

Por “cultivo celular” o “cultivo” se quiere decir el crecimiento y la propagacion de celulas fuera de un organismo multicelular o tejido. Las condiciones de cultivo adecuadas para las celulas mamiferas son conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, “Animal cell culture: A Practical Approach”, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, Nueva York (1992). Las celulas mamiferas se pueden cultivar en suspension o mientras se unen a un sustrato solido. Se pueden usar biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibra hueca, botellas rodillo, matraces de agitacion, o biorreactores de tanque agitado, con o sin microvehiculos.

El cultivo de celula mamifera se cultiva en un biorreactor. En una realizacion se usan biorreactores de 500 l a 20.000 l. En una realizacion preferida, se usan biorreactores de 1.000 l a 2.000 l.

El biorreactor se inocula con al menos 0,5x106 hasta y mas alla de 3,0x106 celulas viables/ml en un medio de cultivo libre de suero. En una realizacion preferida la inoculacion es de 1,0x106 celulas viables/ml.

Una vez inoculadas dentro del biorreactor de produccion las celulas mamiferas se someten a una fase de crecimiento exponencial. La fase de crecimiento se puede mantener usando un proceso semicontinuo con alimentaciones por bolo de un medio de alimentacion libre de suero que tiene de 5 a 8 g/l de glucosa. Estas alimentaciones por bolo complementadas en general comienzan en breve despues de que las celulas se inoculen dentro del biorreactor, en el momento cuando se anticipa o determina que el cultivo celular necesita alimentacion. Por ejemplo, las alimentaciones complementarias pueden comenzar en o aproximadamente el dia 3 o 4 del cultivo o un dia o dos antes o despues. El cultivo puede recibir dos, tres, o mas alimentaciones por bolo durante la fase de crecimiento. Ni el medio de cultivo celular basal ni el medio de alimentacion por bolo contienen galactosa.

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Cuando las celulas entran en la fase estacionaria o de produccion, o el cultivo celular ha conseguido una densidad celular viable deseada y/o titulo celular, las alimentaciones por bolo semicontinuas (fed batch) son discontinuas y se empieza la perfusion. El cultivo de perfusion es uno en el que el cultivo celular recibe medio de alimentacion de perfusion fresco mientras que se separa simultaneamente el medio usado. La perfusion puede ser continua, paso a paso, intermitente, o una combinacion de cualquiera o todas de cualquiera de estas. Los indices de perfusion pueden ser menos de un volumen de trabajo a muchos volumenes de trabajo por dia. Preferiblemente las celulas se retienen en el cultivo y el medio usado que se separa es basicamente libre de celulas o tiene significativamente menos celulas que el cultivo. La perfusion se puede conseguir mediante un numero de medios incluyendo la centrifugacion, sedimentacion o filtracion. Vease, por ejemplo, Voisard y col., (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751 -65. Un metodo de filtracion preferido es filtracion de flujo tangencial alterno. El flujo tangencial alterno se mantiene bombeando medio a traves de modulos de filtro de fibra hueca. Vease, por ejemplo, la patente americana N.° 6.544.424. Los modulos de fibra hueca pueden ser microfiltros o ultrafiltros.

Cuando el cultivo semicontinuo alcanza un punto desencadenante predeterminado, tal como viabilidad celular deseada, densidad celular, volumen celular empaquetado en porcentaje, titulo, titulo ajustado de volumen celular empaquetado, edad o similares, puede tener lugar un cambio entre semicontinuo y perfusion. Por ejemplo, este cambio puede tener lugar en o aproximadamente el dia 7 del cultivo, pero puede tener lugar un dia o dos antes o despues. La formulacion de alimentacion de perfusion contiene glucosa a una concentracion de hasta 15 g/l o mas, pero no contiene galactosa. En una realizacion, el medio de perfusion contiene 15 g/l de glucosa.

Cuando el cultivo de perfusion alcanza un punto desencadenante predeterminado, tal como viabilidad celular deseada, densidad celular, volumen celular empaquetado en porcentaje, titulo, titulo ajustado de volumen celular empaquetado, edad o similares, se reduce la concentracion de glucosa en el medio de cultivo celular. Por ejemplo, este cambio se puede iniciar el dia 11 del cultivo, pero puede tener lugar un dia o dos antes o despues. En ese momento el cultivo celular se somete a perfusion con el medio de cultivo celular que contiene una concentracion inferior de glucosa. Tal concentracion inferior de glucosa dara como resultado una concentracion inferior de glucosa medida en los medios usados de o casi 0 g/l. La glucosa se puede suministrar a hasta 8 g/l.

En una realizacion, se suministra glucosa hasta 6 g/l. En otra realizacion se suministra glucosa hasta 4 g/l. En otra realizacion, se suministra glucosa hasta 3 g/l. En otra realizacion la glucosa es 2 a 3 g/l. En otra realizacion mas, la glucosa es 2,5 g/l. En otra realizacion, la glucosa es 0 g/l.

El estado de glucosa limitada en el cultivo celular se mantiene haciendo un seguimiento de la concentracion de glucosa en el cultivo celular, tal como midiendo la concentracion de glucosa en el medio usado, y ajustando la concentracion de glucosa en la formulacion del medio de perfusion para mantener un nivel de o casi 0 g/l en el medio usado.

El medio de cultivo celular que contiene la concentracion inferior de glucosa tambien se puede complementar con galactosa a una concentracion de hasta 20 g/l. En una realizacion la concentracion de galactosa es de 10 a 15 g/l. En otra realizacion la concentracion de galactosa es de 11,5 g/l.

El cultivo celular se puede mantener continuamente en un estado de glucosa limitada complementado con galactosa. El cultivo celular se puede mantener en un estado de glucosa limitada complementado con galactosa hasta la recoleccion. El cultivo celular se puede restaurar a un estado limitado de no glucosa sin complementos de galactosa y el proceso entero comenzado de nuevo.

El cultivo celular tambien se podria mantener en un sistema de cultivo de perfusion para tanto las fases de crecimiento como de produccion. Una vez inoculado dentro del biorreactor de produccion las celulas mamiferas se someten a una fase de crecimiento exponencial durante dicho tiempo el cultivo celular se somete a perfusion con medio de cultivo celular libre de suero y/o quimicamente definido complementado con 5 a 15 g/l de glucosa. El medio de cultivo celular no contiene galactosa. El cultivo se mantiene hasta que se alcanza un punto desencadenante deseado, por ejemplo, densidad celular viable deseada, viabilidad celular, volumen celular empaquetado en porcentaje, titulo, titulo de volumen ajustado celular empaquetado, edad o similares. En ese momento el cultivo celular se somete a perfusion con un medio de cultivo celular que contiene una concentracion limitante de glucosa. Tal concentracion limitante de glucosa dara como resultado una concentracion de glucosa en los medios usados de o casi 0 g/l de glucosa. Se puede suministrar glucosa a hasta 8 g/l. En una realizacion, se suministra glucosa hasta 6 g/l. En otra realizacion se suministra glucosa hasta 4 g/l. En otra realizacion, se suministra glucosa hasta 3 g/l. En otra realizacion, la glucosa es 2 a 3 g/l. En otra realizacion mas, la glucosa es 2,5 g/l. En otra realizacion, la glucosa es 0 g/l.

El medio de cultivo celular que contiene la cantidad limitante de glucosa tambien puede contener galactosa a una concentracion de hasta 20 g/l. En una realizacion la concentracion de galactosa es de 10 a 15 g/l. En otra realizacion la concentracion de galactosa es de 11,5 g/l.

Ademas, el medio de cultivo celular que contiene la cantidad limitante de glucosa tambien puede contener glutamina ademas de galactosa. La glutamina esta a una concentracion de 1 a 20 mM en combinacion con galactosa. En una realizacion la concentracion de glutamina es de 5 a 10 mM.

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La densidad celular viable puede ser una senal para la transicion a la fase de produccion o para reducir la concentracion de glucosa en el medio de cultivo celular. Tambien puede ser deseable mantener un cierto intervalo o nivel de densidad celular viable durante la fase de produccion. En una realizacion la densidad celular viable es de 10x106 celulas viables/ml a al menos aproximadamente 60x106 celulas viables/ml. En otra realizacion la densidad celular viable es de 10x106 celulas viables/ml a 50x106 celulas viables/ml. En otra realizacion la densidad celular

viable es de 10x106 celulas viables/ml a 40x106 celulas viables/ml. En una realizacion preferida la densidad celular

viable es de 10x106 celulas viables/ml a 30x106 celulas viables/ml. En otra realizacion preferida la densidad celular

viable es de 10x106 celulas viables/ml a 20x106 celulas viables/ml. En otra realizacion preferida la densidad celular

viable es de 20x106 celulas viables/ml a 30x106 celulas viables/ml. En otra realizacion preferida mas la densidad celular viable es de 20x106 celulas viables/ml a 25x106 celulas viables/ml. En una realizacion incluso mas preferida la densidad celular viable es al menos aproximadamente 20x106 celulas viables/ml.

El volumen celular empaquetado en porcentaje (%PCV) tambien se puede usar como una senal para la transicion a la fase de produccion o para comenzar la alimentacion del cultivo celular con un medio de cultivo celular que contiene una cantidad limitante de glucosa. El cultivo celular tambien se puede mantener a un volumen celular empaquetado deseado durante la fase de produccion. En una realizacion el volumen celular empaquetado es igual a o menos del 30 %. En una realizacion preferida el volumen celular empaquetado es al menos aproximadamente 15 a 30 %. En una realizacion preferida el volumen celular empaquetado es al menos aproximadamente 20 a 25 %. En otra realizacion preferida el volumen celular empaquetado es igual a o menos del 25 %. En otra realizacion preferida el volumen celular empaquetado es igual a o menos del 15 %. En otra realizacion preferida el volumen celular empaquetado es igual a o menos del 20 %. En otra realizacion preferida mas el volumen celular empaquetado es igual a o menos del 15 %.

Un medio de cultivo celular de perfusion que tiene una concentracion reducida de asparagina se puede usar para detener el crecimiento celular mientras que se mantiene la productividad y la viabilidad durante la fase de produccion. En una realizacion preferida la concentracion de asparagina es al menos aproximadamente 0 mM a al menos aproximadamente 5 mM de asparagina, vease la publicacion WIPO N.° WO 2013/006479.

Como se usa en el presente documento, “flujo de perfusion” es la cantidad de medios que se pasa a traves (anadidos y eliminados) de un biorreactor, generalmente expresado como alguna parte o multiplo del volumen de trabajo, en un tiempo dado. “Volumen de trabajo” se refiere a la cantidad de volumen de biorreactor usado para el cultivo celular. En una realizacion el flujo de perfusion es un volumen de trabajo o menos por dia. El medio de alimentacion de perfusion se puede formular para maximizar la concentracion de nutriente de perfusion para minimizar del indice de perfusion.

Como se usa en el presente documento, “densidad celular” se refiere al numero de celulas en un volumen dado de medio de cultivo. “Densidad celular viable” se refiere al numero de celulas vivas en un volumen dado de medio de cultivo, determinado por ensayos de viabilidad convencionales (tales como metodo por exclusion de tinte azul de tripan).

Como se usa en el presente documento, “volumen celular empaquetado” (PCV), tambien referido como “volumen celular empaquetado en porcentaje” (% PCV), es la relacion del volumen ocupado por las celulas, y el volumen total del cultivo celular, expresado como porcentaje (vease Stettler, y col., (2006) Biotechnol Bioeng. Dic 20:95(6):1.228- 33). El volumen celular empaquetado es una funcion de la densidad celular y el diametro celular; incrementos en el volumen celular empaquetado podrian surgir a partir de incrementos en o bien la densidad celular o el diametro celular o ambos. El volumen celular empaquetado es una medida del contenido solido en el cultivo celular. Los solidos se separan durante la recoleccion y la purificacion posterior. Mas solidos significa mas esfuerzo para separar el material solido del producto deseado durante las etapas de recoleccion y purificacion posterior. Tambien, el producto deseado puede llegar a estar atrapado en los solidos y perdido durante el proceso de recoleccion, dando como resultado una disminuida produccion de producto. Puesto que las celulas hospedadoras varian en tamano y los cultivos celulares tambien contienen celulas muertas y que se mueren y otros restos celulares, el volumen celular empaquetado es un modo mas preciso de describir el contenido solido dentro de un cultivo celular que la densidad celular o la densidad celular viable.

Con el fin de esta invencion, el medio de cultivo celular es un medio adecuado para el crecimiento de celulas animales, tales como celulas mamiferas, en cultivo celular in vitro. Las formulaciones de medios de cultivo celular son bien conocidas en la tecnica. Generalmente, los medios de cultivo celular estan comprendidos de tampones, sales, carbohidratos, aminoacidos, vitaminas y elementos esenciales traza. “Libre de suero” se aplica a un medio de cultivo celular que no contiene sueros animales, tales como suero fetal bovino. Diversos medios de cultivo de tejido, incluyendo los medios de cultivo definidos, estan comercialmente disponibles, por ejemplo, uno cualquiera o una combinacion de los siguientes medios de cultivo celular: Medio RPMI-1640, Medio RPMI-1641, Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Medio Eagle esencial minimo, Medio F-12K, Medio F12 de Ham, Medio de Dulbecco modificado de Iscove, Medio 5A de McCoy, Medio L-15 de Leibovitz, y medios libre de suero tales como EX-CELL™ 300 Series (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), entre otros. Versiones libres de suero de tales medios de cultivo estan tambien disponibles. Los medios de cultivo celular se pueden complementar con concentraciones adicionales o incrementadas de componentes tales como aminoacidos, sales, azucares, vitaminas, hormonas,

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factores de crecimiento, tampones, antibioticos, lipidos, elementos traza y similares, dependiendo de los requerimientos de las celulas a cultivar y/o los parametros de cultivo celular deseados.

Los medios de cultivo celular pueden ser libres de suero, libres de proteina y/o libres de peptona. “Libre de suero” se aplica a un medio de cultivo celular que no contiene sueros animales, tales como suero fetal bovino. “Libre de proteina” se aplica a medios de cultivo celular libres de proteina exogenamente anadida, tal como transferrina, factores de crecimiento proteico IGF-1, o insulina. Medios libres de proteina pueden o no pueden contener peptonas. “Libre de peptona” se aplica a los medios de cultivo celular que no contienen hidrosilatos de proteina exogenos tales como hidrolisatos de proteina animal y/o vegetal. El caldo de cultivo celular o terminologia similar se refiere a los medios de cultivo celular que contiene, entre otras cosas, celulas mamiferas viables y no viables, metabolitos celulares y restos celulares tales como acidos nucleicos, proteinas y liposomas.

Los cultivos celulares tambien se pueden complementar con medio de alimentacion concentrado que contiene componentes, tales como nutrientes y aminoacidos, que se consumen durante el trascurso de la fase de produccion del cultivo celular. El medio de alimentacion concentrado puede estar basado en justo aproximadamente cualquier formulacion de medios de cultivo celular. Tal medio de alimentacion concentrado puede contener en cualquier parte de uno o casi todos los componentes del medio de cultivo celular a, por ejemplo, aproximadamente 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100x, 200X, 400X, 600X, 800X, o incluso aproximadamente 1.000X de su cantidad normal, vease por ejemplo la publicacion WIPO N.° WO2012/145682.

El metodo segun la presente invencion se puede usar para mejorar la produccion de proteinas recombinantes en procesos de cultivo de fase multiple. En un proceso de fase multiple, las celulas se cultivan en dos o mas fases distintas. Por ejemplo, las celulas se pueden cultivar primero en una o mas fases de crecimiento, bajo condiciones ambientales que maximizan la proliferacion celular y la viabilidad, a continuacion, se transfieren a una fase de produccion, bajo condiciones que maximizan la produccion de proteina. En un proceso comercial para la produccion de una proteina por celulas mamiferas, hay fases de crecimiento normalmente multiples, por ejemplo, al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 que ocurren en diferentes recipientes de cultivo que preceden un cultivo de produccion final. Las fases de crecimiento y produccion pueden ser precedidas por, o separadas por, una o mas fases de transicion. En procesos de fase multiple, el metodo segun la presente invencion se puede emplear al menos durante la fase de crecimiento y produccion de la fase de produccion final de un cultivo celular comercial, aunque tambien se puede emplear en una fase de crecimiento precedente. Una fase de produccion se puede conducir a gran escala. Un proceso a gran escala se puede conducir en un volumen de al menos aproximadamente 100, 500, 1.000, 2.000, 3.000, 5.000, 7.000, 8.000, 10.000, 15.000, 20.000 litros. En una realizacion preferida la produccion se lleva a cabo en biorreactores de 500 l, 1.000 l y/o 2.000 l. Una fase de crecimiento puede ocurrir a una temperatura mayor que una fase de produccion. Por ejemplo, una fase de crecimiento puede ocurrir a una primera temperatura de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 38 °C, y una fase de produccion puede ocurrir a una segunda temperatura de aproximadamente 29 °C a aproximadamente 37 °C, opcionalmente de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 36 °C o de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 34 °C. Ademas, los inductores quimicos de la produccion de proteina, tal como, por ejemplo, cafeina, butirato y hexametileno bisacetamida (HMBA), se puede anadir a la vez que, antes, y/o despues de un cambio de temperatura. Si los inductores se anaden despues de un cambio de temperatura, se pueden anadir de una hora a cinco dias despues del cambio de temperatura, opcionalmente de uno a dos dias despues del cambio de temperatura. Los cultivos celulares se pueden mantener durante dias o incluso semanas mientras que las celulas producen la(s) proteina(s) deseada(s).

Generalmente los cultivos celulares que preceden el cultivo de produccion final (N-x a N-1) se usan para generar las celulas semilla que se usaran para inocular el biorreactor de produccion, el cultivo N-1. La densidad de celula semilla puede tener un impacto positivo sobre el nivel de la proteina recombinante producida. Los niveles de producto tienden a incrementar con el incremento de la densidad de semilla. El mejoramiento en titulo no solamente esta ligado a la mayor densidad de semilla, sino es probable que este influido por el estado del ciclo celular y metabolico de las celulas que se colocan en la produccion.

Las celulas semilla se pueden producir por cualquier metodo de cultivo. Un metodo preferido es un cultivo de perfusion que usa la filtracion de flujo tangencial alterno. Se puede hacer funcionar un biorreactor N-1 usando filtracion de flujo tangencial alterno para proporcionar celulas a alta densidad para inocular un biorreactor de produccion. Se puede usar la fase N-1 para cultivar celulas a densidades de >90x106 celulas/ml. El biorreactor N-1 se puede usar para generar cultivos semilla por bolo o se pueden usar como un cultivo madre semilla movil que se podria mantener para sembrar biorreactores de produccion multiple a alta densidad de celula semilla. La duracion de la fase de crecimiento de la produccion puede oscilar de 7 a 14 dias y se puede disenar para mantener las celulas en crecimiento exponencial antes de la inoculacion del biorreactor de produccion. Los indices de perfusion, la formulacion del medio y el ritmo se optimizan para cultivar celulas y distribuirlas al biorreactor de produccion en un estado que es lo mas conductivo para optimizar su produccion. Las densidades de celula semilla de >15x106 celulas/ml se pueden conseguir para sembrar los biorreactores de produccion.

Las lineas celulares (tambien referidas como “celulas hospedadoras”) usadas en la invencion estan modificadas por ingenieria genetica para expresar un polipeptido de interes comercial o cientifico. Las lineas celulares generalmente se derivan de un linaje que surge de un cultivo primario que se puede mantener en cultivo durante un tiempo no

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limitado. Modificar por ingenierfa genetica la linea celular implica transfeccion, transformacion o transduccion de las celulas con una molecula de polinucleotido recombinante, y/o si no alteracion (por ejemplo, por recombinacion homologa y activacion genica o fusion de una celula recombinante con una celula no recombinante) para causar que la celula hospedadora exprese un polipeptido recombinante deseado. Los metodos y vectores para celulas y/o lineas celulares que estan modificadas por ingenierfa genetica para expresar un polipeptido de interes son bien conocidos por los expertos en la tecnica; por ejemplo, diversas tecnicas se ilustran en “Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel y col., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, y actualizaciones trimestrales); Sambrook y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R.J., “Large Scale Mammalian Cell Culture”, 1990, pp. 15-69.

Las lineas celulares animales se derivan de celulas cuyos progenitores se derivaron de un animal multicelular. Un tipo de linea celular animal es una linea celular mamifera. Una amplia diversidad de lineas celulares mamiferas adecuadas para el crecimiento en el cultivo estan disponibles en la “American Type Culture Collection” (Manassas, Va.) y vendedores comerciales. Ejemplos de lineas celulares normalmente usadas en la industria incluyen VERO, BHK, HeLa, CV1 (incluyendo Cos), MDCK, 293, 3T3, lineas celulares de mieloma (por ejemplo, NSO, nS1), celulas PC12, WI38 y celulas de ovario de hamster chino (CHO). Las celulas CHO se usan mucho para la produccion de proteinas recombinantes complejas, por ejemplo, citoquinas, factores de coagulacion, y anticuerpos (Brasel y col. (1996), Blood 88:2.004-2.012; Kaufman y col. (1988), J. Biol. Chem. 263:6.352-6.362; McKinnon y col. (1991), J. MoI. Endocrinol 6:231-239; Wood y col. (1990), J. Immunol. 145:3.011-3.016). Las lineas celulares mutantes deficientes de dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub y col. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4.216-4.220), DXB11 y DG-44, son lineas celulares hospedadoras de CHO deseables debido a que el sistema de expresion genica seleccionable y amplificable de DHFR eficiente permite la expresion de proteina recombinante de alto nivel en estas celulas (Kaufman R.J. (1990), Meth. Enzymol. 185:537-566). Ademas, estas celulas son faciles de manipular como cultivos adherentes o de suspension y presentan estabilidad genetica relativamente buena. Las celulas CHO y las proteinas expresadas recombinantemente en ellas han sido caracterizadas ampliamente y han sido aprobadas para su uso en la produccion comercial clinica por agencias reguladoras.

Los metodos de la invencion se pueden usar para cultivar celulas que expresan proteinas recombinantes de interes. Las proteinas recombinantes expresadas se pueden secretar dentro del medio de cultivo del cual se pueden recuperar y/o recoger. Ademas, las proteinas se pueden purificar, o parcialmente purificar, de tal cultivo o componente (por ejemplo, de medio de cultivo) usando procesos y productos conocidos disponibles de los vendedores comerciales. A continuacion, las proteinas purificadas se pueden “formular”, significando intercambiar de tampon, esterilizar, empaquetar a granel, y/o empaquetar para un usuario final. Las formulaciones adecuadas para las composiciones farmaceuticas incluyen aquellas descritas en “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 18° ed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Como se usa en el presente documento “peptido”, “polipeptido” y “proteina” se usan de manera intercambiable por todo el documento y se refiere a una molecula que comprende dos o mas residuos de aminoacidos unidos unos a otros por enlaces peptidicos. Los peptidos, polipeptidos y proteinas tambien incluyen modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, glucosilacion, union lipidica, sulfatacion, gama carboxilacion de restos de acido glutamico, hidroxilacion y ADP-ribosilacion. “Glucoproteina” se refiere a peptidos, polipeptidos y proteinas, que tienen al menos una cadena lateral de oligosacarido que incluye restos de manosa. Las glucoproteinas pueden ser homologas a la celula hospedadora, o pueden ser heterologas, es decir, extranas, a la celula hospedadora a utilizar, tal como, por ejemplo, una glucoproteina humana producida por una celula hospedadora de ovario de hamster chino (CHO). Los polipeptidos pueden ser de interes cientifico o comercial, incluyendo farmacos basados en proteina. Polipeptidos incluyen, entre otras cosas, anticuerpos, proteinas de fusion, y citoquinas. Peptidos, polipeptidos y proteinas se producen por lineas celulares animales recombinantes usando metodos de cultivo celular y se pueden referir como “peptido recombinante”, “polipeptido recombinante” y “proteina recombinante”. La(s) proteina(s) expresada(s) se pueden producir intracelularmente o secretar dentro del medio de cultivo a partir del cual se pueden recuperar y/o recoger.

Ejemplos de polipeptidos que se pueden producir con los metodos de la invencion incluyen proteinas que comprenden secuencias de aminoacidos identicas a o basicamente similares a toda o parte de una de las siguientes proteinas: factor de necrosis tumoral (TNF), ligando de flt3 (documento WO 94/28391), eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, IL-2, angiopoyetina-2 (Maisonpierre y col. (1997), Science 277(5322): 55-60), ligando para el activador de receptor de NF-kappa B (RANKL, documento WO 01/36637), ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL, documento WO 97/01633), linfopoyetina derivada de estroma timico, factor estimulante de colonia de granulocito, factor estimulante de colonia granulocito-macrofago (GM-CSF, patente australiana N.° 588819), factor de crecimiento de mastocito, factor de crecimiento de celula madre (patente americana N.° 6.204.363), factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento de queratinocito, factor de crecimiento y desarrollo de megacariocito, RANTES, hormona de crecimiento de proteina 2 similar a fibrinogeno humano (FGL2; n.° de acceso de NCBI. NM_00682; Ruegg y Pytela (1995), Gene 160:257-62), insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similares a insulina, hormona paratiroidea, interferones que incluyen a- interferones, Y-interferon e interferones consensos (patente americana N.° 4.695.623 y 4.897471), factor de crecimiento nervioso, factor neurotrofico derivado de cerebro, proteinas similares a sinaptotagmina (SLP 1-5), neurotrofina-3, glucagon, interleuquinas, factores estimulantes de colonia, linfotoxina-p, factor inhibidor de leucemia,

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y oncostatina-M. Las descripciones de otras glucoproteinas se pueden encontrar en, por ejemplo, ’’Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research”, todos los volumenes (Aggarwal y Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); ’Growth Factors: A Practical Approach” (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., Nueva York, 1993); y “The Cytokine Handbook”, Vols. 1 y 2 (Thompson and Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003).

Ademas los metodos de la invencion serian utiles para producir proteinas que comprenden toda o parte de la secuencia de aminoacidos de un receptor para cualquiera de las proteinas anteriormente mencionadas, un antagonista a tal receptor o cualquiera de las proteinas anteriormente mencionadas, y/o proteinas basicamente similares a tales receptores o antagonistas. Estos receptores y antagonistas incluyen: ambas formas del receptor de factor de necrosis tumoral (TNFR, referidas como p55 y p75, patente americana N.° 5.395.760 y patente americana N.° 5.610.279), receptores de Interleuquina-1 (IL-1) (tipos I y II; patente europea N.°. 0460846, patente americana N.° 4.968.607, y patente americana N.° 5.767.064), antagonistas del receptor de IL-1 (patente americana N.° 6.337.072), antagonistas o inhibidores de IL-1 (patente americana N.° 5.981.713, 6.096.728, y 5.075.222) receptores de IL-2, receptores de IL-4 (patente europea N.°. 0 367 566 y patente americana N.° 5.856.296), receptores de IL-15, receptores de IL-17, receptores de IL-18, receptores de Fc, receptor del factor estimulante de colonia de granulocito- macrofago, receptor del factor estimulante de colonia de granulocito, receptores para el factor inhibidor de oncostatina-M y leucemia, activador de receptor de NF-Kappa B (RANK, documento WO 01/36637 y patente americana N.° 6.271.349), osteoprotegerina (patente americana N.° 6.015.938), receptores para TRAIL (incluyendo receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4) y receptores que comprenden dominios de muerte, tales como Fas o receptor inductor de apoptosis (AIR).

Otras proteinas que se pueden producir usando la invencion incluyen proteinas que comprenden toda o parte de las secuencias de aminoacidos de antigenos de diferenciacion (referidos como proteinas CD) o sus ligandos o proteinas basicamente similares a cualquiera de estos. Tales antigenos se describen en “Leukocyte Typing VI” (“Proceedings of the VIth International Workshop and Conference”, Kishimoto, Kikutani y col., eds., Kobe, Japon, 1996). Proteinas CD similares se describen en posteriores talleres. Ejemplos de tales antigenos incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, y ligandos a los mismos (ligando de CD27, ligando de CD30, etc.). Varios de los antigenos CD son miembros de la familia del receptor de TNF, que tambien incluye 41BB y OX40. Los ligandos con frecuencia son miembros de la familia TNF, ya que son ligando de 41BB y ligando de OX40.

Las proteinas enzimaticamente activas o sus ligandos tambien se pueden producir mediante la invencion. Ejemplos incluyen proteinas que comprenden toda o parte de una de las siguientes proteinas o sus ligandos o una proteina basicamente similar a una de estas: una desintegrina y miembros de la familia de dominio de metaloproteinasa incluyendo la enzima de conversion de TNF-alfa, diversas quinasas, glucocerebrosidasa, superoxido dismutasa, activador del plasminogeno de tejido, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteina E, apolipoproteina A-I, globinas, un antagonista de IL-2, antitripsina alfa-1, ligandos para cualquiera de las enzimas anteriormente mencionadas, y numerosas otras enzimas y sus ligandos.

El termino “anticuerpo” incluye la referencia a inmunoglobulinas de cualquier isotipo o subclase o a una region de union a antigeno del mismo que compite con el anticuerpo intacto para la union especifica, a menos que se especifique lo contrario, incluyendo humano, humanizado, quimerico, multiespecifico, monoclonal, policlonal y oligomeros o fragmentos de union a antigeno de los mismos. Tambien se incluyen proteinas que tienen un fragmento de union a antigeno o region tal como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, diacuerpos, Fd, dAc, maxicuerpos, moleculas de anticuerpo de cadena sencilla, fragmentos de la region determinante complementaria (CDR), scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipeptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglubulina que es suficiente para conferir union de antigeno especifica a un polipeptido diana. El termino “anticuerpo” incluye, pero no se limita a, los que se preparan, expresan, crean o aislan mediante medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una celula hospedadora sometida a transfeccion para expresar el anticuerpo.

Ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que reconocen una cualquiera o una combinacion de proteinas que incluyen, pero no se limitan a, las proteinas anteriormente mencionadas y/o los siguientes antigenos: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1 a, IL-1 p IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, subunidades del receptor de IL-18, FGL2, PDGF-p y sus analogos (vease las patentes americanas N.° 5.272.064 y 5.149.792), receptor de VEGF, TGF, TGF-p2, TGF-p1, EGF (vease la patente americana N.° 6.235.883) receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocito, ligando de osteoprotegerina, interferon gama, estimulador del linfocito B (BlyS, tambien conocido como BAFF, THANK, TALL-1, y zTNF4; vease Do y Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1 ):19-25), complemento C5, IgE, antigeno tumoral CA125, antigeno tumoral MUC1, antigeno PEM, LCG (que es un producto genico que se expresa en asociacion con el cancer de pulmon), HER-2, HER-3, una glucoproteina asociada a tumor TAG-72, el antigeno SK-1, epitopos asociados a tumor que estan presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cancer de colon y/o pancreatico, epitopos o proteinas asociados a cancer expresados en celulas cancerosas de pecho, colon, celula escamosa, prostata, pancreatico, de pulmon y/o rinon y/o en celulas de melanoma, glioma, o neuroblastoma, el nucleo necrotico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, receptores TRAIL 1, 2, 3 y 4, RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molecula de adhesion VAP-1, molecula de adhesion celular epitelial (EpCAM),

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molecula de adhesion intercelular-3 (ICAM-3), leucointegrina adhesina, la glucoproteina de plaqueta gp llb/llla, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-factor de tejido ), MHC I, antigeno carcinoembrionario (CEA), fetoproteina alfa (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA- 4 (que es un antigeno asociado a linfocito T citotoxico), receptor de Fc-y-1, HLA-DR 10 beta, antigeno de HLA-DR, esclerostina, L-selectina, Virus sincitial respiratorio, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), Streptococcus mutans, y Staphlycoccus aureus, Ejemplos especificos de anticuerpos conocidos que se pueden producir usando los metodos de la invencion incluyen pero no se limitan a adalimumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, eculizumab, gemtuzumab ozogamicina, golimumab, ibritumomab tiuxetan, labetuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, rovelizumab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab y zanolimumab.

La invencion se puede usar para producir proteinas de fusion recombinantes que comprenden, por ejemplo, cualquiera de las proteinas anteriormente mencionadas. Por ejemplo, las proteinas de fusion recombinantes que comprenden una de las proteinas anteriormente mencionadas mas un dominio de multimerizacion, tal como cremallera de leucina, una super helice, una parte Fc de una inmunoglobulina, o una proteina basicamente similar, se pueden producir usando los metodos de la invencion. Vease, por ejemplo, el documento WO94/10308; Lovejoy y col. (1993), Science 259:1.288-1.293; Harbury y col. (1993), Science 262:1.401-05; Harbury y col. (1994), Nature 371:80-83; Hakansson y col.(1999), Structure 7:255-64. Especificamente incluido entre tales proteinas de fusion recombinantes estan las proteinas en las que una parte de un receptor se fusiona a una parte Fc de un anticuerpo tal como etanercept (un p75 TNFR:Fc), y betalacept (CTLA4:Fc). En otra realizacion son conjugados anticuerpo- farmaco.

Aunque la terminologia usada en esta solicitud es estandar dentro de la tecnica, las definiciones de ciertos terminos se proporcionan en el presente documento para asegurar la claridad y precision al significado de las reivindicaciones. Unidades, prefijos, y simbolos se pueden indicar en su forma aceptada por SI. Los intervalos numericos indicados en el presente documento incluyen los numeros que definen el intervalo e incluyen y son de apoyo de cada numero entero dentro del intervalo definido. A menos que se indique lo contrario, los terminos “un” o “una” se interpretan que significan “al menos uno de”. Los titulos de seccion usados en el presente documento son con fines organizativos solamente y no se interpretan como limitantes al asunto descrito. Los metodos y tecnicas descritos en el presente documento generalmente se realizan segun los metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y se describen en diversas referencias generales y mas especificas que se citan y discuten a traves de la presente memoria a menos que se indique lo contrario. Vease, por ejemplo, Sambrook y col. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3° ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) y Ausubel y col., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane “Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press”, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990).

La presente invencion no esta limitada en el alcance por las realizaciones especificas descritas en el presente documento que se consideran como ilustraciones sencillas de aspectos individuales de la invencion.

Los siguientes ejemplos demuestran realizaciones y aspectos de los metodos descritos y no se pretende que sean limitantes.

Ejemplos

Se aborda la sustitucion de especies de carbohidrato alternativas para glucosa dentro de un sistema biorreactor con el fin de manipular el contenido de la glucoforma de alta manosa y la calidad de proteina total.

Ejemplo 1

Cultivo semicontinuo con alimentacion de glucosa continua y alimentacion de galactosa por bolo

Los efectos de la glucosa reducida y una fuente de carbono alternativa sobre el crecimiento de cultivo celular, titulo y calidad de producto, particularmente los niveles de Man5, se evaluaron ensayando diferentes concentraciones de glucosa y galactosa usando un proceso semicontinuo. El objetivo del experimento era reducir la cantidad de glucosa disponible en el medio de cultivo celular, mientras que se proporcionaba una fuente de carbono diferente a traves de una alimentacion de galactosa.

Se inocularon doce biorreactores Applikon de 2 l con celulas CHO que expresaban un anticuerpo IgG2 recombinante a 20x105 celulas viables/ml en un volumen de trabajo de 1 l de un medio de cultivo celular libre de suero. Los cultivos se mantuvieron a 36 °C, oxigeno disuelto (OD) al 30 %, 290 rpm de agitacion, y pH de 6,95. Se suministro un suplemento de tirosina-cistina los dias 2 y 5, volumetricamente al 0,36 % basado en el volumen inicial. Se anadieron CO2 y carbonato de sodio 1 M segun era necesario para el control de pH.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La alimentacion por bolo de los medios de cultivo era los dias 2, 5 y 9, volumetricamente basados en el 9 % del volumen inicial.

Se eligio un diseno de experimento de dos factores para evaluar la realizacion de cultivo celular y los atributos de calidad de producto con cantidades variantes de glucosa y galactosa en el medio de cultivo celular. El diseno del experimento consistio en 6 tratamientos, biorreactores duplicados para cada tratamiento como se muestra en la Tabla 1. El primer factor era alimentacion de glucosa continua (glucosa continua) para administrar 3, 2 o 1 g/dia de glucosa comenzando a partir del dia 2. Los tratamientos con 3 g/dia de glucosa tambien recibieron alimentaciones de glucosa por bolo adicionales para mantener la concentracion de glucosa a 3 g/l. El fin era asegurar que los tratamientos de 3 g/dia se mantuvieran como controles positivos, teniendo nunca una limitacion de glucosa.

El segundo factor era alimentaciones por bolo con (1+, 2+, 3+) y sin (1-, 2-, 3-) galactosa (bolo de galactosa). El objetivo era mantener la concentracion de galactosa en los medios de cultivo celular por encima de 4 g/l comenzando el dia 2.

Tabla 1. Diseno experimental de 2 factores para el experimento semicontinuo

Proceso

Glucosa continua, g/dia Bolo de Galactosa, g/l

719

2 0

720

3+bolo glu 0

721

3+bolo glu 4

722

1 0

723

1 4

724

2 0

725

2 4

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3+bolo glu 0

727

2 4

728

1 0

729

3+bolo glu 4

730

1 4

Durante el desarrollo del cultivo, se tomaron muestras diarias para valorar el cultivo. Se determinaron la densidad celular viable (VCD) y la viabilidad a escala de mesa de trabajo usando Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA). Se determino el volumen celular empaquetado usando VoluPAC (Sartorius, Goettingen, Alemania). Se determinaron el pH, dioxido de carbono disuelto (pCO2), y oxigeno disuelto (pO2) usando un analizador de gas en sangre (BGA) Siemens 248 (Chiron Diagnostics, CA). Se obtuvo la concentracion de galactosa usando un analizador de bioquimica selecto YSI Modelo 2700 (YSI Incorporated, Yellow Springs, OH). Los datos de metabolito (glucosa, lactato y amoniaco) se obtuvieron usando Analizador Polymedco Polychem (Polymedco Inc., Cortland Manor, NY). Se determino la osmolaridad usando un micro osmometro modelo 2020 de Advanced Instruments (Advanced Instruments, Norwood, MA). Se almacenaron muestras de sobrenadante a -80 °C. Al final de los experimentos, se descongelaron las muestras de sobrenadante libre de celula congeladas y se sometieron colectivamente a analisis de titulo y glucano.

El titulo se determino usando analisis por HPLC. Las muestras de sobrenadante de cultivo celular de diferentes momentos se descongelaron y filtraron de nuevo en una placa de 96 pocillos con membrana de 0,2 pm. Las muestras se inyectaron a un sistema de HPLC (Hewlett Packard 1100) equipado con deteccion de UV a 280 nm usando columna Poros® A/20 de 2,1 mm Dx30 mm L (Applied Biosystems, Foster City, CA) a un flujo de 2 ml/min. El metodo en gradiente que usa fase movil fosfato de sodio 100 mM/clorito de sodio 250 mM y acido acetico al 2 %/glicina 100 mM se uso para eluir cada muestra de proteina durante cada 5 min.

Para el analisis de glucano, las muestras de sobrenadante de cultivo celular se recogieron y purificaron por Proteina A. Las muestras purificadas se trataron con PNGasa-F y se incubaron a 37 °C durante 2 horas para liberar los glucanos N-ligados. Los glucanos enzimaticamente liberados se marcaron con acido 2-aminobenzoico (2-AA) a 80 °C durante 75 minutos. A continuacion se separo el exceso del marcador 2-AA con un cartucho Glycoclean S. Las muestras se evaporaron durante la noche y el sedimento seco resultante se reconstituyo con agua para posterior analisis por HILIC (cromatografia liquida de interaccion hidrofila). Los glucanos se inyectaron y unieron a la columna en altas condiciones organicas y se eluyeron con un gradiente creciente de un tampon de formato de amonio acuoso. Se uso la deteccion de fluorescencia para hacer un seguimiento de la elucion de glucano y se calculo el porcentaje relativo de las especies de glucano principales y menores.

Resultados del proceso semicontinuo con alimentacion de glucosa continua y alimentacion de galactosa por bolo

Los tratamientos de cultivo celular que recibieron 3 g/dia de alimentacion de glucosa continua (Procesos 720, 721, 726, y 729), tambien recibieron alimentacion de glucosa por bolo para conservar su nivel por encima de 3 g/l. Procesos 720 y 726, que no recibieron alimentacion de galactosa por bolo, requirieron de forma rutinaria alimentaciones por bolo de glucosa, mientras que los procesos que recibieron galactosa (procesos 721 y 729) no

5

10

15

20

25

30

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40

45

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65

requirieron alimentaciones de glucosa por bolo con frecuencia. Los cultivos celulares que recibieron 1 o 2 g/dia de alimentacion de glucosa continua, no recibieron ninguna alimentacion de glucosa por bolo adicional. El analisis de medios usados de estos cultivos mostro que la concentracion de glucosa era de 0 g/l el dia 4 sin reparar en si el cultivo recibia o no las alimentaciones de galactosa por bolo (Figura 1A).

Los cultivos celulares que recibieron alimentaciones de galactosa por bolo (Procesos 721,723, 725, 727, 729 y 730), mantuvieron los niveles de galactosa por encima de 2,5 g/l aunque el objetivo original era por encima de 4 g/l. (Figura 1B) Cuando se analizaron los numeros de consumo de galactosa, se encontro que habia una diferencia estadisticamente significativa en cuanta galactosa consumian los cultivos para los cultivos con glucosa limitada (Procesos que recibieron 2 g/dia o 1 g/dia de alimentacion de glucosa continua) o sin glucosa limitada (Procesos que recibieron 3 g/dia de alimentacion de glucosa continua mas alimentacion de glucosa por bolo). Los cultivos con glucosa limitada consumieron un promedio de 4,60 gramos de galactosa total, mientras que aquellos sin una limitacion sobre la glucosa consumieron un promedio de 3,81 gramos.

Las alimentaciones de glucosa continuas y las alimentaciones de galactosa por bolo tenian impacto significativo sobre la densidad celular viable y la viabilidad. Los cultivos con glucosa limitada (Procesos que recibieron 2 g/dia o 1 g/dia de alimentacion de glucosa continua), junto con una alimentacion de galactosa por bolo, mantuvieron buena densidad celular viable y viabilidad. Sin embargo, los cultivos con glucosa limitada (Procesos que recibieron 2 g/dia o 1 g/dia de alimentacion de glucosa continua) que no recibieron alimentaciones de galactosa por bolo no pudieron mantener la densidad celular viable y la viabilidad una vez que la glucosa alcanzo una limitacion el dia 4 (Figuras 1C y 1D).

Los datos anteriores indicaron que la galactosa se podia usar como fuente de carbono alternativo cuando la glucosa estaba limitada en el medio de cultivo celular. Aunque los cultivos con glucosa limitada (Procesos que recibieron 2 g/dia o 1 g/dia de alimentacion de glucosa continua), junto con alimentacion de galactosa por bolo, mantuvieron buena densidad celular viable y viabilidad, el titulo se redujo significativamente en comparacion con aquellos cultivos sin limitacion de glucosa (Procesos que recibieron 3 g/dia de alimentacion de glucosa continua), vease la Figura 1E. El analisis estadistico mostro que el nivel de alimentacion de glucosa continua tenia el mayor efecto sobre el titulo; la alimentacion de galactosa por bolo era tambien significativa, pero a un menor grado.

Los niveles de Man5 en las muestras del dia 7 se redujeron en proporcion al incremento de la alimentacion de glucosa desde 1 g/dia a 3 g/dia sin reparar en si habia o no una alimentacion de galactosa. La glucosa limitada era el unico factor estadisticamente significativo que dio como resultado incremento de Man5 en cultivo. (Figura 1F).

Ejemplo 2

Proceso de perfusion con glucosa limitada, galactosa como fuente de carbono alternativa y la adicion de glutamina

El estudio semicontinuo anterior mostro que la glucosa limitante era el unico factor que daba como resultado incremento de Man5; sin embargo los cultivos con glucosa limitada no pudieron mantener la densidad celular viable o viabilidad celular. La fuente de carbono alternativa, galactosa, no dio como resultado incremento de Man5, pero era catabolizada por las celula CHO y mantuvo buena densidad celular viable y viabilidad celular en aquellos cultivos en los que se anadio. Sin embargo, el titulo se redujo significativamente con niveles de glucosa limitados incluso con la fuente de carbono alternativa presente. Conseguir la calidad de producto deseable sin mejoramiento significativo en el titulo no es comercialmente viable, lo cual es el mismo caso que conseguir mejoramiento significativo en el titulo sin calidad de producto comparable.

Para conseguir los objetivos de mantener o mejorar el titulo y conseguir la calidad de producto deseable, los efectos de la glucosa baja y una fuente de carbono alternativa sobre la realizacion del cultivo celular y los niveles de Man5 se ensayaron en un cultivo celular de perfusion. El diseno del experimento consistio en 3 tratamientos, biorreactores duplicados para cada tratamiento.

En el dia 0, las celulas CHO que expresaban un anticuerpo IgG2 recombinante se inocularon en biorreactores de produccion de 3 l a 1x106 celulas viables/ml en un volumen de trabajo de 1.300 ml de un medio de cultivo celular definido libre de suero que contenia 5 a 8 g/l de glucosa. Los cultivos se mantuvieron a 36 °C, oxigeno disuelto al 30 %, agitacion a 400 RPM. El cultivo se cultivo en modo discontinuo durante tres dias. La concentracion de glucosa en el analisis de medio usado oscilo de 1 a 8 g/l.

En los dias 3 y 6 el cultivo recibio alimentaciones por bolo de un medio de alimentacion definido libre de suero concentrado, volumen de trabajo inicial al 8 % el dia 3 y volumen de trabajo inicial al 8 % el dia 6. Las alimentaciones de glucosa por bolo se hicieron los dias 3, 4, 5, 6, 7 para mantener una concentracion objetivo de 8 g/l de glucosa en cultivo. La glucosa en el analisis de medio usado oscilo de 1 a 8 g/l.

La perfusion se comenzo el dia 7 a un indice de perfusion de 0,48 vol/dia. La perfusion se consiguio usando un sistema de perfusion y filtracion de flujo tangencial alterno (Refine Technologies, Hanover, NJ) con un filtro de fibra hueca de 30 kDa (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). El medio de perfusion definido libre de suero, pH 7,0, contenia

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

15 g/l de glucosa. La glucosa en el analisis de medio usado oscilo de 3 a 8 g/l.

En el dfa 11 se hizo el cambio a un medio de perfusion definido libre de suero que contenfa ya galactosa y que tenfa una cantidad reducida de glucosa, vease Tabla 2a. La concentracion de glucosa en el medio de perfusion se disminuyo a 2 g/l o 4 g/l. La galactosa estaba compuesta en el medio a 6 g/l. Se usaron alimentaciones por bolo de una solucion madre de galactosa al 30 % segun era necesario para mantener la galactosa a una concentracion de 4 g/l o mas en el cultivo celular.

Para este experimento, el medio de cultivo de perfusion tambien incluyo glutamina a 5 o 10 mM para determinar si la glutamina, como la glucosa, tenfa algun efecto sobre la densidad celular viable, viabilidad celular, tftulo y/o niveles de Man5 en una situacion de limitacion de glutamina. La bibliograffa sugerfa que bajas concentraciones de glutamina podrfan tener un impacto negativo sobre el cultivo celular. Los cultivos se sometieron a perfusion con este medio de cultivo celular hasta la recoleccion el dfa 17.

Tabla 2a. Concentracion de glucosa, galactosa y glutamina en el medio de cultivo de perfusion definida libre de _______________________suero el dia 11 (pH 7,0) ___________________

Proceso

Glucosa g/l Galactosa g/l Glutamina mM

79

2 6 10

81

2 6 10

82

4 6 10

83

4 6 10

88

4 6 5

89

4 6 5

Los perfiles del cultivo celular se muestran en la Figura 2. Los perfiles de la densidad celular viable y viabilidad muestran tendencias comparables (Figuras 2A y 2B). La viabilidad de las condiciones de baja glucosa (2 g/l) y baja glutamina (5 mM) mostraron una tendencia descendente entre el dfa 15 y 17. Sin embargo, la concentracion de glutamina en el analisis de medios usados indico que la glutamina no estaba limitada bajo ninguna de las condiciones ensayadas (Figura 2C).

El descubrimiento sorprendente era que el tftulo ajustado de volumen celular empaquetado (tftulo de PCV) mostrado en la Figura 2D estaba cerca de los valores vistos para un proceso de perfusion que no estaba limitado por glucosa. El tftulo de los experimentos de perfusion en este ejemplo era mucho mayor que el visto en el proceso semicontinuo del Ejemplo 1 que solamente produjo un tftulo del 50 %. Estos datos indican que las celulas presentan un estado fisiologico diferente cuando se limita la glucosa en un proceso de perfusion que el que muestran en un proceso semicontinuo.

El analisis de los medios usados muestra que la concentracion de glucosa en los sobrenadantes de cultivo tratados con 2 g/l de glucosa en el medio de perfusion alcanzo cero el dfa 12 y la concentracion de glucosa en los sobrenadantes de cultivo tratados con 4 g/l de glucosa alcanzo cero el dfa 13, excepto para el Proceso 83 (Figura 2E). El analisis de medios usados confirmo que los cultivos estaban en un estado de glucosa limitada.

En general, la concentracion de galactosa en el cultivo determinado por analisis de medios usados permanecio por encima de 4 g/l (Figura 2F).

La Tabla 2b muestra que la especie Man5 se incrementaba cuando la concentracion de glucosa en el medio de perfusion se reducfa a 2 g/l. Los datos del curso de tiempo muestran que la especie Man5 se incrementaba con un incremento en la duracion del cultivo (Dfa 15 a Dfa 17). En igualdad de condiciones, cuando la concentracion de glucosa en el medio de perfusion se incrementaba a 4 g/l, la especie Man5 disminufa en consecuencia. Estos resultados indican que la glucosa limitante daba como resultado un incremento en los niveles de Man5 y que el estado limitado se podfa iniciar reduciendo la concentracion de glucosa en el medio de cultivo celular de perfusion a 2 g/l o inferior y confirmando con analisis de medios usados. Sin embargo, la variacion del proceso y la masa celular pueden impactar en la limitacion de glucosa y la modificacion en la especie Man5. El Proceso 83, mostro un valor de Man5 mayor que cualquier otro proceso que recibio glucosa a 4 g/l. En este caso el Proceso 83 tenfa una densidad celular viable y titulo ajustado de volumen celular empaquetado mayores (Figuras 2A y 2D) que cualquiera de los cultivos que recibieron 2 g/l de glucosa (Procesos 79 y 81) pero similares a los Procesos 79 y 81, alcanzo una concentracion de glucosa inferior que la medida por el analisis de medio gastado el dfa 12. Esto era antes que cualquier cultivo que recibfa glucosa a 4 g/l (Figura 2E). Por lo tanto, factores tales como la masa celular y/o la variacion del proceso pueden impactar en la concentracion de alimentacion de glucosa dando como resultado una situacion de glucosa limitada. En este caso en el que la densidad celular era mayor el dfa 12 (Figura 2A) conduciendo a una concentracion cerca de 0 g/l de glucosa en el medio usado, un estado de glucosa limitado se inicio incluso aunque el cultivo celular era alimentado con un medio de alimentacion de perfusion de alta glucosa (4 g/l). Una vez que la glucosa estaba limitada, se incrementaron los niveles de Man5.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla 2b. % de Man5 el dia 15 y 17 despues del cambio en la formulacion del medio de perfusion el dia 11

Proceso

Glucosa g/l Galactosa g/l Glutamina mM % Man5 dia 15 % Man5 dia 17

79

2 6 10 9,29 9,84

81

2 6 10 9,28 9,49

82

4 6 10 4,64 5,62

83

4 6 10 7,56 8,91

88

4 6 5 5,19 5,65

89

4 6 5 5,09 5,63

Ejemplo 3

Proceso de perfusion con una combinacion de glucosa reducida y alta galactosa

Se realizo un experimento con un medio de perfusion definido libre de suero (pH 7,0) formulado con glucosa a concentraciones de 1,5 o 3 g/l. La galactosa se anadio a 10, 11,5 o 13 g/l, basado en la tasa de consumo total del experimento anteriormente descrito. Tanto la glucosa como la galactosa estaban compuestas en los medios de perfusion asi el cultivo se podia mantener sin alimentaciones por bolo de o bien glucosa o galactosa. La composicion redujo la complejidad del proceso y mejoro la uniformidad. El experimento se realizo como se describio anteriormente; usando las mismas estrategias de alimentacion los dias 0 a 10. La Tabla 3 proporciona las combinaciones de formulaciones de medio de perfusion los dias 11 a 17.

Tabla 3. Diseno de experimento de c

lucosa y galactosa en medios de perfusion.

Proceso

Glucosa g/l Galactosa g/l

103

3 13

104

0 10

105

0 13

106

0 10

107

1,5 11,5

108

0 13

109*

3 10

111

3 13

112

3 10

113

1,5 11,5

*El proceso 109 se excluyo de las figuras debido al fallo operacional del biorreactor

Los perfiles de cultivo celular en la Figura 3 muestran que todas las condiciones de cultivo celular ensayadas estaban limitadas por glucosa despues del cambio del dia 11 (Figura 3A) y las concentraciones de galactosa medidas en el ensayo de medio usado se mantuvieron entre 4 a 8 g/l (Figura 3B) que era proporcional a las concentraciones de galactosa compuestas en el medio de perfusion. El nivel de lactato bajo en pendiente a cero una vez que la glucosa alcanzo una limitacion el dia 12 (Figura 3C). El nivel de amoniaco se incremento comenzando el dia 10, antes de que la glucosa alcanzara una limitacion (Figura 3D). Era muy interesante ver que al reducir la concentracion de glucosa comenzando el dia 11 se daba como resultado crecimiento, viabilidad y titulo inferiores (Figuras 3E-3G). Estos resultados indican que la glucosa limitada, no limitacion de glutamina, causa reduccion de titulo en un proceso de perfusion asi como el proceso semicontinuo en el Ejemplo 1. Tambien, puesto que los niveles de glucosa de 2 a 3 g/l, e incluso hasta 4 g/l, dieron como resultado el incremento en los niveles de Man5, los niveles de glucosa tambien proporcionaron alguna ayuda en el mantenimiento de los niveles de titulo superior.

El analisis estadistico que uso el programa informatico JMP (JMP Inc. Cary, NC) revelo que la concentracion de glucosa era el unico factor estadisticamente significativo (valor p=0,032) que el titulo impactado. La galactosa no era un factor estadisticamente significativo para el titulo (Figura 4A). Por otro lado, tanto la glucosa como la galactosa no eran factores estadisticamente significativos que impactaban en la especie Man5, pero la interaccion entre glucosa y galactosa era estadisticamente significativa (valor p=0,0613). (Figura 4B). A mayor concentracion de galactosa mayor el efecto de la glucosa limitada en la especie Man5.

En general los niveles de Man5 se incrementaron y estabilizaron cuando la glucosa oscilo de 0 a 3 g/l y disminuyeron cuando los niveles de glucosa eran de 4 g/l o mayor. La Figura 5 muestra el incremento en porcentaje de la especie Man5 el dia 11, 13, 15 y 17. Para todas las condiciones de cultivo, el porcentaje de especie Man5 comenzo a aproximadamente el 2 % el dia 11 y a continuacion se incremento gradualmente a por el encima del 10 % el dia 17. El incremento mas significativo en porcentaje de la especie Man5 era los dias 11 a 13 cuando la glucosa llego a estar limitada.

Puesto que la glucosa impacta en el titulo, la glucosa deberia ser suministrada a la mayor concentracion que aun soportaria un incremento en Man5 mientras que se mantiene la viabilidad celular, densidad y titulo a un nivel aceptable, basado en las condiciones del cultivo celular, tales como masa celular, el proceso de cultivo celular y la fuente de carbon alterno usada. Por ejemplo, para un cultivo celular de perfusion que tenia de 15 a 25x106

celulas/ml, concentraciones de glucosa de 0 a 4 g/l en combinacion con galactosa a 10 a 13 g/l, dieron como resultado un incremento de Man5.

Claims (22)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para la modulacion de una o mas especies de glucano de alta manosa sobre una proteina recombinante durante el cultivo de celula mamifera que comprende:

   establecer un cultivo de celula mamifera en un biorreactor con un medio de cultivo definido libre de suero que contiene 5 a 8 g/l de glucosa;

   cultivar las celulas mamiferas durante una fase de crecimiento y complementar el medio de cultivo con alimentaciones por bolo de un medio de alimentacion definido libre de suero de 5 a 8 g/l de glucosa; iniciar una fase de produccion en el cultivo celular mediante perfusion con un medio de perfusion libre de suero que tiene 5 a 15 g/l de glucosa; y

   en un momento predeterminado durante la fase de produccion, reducir la concentracion de glucosa a concentraciones limitantes mediante perfusion del cultivo celular con un medio de perfusion de baja glucosa que contiene o esta complementado con una cantidad disminuida de glucosa, en la que dicho medio de perfusion contiene ademas o esta complementado con galactosa.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la cantidad disminuida de glucosa es suficiente para dar como resultado una concentracion de glucosa en el medio usado de o aproximadamente 0 g/l.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la concentracion de la cantidad disminuida de glucosa en el medio de perfusion de baja glucosa es de 0 a 3 g/l, de 2 a 3 g/l, es 2,5 g/l o es 0 g/l.
4. 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la concentracion de galactosa en el medio de perfusion es de 10 a 20 g/l, de 10 a 15 g/l, de 10 a 12 g/l, o es 11,5 g/l.
5. 5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la perfusion comienza (a) en o aproximadamente el dia 5 a en o aproximadamente el dia 9 del cultivo celular, o (b) en o aproximadamente el dia 5 a en o aproximadamente el dia 7 del cultivo celular.
6. 6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que:

   (a) la perfusion comienza cuando las celulas han alcanzado una fase de produccion;

   (b) la perfusion comprende perfusion continua;

   (c) el indice de perfusion es constante;

   (d) la perfusion se realiza a un indice de menos de o igual a 1,0 volumenes de trabajo por dia;

   (e) la perfusion se realiza a un indice que incrementa durante la fase de produccion de 0,25 volumen de trabajo por dia a 1,0 volumen de trabajo por dia durante el cultivo celular;

   (f) la perfusion se realiza a un indice que alcanza 1,0 volumen de trabajo por dia en el dia 9 al dia 11 del cultivo celular; o

   (g) la perfusion se realiza a un indice que alcanza 1,0 volumen de trabajo por dia en el dia 10 del cultivo celular.
7. 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que

   (a) las alimentaciones por bolo de medio de alimentacion libre de suero comienzan el dia 3 o el dia 4 del cultivo celular; y/o

   (b) el cultivo de celula mamifera se establece inoculando el biorreactor con al menos 0,5x106 a 3,0x106 celulas/ml o con al menos 0,5x106 a 1,5x106 celulas/ml en un medio de cultivo libre de suero.
8. 8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo ademas un cambio de temperatura de 36 2C a 31 °C o de 36 °C a 33 °C.
9. 9. El metodo segun la reivindicacion 8, en el que el cambio de temperatura ocurre (a) en la transicion entre la fase de crecimiento y la fase de produccion, o (b) durante la fase de produccion.
10. 10. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo ademas la induccion de la deteccion del crecimiento celular por:

    (a) privacion de L-asparagina seguido de perfusion con un medio de perfusion libre de suero que tiene una concentracion de L-asparagina de 5 mM o menos, o

    (b) perfusion con un medio de perfusion libre de suero que tiene una concentracion de L-asparagina de 5 mM o menos.
11. 11. El metodo segun la reivindicacion 10, en el que la concentracion de L-asparagina en el medio de perfusion libre de suero es menos de o igual a 5 mM, menos de o igual a 4,0 mM, menos de o igual a 3,0 mM, menos de o igual a 2,0 mM, menos de o igual a 1,0 mM, o es 0 mM.

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40
12. 12. El metodo segun la reivindicacion 10 u 11, en el que se hace un seguimiento de la concentracion de L- asparagina del medio de cultivo celular antes de y durante la privacion de L-asparagina.
13. 13. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo ademas que el volumen celular empaquetado durante una fase de produccion es menos de o igual al 35 %, o menos de o igual al 30 %, opcionalmente en el que la densidad celular viable del cultivo de celula mamifera es de 10x106 celulas viables/ml a 80x106 celulas viables/ml o 20x106 celulas viables/ml a 30x106 celulas viables/ml
14. 14. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la perfusion se consigue por flujo tangencial alterno, opcionalmente usando un ultrafiltro o un microfiltro.
15. 15. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l, al menos 500 l a 2.000 l, o al menos 1.000 l a 2.000 l.
16. 16. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la especie de glucano de alta manosa es Manosa 5.
17. 17. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las celulas mamiferas son celulas de ovario de hamster chino (CHO).
18. 18. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteina recombinante es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, una proteina de fusion recombinante o una citoquina.
19. 19. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo ademas una etapa de recoleccion de la proteina recombinante producida por el cultivo celular.
20. 20. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteina recombinante producida por el cultivo celular se purifica y formula en una formulacion farmaceuticamente aceptable.
21. 21. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la produccion de proteina recombinante de la especie de glucano de alta manosa se incrementa en comparacion con un cultivo en el que las celulas no se someten a glucosa limitada en combinacion con galactosa.
22. 22. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y 19 a 20, en el que la proteina recombinante es un anticuerpo,

    las celulas mamiferas son celulas CHO,

    la especie de glucano de alta manosa es Manosa 5, y

    en el que la produccion de anticuerpo de la especie Manosa 5 se incrementa en comparacion con un cultivo en el que las celulas CHO no se someten a glucosa limitada en combinacion con galactosa.