KR20230072208A - 저혈청 배지 첨가제 및 이의 용도 - Google Patents

저혈청 배지 첨가제 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저혈청 배지 첨가제 및 이의 용도에 관한 것이다.
일 양상에 따르면 따르면, 본 발명의 세포 배양용 배지 첨가제 또는 이를 포함하는 세포 배양용 배지 조성물은 저혈청 조건에서도 다양한 세포를 효과적으로 배양할 수 있음을 확인하였는 바, 상기 배지 첨가제는 소태아혈청 등의 혈청 성분을 대체하여 사용할 수 있다.

Description

저혈청 배지 첨가제 및 이의 용도 {Low serum media supplement and uses thereof}
본 발명은 저혈청 배지 첨가제 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포배양은 오늘날 분자생물학, 면역학을 비롯한 의학 분야의 연구에 가장 기본적이고 중요한 실험 기법이다. 현재까지 사용되고 있는 동물세포 배양법은 성장을 위하여 반드시 세포배양배지에 혈청을 공급해 주어야 하며, 가장 널리 사용되는 혈청으로 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 있다.
그러나, 상기 배지를 이용한 세포의 배양과정에서 소태아혈청을 포함한 동물유래 단백질원을 사용함으로써 종간 오염성 등의 안정성 문제를 배제하기가 어렵다. 또한, 소태아혈청의 제조과정은 임신한 어미 소의 자궁에서 소태아를 적출하여 혈청을 분리하므로 필연적으로 윤리적인 문제가 발생할 수밖에 없고, 미국 FDA 및 유럽연합의 EMEA(European Medicines Agency)를 비롯한 국제사회는 소태아혈청의 사용 자제와 대체제의 개발을 권고하고 있는 실정이다. 나아가, 소태아혈청에 의한 광우병 전파 위험성에 대한 논란 역시 여전히 해결되지 않은 상황이다.
소태아혈청을 대체하는 첨가제의 연구가 활발히 이루어진 결과, 다양한 혈청 대체제가 개발되었으나, 현재까지 개발된 첨가제의 경우 적용 가능한 세포주가 매우 한정적이고, 배양을 위한 세포주의 적응 과정이 어려우며 세포분열 및 성장속도가 느릴 뿐만 아니라, 소태아혈청 대신 세포배양에 필수적인 각종 호르몬 및 성장인자의 추가적인 첨가가 필요해 사용자의 번거로움을 초래하는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 배양 배지에서 혈청을 일부 대체할 수 있는 첨가제를 개발하여, 기존의 배양 배지에서 혈청 함유량을 감소시키더라도 세포 성장률 및 생존률 등을 유지할 수 있는 것을 확인하여 위와 같은 문제점을 해결하였다.
일 양상은 아 셀렌산나트륨 (Sodium selenite), 피루브산 (Pyruvate), 에탄올아민 (Ethanolamine), 아스코르브산 (Ascorbic acid), 황산 제2철 (Ferric Sulfate), 혈소판 용해물 (Platelet lysates) 및 지질 복합체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 세포 배양용 배지 첨가제를 제공한다.
다른 양상은 상기 세포 배양용 배지 첨가제를 포함하는, 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
일 양상은 아 셀렌산나트륨 (Sodium selenite), 피루브산 (Pyruvate), 에탄올아민 (Ethanolamine), 아스코르브산 (Ascorbic acid), 황산 제2철 (Ferric Sulfate), 혈소판 용해물 (Platelet lysates) 및 지질 복합체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 세포 배양용 배지 첨가제를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "세포 배양 (cell culture)"은 조절된 조건 하에서 인공적으로 체외에서 살아있는 세포를 키우는 과정을 의미한다. 또한, 개체 조직의 일부분을 무균적으로 떼어내 효소로 세포간 연결 물질을 분해하여 유리시킨 현탁액을 병이나 페트리 접시와 같은 배양 접시의 편평한 밑부분에 도말하여 세포를 성장 및 증식시키는 것일 수 있다.
상기 세포는 동물 세포로서 미분화 세포, 분화 중인 세포, 또는 분화가 완료된 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 첨가제는 아 셀렌산나트륨 (Sodium selenite), 피루브산 (Pyruvate), 에탄올아민 (Ethanolamine), 아스코르브산 (Ascorbic acid), 황산 제2철 (Ferric Sulfate), 혈소판 용해물 (Platelet lysates) 및 지질 복합체를 포함하는 것일 수 있다.
상기 아셀렌산나트륨 (Sodium selenite, Na2SeO3) 활성산소를 억제하는 기능인 항산화기능이 우수한 것으로 알려져 있으며, 5수화물(Na2SeO3·5H2O) 및 8수화물(Na2SeO3·8H2O) 형태로　존재할 수 있다.
상기 피루브산 (Pyruvate, C3H4O3)은 카복실산과 케톤 작용기를 가진 가장 단순한 알파 케토산이며, CH3COCOOH의 화학식으로 표현될 수 있다. 피루브산은 해당과정을 통해 포도당으로부터 생성될 수 있으며, 포도당 신생합성을 통해 다시 탄수화물(예: 포도당)로 다시 전환되거나, 아세틸-CoA와의 반응을 통해 지방산으로 전환될 수도 있다. 또한 피루브산은 아미노산인 알라닌을 만드는데 사용될 수 있고 발효를 통해 에탄올 또는 젖산으로 전환될 수도 있으며, 산소가 존재할 때 시트르산 회로와 산화적 인산화를 통해 세포에 에너지를 공급하고, 산소가 결핍되면 젖산 발효나 에탄올 발효를 한다.
상기 아스코르브산 (Ascorbic acid, C6H8O6)은 아스코르브산은 비타민 C로 작용하는 물질로서 활성산소 종(Reactive oxygen species)을 조절하는 용해성 산화환원분자로 알려져있다.
상기 혈소판 용해물은 (Platelet lysates)은 혈소판의 동결/융해과정 등으로 수득된 물질을 의미한다. 혈소판은 성장 인자, 키모카인과 (chemokine) 인터루킨을 포함한 사이토카인, 다른 대사 산물 및 세포외 소포 (extracellular vesicle, EV)와 같은 많은 생활성 분자(bioactive molecule)의 풍부한 공급원으로 알려져 있는 바, 상기 혈소판 용해물은 세포 성장에 필요한 많은 양의 성장 인자를 포함하고 있을 수 있다. 상기 혈소판 용해물은 인간 (human) 유래 또는 소 (bovine) 유래일 수 있다.
상기 지질 복합체는 지질성분의 혼합물을 의미하는 것으로서, 상기 지질 복합체는 콜레스테롤, 지방산 및 지질 단백질로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 콜레스테롤, 지방산 및 지질 단백질을 포함하는 것일 수 있다.
상기 배지 첨가제는 인슐린 (insulin) 및 하이드로코르티손(Hydrocortisone)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하지 않을 수 있으며, 구체적으로 상기 인슐린 및 하이드로코르티손을 모두 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 배지 첨가제는 저혈청 배지에 첨가되는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 저혈청 배지는 혈청이 전체 배지 100 부피부에 대해 1 내지 5 부피부로 포함된 배지를 의미하는 것일 수 있다.
상기 배지 첨가제는 혈청을 전부 또는 일부 대체할 수 있는 바, 상기 배지 첨가제가 함유된 세포 배양 배지는 일반적인 배양 배지(약 10% 혈청 함유) 보다 혈청 함유량이 감소될 수 있다. 또한, 상기 배지 첨가제가 포함된 저혈청 배양 배지는 10% 혈청 함유-배양 배지와 유사한 세포 성장률, 세포 생존률 및 계대 배양 효율을 보이며, 세포의 형태, 세포 주기 및 세포 사멸 단계 또한 유사한 특징을 나타낸다.
본 명세서에서 용어, "계대 배양 (sub-culture)"이란, 세포 증식 방법의 하나로, 세포를 보존하고 세포의 대를 이어가기 위해 수일마다 주기적으로 새로운 배지에 이식시키는 것을 의미한다. "계대 (passage)"는 배양 용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양 용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기 (confluence)까지의 세포의 성장 및 증식인 것일 수 있다. 세포를 배양하는 방법 및 계대 배양 방법은 통상의 배양 방법 및 공지된 방법으로 수행되는 것 일수 있다.
또 다른 양상은 상기 세포 배양용 배지 첨가제를 포함하는, 세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
상기 세포 배양용 배지 조성물은 기본 배지 및 상기 세포 배양용 배지 첨가제를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 기본 배지에 상기 세포 배양용 배지 첨가제가 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 기본 배지는 일반적으로 당업계에서 사용되고, 세포를 배양하기 위한 기본적인 구성성분을 포함하고 있는 배지일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배지(culture media)"는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장, 생존 및 분화를 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 해당분야에서 사용되는 세포의 배양 및 분화에 적절한 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 해당분야의 기술적 수준에서 배지의 종류와 배양 조건을 선택할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 구체적으로 기본 배지 (Basal medium) 또는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium, CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 상기 세포 배양 최소 배지에는 예를 들어, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, F-12K, DMEM/F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's Medium, MesenCult-XF, DMEM/HG (Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose) 배지, 및 MCDB+DMEM/LG (MCDB+Dulbecco's Modified Eagle's Medium low glucose) 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 배지는 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 겐타마이신 (gentamicin) 또는 이들의 2 이상의 혼합물 등의 항생제를 포함할 수 있다.
상기 세포 배양용 배지 조성물은 혈청을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 혈청은 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS), 소아 혈청(Bovine calf serum, BCS, 사람 혈청(human serum) 및 말 혈청(Horse serum, HS)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 세포 배양용 배지 조성물은 저혈청 배지 조성물로서, 상기 혈청은 전체 배지 조성물 100 부피부에 대해 1 내지 5 부피부 [%(v/v)]로 포함된 것일 수 있으며, 구체적으로 1 내지 5 %(v/v), 1 내지 4.5 %(v/v), 1 내지 4 %(v/v), 1 내지 3.5 %(v/v), 1 내지 3 %(v/v), 1.5 내지 5 %(v/v), 1.5 내지 4.5 %(v/v), 1.5 내지 4 %(v/v), 1.5 내지 3.5 %(v/v), 1.5 내지 3 %(v/v), 2 내지 5 %(v/v), 2 내지 4.5 %(v/v), 2 내지 4 %(v/v), 2 내지 3.5 %(v/v), 또는 2 내지 3 %(v/v)의 농도로 포함되는 것일 수 있다.
상기 세포 배양용 배지 조성물은 상기 배지 첨가제를 함유함으로서 혈청을 일부 대체할 수 있는 바, 일반적인 배양 배지(약 10% 혈청 함유) 보다 혈청 함유량이 감소된 저혈청 배지일 수 있다. 또한, 상기 세포 배양용 배지 조성물은 10% 혈청 함유-배양 배지와 유사한 세포 성장률, 세포 생존률 및 계대 배양 효율을 보이며, 세포의 형태, 세포 주기 및 세포 사멸 단계 또한 유사한 특징을 나타낸다.
일 양상에 따르면 따르면, 본 발명의 세포 배양용 배지 첨가제 또는 이를 포함하는 세포 배양용 배지 조성물은 저혈청 조건에서도 다양한 세포를 효과적으로 배양할 수 있음을 확인하였는 바, 상기 배지 첨가제는 소태아혈청 등의 혈청 성분을 대체하여 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 첨가제가 함유된 저혈청 배지의 세포 배양 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 첨가제가 함유된 저혈청 배지로 배양된 세포의 성장률을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 저혈청 배지 첨가제에 인슐린 또는 히드로코르티손이 추가로 첨가된 경우 배양된 세포의 생장 상태를 나타낸 도면이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 첨가제가 함유된 저혈청 배지로 배양된 세포의 생존률을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 첨가제가 함유된 저혈청 배지로 배양된 세포의 계대 배양 효율을 나타낸 도면이다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 첨가제가 함유된 저혈청 배지로 배양된 Vero 세포주의 배양 결과를 나타낸 도면이다.
도 9 및 도 10은 본 발명의 첨가제가 함유된 저혈청 배지로 배양된 HEK-293 세포주의 배양 결과를 나타낸 도면이다.
도 11 및 도 12는 본 발명의 첨가제가 함유된 저혈청 배지로 배양된 HeLa 세포주의 배양 결과를 나타낸 도면이다.
도 13 및 도 14는 본 발명의 첨가제가 함유된 저혈청 배지로 배양된 MDCK 세포주의 배양 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 본 발명의 첨가제가 함유된 저혈청 배지로 배양된 Vero 및 MDCK 세포주의 계대 배양 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 본 발명의 첨가제가 함유된 저혈청 배지로 배양된 세포의 세포 주기 및 세포 사멸 단계를 나타낸 도면이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신규 저혈청 배지 첨가제 개발
본 발명의 저혈청 배지에 첨가하는 신규한 첨가 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명의 첨가 조성물을 2~3% 농도의 혈청이 포함된 저혈청 배지에 에 추가하여, 10% 혈청 배양액과 유사한 성능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 저혈청 배지 첨가제 (Low serum media supplement, LSS)의 구성성분 및 상기 LSS가 배지에 첨가된 경우 배지 기준의 첨가물 농도를 하기 표 1에 구체적으로 기재하였다. 한편, LipoGro은 RMBIO사로부터 구매하였으며, 콜레스테롤(cholesterol), 지방산 (fatty acid) 및 지질단백질(lipoprotein)을 포함하는 지질성분 복합체를 포함하고 있다.
성분 농도
아 셀렌산나트륨 (Sodium selenite) 1 내지 20 ng/mL
피루브산 (Pyruvate) 10 내지 1000 μg/mL
에탄올아민 (Ethanolamine) 1 내지 20 μg/mL
아스코르브산 (Ascorbic acid) 50 내지 500 ng/mL
황산 제2철 (Ferric Sulfate) 0.1 내지 5 μg/mL
혈소판 용해물 (Bovine Platelet lysates) 0.1% 내지 5 %
지질 복합체 (LipoGro) 0.01% 내지 0.5 %
이하에서는 상기 저혈청 배지 첨가제가 포함된 배지의 세포 배양 관련 효과를 확인하기 위해 실험을 수행하였다. 구체적으로, 양성 대조군으로는 10% FBS가 함유된 DMEM 또는 RPMI 배지로 설정하였고, 실험군으로는 1) 기본 배지에 2-3% FBS 및 본 발명의 LSS가 함유된 배지 및 2) 저혈청 배지로 판매되고 있는 타사의 RPMI 1640 저혈청 배지와 DMEM 전용 저혈청 배지(제조사에 프로토콜에 따라 구성함) 에 2-3% FBS가 함유된 배지로 설정하였다.
실시예 2: 세포 배양 및 세포 성장률 평가
본 발명의 LSS 함유 배지의 세포 배양 결과 및 세포 성장률에 미치는 효과를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 사전 배양된 CHO-K1 세포주의 배양 플레이트의 배지 상층액을 버리고, 부착된 세포가 떨어지지 않게 PBS로 세척하였다. 세척된 세포를 탈착시키기 위해 TrypLETM express enzyme을 넣고 37℃ 5% CO2 조건에서 3분동안 인큐베이션시켰다. 그 후 완전 배지(Complete medium)를 넣고 중화하면서 세포를 모은 후, 3000rpm 조건으로 3분동안 원심분리하였다. 이 후, 상층액을 버린 후 세포 펠릿을 현탁시킨 후 세포 수를 측정하였으며, 세포 농도가 1 x 106/ml이 되도록 배지를 추가하였다. 다음으로, 상기 세포 현탁액 0.25ml 및 실험에 사용되는 조건 배지 9.75ml을 15ml 튜브에 혼합하여 총 10ml이 되도록 하였으며(세포 농도 2.5 x 104/ml), 10ml의 조건배지 안에 부유되어 있는 세포를 잘 혼합한 후 96웰 플레이트에 0.1ml씩 접종하고 (세포 농도 2.5 x 103/웰), 37℃ 5% CO2 조건에서 4일간 세포를 배양하였다.
그 결과, 본 발명의 LSS를 포함하는 저혈청 배지의 경우 10% FBS를 포함하는 양성 대조군과 유사한 세포 배양 결과를 나타냈으며, 세포 형태 또한 안정적인 것으로 확인되었다 (도 1).
다음으로, 상기 각각의 배지로 배양된 세포의 성장률을 확인하기 위해 배양 1일째, 2일째. 3일째 및 4일째에 각각 세포를 수집하여 세포 수를 확인하여 성장률을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 LSS를 포함하는 저혈청 배지의 경우, 10% FBS를 포함하는 양성 대조군 및 2-3% FBS가 함유된 Advanced 배지와 유사한 세포 성장률을 나타냈으며, 세포 형태 또한 안정적인 것으로 확인되었다 (도 2).
상기 결과를 토대로 본 발명의 LSS이 함유된 배지는 적은 혈청이 포함되더라도 우수한 세포 생장 및 세포 성장률을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 세포 배양 및 세포 성장률 평가
본 발명의 저혈청 배지 첨가제에 추가 성분을 함유한 경우 세포 생장율에 영향을 미칠 수 있는 지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 세포를 배양하였으며, 배양 배지는 LSS가 함유된 저혈청 배지에 인슐린 (Insulin) 또는 히드로코르티손 (Hydrocortisone)을 농도별로 추가하였다.
그 결과, 상기 인슐린 또는 히드로코르티손은 소량이 첨가되어도 세포 형태가 변하였으며, 세포 성장 또한 저해되는 것을 확인하였다 (도 3). 따라서, 상기 결과를 토대로 본 발명의 LSS에 인슐린 및/또는 히드로코르티손이 추가로 첨가될 경우에는 오히려 세포 생장 및 생존을 저해할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4: 세포 생존율 평가
본 발명의 LSS 함유 배지가 세포 생존률에 미치는 효과를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 사전 배양된 CHO-K1 세포주의 배양 플레이트의 배지 상층액을 버리고, 부착된 세포가 떨어지지 않게 PBS로 세척하였다. 세척된 세포를 탈착시키기 위해 TrypLETM express enzyme을 넣고 37℃ 5% CO2 조건에서 3분동안 인큐베이션시켰다. 그 후 완전 배지(Complete medium)를 넣고 중화하면서 세포를 모은 후, 3000rpm 조건으로 3분동안 원심분리하였다. 이 후, 상층액을 버린 후 세포 펠릿을 현탁시킨 후 세포 수를 측정하였으며, 세포 농도가 1 x 106/ml이 되도록 배지를 추가하였다. 상기 세포 현탁액 0.25ml 및 실험에 사용되는 조건 배지 9.75ml을 15ml 튜브에 혼합하여 총 10ml이 되도록 하였으며(세포 농도 2.5 x 104/ml), 10ml의 조건배지 안에 부유되어 있는 세포를 잘 혼합한 후 96웰 플레이트에 0.1ml씩 접종하고 (세포 농도 2.5 x 103/웰), 37℃ 5% CO2 조건에서 세포를 배양하였다.
다음으로, 상기 각각의 배지로 배양된 세포의 생존율을 확인하기 위해, 배양 4일 후 Hoechst/PI 염색을 수행하였다. Hoechst 염색시약은 세포 전체를 염색하고, PI는 죽은세포만을 염색할 수 있으므로, 상기 염색 비율을 통해 세포 생존율을 확인할 수 있다. 염색 버퍼(Stain buffer)은 Hoechst 10ug/ml 및 PI 5ug/ml을 DPBS에 혼합하여 제조하였으며, 각 웰에 염색 버퍼를 100ul씩 넣고 37℃ 조건에서 10분동안 반응시킨 후, 전자동현미경을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 LSS를 포함하는 저혈청 배지의 경우, 10% FBS를 포함하는 양성 대조군 및 2-3% FBS가 함유된 Advanced 배지와 유사한 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였는 바 (도 4 및 도 5), 본 발명의 LSS이 함유된 배지는 적은 혈청이 포함되더라도 우수한 세포 생존률을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5: 계대 배양 (Sub-culture) 평가
본 발명의 LSS 함유 배지가 세포의 계대 배양 효율에 미치는 효과를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 사전 배양된 CHO-K1 세포주의 배양 플레이트의 배지 상층액을 버리고, 부착된 세포가 떨어지지 않게 PBS로 세척하였다. 세척된 세포를 탈착시키기 위해 TrypLETM express enzyme을 넣고 37℃ 5% CO2 조건에서 3분동안 인큐베이션시켰다. 그 후 완전 배지(Complete medium)를 넣고 중화하면서 세포를 모은 후, 3000rpm 조건으로 3분동안 원심분리하였다. 이 후, 상층액을 버린 후 세포 페렛을 현탁시킨 후 세포 수를 측정하였으며, 세포 농도가 1 x 106/ml이 되도록 배지를 추가하였다. 이 후, 각각의 조건 배지 10 ml를 100 mm 세포배양 플레이트에 넣고 상기 세포 현탁액 0.5ml를 접종하고 (세포 농도 5.0 x 105/dish), 37℃ 5% CO2 조건에서 세포를 배양하였다.
다음으로, 상기 각각의 배지로 배양된 세포의 계대 배양 결과를 확인하기 위해, 주 2회에 계대 배양을 수행하였으며, 계대 배양시에는 세포 수를 측정하여 동일 세포수로 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 LSS를 포함하는 저혈청 배지의 경우, 10% FBS를 포함하는 양성 대조군 및 2-3% FBS가 함유된 타사 저혈청 배지와 유사한 계대 배양 효율을 나타내는 것을 확인하였는 바 (도 6), 본 발명의 LSS이 함유된 배지는 적은 혈청이 포함되더라도 우수한 세포 배양 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6: 다양한 세포주에서 세포 배양 효과 평가
본 발명의 LSS 함유 배지의 세포 배양 효과를 다양한 세포주에서 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, CHO-K1 세포주 외에 Vero, HEK-293, HeLa 및 MDCK 세포주의 세포 성장률 및 배양 중 세포 형태를 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 LSS를 포함하는 저혈청 배지의 경우, Vero 세포주 (도 7 및 도 8), HEK-293 세포주 (도 9 및 도 10), HeLa 세포주 (도 11 및 도 12) 및 MDCK 세포주 (도 13 및 도 14)에서도 10% FBS를 포함하는 양성 대조군 및 2-3% FBS가 함유된 타사 저혈청 배지와 유사한 세포 성장률을 나타냈으며, 세포 형태 또한 안정적인 것으로 확인되었다.
또한, Vero 세포주 및 MDCK 세포주에서의 계대 배양 효율을 확인한 결과, 본 발명의 LSS를 포함하는 저혈청 배지의 경우에도 다른 대조군과 유사한 효율 및 세포 형태를 나타내는 것을 확인하였다 (도 15).
따라서, 본 발명의 LSS이 함유된 배지는 적은 혈청이 다양한 세포주에서 우수한 세포 배양 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7: 배양된 세포의 세포 주기 및 세포 사멸 단계 평가
본 발명의 LSS 함유 배지로 배양된 세포의 세포 주기 및 세포 사멸 단계를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 세포 주기를 측정하기 위해, 각각의 조건 배지로 배양된 CHO-K1 세포주의 배양 플레이트의 배지 상층액을 버리고, 부착된 세포가 떨어지지 않게 PBS로 세척하였다. 세척된 세포를 탈착시키기 위해 TrypLETM express enzyme을 넣고 37℃ 5% CO2 조건에서 3분동안 인큐베이션시켰다. 그 후 세포를 모은 후, 3500rpm 조건으로 3분동안 원심분리하고, 상층액을 제거한 후 차가운 PBS 600 ul로 현탁시켰다. 100% 에탄올 1.4ml를 한방울씩 떨어뜨린 후, 4000rpm 조건으로 3분동안 원심분리하고, PBS로 세척 후 다시 4000rpm 조건으로 3분동안 원심분리하였다. 다음으로, 100 ug/ml RNase A 및 50 ug/ml PI가 DPBS에 혼합된 염색 버퍼(Stain buffer)를 샘플마다 0.5 ml씩 넣고 얼음 위에서 빛 차단하고 30분동안 반응시킨 후, 유세포분석기를 이용하여 세포주기를 측정하였다.
또한, 세포 사멸 수준을 측정하기 위해, 각각의 조건 배지로 배양된 CHO-K1 세포주의 배양 플레이트의 배지 상층액을 버리고, 부착된 세포가 떨어지지 않게 PBS로 세척하였다. 세척된 세포를 탈착시키기 위해 TrypLETM express enzyme을 넣고 37℃ 5% CO2 조건에서 3분동안 인큐베이션시켰다. 그 후 세포를 모은 후, 3500rpm 조건으로 3분동안 원심분리하고, 상층액을 제거한 후 차가운 PBS로 현탁시키고, 다시 3500rpm 조건으로 3분동안 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 제거한 후 1X Annexin V binding 버퍼를 각 튜브 당 100ul씩 넣고 세포를 부유시킨 후, FITC 3ul를 넣고 실온 및 빛 차단 조건에서 15분동안 반응시켰다. 그 후, 1X Annexin V binding 버퍼를 각 튜브 당 400ul씩 넣고 세포를 부유시킨 후, 형광 측정 직전에 PI 2ul 넣고 유세포분석기를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 LSS를 포함하는 저혈청 배지의 경우, 10% FBS를 포함하는 양성 대조군 및 2-3% FBS가 함유된 타사 저혈청 배지와 유사한 세포 주기 및 세포 사멸 단계를 나타내는 것을 확인하였는 바 (도 16), 본 발명의 LSS이 함유된 배지는 적은 혈청이 포함되더라도 일반적인 혈청 배지와 유사한 세포 배양 결과를 나타내는 것을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

  1. 아 셀렌산나트륨 (Sodium selenite), 피루브산 (Pyruvate), 에탄올아민 (Ethanolamine), 아스코르브산 (Ascorbic acid), 황산 제2철 (Ferric Sulfate), 혈소판 용해물 (Platelet lysates) 및 지질 복합체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 세포 배양용 배지 첨가제.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 첨가제는 아 셀렌산나트륨 (Sodium selenite), 피루브산 (Pyruvate), 에탄올아민 (Ethanolamine), 아스코르브산 (Ascorbic acid), 황산 제2철 (Ferric Sulfate), 혈소판 용해물 (Platelet lysates) 및 지질 복합체를 포함하는 것인, 세포 배양용 배지 첨가제.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 첨가제는 인슐린 (insulin) 또는 히드로코르티손 (hydrocortisone)을 포함하지 않는 것인, 세포 배양용 배지 첨가제.
  4. 청구항 1의 세포 배양용 배지 첨가제를 포함하는, 세포 배양용 배지 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 조성물은 혈청을 추가로 포함하는 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 혈청은 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS), 소아 혈청(Bovine calf serum, BCS, 사람 혈청(human serum) 및 말 혈청(Horse serum, HS)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 혈청은 전체 배지 조성물 100 부피부에 대해 1 내지 5 부피부로 포함된 것인, 세포 배양용 배지 조성물.
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