CN107043747A - 一种人脐带间充质干细胞无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，主要成分包括氨基酸，无机盐成分，生长因子及白蛋白成分。本发明的人脐带间充质干细胞无血清培养基，不含任何血清组分，且成分明确，克服了异种蛋白污染和致病微生物的危险,解决了MSCs临床应用的生物安全性问题。采用本发明的无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，可在体外获得高数量、高纯度并且安全优质的脐带间充质干细胞，同时可提高细胞存活率，维持干细胞的特性。本发明可解决细胞数量不够的问题，且每批次的细胞数量、存活率及免疫表型更加稳定，符合相关指标要求。

Description

一种人脐带间充质干细胞无血清培养基
技术领域
本发明涉及一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，属于细胞工程技术领域。
背景技术
间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源于中胚层，也称多能间充质基质细胞(multipotent mesenchymal stromal cells)，为多能干细胞的一种，它最早发现于骨髓中，具有向三种胚层细胞分化的多向分化潜能，具有低免疫原性、不刺激产生同种异体免疫反应、不被细胞毒性T细胞和NK细胞杀伤，以及免疫调节作用。MSCs在相应的诱导条件下能分化为骨、脂肪、软骨、肌肉和肝细胞等不同类型细胞。脐带间充质干细胞是一类存在于人脐带中，具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞群。它取材方便，来源广泛，其使用属“废物利用”，不受伦理、道德限制，可以为实验和临床提供充足的细胞来源，特别能为神经系统疾病的治疗带来新的希望。已经证明其能被诱导分化为成骨细胞、胰岛分泌细胞和类肝细胞等,并在免疫抑制治疗方面具有积极的临床应用前景，然而其临床应用必须以在体外获得高数量和高纯度的脐带间充质干细胞为基础。
细胞培养基是决定细胞体外生长代谢最重要、最直接的环境因素。目前大多数合成细胞培养基均需要补充动物血清才能支持细胞的体外生长、增殖，而动物血清的使用带来了动物性病原微生物污染培养物的可能，因此推动了动物细胞无血清培养基的发展。同时，我国对血制品管理严格，成人AB血清不易获得且价格昂贵。动物血清如胎牛血清，对人类而言，存在异种蛋白抗原和携带在人类致病的未知病毒等危险，从而限制了脐带MSCs在临床的应用。
现有技术中，尚未见到有关于人脐带间充质干细胞无血清培养基的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其不含动物源成分，可以完全实现无血清培养干细胞。采用本发明的无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，可在体外获得高数量、高纯度并且安全优质的脐带间充质干细胞，同时可提高细胞存活率，维持干细胞的特性。本发明可解决细胞数量不够的问题，且每批次的细胞数量、存活率及免疫表型更加稳定。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 100～300；
CuSO4·5H2O 0.0005～0.005；
L-天门冬酰胺 25～75；
L-天门冬氨酸 10～30；
L-谷氨酸 10～30；
Ni(NO3)2·6H2O 0.00002～0.0002；
L-谷氨酰胺 0～500；
ZnSO4·7H2O 0.06～0.6；
甘氨酸 5～15；
CoCl2·6H2O 0.001～0.008；
L-组氨酸 10～30；
NaSiO3·9H2O 0.001～0.01；
L-异亮氨酸 25～75；
Na3VO4·12H2O 0.0005～0.005；
L-赖氨酸盐酸 20～60；
SnCl2·2H2O 0.00001～0.0001；
L-蛋氨酸 10～30；
Na2SeO3 0.002～0.01；
L-苯丙氨酸 10～30；
FeSO4·7H2O 0.2～1.6；
L-脯氨酸 10～30；
葡萄糖 1000～4000；
L-丝氨酸 15～45；
维生素C 0.176～0.704；
L-苏氨酸 10～30；
对羟基苯甲酸 0.5～1.5；
L-色氨酸 5～15；
丙酮酸钠 55～550；
L-缬氨酸 10～30；
亚油酸 0.01～0.05；
L-亮氨酸 25～75；
β-巯基乙醇 0.8～4.0；
二水L-酪氨酸二钠 144～432；
乙醇胺 1～5；
L-胱氨酸二盐酸 25～75；
地塞米松 0.001～0.005；
人转铁蛋白 5～50；
人血清白蛋白 1000～5000；
纤粘连蛋白 0.5～5；
重组人成纤维细胞生长因子 0.1～10；
重组人转化因子β 0.1～10；
重组人表皮生长因子 0.1～10；
胰岛素：8～20；
纯化人转铁蛋白液：1～30；
胆固醇：20～60；
过氧化氢酶：20～50；
亚硒酸钠：17.3～35.0；
1％(质量百分数)二巯基乙醇溶液：0.35～1.0ml/L；
余量为水。
所述重组人成纤维细胞生长因子、重组人转化因子、重组人表皮生长因子均可市场购买得到，本发明所用为进口产品，均购自peprotech，商品名称为：EGF(重组人表皮生长因子)，商品号为AF-100-15-50；商品名称为TGF-b(重组人转化因子)，货号：100-21-100；商品名为(FGF)成纤维细胞生长因子，商品货号：100-18B-50。
本发明的无血清培养基的制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
本发明的人脐带间充质干细胞无血清培养基，不含任何血清组分，且成分明确，克服了异种蛋白污染和致病微生物的危险,解决了MSCs临床应用的生物安全性问题。
采用本发明的无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，可在体外获得高数量、高纯度并且安全优质的脐带间充质干细胞，同时可提高细胞存活率，维持干细胞的特性。本发明可解决细胞数量不够的问题，且每批次的细胞数量、存活率及免疫表型更加稳定，符合相关指标要求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1制备人脐带间充质干细胞无血清培养基
各原料的浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 200；
CuSO4·5H2O 0.002；
L-天门冬酰胺 50；
L-天门冬氨酸 20；
L-谷氨酸 20；
Ni(NO3)2·6H2O 0.0001；
L-谷氨酰胺 300；
ZnSO4·7H2O 0.3；
甘氨酸 10；
CoCl2·6H2O 0.005；
L-组氨酸 20；
NaSiO3·9H2O 0.005；
L-异亮氨酸 50；
Na3VO4·12H2O 0.002；
L-赖氨酸盐酸 40；
SnCl2·2H2O 0.00005；
L-蛋氨酸 20；
Na2SeO3 0.005；
L-苯丙氨酸 20；
FeSO4·7H2O 1.0；
L-脯氨酸 20；
葡萄糖 3000；
L-丝氨酸 30；
维生素C 0.500；
L-苏氨酸 20；
对羟基苯甲酸 1.0；
L-色氨酸 10；
丙酮酸钠 300；
L-缬氨酸 20；
亚油酸 0.03；
L-亮氨酸 50；
β-巯基乙醇 2.0；
二水L-酪氨酸二钠 300；
乙醇胺 3；
L-胱氨酸二盐酸 50；
地塞米松 0.003；
人转铁蛋白 30；
人血清白蛋白 2500；
纤粘连蛋白 3；
重组人成纤维细胞生长因子 5；
重组人转化因子β 5；
重组人表皮生长因子 5；
胰岛素：10；
纯化人转铁蛋白：20；
胆固醇：40；
过氧化氢酶：30；
亚硒酸钠：25.0；
1％二巯基乙醇溶液：0.8ml/L；
余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
实施例2制备人脐带间充质干细胞无血清培养基
各原料的浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 100；
CuSO4·5H2O 0.0005；
L-天门冬酰胺 75；
L-天门冬氨酸 30；
L-谷氨酸 10；
Ni(NO3)2·6H2O 0.00002；
L-谷氨酰胺 500；
ZnSO4·7H2O 0.6；
甘氨酸 5；
CoCl2·6H2O 0.001；
L-组氨酸 30；
NaSiO3·9H2O 0.01；
L-异亮氨酸 25；
Na3VO4·12H2O 0.0005；
L-赖氨酸盐酸 60；
SnCl2·2H2O 0.0001；
L-蛋氨酸 10；
Na2SeO3 0.002；
L-苯丙氨酸 30；
FeSO4·7H2O 1.6；
L-脯氨酸 10；
葡萄糖 1000；
L-丝氨酸 45；
维生素C 0.704；
L-苏氨酸 10；
对羟基苯甲酸 0.5；
L-色氨酸 15；
丙酮酸钠 550；
L-缬氨酸 10；
亚油酸 0.01；
L-亮氨酸 75；
β-巯基乙醇 4.0；
二水L-酪氨酸二钠 144；
乙醇胺 1；
L-胱氨酸二盐酸 75；
地塞米松 0.005；
人转铁蛋白 5；
人血清白蛋白 1000；
纤粘连蛋白 5；
重组人成纤维细胞生长因子 10；
重组人转化因子β 0.1；
重组人表皮生长因子 0.1；
胰岛素：20；
纯化人转铁蛋白：30；
胆固醇：20；
过氧化氢酶：20；
亚硒酸钠：35.0；
1％二巯基乙醇溶液：1.0ml/L；
余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
实施例3制备人脐带间充质干细胞无血清培养基
各原料浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 300；
CuSO4·5H2O 0.005；
L-天门冬酰胺 25；
L-天门冬氨酸 10；
L-谷氨酸 30；
Ni(NO3)2·6H2O 0.0002；
L-谷氨酰胺 0；
ZnSO4·7H2O 0.06；
甘氨酸 15；
CoCl2·6H2O 0.008；
L-组氨酸 10；
NaSiO3·9H2O 0.001；
L-异亮氨酸 75；
Na3VO4·12H2O 0.005；
L-赖氨酸盐酸 20；
SnCl2·2H2O 0.00001；
L-蛋氨酸 30；
Na2SeO3 0.01；
L-苯丙氨酸 10；
FeSO4·7H2O 0.2；
L-脯氨酸 30；
葡萄糖 4000；
L-丝氨酸 15；
维生素C 0.176；
L-苏氨酸 30；
对羟基苯甲酸 1.5；
L-色氨酸 5；
丙酮酸钠 55；
L-缬氨酸 30；
亚油酸 0.05；
L-亮氨酸 25；
β-巯基乙醇 0.8；
二水L-酪氨酸二钠 432；
乙醇胺 5；
L-胱氨酸二盐酸 25；
地塞米松 0.001；
人转铁蛋白 50；
人血清白蛋白 5000；
纤粘连蛋白 0.5；
重组人成纤维细胞生长因子 0.1；
重组人转化因子β 10；
重组人表皮生长因子 10；
胰岛素：8；
纯化人转铁蛋白：1；
胆固醇：60；
过氧化氢酶：50；
亚硒酸钠：17.3；
1％二巯基乙醇溶液：0.35ml/L；
余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
实验
将实施例2制备的培养基置于T25细胞培养瓶中，将脐带间充质干细胞以1.0×104cells/cm2接种，在温度37℃下培养，统计原代细胞的爬出时间，每代的生长时间。
同时，以lonza无血清培养基(市场购买得到)为对照培养脐带间充质干细胞。
结论：
原代细胞爬出时间：通常的细胞培养基进行脐带植块法爬细胞，8～10天可见细胞爬出，而本发明的无血清培养基，爬出细胞时间缩短至7天,提高了细胞分离效率。
细胞每代生长时间，经过连续10代监测，平均每代生长时间在2～3天，比lonza无血清培养基提高了一天，节约了培养时间，提高了工作效率。
连续传代次数：传统的MSC无血清培养基传代至6代以后，细胞生长变缓慢，本发明的培养基可连续传代至10代，细胞仍保持其分化潜能，而lonza培养基传代至第8代，细胞生长明显变缓，导致后期无法传代。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (5)

1.一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 100～300；
CuSO4·5H2O 0.0005～0.005；
L-天门冬酰胺 25～75；
L-天门冬氨酸 10～30；
L-谷氨酸 10～30；
Ni(NO3)2·6H2O 0.00002～0.0002；
L-谷氨酰胺 0～500；
ZnSO4·7H2O 0.06～0.6；
甘氨酸 5～15；
CoCl2·6H2O 0.001～0.008；
L-组氨酸 10～30；
NaSiO3·9H2O 0.001～0.01；
L-异亮氨酸 25～75；
Na3VO4·12H2O 0.0005～0.005；
L-赖氨酸盐酸 20～60；
SnCl2·2H2O 0.00001～0.0001；
L-蛋氨酸 10～30；
Na2SeO3 0.002～0.01；
L-苯丙氨酸 10～30；
FeSO4·7H2O 0.2～1.6；
L-脯氨酸 10～30；
葡萄糖 1000～4000；
L-丝氨酸 15～45；
维生素C O.176～0.704；
L-苏氨酸 10～30；
对羟基苯甲酸 0.5～1.5；
L-色氨酸 5～15；
丙酮酸钠 55～550；
L-缬氨酸 1O～30；
亚油酸 0.01～0.05；
L-亮氨酸 25～75；
β-巯基乙醇 0.8～4.0；
二水L-酪氨酸二钠 144～432；
乙醇胺 1～5；
L-胱氨酸二盐酸 25～75；
地塞米松 0.001～0.005；
人转铁蛋白 5～50；
人血清白蛋白 1000～5000；
纤粘连蛋白 0.5～5；
重组人成纤维细胞生长因子 0.1～10；
重组人转化因子β 0.1～10；
重组人表皮生长因子 0.1～10；
胰岛素：8～20；
纯化人转铁蛋白液：1～30；
胆固醇：20～60；
过氧化氢酶：20～50；
亚硒酸钠：17.3～35.0；
1％二巯基乙醇溶液：0.35～1.0ml/L；
余量为水。
2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：
L-精氨酸 200；
CuSO4·5H2O 0.002；
L-天门冬酰胺 50；
L-天门冬氨酸 20；
L-谷氨酸 20；
Ni(NO3)2·6H2O 0.0001；
L-谷氨酰胺 300；
ZnSO4·7H2O 0.3；
甘氨酸 10；
CoCl2·6H2O 0.005；
L-组氨酸 20；
NaSiO3·9H2O 0.005；
L-异亮氨酸 50；
Na3VO4·12H2O 0.002；
L-赖氨酸盐酸 40；
SnCl2·2H2O 0.00005；
L-蛋氨酸 20；
Na2SeO3 0.005；
L-苯丙氨酸 20；
FeSO4·7H2O 1.0；
L-脯氨酸 20；
葡萄糖 3000；
L-丝氨酸 30；
维生素C O.500；
L-苏氨酸 20；
对羟基苯甲酸 1.0；
L-色氨酸 10；
丙酮酸钠 300；
L-缬氨酸 20；
亚油酸 0.03；
L-亮氨酸 50；
β-巯基乙醇 2.0；
二水L-酪氨酸二钠 300；
乙醇胺 3；
L-胱氨酸二盐酸 50；
地塞米松 0.003；
人转铁蛋白 30；
人血清白蛋白 2500；
纤粘连蛋白 3；
重组人成纤维细胞生长因子 5；
重组人转化因子β 5；
重组人表皮生长因子 5；
胰岛素：10；
纯化人转铁蛋白：20；
胆固醇：40；
过氧化氢酶：30；
亚硒酸钠：25.0；
1％二巯基乙醇溶液：0.8；
余量为水。
3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：
L-精氨酸 100；
CuSO4·5H2O 0.0005；
L-天门冬酰胺 75；
L-天门冬氨酸 30；
L-谷氨酸 10；
Ni(NO3)2·6H2O 0.00002；
L-谷氨酰胺 500；
ZnSO4·7H2O 0.6；
甘氨酸 5；
CoCl2·6H2O 0.001；
L-组氨酸 30；
NaSiO3·9H2O 0.01；
L-异亮氨酸 25；
Na3VO4·12H2O 0.0005；
L-赖氨酸盐酸 60；
SnCl2·2H2O 0.0001；
L-蛋氨酸 10；
Na2SeO3 0.002；
L-苯丙氨酸 30；
FeSO4·7H2O 1.6；
L-脯氨酸 10；
葡萄糖 1000；
L-丝氨酸 45；
维生素C 0.704；
L-苏氨酸 10；
对羟基苯甲酸 0.5；
L-色氨酸 15；
丙酮酸钠 550；
L-缬氨酸 1O；
亚油酸 0.01；
L-亮氨酸 75；
β-巯基乙醇 4.0；
二水L-酪氨酸二钠 144；
乙醇胺 1；
L-胱氨酸二盐酸 75；
地塞米松 0.005；
人转铁蛋白 5；
人血清白蛋白 1000；
纤粘连蛋白 5；
重组人成纤维细胞生长因子 10；
重组人转化因子β 0.1；
重组人表皮生长因子 0.1；
胰岛素：20；
纯化人转铁蛋白：30；
胆固醇：20；
过氧化氢酶：20；
亚硒酸钠：35.0；
1％二巯基乙醇溶液：1.0；
余量为水。
4.权利要求1～3中任一项所述的人脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于：取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如权利要求1～3中任一项所述，调节pH值至7.1～7.4，即得。
5.权利要求1～3中任一项所述的人脐带间充质干细胞无血清培养基在培养人脐带间充质干细胞中的应用。
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