CN106190985A - 杂交瘤细胞无血清培养液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种杂交瘤细胞无血清培养液，其特征在于，包括：RPMI 1640培养基，以及额外添加于RPMI 1640培养基中的营养组分，营养组分的种类和单位体积的添加质量如下：类胰岛素-I类活性多肽4.75-5.25mg/L，人转铁蛋白活性多肽1.9-2.1mg/L。本发明不含有大分子蛋白，利于后续单克隆抗体的纯化。同时，与市场上的同类产品相比，单克隆抗体的表达量提升20％。可以减少单克隆抗体的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种杂交瘤细胞无血清培养液，属于细胞培养领域。
背景技术
单克隆抗体药物是有别于传统化学药物的生物类药物。它通过与相应抗原结合，清除抗原表达细胞，达到治疗目的。目前已经广发应用于肿瘤和自身免疫性疾病的治疗，是近来药物研发的热点。现今，已经上市的单克隆抗体药物已达数十种，许多是当年年销售额超过10亿美元的“重磅炸弹”药物。国内外著名药企正在开发并已经进入临床实验的单克隆抗体药物也有数十种，华尔街预测，未来单克隆抗体药物的市场份额将达到350亿美元。
单克隆抗体是由杂交瘤细胞分泌而成。杂交瘤细胞无血清培养液是促进杂交瘤细胞增殖，分泌单克隆抗体的关键因素。一个好的杂交瘤无血清培养液不但能够提高单克隆抗体的产量，还能够便于下游单克隆抗体的纯化。
目前市场已有几款杂交瘤无血清培养液，但是在单位单克隆抗体的产量和后续抗体纯化方面仍显不足，需要进一步改进和提升，来提高单位单克隆抗体的产量和减少下游单克隆抗体的纯化步骤，节省药物的制作成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于单克隆抗体生产的杂交瘤细胞无血清培养液，以解决上述问题。
本发明采用了如下技术方案：
一种杂交瘤细胞无血清培养液，其特征在于，包括：RPMI 1640培养基，以及额外添加于RPMI 1640培养基中的营养组分，营养组分的种类和单位体积的添加质量如下：类胰岛素-I类活性多肽4.75-5.25mg/L，人转铁蛋白活性多肽1.9-2.1mg/L。
本发明所提供的杂交瘤细胞无血清培养液，还可以具有这样的特征：其中，类胰岛素-I类分子活性多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明所提供的杂交瘤细胞无血清培养液，转铁蛋白活性多肽的序列的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明所提供的杂交瘤细胞无血清培养液，还可以具有这样的特征：其中，营养组分还包括额外添加的L-精氨酸157～173mg/L，L-天门冬酰胺53-59mg/L，L-天门冬氨酸17-19mg/L，L-谷氨酸19-21mg/L，L-谷氨酰胺190-210mg/L，甘氨酸14-16mg/L，L-组氨酸23.75-26.5mg/L，L-异亮氨酸53-59mg/L，L-赖氨酸盐酸33-37mg/L，L-蛋氨酸23.75-26.5mg/L，L-苯丙氨酸21.85-25mg/L，L-脯氨酸19-21mg/L，葡萄糖2500-3000mg/L，L-丝氨酸28.5-31.5mg/L，L-苏氨酸21-23mg/L，L-色氨酸11-12.6mg/L，L-缬氨酸23-26mg/L，L-亮氨酸52-58mg/L，β-巯基乙醇2.85-3.15mg/L，二水L-酪氨酸二钠304-336mg/L，乙醇胺2.85-3.15mg/L，L-胱氨酸二盐酸52.25-57.75mg/L，地塞米松0.002-0.004mg/L，CuSO4·5H2O0.0095-0.0105mg/L，MnCl2·4H2O0.0004-0.0006mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00007-0.00009mg/L，ZnSO4·7H2O0.19-0.21mg/L，CoCl2·6H2O0.004-0.006mg/L，SnC12·2H2O0.00005-0.00007mg/L，Na2SeO30.002mg/L～0.01mg/L，FeSO4·7H2O1.15-1.25mg/L，维生素C0.475-0.525mg/L，对羟基苯甲酸0.95-1.05mg/L，丙酮酸钠190-210mg/L，亚油酸0.025-0.035mg/L。
优选的，上述营养组分还包括额外添加的L-精氨酸165mg/L，L-天门冬酰胺56mg/L，L-天门冬氨酸18mg/L，L-谷氨酸20mg/L，L-谷氨酰胺200mg/L，甘氨酸15mg/L，L-组氨酸25mg/L，L-异亮氨酸56mg/L，L-赖氨酸盐酸35mg/L，L-蛋氨酸25mg/L，L-苯丙氨酸23mg/L，L-脯氨酸20mg/L，葡萄糖2500-3000mg/L，L-丝氨酸30mg/L，L-苏氨酸22mg/L，L-色氨酸12mg/L，L-缬氨酸25mg/L，L-亮氨酸55mg/L，β-巯基乙醇3.0mg/L，二水L-酪氨酸二钠320mg/L，乙醇胺3mg/L，L-胱氨酸二盐酸55mg/L，地塞米松0.003mg/L，CuSO4·5H2O0.001mg/L，MnCl2·4H2O0.0005mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00008mg/L，ZnSO4·7H2O0.2mg/L，CoCl2·6H2O0.005mg/L，SnC12·2H2O0.00006mg/L，Na2SeO30.002mg/L～0.01mg/L，FeSO4·7H2O1.2mg/L，维生素C0.5mg/L，对羟基苯甲酸1.0mg/L，丙酮酸钠200mg/L，亚油酸0.03mg/L。
另外，本发明还提供上述任意一项的杂交瘤细胞无血清培养液在单克隆抗体生产过程中的应用。
发明的有益效果
根据本发明的杂交瘤细胞无血清培养液，与现有杂交瘤细胞无血清培养液相比，具有以下优势：
1.不含有大分子蛋白，利于后续单克隆抗体的纯化
2.与市场上的同类产品相比，单克隆抗体的表达量提升20％。可以减少单克隆抗体的生产成本。
具体实施方式
以下说明本发明的具体实施方式。
以下各实施例中所使用的RPMI-1640细胞培养基成分如表1所示。
表1：RPMI-1640细胞培养基成分
<实施例一>
本实施方式中所使用的杂交瘤细胞无血清培养液，成分包括：
RPMI 1640培养基，以及额外添加于RPMI 1640培养基中的营养组分，营养组分的种类和单位体积的添加质量如下：类胰岛素-I类分子活性多肽4.75mg/L，人转铁蛋白活性多肽1.9mg/L，L-精氨酸157mg/L，L-天门冬酰胺53mg/L，L-天门冬氨酸17mg/L，L-谷氨酸19mg/L，L-谷氨酰胺190mg/L，甘氨酸14mg/L，L-组氨酸23.75mg/L，L-异亮氨酸53mg/L，L-赖氨酸盐酸33mg/L，L-蛋氨酸23.75mg/L，L-苯丙氨酸21.85mg/L，L-脯氨酸19mg/L，葡萄糖2500mg/L，L-丝氨酸28.5mg/L，L-苏氨酸21mg/L，L-色氨酸11mg/L，L-缬氨酸23mg/L，L-亮氨酸52mg/L，β-巯基乙醇2.85mg/L，二水L-酪氨酸二钠304mg/L，乙醇胺2.85mg/L，L-胱氨酸二盐酸52.25mg/L，地塞米松0.002mg/L，CuSO4·5H2O0.0095mg/L，MnCl2·4H2O0.0004mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00007mg/L，ZnSO4·7H2O0.19mg/L，CoCl2·6H2O0.004mg/L，SnC12·2H2O0.00005mg/L，Na2SeO30.002mg/L，FeSO4·7H2O1.15mg/L，维生素C0.475mg/L，对羟基苯甲酸0.95mg/L，丙酮酸钠190mg/L，亚油酸0.025mg/L。
<实施例二>
RPMI 1640培养基，以及额外添加于RPMI 1640培养基中的营养组分，营养组分的种类和单位体积的添加质量如下：类胰岛素-I类分子活性多肽5mg/L，人转铁蛋白活性多肽2mg/L，营养组分还包括额外添加的L-精氨酸165mg/L，L-天门冬酰胺56mg/L，L-天门冬氨酸18mg/L，L-谷氨酸20mg/L，L-谷氨酰胺200mg/L，甘氨酸15mg/L，L-组氨酸25mg/L，L-异亮氨酸56mg/L，L-赖氨酸盐酸35mg/L，L-蛋氨酸25mg/L，L-苯丙氨酸23mg/L，L-脯氨酸20mg/L，葡萄糖2500-3000mg/L，L-丝氨酸30mg/L，L-苏氨酸22mg/L，L-色氨酸12mg/L，L-缬氨酸25mg/L，L-亮氨酸55mg/L，β-巯基乙醇3.0mg/L，二水L-酪氨酸二钠320mg/L，乙醇胺3mg/L，L-胱氨酸二盐酸55mg/L，地塞米松0.003mg/L，CuSO4·5H2O0.001mg/L，MnCl2·4H2O0.0005mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00008mg/L，ZnSO4·7H2O0.2mg/L，CoCl2·6H2O0.005mg/L，SnC12·2H2O0.00006mg/L，Na2SeO30.002mg/L～0.01mg/L，FeSO4·7H2O1.2mg/L，维生素C0.5mg/L，对羟基苯甲酸1.0mg/L，丙酮酸钠200mg/L，亚油酸0.03mg/L。
<实施例三>
RPMI 1640培养基，以及额外添加于RPMI 1640培养基中的营养组分，营养组分的种类和单位体积的添加质量如下：类胰岛素-I类分子活性多肽5.25mg/L，人转铁蛋白活性多肽2.1mg/L。营养组分还包括额外添加的L-精氨酸173mg/L，L-天门冬酰胺59mg/L，L-天门冬氨酸19mg/L，L-谷氨酸21mg/L，L-谷氨酰胺210mg/L，甘氨酸16mg/L，L-组氨酸26.5mg/L，L-异亮氨酸59mg/L，L-赖氨酸盐酸37mg/L，L-蛋氨酸26.5mg/L，L-苯丙氨酸25mg/L，L-脯氨酸21mg/L，葡萄糖3000mg/L，L-丝氨酸31.5mg/L，L-苏氨酸23mg/L，L-色氨酸12.6mg/L，L-缬氨酸26mg/L，L-亮氨酸58mg/L，β-巯基乙醇3.15mg/L，二水L-酪氨酸二钠336mg/L，乙醇胺3.15mg/L，L-胱氨酸二盐酸57.75mg/L，地塞米松0.004mg/L，CuSO4·5H2O0.0105mg/L，MnCl2·4H2O0.0006mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00009mg/L，ZnSO4·7H2O0.21mg/L，CoCl2·6H2O0.006mg/L，SnC12·2H2O0.00007mg/L，Na2SeO30.01mg/L，FeSO4·7H2O1.25mg/L，维生素C0.525mg/L，对羟基苯甲酸1.05mg/L，丙酮酸钠210mg/L，亚油酸0.035mg/L。
<对比例一>
比较上述三个实施例所提供的杂交瘤无血清培养液与Gibco AGT杂交瘤无血清培养液对杂交瘤细胞增殖和单克隆抗体表达量的作用。
选取可以分别表达CD4，Her2/neu，gp100单克隆抗体的GK1.5，杂交瘤细胞作为对照检测细胞。首先接种1×106个分别至25ml实施例一至三中所提供的培养液中。同时接种GK1.5，HN-1以及GP1到25mlGibco AIM V培养液中。放置于CO2培养箱中。72小时后，收取培养上清，通过间接ELISA方法检测培养上清中抗CD4、Her2/neu和gp100抗体的效价来比较各培养液对单克隆抗体产量的影响。
结果如表2所示，
表2中BM-I-1代表实施例一所提供的培养基配方，BM-I-2代表实施例一所提供的培养基配方，BM-I-3代表实施例一所提供的培养基配方。
表2：小规模培养条件下各培养液培养效果的比较
<对比例二>
在5L发酵罐中，进行中试实验来比较在扩大培养过程中，本发明的培养液与现有培养液对细胞增殖和单克隆抗体的影响。
如前，分别接种50ml浓度为1×106GK1.5，HN-1以及GP1细胞到5L发酵罐中，发酵罐中的培养液分别为实施例一至三中所提供的杂交瘤无血清培养液与Gibco AIM V杂交瘤无血清培养液。在发酵罐设置37℃和5％CO2的条件下，搅拌培养72小时后，分别取1ml细胞悬液，计数细胞浓度。另分别取1ml细胞悬液，离心后，取上清。通过间接ELISA方法检测培养上清中抗CD4抗体的效价来比较两种培养液在扩大中试培养中对单克隆抗体产量的影响。
结果分析如表3所示：
表3：中试实验条件下各培养液培养效果的比较
| 细胞系 | Gibco AGT | BM-I-1 | BM-I-1 | BM-I-1 |
| 单抗浓度(ug/ml) | 单抗浓度(ug/ml) | 单抗浓度(ug/ml) | 单抗浓度(ug/ml) | |
| GK1.5 | 35.27 | 39.15 | 40.01 | 39.62 |
| HN-1 | 33.09 | 38.23 | 39.13 | 38.50 |
| GP1 | 33.46 | 38.14 | 38.21 | 38.09 |
从对比例一和对比例二的结果中可以看出，本发明的杂交瘤细胞无血清培养液与市场同类产品相比，单克隆抗体的表达量提升20％。因此可以有效减少单克隆抗体的生产成本。
Claims (6)
1.一种杂交瘤细胞无血清培养液，其特征在于，包括：
RPMI 1640培养基，以及额外添加于所述RPMI 1640培养基中的营养组分，所述营养组分的种类和单位体积的添加质量如下：类胰岛素-I类分子活性多肽4.75-5.25mg/L，人转铁蛋白活性多肽1.9-2.1mg/L。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞无血清培养液，其特征在于：
其中，所述类胰岛素-I类分子活性多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
3.如权利要求1所述的杂交瘤细胞无血清培养液，其特征在于：
所述转铁蛋白活性多肽的序列的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.如权利要求1所述的杂交瘤细胞无血清培养液，其特征在于：
其中，所述营养组分还包括额外添加的L-精氨酸157～173mg/L，L-天门冬酰胺53-59mg/L，L-天门冬氨酸17-19mg/L，L-谷氨酸19-21mg/L，L-谷氨酰胺190-210mg/L，甘氨酸14-16mg/L，L-组氨酸23.75-26.5mg/L，L-异亮氨酸53-59mg/L，L-赖氨酸盐酸33-37mg/L，L-蛋氨酸23.75-26.5mg/L，L-苯丙氨酸21.85-25mg/L，L-脯氨酸19-21mg/L，葡萄糖2500-3000mg/L，L-丝氨酸28.5-31.5mg/L，L-苏氨酸21-23mg/L，L-色氨酸11-12.6mg/L，L-缬氨酸23-26mg/L，L-亮氨酸52-58mg/L，β-巯基乙醇2.85-3.15mg/L，二水L-酪氨酸二钠304-336mg/L，乙醇胺2.85-3.15mg/L，L-胱氨酸二盐酸52.25-57.75mg/L，地塞米松0.002-0.004mg/L，CuSO4·5H2O0.0095-0.0105mg/L，MnCl2·4H2O 0.0004-0.0006mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00007-0.00009mg/L，ZnSO4·7H2O 0.19-0.21mg/L，CoCl2·6H2O0.004-0.006mg/L，SnC12·2H2O 0.00005-0.00007mg/L，Na2SeO30.002mg/L～0.01mg/L，FeSO4·7H2O 1.15-1.25mg/L，维生素C0.475-0.525mg/L，对羟基苯甲酸0.95-1.05mg/L，丙酮酸钠190-210mg/L，亚油酸0.025-0.035mg/L。
5.如权利要求4所述的杂交瘤细胞无血清培养液，其特征在于：
其中，所述营养组分还包括额外添加的L-精氨酸165mg/L，L-天门冬酰胺56mg/L，L-天门冬氨酸18mg/L，L-谷氨酸20mg/L，L-谷氨酰胺200mg/L，甘氨酸15mg/L，L-组氨酸25mg/L，L-异亮氨酸56mg/L，L-赖氨酸盐酸35mg/L，L-蛋氨酸25mg/L，L-苯丙氨酸23mg/L，L-脯氨酸20mg/L，葡萄糖2500-3000mg/L，L-丝氨酸30mg/L，L-苏氨酸22mg/L，L-色氨酸12mg/L，L-缬氨酸25mg/L，L-亮氨酸55mg/L，β-巯基乙醇3.0mg/L，二水L-酪氨酸二钠320mg/L，乙醇胺3mg/L，L-胱氨酸二盐酸55mg/L，地塞米松0.003mg/L，CuSO4·5H2O 0.001mg/L，MnCl2·4H2O 0.0005mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00008mg/L，ZnSO4·7H2O 0.2mg/L，CoCl2·6H2O 0.005mg/L，SnC12·2H2O 0.00006mg/L，Na2SeO30.002mg/L～0.01mg/L，FeSO4·7H2O 1.2mg/L，维生素C 0.5mg/L，对羟基苯甲酸1.0mg/L，丙酮酸钠200mg/L，亚油酸0.03mg/L。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的杂交瘤细胞无血清培养液在单克隆抗体生产过程中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20161207 |