CN111527214A - 用聚醚离子载体调整蛋白质甘露糖基化状况的方法 - Google Patents

用聚醚离子载体调整蛋白质甘露糖基化状况的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111527214A
CN111527214A CN201880080157.6A CN201880080157A CN111527214A CN 111527214 A CN111527214 A CN 111527214A CN 201880080157 A CN201880080157 A CN 201880080157A CN 111527214 A CN111527214 A CN 111527214A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mannosylation
protein
culture
polyether ionophore
maduramicin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201880080157.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111527214B (zh
Inventor
D·布鲁尔曼
T·弗勒明
M·乔丹
H·布罗利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ares Trading SA
Original Assignee
Ares Trading SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ares Trading SA filed Critical Ares Trading SA
Publication of CN111527214A publication Critical patent/CN111527214A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111527214B publication Critical patent/CN111527214B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及用聚醚离子载体在细胞培养过程中调整哺乳动物宿主细胞所表达重组蛋白甘露糖基化状况的方法和组合物。

Description

用聚醚离子载体调整蛋白质甘露糖基化状况的方法
发明领域
本发明涉及用聚醚离子载体在细胞培养过程中调整哺乳动物宿主细胞所表达重组蛋白甘露糖基化状况的方法和组合物。
背景技术
蛋白质如治疗性蛋白质或抗体的糖基化状况是重要的特征，由于其对例如折叠、稳定性和抗体依赖性细胞毒性(ADCC，负责抗体治疗效果的机制之一)的影响而导致半衰期和亲和力变化，进而影响蛋白质的生物学活性(Eon-Duval等，2012)。糖基化高度依赖于用来生产感兴趣蛋白质的细胞系以及细胞培养过程(pH、温度、细胞培养基组成、原料批次间区别、培养基过滤材料、空气等)。
ADCC活性受与Fc区的寡糖连接的岩藻糖和/或甘露糖的量影响，可观察到随着岩藻糖减少和/或甘露糖增加而活性增强。事实上，举例来说，与岩藻糖基化的IgG相比，非岩藻糖基化形式表现出显著增强的ADCC，因为后者FcγRIIIa结合容量(binding capacity)增加而补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗原结合能力都未见改变(Yamane-Ohnuki和Satoh,2009)。类似地，甘露糖-5聚糖水平高的抗体ADCC也更高(Yu等，2012)。因此，在ADCC反应为抗体活性主要治疗机制的情况下，提供方法来制备糖基化状况以岩藻糖基化降低和/或甘露糖基化升高为特征的重组治疗性蛋白质是有益的。高甘露糖基化抗体的优点还包括在低剂量下达到治疗效果。
由于糖基化(例如甘露糖基化)会影响治疗效用和安全性，因此蛋白质糖基化(例如甘露糖基化)的调整对于市售治疗性蛋白质或抗体尤其重要。此外，在生物仿制药化合物框架内，重组蛋白糖基化状况的控制是至关重要的，因为所述重组蛋白的糖基化状况必须与参照产物的糖基化状况一致。已知有些化合物能影响重组产生的蛋白质的甘露糖基化：例如WO2014151878和WO2014159259记载用蔗糖之类寡糖提高甘露糖基化水平，WO2015105609采用精氨酸酶抑制剂，WO2015066357提出采用莫能菌素(monensine)。
然而，仍然需要允许控制重组蛋白糖基化状况例如甘露糖基化状况但不影响在培细胞的性能和重组蛋白产量的培养条件和生产方法。本发明通过提供用于调整重组蛋白糖基化例如重组蛋白甘露糖基化同时保持产量/条件亦可接受的方法和组合物来满足该需求。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种产生甘露糖基化状况经调整的重组蛋白的方法，所述方法包括在含有聚醚离子载体的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞。
或者，本文公开了一种产生甘露糖基化状况经调整的重组蛋白的方法，所述方法包括在补充以至少一种包含聚醚离子载体的补料的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞。
另一方面，本发明提供一种包含细胞培养基的组合物，所述细胞培养基含有聚醚离子载体或补充以聚醚离子载体。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明方法产生的甘露糖基化状况经调整的重组蛋白和药学上可接受的运载体。
另一方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明方法产生的甘露糖基化状况经调整的重组蛋白。
再一方面，本发明提供聚醚离子载体在细胞培养基中或在补料培养基中用于调整重组蛋白甘露糖基化状况的用途。
优选地，聚醚离子载体选自马杜拉霉素(maduramycin)、甲基盐霉素(narasin)或盐霉素(salinomycin)。
附图说明
注：全部附图中：S0后跟浓度＝培养开始时的盐霉素浓度，N0后跟浓度＝培养开始时的甲基盐霉素浓度，M0后跟浓度＝培养开始时的马杜拉霉素浓度，M5后跟浓度＝第5天作为补料添加的马杜拉霉素的浓度，M7后跟浓度＝第7天作为补料添加的马杜拉霉素的浓度。uM＝微摩尔。mioVC/mL＝每mL百万活细胞。
图1显示微型生物反应器Ambr中于不同聚醚离子载体浓度下培养的mAb1细胞的活细胞密度(
Figure BDA0002534971180000021
)随时间的变化。
图2显示微型生物反应器Ambr中于不同盐霉素浓度(培养开始时加入)培养的mAb1细胞的活细胞密度(图2A；
Figure BDA0002534971180000022
)和活力(图2B；
Figure BDA0002534971180000023
)随时间的变化，还有滴度(图2C；PA-HPLC)，至第14天。结果表示为平均值±标准偏差。
图3显示微型生物反应器Ambr中于不同甲基盐霉素浓度(培养开始时加入)培养的mAb1细胞的活细胞密度(图3A；
Figure BDA0002534971180000031
)和活力(图3B；
Figure BDA0002534971180000032
)随时间的变化，还有滴度(图3C；PA-HPLC)，至第14天。结果表示为平均值±标准偏差。
图4显示微型生物反应器Ambr中于不同马杜拉霉素浓度(培养开始时加入)培养的mAb1细胞的活细胞密度(图4A；
Figure BDA0002534971180000033
)和活力(图4B；
Figure BDA0002534971180000034
)随时间的变化，还有滴度(图4C；PA-HPLC)，至第14天。结果表示为平均值±标准偏差。
图5显示微型生物反应器Ambr中于不同马杜拉霉素浓度(第7天加入)培养的mAb1细胞的活细胞密度(图5A；
Figure BDA0002534971180000035
)和活力(图5B；
Figure BDA0002534971180000036
)随时间的变化，还有滴度(图5C；PA-HPLC)，至第14天。结果表示为平均值±标准偏差。
图6显示微型生物反应器Ambr中于不同聚醚离子载体浓度下培养的mAb1第12天(图6A)和第14天(图6B)的甘露糖基化状况。结果表示为平均值±标准偏差。
图7显示微型生物反应器Ambr中于不同盐霉素浓度(培养开始时加入)培养的mAb2细胞的活细胞密度(图7A；
Figure BDA0002534971180000037
)和活力(图7B；
Figure BDA0002534971180000038
)随时间的变化，还有滴度(图7C；PA-HPLC)，至第14天。结果表示为平均值±标准偏差。
图8显示微型生物反应器Ambr中于不同甲基盐霉素浓度(培养开始时加入)培养的mAb2细胞的活细胞密度(图8A；
Figure BDA0002534971180000039
)和活力(图8B；
Figure BDA00025349711800000310
)随时间的变化，还有滴度(图8C；PA-HPLC)，至第14天。结果表示为平均值±标准偏差。
图9显示微型生物反应器Ambr中于不同马杜拉霉素浓度(培养开始时加入)培养的mAb2细胞的活细胞密度(图9A；
Figure BDA00025349711800000311
)和活力(图9B；
Figure BDA00025349711800000312
)随时间的变化，还有滴度(图9C；PA-HPLC)，至第14天。结果表示为平均值±标准偏差。
图10显示微型生物反应器Ambr中于不同马杜拉霉素浓度(第5天加入)培养的mAb2细胞的活细胞密度(图10A；
Figure BDA00025349711800000313
)和活力(图10B；
Figure BDA00025349711800000314
)随时间的变化，还有滴度(图10C；PA-HPLC)，至第14天。结果表示为平均值±标准偏差。
图11显示微型生物反应器Ambr中于不同聚醚离子载体浓度下培养的mAb2第10天(图11A)和第12天(图11B)的甘露糖基化状况。结果表示为平均值±标准偏差。
发明详述
本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。提供本文讨论的出版物和申请仅针对其在本申请提交日之前的公开内容。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。如本文所使用的，提供以下定义以便于理解本发明。
在例如“A和/或B”之类表述中所用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。
术语“细胞培养”或“培养”是指体外(in vitro)(即在生物体外或组织外)的细胞生长和繁殖。哺乳动物细胞的适宜培养条件是本领域已知的，例如在《用于制药和细胞疗法的细胞培养技术》(Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-BasedTherapies)(2005)中教导的。哺乳动物细胞可以悬浮培养或附着于固体基质培养。
术语“细胞培养基”、“培养基”及其复数形式是指可培养任意类型细胞的任意培养基。“基础培养基”是指含有对细胞代谢有用的所有必需成分的细胞培养基。这包括例如氨基酸、脂质、碳源、维生素和矿物盐。DMEM(达氏修正依氏培养基)，RPMI(洛斯维公园纪念研究所培养基)或培养基F12(翰氏(Ham's)F12培养基)是市售基础培养基的示例。或者，所述基础培养基可以是完全内部开发的专有培养基，在此也称为“化学组成明确的培养基”(“chemically defined medium”或“chemically defined culture medium”)，其中所有成分都可以用化学式来描述并且以已知浓度存在。培养基可以不含蛋白质和/或不含血清，并且可以补充任何其他化合物(例如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子)，这取决于培养细胞的需要。
术语“补料培养基”或“补料”(及其复数)是指在培养过程中用作补充物以补充消耗掉的营养素的培养基。补料培养基可以是市售的补料培养基或专有补料培养基(或者在本文中又称化学组成明确的补料培养基)。
术语“生物反应器”或“培养系统”是指可以培养细胞的任何系统，所述培养优选以分批或分批补料方式培养。该术语包括但不限于烧瓶、静态烧瓶、旋转瓶、管、摇管、摇瓶、摇袋(wave bag)、微型生物反应器、生物反应器、纤维生物反应器、流化床生物反应器以及含微载体或不含微载体的搅拌罐生物反应器。或者，术语“培养系统”还包括微量滴定板、毛细管或多孔板。可以使用任意尺寸的生物反应器，例如0.1毫升(0.1mL，非常小规模)至20000升(20000L或20KL，大规模)，例如0.1mL、0.5mL、1mL、5mL、0.01L、0.1L、1L、2L、5L、10L、50L、100L、500L、1000L(或1KL)、2000L(或2K)、5000L(或5KL)、10000L(或10KL)、15000L(或15KL)或20000L(20KL)。
术语“分批补料培养”是指这样一种培养细胞的方法，其中包括团注(bolus)或连续地补充补料培养基以补充消耗掉的营养素。根据培养基配方、细胞系及其他细胞生长条件，这种细胞培养技术能获得超过10x 106至40x 106个细胞/ml的高细胞密度。可采用各种补料策略和培养基配方来创建和维持双相培养条件。
或者可以使用灌注培养。灌注培养中，细胞培养物接受新鲜灌注补料培养基，同时除去废培养基。灌注可以是连续的、分步的、间歇的，或以上若干或全部的任意组合。灌注速率可以为每天小于一工作体积至多个工作体积。优选地，细胞保留在培养物中，且移除的废培养基中基本不含细胞或所含细胞显著少于培养物。灌注可以采用多种细胞截留技术来完成，包括离心、沉淀或过滤(参见例如Voisard等，2003)。
使用本发明的方法和/或细胞培养技术时，甘露糖基化状况经调整的蛋白质一般直接分泌到培养基中。一旦所述蛋白质分泌到培养基中，就可以首先用市售蛋白质浓缩滤器对来自这种表达系统的上清液进行浓缩。
本文中，“细胞密度”是指给定体积培养基中细胞的数量。“活细胞密度”是指据标准活力检测法测定的给定体积培养基中的活细胞数。如果细胞密度与对照培养条件下的细胞密度相比差异在约-10％至+10％范围内，则视为细胞密度保持不变。如果比对照培养条件高出超过+10％则视为升高，如果比对照培养条件低过-10％则视为降低。
术语“活力”或“细胞活力”是指培养物中活细胞总数与细胞总数之间的比率。只要活力与培养开始时的活力相比不低于60％，通常是可接受的(然而，可接受的阈值可以根据具体情况确定)。活力通常用于确定收获时间。例如，在分批补料培养中，活力变至60％时或培养14天后可进行收获。如果与对照培养条件下的活力相比差异在约-10％至+10％范围内，则视为活力保持不变。如果比对照培养条件高出超过+10％则视为升高，如果比对照培养条件低过-10％则视为降低。
术语“滴度”是指溶液中的物质(此处为感兴趣的蛋白质)的量或浓度。它指示溶液可被稀释而仍含有可检测量的感兴趣分子的稀释倍数。其计算是常规的，例如通过连续稀释(1:2、1:4、1:8、1:16等)含有感兴趣蛋白质的样品，然后使用适当的检测方法(比色法、色谱法等)测定各稀释液是否存在可测水平的感兴趣蛋白质。还可以采用诸如PA-HPLC(实施例中所用)、FortéBio
Figure BDA0002534971180000061
或Biacore
Figure BDA0002534971180000062
等手段来测量滴度。如果与对照培养条件下相比差异在约-10％至+10％范围内，则视为滴度保持不变。如果比对照培养条件高出超过+10％则视为升高，如果比对照培养条件低过-10％则视为降低。
术语“经调整的甘露糖基化状况”或“经调整的甘露糖基化水平”指重组蛋白(例如治疗性蛋白质或抗体)的甘露糖基化状况/水平与表达重组蛋白的重组细胞在没有补充聚醚离子载体(例如马杜拉霉素、甲基盐霉素或盐霉素)的细胞培养基中培养所产生的相同蛋白质的甘露糖基化状况/水平相比发生了调整。举例来说，经调整的甘露糖基化状况/水平可以是所述蛋白质中高甘露糖类增加。实施方式之一中，经调整的甘露糖基化状况/水平可包括蛋白质甘露糖基化水平的总体提高，例如所述蛋白质中高甘露糖类增加。如果与对照培养条件相比差异在约-10％至+10％的范围内则视为甘露糖基化水平(总水平或各类糖水平)保持不变。如果比对照培养条件高出超过+10％则视为升高，如果比对照培养条件低过-10％则视为降低。
本文中，术语“蛋白质”包括肽和多肽，并且指包含两个或更多个氨基酸残基的化合物。本发明所述的蛋白质包括但不限于细胞因子、生长因子、激素、融合蛋白(例如Fc融合蛋白)、抗体或其片段。治疗性蛋白质指用于或能够用于治疗的蛋白质。
术语“重组蛋白”是指用重组技术产生的蛋白质。重组技术为本领域技术人员所熟知和掌握(参见例如Sambrook等，1989和更新版)。
术语“抗体”及其复数形式包括但不限于多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合片段，如F(ab')2、Fab蛋白酶水解片段以及单链可变区片段(scFv)。还包括遗传工程改造的完整抗体或片段，例如SEED体、嵌合抗体、scFv和Fab片段，以及合成的抗原结合肽和多肽。
术语“人源化”免疫球蛋白指包含人框架区和一个或多个来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架区的人免疫球蛋白称为“受体”(通过将非人CDR移植到人框架区和恒定区上或通过将整个非人可变结构域整合到人恒定区(嵌合)上来进行人源化)。恒定区不是必需的，但如果存在，其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％、优选至少约95％或更高相同度。因此，如果需要调整效应子功能，则人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了CDR和重链恒定区中的一些残基之外，与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。通过使抗体人源化可以延长生物半衰期并减少对人给药后发生不良免疫反应的可能性。
术语“全人”免疫球蛋白指同时包含人框架区和人CDR的免疫球蛋白。恒定区不是必需的，但如果存在，其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％、优选至少约95％或更高相同度。因此，如果需要调整效应子功能或药代动力学性质，则全人免疫球蛋白的所有部分，可能除了重链恒定区中的少数残基之外，与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。在一些情况下，可以在CDR、框架区或恒定区中引入氨基酸突变来提高抗体的结合亲和力和/或降低免疫原性和/或改善生化/生物物理学性质。
术语“重组抗体”是指用重组技术产生的抗体。由于重组DNA技术在抗体产生中的涉入不必局限于天然抗体中发现的氨基酸序列；抗体可以重新设计以获得所需的特性。可能的变化是多种多样的，从仅改变一个或几个氨基酸到例如可变结构域或恒定区的完全重新设计。通常，进行恒定区的改变以改善、减少或改变例如补体固定(例如补体依赖性细胞毒性，CDC)、与Fc受体的相互作用、以及其他效应子功能(例如抗体依赖性细胞毒性，ADCC)、药物动力学特性(例如，与新生儿Fc受体FcRn结合)等特征。可以为了改善抗原结合特性而对可变结构域进行改变。除抗体外，免疫球蛋白还可以多种其他形式存在，包括例如单链或Fv、Fab和(Fab')2以及双抗体、线性抗体、多价或多特异性杂交抗体。
术语“抗体部分”指完整或全长链或抗体的片段，通常是结合区或可变区。所述部分或片段应保留完整链/抗体的至少一种活性，即它们是“功能性部分”或“功能性片段”。如果它们保留至少一种活性，则优选保留靶标结合特性。抗体部分(或抗体片段)的示例包括但不限于“单链Fv”、“单链抗体”、“Fv”或“scFv”。这些术语指在单个多肽链内包含来自重链和轻链的可变结构域但缺少恒定区的抗体片段。通常，单链抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头由此使得该单链抗体得以形成抗原结合所需的结构。在一些具体实施方式中，单链抗体还可以是双特异性和/或人源化的。
“Fab片段”包含一条重链的可变结构域和CH1结构域和一条轻链。Fab分子的重链无法与另一重链分子形成二硫键。含有一条轻链和一条重链且含有更多恒定区(CH1和CH2结构域之间部分)从而在两条重链之间形成链间二硫键的“Fab'片段”称作F(ab')2分子。“F(ab')2”含有两条轻链和两条重链，重链含有恒定区中CH1和CH2结构域之间的部分，由此在两条重链之间形成链间二硫键。在定义了若干重要术语后，现在可以着重讨论本发明的具体实施方式了。
可以根据本发明产生的已知抗体的实例包括但不限于阿达木单抗(adalimumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、贝利单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、卡那基单抗(canakinumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺珠单抗(denosumab)、依库珠单抗(eculizumab)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、匹姆单抗(pidilizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、司妥昔(siltuximab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、尤特科单抗(ustekinumab)或维多珠单抗(vedolizomab)。
单位、前缀和符号的使用遵循相应标准(国际单位制(SI))。
大多数天然存在的蛋白质包含碳水化合物或糖部分，这些碳水化合物或糖部分与主肽链上选定数目的氨基酸通过特异性连接从而连接到肽上。因此，许多天然存在的肽被称为“糖肽”或“糖蛋白”或被称为“糖基化”的蛋白质或肽。糖蛋白上主要的糖有：岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)、N-乙酰葡糖胺(“GlcNAc”)、木糖和唾液酸。连接到肽链上的寡糖结构被称为“聚糖”分子。聚糖的性质影响着它们连接所在蛋白质的三维结构和稳定性。天然糖肽中的聚糖结构分两大类：“N-连接的聚糖”或“N-连接的寡糖”(真核细胞中的主要形式、)和“O-连接的聚糖”或“O-连接的寡糖”。真核细胞中表达的肽通常包含N-聚糖。N-连接糖蛋白的糖基团加工在内质网(ER)的腔中发生并在高尔基体中持续。这些N-连接的糖基化发生在肽一级结构中的天冬酰胺残基上，在含有氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸(X是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意氨基酸残基)的位点上。
表1列出了CHO细胞分泌的抗体或其片段上可见的主要聚糖：
Figure BDA0002534971180000081
Figure BDA0002534971180000091
表1—主要聚糖结构(图例：灰色方块：GlcNAc；中度灰色圆：甘露糖，浅灰色圆：半乳糖；灰色三角形：岩藻糖；灰色菱形：唾液酸)
术语“糖型”是指区别仅在于连接聚糖数量和/或类型的蛋白质例如抗体或其片段的同种型。通常，含糖蛋白的组合物包含所述糖蛋白的多种不同糖型。
用于测定聚糖一级结构的技术是本领域公知的，可详见例如Roth等(2012)或Song等(2014)。分离细胞产生的蛋白质并确定其N-聚糖的结构是常规的。N-聚糖在含糖分支(也称为“天线(antennae)”)的数目以及所述分支的性质上各不相同，这些分支在man3GlcNac2核心结构之外还可包括例如N-乙酰葡糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、岩藻糖和/或唾液酸。关于标准糖生物学命名法的综述参见Varki等1999。
蛋白质上的N-聚糖结构包含至少三个甘露糖残基。这些结构可以进一步甘露糖基化。甘露糖基化的聚糖如Man5、Man6、Man7、Man8或Man9被称为高甘露糖聚糖(或高甘露糖类)(见前文表1)。
术语“对象”旨在包括(但不限于)哺乳动物，例如人、狗、牛、马、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔或大鼠。更优选地，对象是人。
本发明提供用于调整诸如治疗性蛋白质或抗体之类重组蛋白甘露糖基化状况的方法和组合物。本发明基于针对蛋白生产(例如抗体或其抗原结合片段生产)的细胞培养条件优化，这种优化产生甘露糖基化状况经调整的重组蛋白，所述调整以甘露糖基化水平升高为佳(例如高甘露糖类水平升高)。
马杜拉霉素(maduramycin或maduramicin)是一种聚醚离子载体，最早分离自红色马杜拉放线菌(actinomycete Actinomadura rubra)。它与一价阳离子形成复合物，与K+的亲和力高于与Na+的。它的Cas编号是79356-08-4。它的化学式是：
Figure BDA0002534971180000101
盐霉素是另一种聚醚离子载体。它的Cas编号是53003-10-40。它的化学式是：
Figure BDA0002534971180000102
甲基盐霉素是聚醚离子载体的另一个例子。它是盐霉素的衍生物，多一个甲基基团。它的Cas编号是55134-13-9。它的化学式是：
Figure BDA0002534971180000111
拉沙里菌素是由拉沙里链霉菌(Streptomyces lasaliensis)产生的聚醚离子载体。它的Cas编号是25999-31-9。它的化学式是：
Figure BDA0002534971180000112
目前发现在补充聚醚离子载体(或聚醚离子载体化合物)例如马杜拉霉素、甲基盐霉素和盐霉素的细胞培养条件下重组蛋白的甘露糖化糖型含量增加(尤其是高甘露糖类含量)。因此，在细胞培养生产过程中，当需要调整重组蛋白的甘露糖基化状况(例如所产生的重组蛋白中的高甘露糖类)时，可以在细胞培养物中添加聚醚离子载体(例如马杜霉素、甲基盐霉素、盐霉素)或用含有聚醚离子载体(例如马杜霉素、甲基盐霉素、盐霉素)的补料培养基进行补料。或者，细胞培养基可以已经包含所述聚醚离子载体。还发现，在补充以聚醚离子载体的特定细胞培养条件下，细胞生长、活力和滴度与无聚醚离子载体条件下生长的细胞相比不受深度影响；需要说明的是，所述无聚醚离子载体条件下生长的细胞对应于本发明中的对照。
在一个方面，本发明提供一种产生甘露糖基化状况经调整的重组蛋白的方法，所述方法包括在包含或补充以聚醚离子载体的细胞培养基中培养表达所述蛋白的重组细胞。
或者，本发明记载了一种产生甘露糖基化状况经调整的重组蛋白的方法，所述方法包括在补充以至少一种包含聚醚离子载体的补料的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞。
实施方式之一中，本文提供聚醚离子载体在细胞培养基或补料培养基中用于调整哺乳动物细胞中产生的重组蛋白的糖基化状况(例如调整甘露糖基化状况)的用途。
在另一方面，本发明提供一种包含细胞培养基或补料培养基的组合物，所述细胞培养基或补料培养基含有聚醚离子载体。
再一方面，本发明提供聚醚离子载体(例如马杜拉霉素、甲基盐霉素或盐霉素)用于调整哺乳动物细胞生产的重组蛋白的甘露糖基化状况的用途。
就本发明整体而言，优选的聚醚离子载体化合物选自：马杜拉霉素、甲基盐霉素或盐霉素。
较好的是，就本发明整体而言，蛋白质经调整的甘露糖基化状况是相比对照(即无聚醚离子载体条件下培养的细胞)重组蛋白总甘露糖基化水平升高。更具体地说，甘露糖基化水平升高主要缘于Man5类糖增加，还有Man6和Man7型(尽管程度较低)。较好的是，总甘露糖基化水平以及各种高甘露糖类(例如Man5、Man6、Man7、Man8、Man9)各自的水平至少是对照的两倍，例如比对照至少100％增加、或至少150％增加或至少200％增加(相对变化)。根据定义部分，甘露糖基化水平的调整或甘露糖基化水平的增加是相对于在不补充聚醚离子载体的细胞培养基中培养的表达所述重组蛋白的重组细胞所产生的相同蛋白质的甘露糖基化水平来表示的。
就本发明整体而言，待生产的重组蛋白(或感兴趣的蛋白质)可以是治疗性蛋白质、融合蛋白(例如Fc-融合蛋白)、抗体或其抗原结合片段(例如人抗体或其抗原结合部分、人源化抗体或其抗原结合部分、嵌合抗体或其抗原结合部分)。优选地，它是抗体或其抗原结合片段。
本发明方法可用来产生甘露糖基量或水平升高的任何感兴趣的蛋白质。举例来说，可能的确需要进行抗体甘露糖基化水平调整来达到或维持例如某种CDC和/或ADCC水平。
就本发明整体而言，在接种之前或之后向细胞培养基中添加聚醚离子载体化合物，例如马杜拉霉素、甲基盐霉素或盐霉素。较好的是，将聚醚离子载体化合物加入细胞培养基以达到0.5至250nM或约0.5至250nM的接种后浓度，优选1至200nM或约1至200nM，更优选2至150nM或约2至150nM，例如浓度为或约为2、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120nM。例如，通过调节聚醚离子载体化合物的浓度可以调整甘露糖基化状况。如果在接种前将聚醚离子载体化合物加入细胞培养基则必需考虑与接种本身相关的稀释因数。已知补料时的培养基体积和接种后细胞培养物的体积(或加入的接种物体积)很容易算出稀释因数。上述稀释因数一般为10至15％。然而，如果是高密度接种也可以高达30％。例如，如果目标是相当于接种后约10nM而稀释因数为10％，则聚醚离子载体必须按照约11nM的终浓度(接种前)来添加。该终浓度必须被理解为给定补充物/补料在培养基中一度达到的终浓度。实际上，举例来说，技术人员会明白，如果在培养期间以2次补料加入聚醚离子载体化合物，则总的终浓度将对应于与第一次补充物/补料后剩余终浓度叠加的第二次补充物/补料的终浓度。需要说明的是，聚醚离子载体的浓度必须与具体细胞系相适应，该浓度与针对各目标细胞系的毒性相关。例如，如果化合物起初在200nM左右是有毒的(与对照相比第3天VCD降低因数达3)，则最好在低约10倍(例如20nM)的浓度对其进行测试。
就本发明而言，细胞培养基是适合动物细胞如哺乳动物细胞在体外细胞培养中生长的培养基。细胞培养基配方在本领域中是众所周知的。根据培养细胞的需要，细胞培养基可补充额外的组分，如糖、维生素、激素和生长因子。优选地，细胞培养基不含动物性组分；它们可以不含血清和/或不含蛋白质。
在本发明的某些实施方式中，向细胞培养基补充聚醚离子载体，例如在培养开始时，并且/或者以分批补料或连续的方式补充。可以基于测得的中间甘露糖基化状况/水平来进行聚醚离子载体补料添加。培养期间的所述添加可以通过仅由聚醚离子载体化合物组成的补料或通过所含补充物在聚醚离子载体化合物之外还有其他组分的补料来完成。
本发明实施方式之一中，宿主细胞优选哺乳动物宿主细胞(本文也称为哺乳动物细胞)，包括但不限于HeLa、Cos、3T3、骨髓瘤细胞系(例如NS0、SP2/0)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。优选实施方式之一中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如CHO-S细胞和CHO-k1细胞。
就本发明整体而言，重组细胞(优选哺乳动物细胞)在培养系统例如生物反应器中培养。向生物反应器中接种包含于培养基中的活细胞，所述培养基含有或补充以聚醚离子载体化合物。培养基优选无血清和/或无蛋白质。接种到生产性生物反应器中后重组细胞即经历指数生长阶段。可以通过分批补料方式采用团注(或连续)补料来维持生长期，补料的补料培养基可选地补充以所述聚醚离子载体或由聚醚离子载体组成。补料培养基优选无血清和/或无蛋白质。这种补充性补料通常开始于细胞接种到生物反应器后不久，在预计或确定细胞培养物需要补料的时候进行。例如，补充性补料可以从培养启动后的第3天、第4天或第5天或约第3天、第4天或第5天、或者更早或更晚一天或两天开始。在生长和生产阶段，培养物可接受一次、两次、三次或更多的团注(或连续)补料。这些补料中的任何一次都可任选地补充以聚醚离子载体。用聚醚离子载体进行的补料或补充可以在培养开始时、以分批补料和/或以连续方式进行。或者，可以仅在培养开始后进行聚醚离子载体补充：在这种情况下，在培养开始时(例如在接种时)，不会在培养基中添加聚醚离子载体。当聚醚离子载体作为补料添加时，它可以与常用补充性补料分开(作为单独成分补料)或与常用补充性补料一起(作为另一类型补料的一部分)来补加。所述聚醚离子载体补料可以从培养开始后的第3天、第4天或第5天或者约第3天、第4天或第5天，或者更早或更晚一天或两天开始(例如第1、2、6或7天)。在生长和生产阶段，培养物可接受两次，三次或更多的补料。例如，但不应被视为限制性实例，1)可在第3天加入第一次聚醚离子载体补料，然后在第5天、第7天和第10天再加入聚醚离子载体补料，或2)可在第5天加入第一次聚醚离子载体补料，然后在第7天和第10天再加入聚醚离子载体补料。如果培养周期超过12-14天，例如21-24天，可以适应性调控补料的次数和时机(例如补料增至第15、16或17天)。补充/补料策略取决于目标甘露糖基化状况和培养周期，可根据本申请的记载视具体情况作适应性调整。
本发明的方法、组合物和用途可用于改善多步培养过程中重组蛋白的生产。在多阶段过程中，细胞培养包括两个或更多不同阶段。例如，细胞首先在增强细胞增殖和活力的条件下经历一个或多个生长阶段的培养，然后转入增强蛋白质生产条件下的生产阶段。在多步培养过程中，某些条件可随不同步骤(或阶段)而改变：培养基组成、pH变化、温度变化等。生长阶段的运行温度可高于生产阶段。例如，生长阶段的温度可是约35℃至约38℃的第一温度，然后温度变为生产阶段约29℃至约37℃的第二温度。收获前，细胞培养物可以在生产阶段维持数天或者甚至数周。
用于本发明的细胞系(也称“重组细胞”)经遗传工程改造而表达具有商业或科研价值的蛋白质。用于遗传工程改造细胞和/或细胞系以表达目标多肽的方法和载体是本领域技术人员众所周知的；例如，Ausubel等(1988及其更新版本)或Sambrook等(1989及其更新版本)记载了各种技术。本发明的方法可用于培养表达感兴趣重组蛋白的细胞。重组蛋白质通常被分泌到培养基中，可以从该培养基中回收重组蛋白质。然后可以用已知方法和可从供应商处购得的产品纯化或部分纯化回收的蛋白质。然后可以将纯化的蛋白质配制成药物组合物。用于药物组合物的合适制剂包括《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences,1995)中描述的那些。
另一方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明方法产生的甘露糖基化状况经调整的重组蛋白。
包含甘露糖基化状况经调整例如甘露糖基化水平或量增加的重组蛋白例如Fc-融合蛋白、抗体或其抗原结合片段的本发明组合物可用于治疗对象的任意适应症即组合物所含治疗性蛋白质(例如抗体或其抗原结合片段)适合的任意适应症。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明方法产生的甘露糖基化状况经调整的重组蛋白和药学上可接受的运载体。
某些实施方式中，包含甘露糖基化状况经调整的重组蛋白的本发明药物组合物可以与药学上可接受的运载体一起配制成药物(治疗性)组合物，并且可以通过本领域已知的多种方法给药(参见例如《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences，1995)。这样的药物组合物可以包含以下任一：盐、缓冲剂、表面活性剂、增溶剂、多元醇、氨基酸、防腐剂、相容性运载体、任选的其他治疗剂，以及它们的组合。包含甘露糖基化状况经调整的重组蛋白的本发明药物组合物可以是本领域已知并且可用于治疗用途的形式，例如液体制剂或冻干制剂。本领域技术人员知道，在具体描述的情形以外对本文所述发明进行改变和调整是容易的。应该明确，本发明包括所有这些符合本发明的精神或必要特征的变化和修改。本发明还包括说明书中以单独或组合方式提到或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任意两种或更多种的任意组合和全部组合。
通过参考以下实施例将更全面地理解前文所述。然而，这些实施例是实施本发明的方法的示例，无意于限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
I.细胞，细胞扩增和细胞生长
“mAb1”是针对细胞膜上受体的人源化单克隆抗体。其等电点(pI)约8.5-9.5。mAb1在CHO-S细胞中生产。
“mAb2”是IgG1融合蛋白(即Fc-融合蛋白)，包含针对膜蛋白的部分(IgG部分，包含Fc结构域)，该部分与靶向可溶性蛋白的第二部分连接。其等电点(pI)约6.6-8.0。它在CHO-S细胞中表达。
表达mAb1和mAb2的细胞按0.2×106个细胞/毫升(mL)接种。
所有试验均以分批补料培养方式进行。使用无血清化学组成明确的培养基。培养基原样使用或按所需浓度补充聚醚离子载体(马杜拉霉素、甲基盐霉素、盐霉素和拉沙里菌素均购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))。定期向培养基中补入化学组成明确的补料培养基并且补加葡萄糖以维持所述葡萄糖水平在>0至约8g/L的范围内(补料在第3天，第5天，第7天，第10天且第12天增加葡萄糖补料)。
实施例1中，培养在有效容积30mL的Spin
Figure BDA0002534971180000161
中进行。将培养物在36.5℃，5％CO2、80％湿度下孵育，320rpm振摇。盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素的测试浓度为100、250、500和1000nM。
实施例2和3中，培养在有效体积14mL的
Figure BDA0002534971180000162
中进行(36.5℃，溶氧40％，0.1ml/min N2，pH范围：6.75-7.15，800rpm)。对表达mAb1的细胞在第6天改变温度。其他条件见表2。
各分批补料培养持续14天。
II.分析方法
使用
Figure BDA0002534971180000163
(贝克曼库仑特公司(Beckmann Coulter))测量活细胞密度和活力。PA-HPLC测定抗体滴度。
用高效液相色谱-2-氨基-苯甲酰胺标记技术(2AB-UPLC；mAb1)或质谱(MS；mAB2)确定糖基化状况。聚糖组别如表1所示。
实施例1-聚醚离子载体的毒性
如材料和方法部分所述培养细胞和进行结果分析。需要指出的是，本发明的对照(或对照条件)对应于无聚醚离子载体条件下培养的细胞。
活细胞密度随经过时间的变化如图1所示(图1A：盐霉素；图1B：甲基盐霉素；图1C：马杜拉霉素)。在全部测试浓度(即低至100nM)，盐霉素和甲基盐霉素对细胞高毒，VCD下降因数达3。马杜拉霉素在250nM时的毒性与此相当。100nM马杜拉霉素对VCD的影响不甚严重。
由上述实验可确立各化合物用于后续实验的浓度。
实施例2-聚醚离子载体对于抗体mAb1的影响
如材料和方法部分所述培养细胞和进行结果分析。
活细胞密度，活力和滴度：
活细胞密度、活力随经过时间的变化以及分批补料培养终点的抗体滴度如图2至5所示(图2：盐霉素；图3：甲基盐霉素，图4：培养开始时添加马杜拉霉素，图5：第7天添加马杜拉霉素)。
实验中活力均未受影响：与对照相比保持稳定，不论浓度如何、不论所用是何种聚醚离子载体。
培养开始时添加：在各个测试浓度即5和10nM，相比对照，盐霉素和甲基盐霉素对细胞生长(分别为-13％和-15％)或蛋白质滴度(均为-15％)略有负面影响。马杜拉霉素在40nM可见相似结果(VCD下降约13％，滴度下降约15％)。相比之下，培养开始时添加10和20nM马杜拉霉素都表现出与对照相当的VCD(两浓度均不超过-10％)和滴度(分别为-6％和+1％)。
在第7天添加：培养开始后第7天添加10nM马杜拉霉素，相比对照，未见对VCD和滴度有负面影响。在40nM，马杜拉霉素对生长略有负面影响(-15％)，但是对滴度没有影响。引人注意的是，马杜拉霉素在20nM对活力有负面影响。这可能是因为该生物反应器中乳酸意外升高。但是，鉴于其他更高浓度的结果，马杜拉霉素在该浓度应该是无毒的。
糖基化状况：
糖基化状况如图6所示(图6A＝第12天；图6A＝第14天)。
对于培养开始时添加的聚醚离子载体而言，所得数据提示：
-相比对照，聚醚离子载体甲基盐霉素、盐霉素和马杜拉霉素强烈影响mAb1的甘露糖基化水平，尤其是Man5类糖。例如，在第12天，10mM盐霉素令Man5类糖水平由约1％(对照)升至高达约27％、10mM甲基盐霉素和40nM马杜拉霉素令其升至高达约32％。
-相比对照，聚醚离子载体甲基盐霉素、盐霉素和马杜拉霉素影响mAb1的Man6-Man9类糖水平。例如，在第12天：
ο40mM马杜拉霉素令Man6类糖(M6)水平由约0.35％(对照)升至高达约3.7％，10mM盐霉素令其升至高达约3.2％、10mM甲基盐霉素令其升至高达约6.5％。
ο40mM马杜拉霉素或10mM盐霉素令Man7类糖水平由约0.35％(对照)升至高达约1.5％，10mM甲基盐霉素令其升至高达约4.5％。
ο10mM盐霉素令Man8类糖水平由约0.12％(对照)升至高达约0.3％，40mM马杜拉霉素令其升至高达约1.5％，10mM甲基盐霉素令其升至高达约3.5％。
ο10mM盐霉素令Man9类糖水平由约0.2％(对照)升至高达约0.45％，或40mM马杜拉霉素或10mM甲基盐霉素令其升至高达约0.5％。
-采用不同的聚醚离子载体对总甘露糖基化水平的影响差异很大。举例来说，比较10nM时盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素的影响，甲基盐霉素的甘露糖基化增量最高。事实上，采用10nM甲基盐霉素，培养12天后总甘露糖基化达到约43％，培养14天后达到38.9％。相比之下，马杜拉霉素对甘露糖基化影响最小，培养12天后总甘露糖基化为6.1％，培养14天后为6.6％。以上聚醚离子载体之间的差异可用这些化合物毒性不同来解释。实际毒性测试显示马杜拉霉素在100nM相比其他被测对象是毒性较低的聚醚离子载体(见实施例1)。
-对mAb1甘露糖基化水平相比对照的影响可根据所用聚醚离子载体的性质/浓度和培养时长(例如12或14天)来调整。
对于培养期间以补料形式添加的聚醚离子载体而言，所得数据提示：
-添加化合物(例如马杜拉霉素)仍然影响甘露糖基化水平。
-主要影响仍然主要在于Man5类糖，但已发现对Man6和Man7有较强的影响，尤其在20mM马杜拉霉素浓度。
mAb1相关结论：
当前结果出人意料地提示：盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素能够调整抗体(在此为mAb1)的甘露糖基化，尤其是，能够深度增加Man5类糖的量，也增加M6至M9但程度较低，对于非岩藻糖化(afucoslyated)糖型没有深度影响(增加仅约1-2％；未公开数据)。虽然没有显示，Man糖型增加时岩藻糖化糖型水平降低(3至40％的下降)。相比之下，另一聚醚离子载体即拉沙里菌素对于甘露糖基化没有影响。本实施例显示：可基于本发明的教导通过利用所用聚醚离子载体(盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素)的性质/浓度、培养时长和所述分子的添加时机即培养开始时(例如在接种前或接种后立即加入细胞培养物)还是后期补料添加(例如实施例2中的第7天)对甘露糖基化进行精细调整。
实施例3-聚醚离子载体对于mAb2抗体的影响
如材料和方法部分所述培养细胞和进行结果分析。
活细胞密度，活力和滴度：
活细胞密度、活力随经过时间的变化以及分批补料培养终点的抗体滴度如图7至10所示(图7：盐霉素；图8：甲基盐霉素，图9：培养开始时添加马杜拉霉素，图10：第5天添加马杜拉霉素)。
培养开始时添加：在各个测试浓度即5和10nM，盐霉素显示培养终点时与对照相当的细胞生长(在10nM浓度不超过10％)和蛋白质滴度(至多+10％)。虽然在两个浓度对细胞生长都有负面影响，甲基盐霉素在5nM显示与对照相当的滴度(+10％)且在10nM略有提高(+15％)。马杜拉霉素对细胞生长和滴度的影响情况与甲基盐霉素近似(在任一测试浓度与对照相差至多+10和+12％)。
在第5天添加：在培养开始后第5天添加不论何种浓度的马杜拉霉素，在10nM对于滴度相比对照没有负面影响，但自第12天起负面影响细胞生长。
糖基化状况：
糖基化状况如图11所示(图11A＝第10天；图11B＝第12天)。所得数据提示：
对于培养开始时添加的聚醚离子载体而言，所得数据提示：
-相比对照，聚醚离子载体甲基盐霉素、盐霉素和马杜拉霉素强烈影响mAb2的甘露糖基化水平，尤其是Man5类糖。例如，在第10天，10mM盐霉素令Man5类糖水平由约0.7％(对照)升至高达约15％，40nM马杜拉霉素和10mM甲基盐霉素令其升至高达约16.5％。
-相比对照，聚醚离子载体甲基盐霉素、盐霉素和马杜拉霉素还影响mAb2的Man6-Man9类糖水平，虽然程度较低。例如，在第10天：
ο10mM盐霉素令Man6类糖(M6)水平由约0.1％(对照)升至高达约2.5％，40nM马杜拉霉素和10mM甲基盐霉素令其升至高达约3％。
ο10mM盐霉素令Man7类糖水平由约0.05％(对照)升至高达约0.65％，40mM马杜拉霉素令其升至高达约0.8％、10mM甲基盐霉素令其升至高达约1.0％。
-如同就mAb1所见，采用不同的聚醚离子载体对总甘露糖基化水平的影响差异很大。同样，比较10nM时盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素的影响，甲基盐霉素的甘露糖基化增量最高。事实上，采用10nM甲基盐霉素，培养10天后总甘露糖基化达到约12.0％，培养12天后达到18.0％。相比之下，马杜拉霉素对甘露糖基化影响最小，培养10天后总甘露糖基化为2.7％，培养12天后为约3.5％。
-对mAb2甘露糖基化水平相比对照的影响可根据所用聚醚离子载体的性质/浓度和培养时长(例如10或12天)来调整。
对于培养期间以补料形式添加的聚醚离子载体而言，所得数据提示：
-添加化合物(例如马杜拉霉素)仍然影响甘露糖基化水平。
主要影响仍然主要在于Man5类糖，但已发现对Man6和Man7有不可忽视的影响，尤其在最高测试浓度。
mAb2相关结论：
当前结果出人意料地提示：盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素能够调整Fc-融合蛋白(在此为mAb2)的甘露糖基化，尤其是，能够深度增加Man5类糖的量，也增加M6至M9但程度较低，对于非岩藻糖化(afucoslyated)糖型没有深度影响(未公开数据)。虽然没有显示，Man糖型增加时岩藻糖化糖型水平降低。本实施例显示：可基于本发明的教导通过利用所用聚醚离子载体(盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素)的性质/浓度、培养时长和所述分子的添加时机即培养开始时(例如在接种前或接种后立即加入细胞培养物)还是后期补料添加(例如实施例3中的第5天)对甘露糖基化进行精细调整。
总结
以上实施例显示聚醚离子载体盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素通过增加高甘露糖类同时降低岩藻糖类特异性调整甘露糖基化。本领域技术人员由以上实施例的结果可知盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素均能用来调整任意抗体和任意蛋白质的甘露糖基化尤其是提高总甘露糖基化水平，不论用于生产的细胞系是什么。在培养开始时添加和作为补料添加被证明都是调整甘露糖基化水平的优良策略。出乎意料的是发现另一聚醚离子载体拉沙里菌素对甘露糖基化没有影响。
盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素各自向细胞培养物中添加的确切浓度以及添加/补料的时机(在培养开始时或后期一次或多次补料)需视具体情况而定，取决于本领域技术人员就各具体分子而言想要的甘露糖基化状况。基于本发明的教导无需任何创造性技术就能够做出上述确定。并且，本领域技术人员知道，盐霉素、甲基盐霉素和马杜拉霉素均能用于蛋白质例如抗体生产的任何方法，既便并非以实现特定的糖基化状况为目的。
Figure BDA0002534971180000211
参考文献
1)Eon-Duval等，2012；“重组治疗性蛋白质的质量属性：通过设计开发方法评估对安全性和功效的影响作为质量的一部分”(Quality Attributes of RecombinantTherapeutic Proteins:An Assessment of Impact on Safety and Efficacy as Partof a Quality by Design Development Approach)；Biotechnol.Prog.28(3):608-622
2)N.Yamane-Ohnuki et M.Satoh，2009：“控制岩藻糖基化的治疗性抗体的生产”(Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation)；mAbs,1(3):230-236
3)Yu等，2012；“具有N-连接的甘露糖-5聚糖的抗体的表征和药代动力学特性”(Characterization and pharmacokinetic properties of antibodies with N-linkedMannose-5glycans)；mAbs,4(4):475-487
4)Ziv Roth等，2012；“蛋白质糖基化的鉴定和定量”(Identification andQuantification of Protein Glycosylation)；International Journal ofCarbohydrate Chemistry，论文ID 640923
5)Ting Song等，2014；“深度方法表征制造的重组单克隆抗体药物中的糖基化”(In-Depth Method for the Characterization of Glycosylation in ManufacturedRecombinant Monoclonal Antibody Drugs)，Anal.Chem.,86(12):5661–5666
6)Varki等，1999；《糖生物学要点》(Essentials of Glycobiology)，冷泉港实验室出版社
7)Voisard等，2003,Biotechnol.Bioeng.82:751-765
8)Ausubel等，1988即更新版，《当代分子生物学方法》(Current Protocols inMolecular Biology)，约翰韦利森公司，New York
9)Sambrook等，1989即更新版，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)；冷泉港实验室出版社
10)《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，1995，第18版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司

Claims (14)

1.一种产生甘露糖基化状况经调整的重组蛋白的方法，所述方法包括在包含聚醚离子载体的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞。
2.一种产生甘露糖基化状况经调整的重组蛋白的方法，所述方法包括在补充以至少一种包含聚醚离子载体的补料的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，甘露糖基化水平的所述调整是所述蛋白的甘露糖基化水平升高。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述聚醚离子载体选自马杜拉霉素、甲基盐霉素或盐霉素。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，还包括纯化所述甘露糖基化状况经调整的重组蛋白。
7.一种包含细胞培养基的组合物，所述细胞培养基包含聚醚离子载体或补充以聚醚离子载体。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述聚醚离子载体选自马杜拉霉素、甲基盐霉素或盐霉素。
9.一种药物组合物，包含权利要求1至6中任一项所述方法产生的甘露糖基化状况经调整的重组蛋白和药学上可接受的运载体。
10.一种组合物，包含权利要求1至6中任一项所述方法产生的甘露糖基化状况经调整的重组蛋白。
11.如权利要求中1至6中任一项所述的方法、如权利要求9所述的药物组合物或如权利要求10所述的组合物，其中，所述重组蛋白选自：抗体或其抗原结合片段，例如人抗体或其抗原结合部分、人源化抗体或其抗原结合部分、嵌合抗体或其抗原结合部分、融合蛋白、生长因子、激素、或细胞因子。
12.聚醚离子载体在细胞培养基中或在补料培养基中用于调整重组蛋白甘露糖基化状况的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中，所述聚醚离子载体选自马杜拉霉素、甲基盐霉素或盐霉素。
14.如权利要求1至6或11中任一项所述的方法、如权利要求7和8中任一项所述的组合物或如权利要求12和13中任一项所述的用途，其中，接种后细胞培养基中聚醚离子载体的浓度为0.5nM至250nM或约0.5nM至250nM。
CN201880080157.6A 2017-12-20 2018-12-19 用聚醚离子载体调整蛋白质甘露糖基化状况的方法 Active CN111527214B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17209007.8 2017-12-20
EP17209007 2017-12-20
PCT/EP2018/085909 WO2019121961A2 (en) 2017-12-20 2018-12-19 Methods for modulating protein mannosylation profiles using a polyether ionophore

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111527214A true CN111527214A (zh) 2020-08-11
CN111527214B CN111527214B (zh) 2024-08-06

Family

ID=60915269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880080157.6A Active CN111527214B (zh) 2017-12-20 2018-12-19 用聚醚离子载体调整蛋白质甘露糖基化状况的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11566062B2 (zh)
EP (1) EP3728621A2 (zh)
JP (1) JP7267284B2 (zh)
CN (1) CN111527214B (zh)
AU (1) AU2018392658B2 (zh)
CA (1) CA3085405A1 (zh)
IL (1) IL275464A (zh)
WO (1) WO2019121961A2 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11709156B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved analytical analysis
US11709155B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US11918936B2 (en) 2020-01-17 2024-03-05 Waters Technologies Corporation Performance and dynamic range for oligonucleotide bioanalysis through reduction of non specific binding
CN112999235B (zh) * 2021-02-24 2022-09-09 武汉大学 糖基聚醚化合物在制备抗副粘病毒或肠道病毒药物的用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5888788A (en) * 1994-05-18 1999-03-30 Union Nationale Des Groupements De Distillateurs D'alcool (Ungda) Use of ionophoretic polyether antibiotics for controlling bacterial growth in alcoholic fermentation
CN102803292A (zh) * 2009-04-20 2012-11-28 辉瑞公司 蛋白质糖基化的控制及其相关组合物和方法
WO2014084110A1 (ja) * 2012-11-30 2014-06-05 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖付加リンカー、糖鎖付加リンカーと生理活性物質とを含む化合物またはその塩、及びそれらの製造方法
US20140271632A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Abbvie, Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US20160281124A1 (en) * 2013-10-31 2016-09-29 Amgen Inc. Use of monensin to regulate glycosylation of recombinant proteins

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2697723B1 (fr) * 1992-11-06 1995-03-03 Ungda Utilisation des antibiotiques ionophores polyéthers dans les procédés industriels d'extraction ou de production de produits sucrés.
TWI832345B (zh) 2013-03-14 2024-02-11 美商安美基公司 用於增加重組蛋白質之甘露糖含量之方法
EP3094735A1 (en) 2014-01-13 2016-11-23 Amgen Inc. Regulating ornithine metabolism to manipulate the high mannose glycoform content of recombinant proteins

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5888788A (en) * 1994-05-18 1999-03-30 Union Nationale Des Groupements De Distillateurs D'alcool (Ungda) Use of ionophoretic polyether antibiotics for controlling bacterial growth in alcoholic fermentation
CN102803292A (zh) * 2009-04-20 2012-11-28 辉瑞公司 蛋白质糖基化的控制及其相关组合物和方法
WO2014084110A1 (ja) * 2012-11-30 2014-06-05 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖付加リンカー、糖鎖付加リンカーと生理活性物質とを含む化合物またはその塩、及びそれらの製造方法
US20140271632A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Abbvie, Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US20160281124A1 (en) * 2013-10-31 2016-09-29 Amgen Inc. Use of monensin to regulate glycosylation of recombinant proteins

Also Published As

Publication number Publication date
JP7267284B2 (ja) 2023-05-01
CA3085405A1 (en) 2019-06-27
US20200339665A1 (en) 2020-10-29
JP2021506323A (ja) 2021-02-22
EP3728621A2 (en) 2020-10-28
WO2019121961A2 (en) 2019-06-27
WO2019121961A3 (en) 2019-08-01
IL275464A (en) 2020-08-31
AU2018392658A1 (en) 2020-06-11
CN111527214B (zh) 2024-08-06
AU2018392658B2 (en) 2024-07-25
US11566062B2 (en) 2023-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111527214B (zh) 用聚醚离子载体调整蛋白质甘露糖基化状况的方法
AU2021258023B2 (en) Methods for modulating protein galactosylation profiles of recombinant proteins using peracetyl galactose
CN111954719A (zh) 细胞培养物中产生的抗体的总去岩藻糖基化糖型
AU2016354052B2 (en) Methods for modulating production profiles of recombinant proteins
US20220204920A1 (en) Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins
EP3325610B1 (en) Methods for modulating production profiles of recombinant proteins
WO2006109781A1 (ja) 糖タンパク質組成物の製造方法
EP3510141B1 (en) Methods for modulating production profiles of recombinant proteins
WO2016162514A1 (en) Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant proteins
WO2021066772A1 (en) Cell culture medium for reducing fucosylation and basic variants in the production of antibodies
TR2022003651T2 (tr) Anti̇kor üreti̇mi̇nde fukozi̇lasyon ve temel varyantlari azaltmaya yöneli̇k hücre kültürü ortami

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant