CN113755449A - 一种提高杂交瘤细胞存活率的营养补充剂、培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种提高杂交瘤细胞存活率的营养补充剂、培养基及培养方法，所述营养补充剂的组分包括丙酮酸钠、白细胞介素6和人胰岛素；将其加入主体组分包括DMEM、胎牛血清、谷氨酰胺和HT培养基添加剂的培养基中对杂交瘤细胞进行培养，以提高杂交瘤细胞的存活率。在使用含该营养补充剂的培养基进行杂交瘤细胞培养时，先将人胰岛素加入培养基主体，再在杂交瘤细胞对数期加入丙酮酸钠和白细胞介素6的混合物，刺激增殖，从而代替昂贵的血清及或高血清浓度的方式提高杂交瘤细胞的存活率。本发明营养补充剂不对杂交瘤细胞单克隆抗体的生产产生干扰，并达到控制成本的目的，具有良好的经济效益及应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高杂交瘤细胞存活率的营养补充剂、培养基及培养方法。
背景技术
杂交瘤细胞培养技术实现了单克隆抗体的生产，并为抗体的免疫学诊断提供了各种各样的抗体试剂。但通过免疫淋巴细胞(免疫B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，在融合时细胞本就受到损伤，再加上后期的传代、冻存、复苏过程中不同程度的进一步损伤，会导致一些杂交瘤细胞在培养过程中出现细胞存活率、抗体产量明显降低，甚至出现细胞死亡的现象。
在杂交瘤细胞的培养过程中，培养基起到了关键的作用。如果培养基的营养不够，容易导致杂交瘤细胞状态不好，活力降低甚至死亡，最终影响抗体的产量。目前的杂交瘤培养基，用于培养状态较好的杂交瘤细胞尚可，但是对于状态不佳，活力较低的杂交瘤细胞，培养效果明显欠佳。存在这一问题的主要原因是现有的培养基营养不够，且不能提高杂交瘤细胞的状态及活力。通常的解决这一问题的方法是提培养基高血清的浓度或者更换更好的血清，以此提高培养基中的营养，改善细胞的状态及活力。但是这样一来，血清的消耗量会增加，成本会大大提高。而且有些进口的胎牛血清虽然好用，但是血源紧张，甚至出现有价无市的情况。最主要的是由于添加了高比例的血清，其带来的外源抗体对单克隆抗体的生产产生了干扰，不利于单克隆抗体的生产。
因此，亟需一种新的培养基和培养方式，在提高杂交瘤细胞的存活率同时不对其单克隆抗体的生产产生干扰，并达到控制成本的目的。
发明内容
针对上述存在的问题及为了达到上述的目的，本申请提供一种提高杂交瘤细胞存活率的营养补充剂、培养基及培养方法，通过对现有培养基进行改良，传代培养时加入一定浓度的营养补充剂，代替血清，达到提高培养基营养目的的同时能改善细胞的状态及活力，提高杂交瘤细胞的存活率。具体技术方案如下：
首先，本发明提供一种提高杂交瘤细胞存活率的营养补充剂，在杂交瘤细胞培养过程中，将该营养补充剂添加到培养杂交瘤细胞的培养基中，可以提高杂交瘤细胞的存活率，该营养补充剂的组分包括丙酮酸钠、白细胞介素6和人胰岛素。
作为优选的技术方案的，所述营养补充剂的加入量为：每升培养基添加丙酮酸钠0.1～200mg，白细胞介素6 0.1～200ng，人胰岛素0.1～10mg。
作为进一步优选的技术方案的，每升培养基中丙酮酸钠添加量为10～100mg，白细胞介素6添加量为10～100ng，人胰岛素添加量为0.5～5mg。
作为最优选的技术方案的，每升培养基中丙酮酸钠添加量为50mg，白细胞介素6添加量为50ng，人胰岛素添加量为2mg。
其次，本发明提供一种提高杂交瘤细胞存活率的培养基，该培养基包括培养基主体和前述的营养补充剂；所述培养基主体的组分包括DMEM、胎牛血清、谷氨酰胺和HT培养基添加剂。
作为优选的技术方案的，所述DMEM占培养基主体总质量的80～85％wt，所述胎牛血清占培养基主体总质量的10～15％wt。
另外，本发明还提供一种提高杂交瘤细胞存活率的培养方法，该培养方法使用前述的培养基进行培养，包括以下步骤：
(1)复苏培养：将冻存的杂交瘤细胞复溶后接种于培养基主体中进行复苏培养，获得复苏的杂交瘤细胞；
(2)活化培养：将复苏的杂交瘤细胞接种到含有人胰岛素的培养基主体中，进行活化培养，为细胞分裂生长做好前期准备；
(3)增殖培养：在杂交瘤细胞活化培养一定时间后，向培养基主体中加入白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物，继续培养，刺激杂交瘤细胞增殖；
(4)传代培养：将增殖培养杂交瘤细胞转接到含有营养补充剂的全培养基上进行传代培养。
作为优选的技术方案的，步骤(1)至步骤(4)的培养条件均为：温度37℃，CO2浓度为5％。
作为优选的技术方案的，步骤(3)中，在杂交瘤细胞活化培养12h时，向培养基主体中加入白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物。
作为另一优选的技术方案的，步骤(3)中，在杂交瘤细胞活化培养4h和12h时，分别向培养基主体中加入白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物，且两次加入的混合物体积比为1:9。
本发明的有益效果：
本发明营养补充剂采用丙酮酸钠、白细胞介素6和人胰岛素对杂交瘤细胞培养过程中进行营养补充，代替昂贵的血清及提高血清浓度，提高杂交瘤细胞的存活率，同时不对杂交瘤细胞单克隆抗体的生产产生干扰，并达到控制成本的目的。
本发明培养基加入丙酮酸钠作为能量物质，在细胞培养中起到替代碳源的作用，参与细胞营养代谢，在细胞培养的特定时期补入丙酮酸钠为细胞产生抗体和细胞增殖提供能源；加入的白细胞介素6为多功能细胞因子，起到促进杂交骨髓瘤细胞增殖的作用；加入的人胰岛素可调节糖代谢，促进组织对葡萄糖的摄取和利用，在培养基中添加人胰岛素有利于细胞利用葡萄糖及氨基酸，促进细胞生长。
本发明培养方法在杂交瘤细胞复苏后先加入人胰岛素以激活丙酮酸脱氢酶，加速丙酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化，促进细胞对糖分的吸收和利用，也可以促进细胞对氨基酸的摄取和蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，同时胰岛素还可促进钾离子和镁离子进入细胞，促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成，为细胞分裂生长做好前期准备。由于杂交瘤细胞前期的潜伏期约为4h，于培养12h时可达对数增生期，丙酮酸钠用作能源补充物质，白细胞介素6用作刺激杂交瘤细胞产生抗体并增殖，在杂交瘤细胞培养一段时间后再将白介素6和丙酮酸钠混合加入，可迅速有效的刺激对数期细胞进行生长繁殖，从而提高杂交瘤细胞的存活率。
实验证明，本发明营养补充剂、培养基及培养方法不仅适用于状态较好的杂交瘤细胞培养，对于活力较低，状态较差的杂交瘤细胞，也能保证其正常存活的杂交瘤细胞时，不用更换更加昂贵的血清或提高血清浓度，也可取得与更换血清或提高血清浓度这一方法一样的效果，甚至超越其效果，具有良好的经济效益及应用前景。
附图说明：
图1为传统培养基培养状态较差的杂交瘤细胞48h后显微镜下镜检结果；
图2为配方1培养状态较差的杂交瘤细胞48h后显微镜下镜检结果；
图3为配方2培养状态较差的杂交瘤细胞48h后显微镜下镜检结果；
图4为配方3培养状态较差的杂交瘤细胞48h后显微镜下镜检结果；
图5为配方4培养状态较差的杂交瘤细胞48h后显微镜下镜检结果；
图6为传统培养基培养状态较好的杂交瘤细胞48h后显微镜下镜检结果；
图7为配方1培养状态较好的杂交瘤细胞48h后显微镜下镜检结果；
图8为配方2培养状态较好的杂交瘤细胞48h后显微镜下镜检结果；
图9为配方3培养状态较好的杂交瘤细胞48h后显微镜下镜检结果；
图10为配方4培养状态较好的杂交瘤细胞48h后显微镜下镜检结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例为一种提高杂交瘤细胞存活率的培养方法，该培养方法使用的培养基包括培养基主体和营养补充剂。其中，
所述培养基主体的组分包括DMEM、胎牛血清、谷氨酰胺和HT培养基添加剂；作为优选的技术方案的，所述DMEM占培养基主体总质量的80～85％wt,所述胎牛血清占培养基主体总质量的10～15％wt。
所述营养补充剂的组分包括丙酮酸钠、白细胞介素6和人胰岛素；丙酮酸钠作为能量物质，在细胞培养中起到替代碳源的作用，参与细胞营养代谢，在细胞培养的特定时期补入丙酮酸钠为细胞产生抗体和细胞增殖提供能源；白细胞介素6是一个多功能细胞因子，对B淋巴细胞的生长和抗体产生具有促进和诱导作用，对骨髓细胞和浆细胞有增殖作用，杂交瘤细胞是骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞，具备骨髓细胞和B细胞的双重特性，在培养基中加入白介素6主要是起到促进杂交骨髓瘤细胞增殖的作用；本实施例中的人胰岛素是采用利用基因重组技术生产出来的，其可调节糖代谢，促进组织对葡萄糖的摄取和利用，在培养基中添加人胰岛素有利于细胞利用葡萄糖及氨基酸，促进细胞生长。
所述营养补充剂的加入量优选为每升培养基添加丙酮酸钠0.1～200mg，白细胞介素6 0.1～200ng，人胰岛素0.1～10mg；进一步优选为每升培养基中丙酮酸钠添加量为10～100mg，白细胞介素6添加量为10～100ng，人胰岛素添加量为0.5～5mg；最优选为每升培养基中丙酮酸钠添加量为50mg，白细胞介素6添加量为50ng，人胰岛素添加量为2mg。
本实施例所述的培养方法包括以下步骤：
(1)复苏培养：将冻存的杂交瘤细胞复溶后接种于培养基主体中，37℃，5％CO2培养条件下进行复苏培养，获得复苏的杂交瘤细胞。
(2)活化培养：将复苏的杂交瘤细胞接种到含有人胰岛素的培养基主体中，37℃，5％CO2培养条件下进行活化培养，为细胞分裂生长做好前期准备。
(3)增殖培养：在杂交瘤细胞活化培养一定时间后，向培养基主体中加入白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物，继续在37℃，5％CO2培养条件下进行培养，刺激杂交瘤细胞增殖。
(4)传代培养：将增殖培养杂交瘤细胞转接到含有营养补充剂的全培养基上进行传代培养。
向培养基主体中加入白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物时机可选择在杂交瘤细胞活化培养12h时加入，此时杂交瘤细胞增殖达对数增生期，此时向培养基主体中加入白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物可迅速有效的刺激对数期细胞进行生长繁殖，从而提高杂交瘤细胞的存活率。另外，还可以调整在杂交瘤细胞活化培养4h和12h时，分别向培养基主体中加入白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物，两次加入的混合物体积比可控制为1:9，因为杂交瘤细胞前期的潜伏期约为4h，在杂交瘤细胞活化培养4h时加入一定浓度的白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物，可刺激杂交瘤细胞分裂，确保在培养至12h时杂交瘤细胞增殖达对数增生期，再次加入大浓度的白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物，可有效的刺激杂交瘤细胞生长繁殖，近而提高杂交瘤细胞的存活率。
效果例1
本实施例为验证实施例1的培养方法对状态较差的杂交瘤细胞的培养效果，具体如下：
实验方法：配制加入不同营养补充剂浓度的培养基对生长状态较差的杂交瘤细胞进行培养，同时采用传统培养基培养进行对比。
首先进行培养基的配制。采用配方为(10-15％)FBS+(80-85％)DMEM+Glu+HT的传统培养基作为对照组，在传统培养基的基础上，分别添加不同浓度的丙酮酸钠、白介素6、人胰岛素作为实验组，具体添加情况如表1所示。
表1：培养基添加营养补充剂的浓度配比
其次进行杂交瘤细胞的制备。将杂交瘤细胞9A2B5株从冻存状态下，按常规步骤37℃快速复溶后先接种于含传统培养基的T25培养瓶中，待生长密度达到80-90％时，转接种于含传统培养基的T75培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱培养。长满后延迟换液1天，制得生长状态较差的杂交瘤细胞，用于后续实验。
然后进行分组培养。将状态较差的杂交瘤细胞按1×105个/孔接种到24孔板中，按表2分别加入不同配方的培养基，并以传统培养基为对照，每孔1ml(做3个重复孔)，分组情况如表2所示。培养48小时，显微镜下观察各组细胞的生长状态、密度，收集上清培养基检测抗体浓度。
表2：24孔板分组情况
| 传统培养基 | 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 | |
| 传统培养基 | 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 | |
| 传统培养基 | 配方1 | 配方2 | 配3 | 配方4 | |
结果如下：
分组培养48小时后，显微镜下观察形态和密度如图1至图5所示，在传统培养基中培养后，细胞碎片较多，形态各异，且细胞密度较低，甚至出现细胞继续死亡的现象；配方1-配方4中也有部分细胞碎片，但细胞存活率得到了很大的提高；特别是配方3和配方4，细胞经台盼蓝染色计数发现，细胞的形态更均一、密度更高(5.6-5.9×105个/ml)，活细胞计数结果见表3。
表3：活细胞计数结果
| 组别 | 传统培养基 | 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 |
| 复孔1 | 1.2×105个/ml | 2.2×105个/ml | 3.4×105个/ml | 5.6×105个/ml | 6.1×105个/ml |
| 复孔2 | 1.0×105个/ml | 2.5×105个/ml | 3.7×105个/ml | 5.9×105个/ml | 5.7×105个/ml |
| 复孔3 | 1.2×105个/ml | 2.0×105个/ml | 2.9×105个/ml | 5.3×105个/ml | 6.0×105个/ml |
| 活细胞平均数 | 1.1×105个/ml | 2.2×105个/ml | 3.3×105个/ml | 5.6×105个/ml | 5.9×105个/ml |
分组培养48小时后，通过间接ELISA法对其上清进行抗体活性检测，结果见表4。
表4：抗体活力检测表(间接ELISA法)
在传统培养基中培养后，由于细胞状态较差，存活率较低，最终导致同等体积的培养体系中，传统培养基培养的杂交瘤细胞抗体浓度极低；配方1-配方4加入添加剂后的培养基，由于细胞存活率得到了很大提高，所以抗体产量明显优于传统培养基，特别是配方3、配方4培养的杂交瘤细胞的抗体活力明显高于其他组。
经过上述结果分析，状态较差的杂交瘤细胞9A2B5，在加入了添加剂的培养基中培养后，不论细胞存活率还是抗体产量都明显高于传统培养基，特别是配方3和配方4。但配方4使用的添加剂量是配方3的2倍，但最终细胞密度和抗体产量差异不明显，所以本着节约成本的原则，本实验中我们得到了配方3(传统培养基+丙酮酸钠(50mg/L)+白细胞介素6(50ng/L)+人胰岛素(2mg/L))为最佳培养基。
效果例2
本实施例为验证实施例1的培养方法对状态较好的杂交瘤细胞的培养效果，具体如下：
实验方法：配制加入不同营养补充剂浓度的培养基对生长状态较好的杂交瘤细胞进行培养，同时采用传统培养基培养进行对比。
培养基的配制。同样采用配方为(10-15％)FBS+(80-85％)DMEM+Glu+HT的传统培养基作为对照组，在传统培养基的基础上，分别添加不同浓度的丙酮酸钠、白介素6、人胰岛素作为实验组，具体添加情况如表5所示。
表5：培养基添加营养补充剂的浓度配比
杂交瘤细胞的制备。将杂交瘤细胞9A2B5株从冻存状态下，按常规步骤37℃快速复溶后先接种于含传统培养基的T25培养瓶中，待生长密度达到80-90％时，转接种于含传统培养基的T75培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱培养，制得生长状态良好的杂交瘤细胞，长满后用于后续实验。
分组培养。将符合要求的杂交瘤细胞按1×105个/孔接种到24孔板中，按表6分别加入不同配方的培养基，并以传统培养基为对照，每孔1ml(做3个重复孔)，分组情况如表6所示。培养48小时，显微镜下观察各组细胞的生长状态、密度，收集上清培养基检测抗体浓度。
表6：24孔板分组情况
| 传统培养基 | 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 | |
| 传统培养基 | 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 | |
| 传统培养基 | 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 | |
结果如下：
分组培养48小时后，显微镜下观察形态和密度如图6至图10所示。传统培养基和加入添加剂的培养基，细胞生长状态良好，形态都无明显差异；但对于细胞密度，配方1-配方4中整体细胞密度较传统培养基中的高；特别是配方3和配方4，细胞经台盼蓝染色计数发现，细胞密度高达(7.9-8.0)×105个/ml，活细胞计数结果见表7。
表7：活细胞计数结果
| 组别 | 传统培养基 | 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 |
| 复孔1 | 3.5×105个/ml | 5.0×105个/ml | 5.6×105个/ml | 7.8×105个/ml | 8.0×105个/ml |
| 复孔2 | 3.9×105个/ml | 5.1×105个/ml | 5.5×105个/ml | 7.3×105个/ml | 8.3×105个/ml |
| 复孔3 | 3.3×105个/ml | 4.7×105个/ml | 5.4×105个/ml | 7.9×105个/ml | 7.8×105个/ml |
| 活细胞 | 3.6×105个/ml | 4.9×105个/ml | 5.5×105个/ml | 7.7×105个/ml | 8.0×105个/ml |
状态较好的杂交瘤细胞9A2B5株培养48小时后，再通过间接ELISA法对其上清进行抗体活性检测，结果见表8
表8：抗体活力检测表(间接ELISA法)
分析发现，由于细胞生长密度的不同，最终导致同等体积的培养体系中，加入添加剂后的培养基抗体产量高于传统培养基。特别是配方3、配方4培养的杂交瘤细胞的抗体浓度明显高于其它组。
经过上述结果分析，状态较好的杂交瘤细胞9A2B5，在加入了添加剂的培养基中培养后，细胞密度和抗体产量都明显高于传统培养基，特别是配方3和配方4。但配方4使用的添加剂量是配方3的2倍，但最终细胞密度和抗体产量差异不明显，所以本着节约成本的原则，本实验中我们也是得到了配方3(传统培养基+丙酮酸钠(50mg/L)+白细胞介素6(50ng/L)+人胰岛素(2mg/L))为最佳培养基。
综上所述，通过在传统培养基的基础上添加丙酮酸钠、白介素6、人胰岛素添加剂后，不仅能提高状态较差的杂交瘤细胞的存活率，还能让状态良好的细胞更高密度地生长；随之带来的是抗体产量的增加。特别是配方3(传统培养基+丙酮酸钠：50mg/L+白细胞介素6:50ng/L+人胰岛素：2mg/L)，在状态较差的杂交瘤培养过程中，细胞密度和抗体产量是传统培养基培养的4-5倍；在状态较好的杂交瘤培养过程中，细胞密度和抗体产量也是传统培养基培养的2倍左右。最终配方3的培养基在杂交瘤细胞培养过程在不仅能大大提高其存活率，而且能提高相应抗体的产量。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种提高杂交瘤细胞存活率的营养补充剂，其特征在于：该营养补充剂用于添加到培养杂交瘤细胞的培养基中以提高杂交瘤细胞的存活率，其组分包括丙酮酸钠、白细胞介素6和人胰岛素。
2.根据权利要求1所述的提高杂交瘤细胞存活率的营养补充剂，其特征在于：所述营养补充剂的加入量为：每升培养基添加丙酮酸钠0.1～200mg，白细胞介素6 0.1～200ng，人胰岛素0.1～10mg。
3.根据权利要求2所述的提高杂交瘤细胞存活率的营养补充剂，其特征在于：每升培养基中丙酮酸钠添加量为10～100mg，白细胞介素6添加量为10～100ng，人胰岛素添加量为0.5～5mg。
4.根据权利要求3所述的提高杂交瘤细胞存活率的营养补充剂，其特征在于：每升培养基中丙酮酸钠添加量为50mg，白细胞介素6添加量为50ng，人胰岛素添加量为2mg。
5.一种提高杂交瘤细胞存活率的培养基，其特征在于：该培养基包括培养基主体和权利要求1～4任意一项所述的营养补充剂；所述培养基主体的组分包括DMEM、胎牛血清、谷氨酰胺和HT培养基添加剂。
6.根据权利要求5所述的提高杂交瘤细胞存活率的培养基，其特征在于：所述DMEM占培养基主体总质量的80～85%wt，所述胎牛血清占培养基主体总质量的10～15%wt。
7.一种提高杂交瘤细胞存活率的培养方法，其特征在于：使用权利要求5或6所述的培养基进行培养，包括以下步骤：
（1）复苏培养：将冻存的杂交瘤细胞复溶后接种于培养基主体中进行复苏培养，获得复苏的杂交瘤细胞；
（2）活化培养：将复苏的杂交瘤细胞接种到含有人胰岛素的培养基主体中，进行活化培养，为细胞分裂生长做好前期准备；
（3）增殖培养：在杂交瘤细胞活化培养一定时间后，向培养基主体中加入白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物，继续培养，刺激杂交瘤细胞增殖；
（4）传代培养：将增殖培养杂交瘤细胞转接到含有营养补充剂的全培养基上进行传代培养。
8.根据权利要求7所述的提高杂交瘤细胞存活率的培养方法，其特征在于：步骤（1）至步骤（4）的培养条件均为：温度37℃，CO2浓度为5% 。
9.根据权利要求7所述的提高杂交瘤细胞存活率的培养方法，其特征在于：步骤（3）中，在杂交瘤细胞活化培养12h时，向培养基主体中加入白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物。
10.根据权利要求7所述的提高杂交瘤细胞存活率的培养方法，其特征在于：步骤（3）中，在杂交瘤细胞活化培养4h和12h时，分别向培养基主体中加入白细胞介素6和丙酮酸钠的混合物，且两次加入的混合物体积比为1:9。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992009686A1 (en) * | 1989-05-17 | 1992-06-11 | The Scottish Crop Research Institute | Supplement for hybridoma cell growth medium |
| FR2910024A1 (fr) * | 2006-12-19 | 2008-06-20 | Agronomique Inst Nat Rech | Milieu de culture synthetique chimiquement defini. |
| CN103898041A (zh) * | 2012-12-25 | 2014-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 杂交瘤细胞的培养方法 |
| CN105462934A (zh) * | 2016-01-05 | 2016-04-06 | 同昕生物技术（北京）有限公司 | 用于提高杂交瘤细胞克隆数量的添加剂及其制备方法 |
| CN106190985A (zh) * | 2015-04-29 | 2016-12-07 | 李昂 | 杂交瘤细胞无血清培养液 |
| CN111925987A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-11-13 | 深圳市一五零生命科技有限公司 | Nk细胞无血清培养液及nk细胞的培养方法 |
| CN112226416A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-01-15 | 通山县金瑞生物科技研发中心 | 一种杂交瘤细胞培养用培养基添加剂 |
-
2021
- 2021-09-30 CN CN202111160341.1A patent/CN113755449A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992009686A1 (en) * | 1989-05-17 | 1992-06-11 | The Scottish Crop Research Institute | Supplement for hybridoma cell growth medium |
| FR2910024A1 (fr) * | 2006-12-19 | 2008-06-20 | Agronomique Inst Nat Rech | Milieu de culture synthetique chimiquement defini. |
| CN103898041A (zh) * | 2012-12-25 | 2014-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 杂交瘤细胞的培养方法 |
| CN106190985A (zh) * | 2015-04-29 | 2016-12-07 | 李昂 | 杂交瘤细胞无血清培养液 |
| CN105462934A (zh) * | 2016-01-05 | 2016-04-06 | 同昕生物技术（北京）有限公司 | 用于提高杂交瘤细胞克隆数量的添加剂及其制备方法 |
| CN111925987A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-11-13 | 深圳市一五零生命科技有限公司 | Nk细胞无血清培养液及nk细胞的培养方法 |
| CN112226416A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-01-15 | 通山县金瑞生物科技研发中心 | 一种杂交瘤细胞培养用培养基添加剂 |
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