CN111925987A - Nk细胞无血清培养液及nk细胞的培养方法 - Google Patents

Nk细胞无血清培养液及nk细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种NK细胞无血清培养液及NK细胞的培养方法，该无血清培养液包括基础培养液、促生长组分、酶抑制剂、微量元素和微支撑体，在该培养液中不含牛血清白蛋白，在培养NK细胞之后，纯化过程简单，并且避免动物蛋白引起人体免疫反应；同时在无血清培养液中具有微支撑体，且具有促进贴壁生长的昆布氨酸和多聚赖氨酸，能够提高NK细胞的扩增速度；在培养基中加入微量元素锌能够提高抗体表达量，也可以抑制细胞的凋亡；铜也可以提高抗体表达量。本发明的培养液能够实现对NK细胞培养的高效培养，并且能够提高NK细胞对肿瘤的杀伤能力。

Description

NK细胞无血清培养液及NK细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种NK细胞的无血清培养液，及采用该无血清培养液对NK细胞的培养方法。
背景技术
NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，作为与T细胞、B细胞并列的一大类淋巴细胞群体，是天然免疫系统的重要成员，负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞。
肿瘤是困扰人类健康的重大疾病，但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性，一直找不到一种更加深入治疗方法，随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但现在仍然是难治性的疾病。NK细胞的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)及寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染免疫的重要组成部分。由于这些特点，NK细胞在细胞免疫治疗上有着广泛的应用前景。在体外被活化的NK细胞毒性较高，可用作免疫细胞的治疗制剂。人体体外及动物试验证实了其对各种癌症治疗的可能性：利用肿瘤细胞系的方法，确认其对血液系统肿瘤(白血病和淋巴瘤等)、肝癌、肺癌、肾癌、神经系统肿瘤和皮肤癌等均具有体外细胞毒性，特别是对白血病和神经源性肿瘤已明确了其临床及非临床的治疗效果。2009年，NK细胞治疗技术就已列入国家三类医疗技术目录。
充足的细胞数量和强烈的细胞毒性是细胞治疗疗效提升的关键因素。现有的细胞免疫治疗中的NK细胞主要是通过分离血液中的淋巴细胞，经体外培养、各种细胞因子刺激诱导扩增培养，得到一定量的细胞后回输人体，进行肿瘤治疗。现有NK细胞的培养基主要是由基础培养基、动物血清和各种因子培养组成，培养得到的NK细胞增殖倍数有限、数量不多，不能广泛的用于治疗，限制了NK细胞在免疫细胞治疗中的应用。
对于现有的NK细胞培养基中，由于添加了动物血清（通常为牛血清白蛋白），这种含有内源性免疫球蛋白的产品不但质量难以控制并标准化，而且还蕴藏着若干不安全因素，并且在使用培养液培养NK细胞之后，在应用于人体之前，纯化过程太复杂且效果不是太好；同时，前国内开发的大多数无血清培养基都能够支持细胞生长，但大多是在已有培养基如DMEM、DMEM/F12等基础上加入各种营养物质，成分复杂，产品的质量和安全性面临考验，同时也为下游纯化带来了困难。而国外Life、Thermo、Lonza等公司的无血清培养基虽然质量可靠稳定，不含蛋白，但其价格相对较为昂贵，成分秘而不宣，不仅增加了细胞大规模培养的成本，减小了产能提升和成本降低的空间，而且不利于根据产品需要对培养基进行优化调整，大大减少了后续的优化空间。
在NK细胞培养过程中面临的另一个问题就是NK细胞增殖速度过缓，虽然现有技术中提出了可以采用立体增殖的模式，但并没有关注在立体增殖过程中，由于NK细胞最初的增殖速度过快会对某种营养成分消耗过快，如果不及时补充消耗过快的营养物质，则后续生长速度会变缓慢；同时，在立体增殖时，也没有考虑到加入的添加剂是否具有很好的生物相容性，生物相容性较差时会对NK细胞的增殖过程造成污染。
而在培养NK细胞时，还需要兼顾NK细胞的细胞杀伤活性，而现有的无血清的培养液并没有兼顾细胞杀伤活性，导致培养的细胞杀伤活性较差。
发明内容
针对现有技术中的细胞培养液具有的成分上的缺陷，使培养的NK细胞具有安全隐患，且对后续的纯化过程要求极高；使用的培养液培养的NK细胞速度缓慢且杀伤活性较差的缺点，提出了本发明的技术方案。
有鉴于此，本发明所解决的技术问题是提供一种不含牛血清白蛋白的NK细胞培养液，在使用该培养液培养NK细胞之后，在应用于人体之前，纯化过程不会太复杂，避免了动物蛋白引起的人体免疫反应的风险；并且该培养液为能够使NK细胞快速增殖的无血清培养液，并且能够提高NK细胞的杀伤活性。并且也提供了一种使用NK无血清培养液高速培养NK细胞的方法。
为解决现有技术的缺陷并得到上述技术效果，提供如下的具体方案：
本发明的提供的一种用于培养NK细胞的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述无血清培养液包括基础培养液、促生长组分、酶抑制剂、微量元素和微支撑体，所述基础培养液包括：转铁蛋白、胰岛素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、精氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸；所述促生长组分包括有单克隆抗体、白细胞介素、昆布氨酸和多聚赖氨酸；所述酶抑制剂为吲哚美辛和胰酶抑制剂或塞来昔布和胰酶抑制剂；所述微量元素包括有含锌、铜、钠、钾、钙、镁、铁的无机盐物质；所述微支撑体包括聚乳酸和/或壳聚糖。
更进一步的，所述基础培养液还包括有葡萄糖、生物素、维生素B12、叶酸。
更进一步的，转铁蛋白的浓度为10-30mg/L、胰岛素的浓度为10-35mg/L、谷氨酰胺的浓度为14-25mmol/L，丙酮酸钠的浓度为3-10mmol/L、精氨酸的浓度为280-315mg/L、谷氨酸的浓度为20-23mg/L、羟脯氨酸的浓度为4-15mg/L、异亮氨酸的浓度为35-55mg/L、脯氨酸的浓度为25-40mg/L、丝氨酸的浓度为15-35mg/L、色氨酸的浓度为6-15mg/L。
更进一步的，所述葡萄糖的浓度为1500-4000mg/L、生物素的浓度为0.3-0.8mg/L、维生素B12的浓度为0.01-0.05mg/L、叶酸的浓度为4-6mg/L。
更进一步的，所述单克隆抗体浓度为20-80μg/L、白细胞介素浓度为30-180μg/L、昆布氨酸浓度为40-500μg/L，多聚赖氨酸的浓度为300-800μg/L。
更进一步的，所述吲哚美辛或塞来昔布的浓度为30-80μmol/L，所述胰酶抑制剂的浓度40-100μmol/L。
更进一步的，还包括pH调节剂，所述培养基的pH值为6.9-7.3，渗透压为160-280mOsm/kg。
更进一步的，所述微支撑体的含量为0.5-2.5g/L。
更进一步的，所述微量元素含锌的无机盐物质为氯化锌，其浓度为1-50mg/L；所述含铜的无机盐为硫酸铜，其浓度为3-35mg/L。
更进一步的，所述含钠的无机盐物质为氯化钠，其浓度为2000-6500mg/L；含钾的无机盐物质为氯化钾，其浓度为100-400mg/L；含钙的无机盐物质为氯化钙，其浓度为250-400mg/L；含镁的无机盐物质为氯化镁，其浓度为20-100mg/L；含铁的无机盐物质为硝酸铁，其浓度为30-80mg/L。
同时，本发明也提供一种使用NK细胞无血清培养液对NK细胞的培养方法，其特征在于，所述NK细胞无血清培养液如前所述的NK细胞无血清培养液，所述培养方法包括如下步骤：
步骤1：获取原始NK细胞；
步骤2：将所述NK细胞置于上述无血清培养液中；
步骤3：在所述无血清培养液中加入人CD3抗体活化剂，刺激NK细胞增殖；
步骤4：对刺激诱导后的NK细胞进行扩增培养，获得NK细胞。
更进一步的，在步骤4之后还包括NK细胞收集：培养的第10-21天，离心收集NK细胞。
更进一步的，培养NK细胞的培养温度为37℃，CO2的浓度为5％。
更进一步的，获取NK细胞的过程为：采集人体血液，采用淋巴分离液梯度离心分离得到外周血单个核细胞，然后收集所述外周血单个核细胞。
更进一步的，将所述外周血单个核细胞用自体灭活血浆的培养基重悬，转入培养瓶中培养，细胞将被分成贴附的附壁细胞和悬浊在培养液中的细胞悬液，其中NK细胞附壁，T细胞在细胞悬液中。
更进一步的，去除细胞悬液中的T细胞，剩下附壁细胞，即获得原始NK细胞。
更进一步的，在NK细胞培养过程中，1-2天后续额外增加谷氨酰胺和丙酮酸钠，添加的浓度为谷氨酰胺14-25mmol/L，丙酮酸钠的浓度为3-10mmol/L。
如上所述，在该培养液中不含牛血清白蛋白，在培养NK细胞之后，纯化过程不会太复杂，并且避免动物蛋白引起人体免疫反应；同时在无血清培养液中具有微支撑体，且具有促进贴壁生长的昆布氨酸和多聚赖氨酸，能够提高NK细胞的扩增速度；在培养基中加入微量元素锌能够提高抗体表达量，也可以抑制细胞的凋亡；铜也可以提高抗体表达量。本发明的培养液能够高效对NK细胞培养，并且能够提高NK细胞对肿瘤的杀伤能力。
为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍， 应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为在培养基中培养两天时间后，基础成分的消耗量；
图2为添加微支撑体材料和不添加微支撑材料在不同培养时间下NK细胞的倍数；
图3为添加昆布氨酸和多聚赖氨酸与不添加昆布氨酸和多聚赖氨酸的培养基的NK细胞的增殖倍数；
图4为不同添加物质的细胞杀伤活性对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。同时，在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
发明人经过大量的研究，并结合现有技术NK培养液的缺陷、NK细胞增殖速度过缓及NK细胞杀伤活性低的缺陷，提供了一种培养NK细胞的无血清培养液，以及使用该培养液对NK细胞的培养方法，下面将结合附图及具体实施例进行详细的描述。
本发明用于培养NK细胞的NK细胞无血清培养液，包括基础培养液、促生长组分、酶抑制剂、微量元素和微支撑体，所述基础培养液包括：转铁蛋白、胰岛素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、精氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸；所述促生长组分包括有单克隆抗体、白细胞介素、昆布氨酸和多聚赖氨酸；所述酶抑制剂为吲哚美辛和胰酶抑制剂或塞来昔布和胰酶抑制剂；所述微量元素包括有含锌、铜、钠、钾、钙、镁、铁的无机盐物质；所述微支撑体包括聚乳酸和/或壳聚糖。
首先，由于本发明中不含有牛血清白蛋白，在使用该培养液培养NK细胞之后，在应用于人体之前，纯化过程不会太复杂，避免了动物蛋白引起的人体免疫反应的风险。
选用本发明所述的NK细胞培养液，其中所述基础培养液还包括有葡萄糖、生物素、维生素B12、叶酸；更进一步的，在基础培养液中的转铁蛋白的浓度为10-30mg/L、胰岛素的浓度为10-35mg/L、谷氨酰胺的浓度为14-25mmol/L，丙酮酸钠的浓度为3-10mmol/L、精氨酸的浓度为280-315mg/L、谷氨酸的浓度为20-23mg/L、羟脯氨酸的浓度为4-15mg/L、异亮氨酸的浓度为35-55mg/L、脯氨酸的浓度为25-40mg/L、丝氨酸的浓度为15-35mg/L、色氨酸的浓度为6-15mg/L。所述葡萄糖的浓度为1500-4000mg/L、生物素的浓度为0.3-0.8mg/L、维生素B12的浓度为0.01-0.05mg/L、叶酸的浓度为4-6mg/L。
在所述培养液中的所述单克隆抗体浓度为20-80μg/L、白细胞介素浓度为30-180μg/L、昆布氨酸浓度为40-500μg/L，多聚赖氨酸的浓度为300-800μg/L。
而酶抑制剂中的所述吲哚美辛或塞来昔布的浓度为30-80μmol/L，所述胰酶抑制剂的浓度40-100μmol/L。
在培养液中还包括pH调节剂，所述培养基的pH值为6.9-7.3，渗透压为160-280mOsm/kg。
所述微支撑体的含量为0.5-2.5g/L，并且所述微量元素含锌的无机盐物质为氯化锌，其浓度为1-50mg/L；所述含铜的无机盐为硫酸铜，其浓度为3-35mg/L。
更进一步的，所述含钠的无机盐物质为氯化钠，其浓度为2000-6500mg/L；含钾的无机盐物质为氯化钾，其浓度为100-400mg/L；含钙的无机盐物质为氯化钙，其浓度为250-400mg/L；含镁的无机盐物质为氯化镁，其浓度为20-100mg/L；含铁的无机盐物质为硝酸铁，其浓度为30-80mg/L。
以上为本发明的NK细胞培养液的基本情况，下面将对培养液的具体效果进一步说明。
1、验证培养液中氨基酸的消耗量
为了验证本发明的培养液中的基础培养液的氨基酸在NK细胞培养期间消耗量，在以后的NK细胞培养过程中对消耗量大的氨基酸进行适量的补充，以提高NK细胞增殖的速度。
使用的培养液的具体配料表如表1所示。这里是使用的具体的一个培养液的配料表的主要物质（其他没有在配料表中展示的物质不代表没有使用，只是与本发明的发明点不是很相关的物质并没有进行详细的描述，其他的物质可以按照现有的来参考），由于该培养基中涉及多个不同的有机物质和无机盐类，并且每种物质是可以在一定范围内进行波动的，本发明的物质及含量会有很多种不同的组合，而本发明的数据中由于篇幅不可能对配料中所有物质的所有范围内的不同组合均进行展示，本发明中会对涉及本发明的具有突出效果的不同物质的具体含量以及对应的效果进行叙述，但不代表没有展示的配料的数值就是不能实现NK细胞培养或者对NK细胞增殖有恶劣影响的数值。
表1：NK细胞培养液的配料表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
使用上述培养液对NK细胞进行培养，培养两天之后，对培养液中的氨基酸成分进行分析，分析基础成分中除转铁蛋白、胰岛素之外的基础成分的消耗量，来确定哪种氨基酸成分消耗量大。经过测量、计算，由于每种加入量不同，剩余量也不同，所以将剩余的成分按照百分比来展示。每种成分的消耗量如1所示。
从图1中可以看出，在培养液中的不同氨基酸的含量都有一定的消耗，而谷氨酰胺的消耗量最大，其次是丙酮酸钠，谷氨酰胺的作用是提供细胞合成核酸及蛋白质必需的氨基酸，丙酮酸钠可以在细胞增殖过程中提供碳源，进一步分析上述消耗较大的氨基酸的代谢特点，发现精氨酸、色氨酸和异亮氨酸合成的原料来均与糖代谢过程中的丙酮酸有关。这可以看出NK细胞对谷氨酰胺和丙酮酸钠的消耗量较大，而在配置的营养液中直接加入过量的谷氨酰胺和丙酮酸钠，会对培养液中氨基酸的营养成分造成失衡，不利于NK细胞的培养，因此，在培养NK细胞过程中，两天之后就要补充一定量的谷氨酰胺和丙酮酸钠，这样有利于NK细胞的增殖。
2、添加微支撑材料对NK细胞增殖的影响
在本次对比实验中添加的微支撑材料为聚乳酸和/或壳聚糖，添加的浓度范围为0.5-2.5g/L，优选为1.5-2.2g/L。
如图2所示的为对比添加微支撑体材料和不添加微支撑体材料在相同时间内NK细胞的增殖倍数的关系，我们选用的培养液的配料相同，唯一的区别就是培养液中一个添加微支撑体材料，一个不添加微支撑体材料，纵坐标为不同时间对应的NK细胞增殖之后是原来的倍数，横坐标为培养的时间，单位为小时。我们可以看出，在前8小时内的培养期间，无论是添加微支撑材料还是不添加微支撑材料，两者与原始的NK细胞相比，增殖的效果并不是很明显，而在8小时之后，明显可以看出，具有微支撑材料的培养液中NK细胞增殖的速度（细胞是原始的倍数）已经超过了没有添加微支撑材料，并且在8小时之后的整个培养期间（8-48小时）增殖的速度均大于没有添加微支撑材料的培养液的NK细胞的增殖速度。
这是由于聚乳酸和/或壳聚糖作为微支撑体材料，利用聚乳酸和/或壳聚糖本身为多孔隙的材料，并且具有一定的机械支撑作用，同时并且具有很好的生物相容性，不会对NK细胞的增殖过程中产生不良影响，也不会对后续的分离等操作造成影响，因此微支撑材料的添加可以扩大了NK细胞的生长空间，使NK细胞在增殖过程中能够接触更多的营养物质，提高了细胞活性和扩增率。
3、促生长组分昆布氨酸和多聚赖氨酸对NK细胞增殖的影响
在该实施例中，我们要验证在添加微支撑结构时，是否只要有微支撑结构就可以促进NK细胞的增殖，还有没有别的添加剂继续能够提高NK细胞的增殖
Figure DEST_PATH_IMAGE004
在该实施例中，我们选用了两个不同的培养液作为对比，标号分别为1号培养液和2号培养液。1号培养液为不添加昆布氨酸和多聚赖氨酸且加入微支撑体材料的培养液，2号为添加昆布氨酸和多聚赖氨酸且加入微支撑体材料的培养液。在该对比实施例中，微支撑材料依然为聚乳酸和/或壳聚糖，添加的浓度范围为0.5-2.5g/L，优选为1.5-2.2g/L。昆布氨酸浓度为40-500μg/L，优选为100-350μg/L，在该对比例中加入量为280μg/L，多聚赖氨酸的浓度为300-800μg/L，优选浓度为400-600μg/L，在该对比例中加入量为600μg/L。
在该对比例中，横坐标为对应的培养的时间，单位为小时；纵坐标为某一个具体时间下NK细胞的数量是原始培养细胞的倍数，我们从图中可以看出，在具有微支撑体材料的培养基中，在前面8小时的培养过程中，两个对比例几乎没有差别的；在8小时之后到48小时的培养期间，我们对每个时间下NK细胞进行统计，可以看出，添加昆布氨酸和多聚赖氨酸的2号培养液的NK细胞增殖速度是高于1号培养液的，也就是在微支撑体能够促进NK细胞增殖的基础上，添加了昆布氨酸和多聚赖氨酸能够进一步提高NK细胞的增殖。
通过进一步研究发现，由于昆布氨酸和多聚赖氨酸能够促进NK细胞的贴壁生长，在培养液中具有微支撑体时，昆布氨酸和多聚赖氨酸可以使更多的NK细胞在微支撑体上附着并扩增，培养的NK细胞沿支撑体进行三维扩增，能够提高NK细胞的扩增速度。
并且进一步研究其附着在微支撑体上的机理以及细胞增殖过程的产生物可知，昆布氨酸和多聚赖氨酸在NK细胞增殖过程中能够促进NK细胞培养并聚集，有助于在微支撑结构上附着；而在NK细胞的增殖过程中，还会产生小分子物质（这种小分子物质为酶），这些小分子物质会对NK细胞的增殖起到阻碍作用，因此，本发明的培养液中还加入有酶抑制剂，酶抑制剂可以抑制细胞增殖过程中产生的小分子物质对NK细胞增殖及NK细胞的活性的抑制，同时，还添加的胰酶抑制剂还可以对胰酶的消化作用终止，能够保护在微支撑结构上扩增的NK细胞，进一步促进NK细胞的增殖。
4、微量元素的影响
在本发明的NK细胞培养液中不仅添加了钠、钾、钙、镁、铁的无机盐物质，如氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硝酸铁，他们的浓度范围为含氯化钠，其浓度为2000-6500mg/L；氯化钾，其浓度为100-400mg/L；氯化钙，其浓度为250-400mg/L；氯化镁，其浓度为20-100mg/L；硝酸铁，其浓度为30-80mg/L。并且除了上述的无机盐物质之外，在本发明的培养液中还添加了含微量元素锌的无机盐物质--氯化锌，其浓度为1-50mg/L，优选20-35mg/L，更优选为25-30mg/L；含铜微量元素的无机盐为硫酸铜，其浓度为3-35mg/L，优选的浓度为10-20mg/L。实验表明，含有微量元素锌在NK细胞培养过程中能够提高抗体表达量，也可以抑制细胞的凋亡；而微量元素铜，则可以提高抗体表达量。这些微量元素能够提高NK细胞的增殖，并提高细胞的杀伤活性。在NK细胞增殖过程中，由于细胞对氧的需求增加，容易出现缺氧情况，添加的铜和铁金属元素可以在缺氧条件下，提高细胞生长和活力以及重组蛋白的表达。
5、杀伤活性的对比
NK细胞的杀伤活性直接体现了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。本发明设置四种对比实施例，第一个是采用NK细胞培养液，但在培养液中不加入单克隆抗体、白细胞介素，并且在NK细胞培养过程中也不加入人CD3抗体活化剂，这个培养过程标记为3号标记；第二个对比实施例是在培养液中添加单克隆抗体和白细胞介素，但在NK细胞培养过程中不加入人CD3抗体活化剂，这个过程标记为4号标记；第三个是采用NK细胞培养液，但在培养液中不添加单克隆抗体、白细胞介素，其他营养成分相同，但在培养过程中添加人CD3抗体活化剂，这个过程标记为5号标记；第四个是采用的培养中加入有单克隆抗体、白细胞介素，并且在培养过程中也添加人CD3抗体活化剂，这个过程标记为6号。
以上述4中不同的对比实施例进行NK细胞培养，在培养10d之后，以多种癌细胞系作为靶细胞测定扩增产物的杀伤活性，调整效应细胞和靶细胞的浓度，每个实施例选择三个不同的效靶比，效靶比分别为10：1、20：1和40：1。经过对比，如图4所示，可看出，不同的组分下，都会出现随着效靶比的增高，扩增的NK细胞对癌细胞杀伤作用增大；而在3号对比例下，NK细胞对癌细胞杀伤作用最低，在6号对比例下，NK细胞对癌细胞杀伤作用最高，并且可以看出，6号对比例的NK细胞对癌细胞杀伤作用会优于5号对比例和4号对比例，这也说明我们的实施例中的单克隆抗体、白细胞介素的加入以及在培养过程中添加的人CD3抗体活化剂的加入分别能够提高NK细胞对癌细胞杀伤作用，并且同时添加能够使NK细胞对癌细胞杀伤作用更高，单克隆抗体、白细胞介素的加入以及在培养过程中添加的人CD3抗体活化剂能够起到协同作用，提高NK细胞对癌细胞杀伤作用。
这是由于使用单克隆抗体和白细胞介素，可以使抗体结合NK细胞的CD56bri细胞，从而使培养过程中活化的细胞具有更强的杀伤活性；而人CD3抗体活化剂在提前加入到培养基中效果会变差，所以在培养过程中添加该抗体活化剂，人CD3抗体活化剂可以诱导体内抗原递呈细胞分泌的能力，又可以促进细胞活化和增殖，通过改变NK细胞表面活化性受体和抑制性受体的平衡状态，而增强NK细胞的肿瘤杀伤能力。这三种物质在NK细胞增殖过程中均加入时，会提高NK细胞的增殖能力和活化能力，所以使NK细胞具有更好的对癌细胞的杀伤能力。
6、其他原料说明
此外，本发明中还具有pH调节剂，用于调整pH值在适合细胞增殖的一个合理范围内，经过pH调节剂的调节使培养液的pH值保持在6.9-7.3的范围内。本发明的pH值调节剂使用的是NaHCO3。在配料中的NaHCO3的作用是维系溶液的酸碱度，使用酚红指示剂；胰岛素作用是刺激糖代谢，有助于细胞生长和增殖，提高细胞的活力和蛋白质的产量；转铁蛋白的作用是转运铁等离子；必需氨基酸(如色氨酸等)是机体不能主动合成的氨基酸，其作用是提供细胞增殖所需的氨基酸；非必需氨基酸(如谷氨酸等)的作用是提供细胞增殖所需的氨基酸。
7、NK细胞的培养方法
在前面的NK细胞培养液的效果说明时，也涉及到了不同对比实施例的NK细胞的培养，下面就对具体的培养进行详细的描述。
在对NK细胞培养时，使用的是上面的NK细胞无血清培养液，其中NK细胞无血清培养液的配料如上述的配料表所述，但这里并不限定只能按照配料表的具体数值的量进行配置培养液，配置培养液时不同物质的加入可以有一定的波动范围，如前面限定的范围，在这里不进行一一的限定。
下面对NK细胞的培养方法进行详细的描述。使用上述的NK细胞无血清培养液进行NK细胞培养时，培养方法主要包括步骤：
步骤1：获取原始NK细胞；
步骤2：将所述NK细胞置于上述无血清培养液中；
步骤3：在所述无血清培养液中加入人CD3抗体活化剂，刺激NK细胞增殖；
步骤4：对刺激诱导后的NK细胞进行扩增培养，获得NK细胞。
在步骤4之后还包括NK细胞收集：培养的第10-21天，离心收集NK细胞。
具体的获取NK细胞的过程为：采集人体血液，采用淋巴分离液梯度离心分离得到外周血单个核细胞，然后收集所述外周血单个核细胞。具体的步骤如稀释人体细胞、离心处理、去除上层细胞等步骤不是本发明的发明点，在这里不进行详细的描述。
然后将所述外周血单个核细胞用自体灭活血浆的培养基重悬，转入培养瓶中培养，细胞将被分成贴附的附壁细胞和悬浊在培养液中的细胞悬液，其中NK细胞附壁，T细胞在细胞悬液中，去除细胞悬液中的T细胞，剩下附壁细胞，即获得原始NK细胞。
培养NK细胞的培养温度为37℃，CO2的浓度为5％，pH值范围为6.9-7.3，要严格控制外界的条件，外界条件对于NK细胞的增殖具有很大的影响。
在步骤3中加入的人CD3抗体活化剂的浓度为10-150mg/L，优选的50-100mg/L。前面也已经叙述了人CD3抗体活化剂可以促进细胞活化和增殖，通过改变NK细胞表面活化性受体和抑制性受体的平衡状态，而增强NK细胞的肿瘤杀伤能力，对NK细胞的对肿瘤细胞的杀伤能力具有提高。
并且由于在NK细胞培养过程中，谷氨酰胺和丙酮酸钠的消耗量较大，谷氨酰胺的作用是提供细胞合成核酸及蛋白质必需的氨基酸，丙酮酸钠可以在NK细胞增殖过程中提供碳源，因此，在1-2天后续额外增加谷氨酰胺和丙酮酸钠，添加的浓度为谷氨酰胺14-25mmol/L，丙酮酸钠的浓度为3-10mmol/L，以促进NK细胞的增殖。
从以上的描述中可以看出，本发明的NK细胞培养液能够使NK细胞快速的增殖、并且在增殖后的NK细胞具有很好的杀伤活性，同时由于培养液不含有牛血清白蛋白，在使用培养液培养NK细胞之后，在应用于人体之前，纯化过程不会太复杂，避免了动物蛋白引起的人体免疫反应的风险；从培养液中的成分可知，其中的更好生物相容性的微支撑体材料的设置、促生长组分昆布氨酸和多聚赖氨酸的添加以及酶抑制剂的添加，这三者是协同作用的，微支撑体提供更好的NK细胞的生长环境，使NK细胞在生长过程中接触更多的养分，促生长组分昆布氨酸和多聚赖氨酸的添加以及酶抑制剂的添加能够促进NK细胞的贴壁生长，使更多的NK细胞贴附在微支撑结构材料上生长，而酶抑制剂的添加抑制细胞增殖过程中产生的小分子物质对NK细胞增殖及NK细胞的活性的抑制，同时，还添加的胰酶抑制剂还可以对胰酶的消化作用终止，能够保护在微支撑结构上扩增的NK细胞，进一步促进NK细胞的增殖。这三种协同作用使NK细胞的增殖速度更快。在对NK细胞的杀伤活性方面，本发明培养液中添加的使用单克隆抗体和白细胞介素与培养过程中添加的人CD3抗体活化剂可以协同作用，提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，同时微量元素锌和铜的加入可以抑制细胞的凋亡并提高抗体的表达量。因此本发明的NK细胞培养液能够对NK细胞进行很好的培育，培养NK细胞的方法能够培养出对癌细胞具有很好的杀伤性能的NK细胞。
本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案作出各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

Claims (18)

1.一种NK细胞无血清培养液，所述NK细胞无血清培养液用于培养NK细胞，其特征在于，所述无血清培养液包括基础培养液、促生长组分、酶抑制剂、微量元素和微支撑体，所述基础培养液包括：转铁蛋白、胰岛素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、精氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸；所述促生长组分包括有单克隆抗体、白细胞介素、昆布氨酸和多聚赖氨酸；所述酶抑制剂包括吲哚美辛和胰酶抑制剂或塞来昔布和胰酶抑制剂；所述微量元素包括有含锌、铜、钠、钾、钙、镁、铁的无机盐物质；所述微支撑体包括聚乳酸和/或壳聚糖。
2.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述基础培养液还包括有葡萄糖、生物素、维生素B12、叶酸。
3.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述转铁蛋白的浓度为10-30mg/L、所述胰岛素的浓度为10-35mg/L、所述谷氨酰胺的浓度为14-25mmol/L，所述丙酮酸钠的浓度为3-10mmol/L、所述精氨酸的浓度为280-315mg/L、所述谷氨酸的浓度为20-23mg/L、所述羟脯氨酸的浓度为4-15mg/L、所述异亮氨酸的浓度为35-55mg/L、所述脯氨酸的浓度为25-40mg/L、所述丝氨酸的浓度为15-35mg/L、所述色氨酸的浓度为6-15mg/L。
4.如权利要求2所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为1500-4000mg/L、所述生物素的浓度为0.3-0.8mg/L、所述维生素B12的浓度为0.01-0.05mg/L、所述叶酸的浓度为4-6mg/L。
5.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述单克隆抗体浓度为20-80μg/L、白细胞介素浓度为30-180μg/L、昆布氨酸浓度为40-500μg/L，多聚赖氨酸的浓度为300-800μg/L。
6.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述吲哚美辛或塞来昔布的浓度为30-80μmol/L，所述胰酶抑制剂的浓度40-100μmol/L。
7.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，还包括pH调节剂，所述基础培养基的pH值为6.9-7.3，渗透压为160-280mOsm/kg。
8.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述微支撑体的含量为0.5-2.5g/L。
9.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述微量元素含锌的无机盐物质为氯化锌，其浓度为1-50mg/L；所述含铜的无机盐为硫酸铜，其浓度为3-35mg/L。
10.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述含钠的无机盐物质为氯化钠，其浓度为2000-6500mg/L；含钾的无机盐物质为氯化钾，其浓度为100-400mg/L；含钙的无机盐物质为氯化钙，其浓度为250-400mg/L；含镁的无机盐物质为氯化镁，其浓度为20-100mg/L；含铁的无机盐物质为硝酸铁，其浓度为30-80mg/L。
11.一种使用NK细胞无血清培养液对NK细胞的培养方法，其特征在于，所述NK细胞无血清培养液如权利要求1-10中任一项所述的NK细胞无血清培养液，
所述培养方法包括如下步骤：
步骤1：获取原始NK细胞；
步骤2：将所述NK细胞置于上述无血清培养液中；
步骤3：在所述无血清培养液中加入人CD3抗体活化剂，刺激NK细胞增殖；
步骤4：对刺激诱导后的NK细胞进行扩增培养，获得NK细胞。
12.如权利要求11所述的对NK细胞的培养方法，其特征在于，在步骤4之后还包括NK细胞收集：培养的第10-21天，离心收集NK细胞。
13.如权利要求11所述的对NK细胞的培养方法，其特征在于，培养NK细胞的培养温度为37℃，CO2的浓度为5％。
14.如权利要求11所述的对NK细胞的培养方法，其特征在于，获取NK细胞的过程为：采集人体血液，采用淋巴分离液梯度离心分离得到外周血单个核细胞，然后收集所述外周血单个核细胞。
15.如权利要求14所述的对NK细胞的培养方法，其特征在于，将所述外周血单个核细胞用自体灭活血浆的培养基重悬，转入培养瓶中培养，细胞将被分成贴附的附壁细胞和悬浊在培养液中的细胞悬液，其中NK细胞附壁，T细胞在细胞悬液中。
16.如权利要求15所述的对NK细胞的培养方法，其特征在于，去除细胞悬液中的T细胞，剩下附壁细胞，即获得原始NK细胞。
17.如权利要求11所述的对NK细胞的培养方法，其特征在于，在NK细胞培养过程中，1-2天后续额外增加谷氨酰胺和丙酮酸钠，添加的浓度为谷氨酰胺14-25mmol/L，丙酮酸钠的浓度为3-10mmol/L。
18.如权利要求11所述的对NK细胞的培养方法，其特征在于，在步骤3中加入人CD3抗体活化剂的浓度为10-150mg/L。
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