WO2018074757A1 - Ｓｏｃｓ의 발현 또는 활성 억제를 이용한 고효능 줄기세포 선별방법 - Google Patents

Ｓｏｃｓ의 발현 또는 활성 억제를 이용한 고효능 줄기세포 선별방법 Download PDF

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이명우
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Definitions

  • the present invention comprising the step of measuring the level of a specific immunosuppressive biomarker in mesenchymal stem cells suppressed the expression or activity of a suppressor of cytokine signaling (SOCS), high-efficiency mesenchymal stem cells for the treatment of immune diseases
  • SOCS suppressor of cytokine signaling
  • the present invention relates to a screening method, high-efficiency mesenchymal stem cells selected by this method, and a method for treating immune diseases using the high-efficiency mesenchymal stem cells.
  • Organ, tissue, or cell transplantation can be used to save the lives of patients suffering from various kinds of diseases. Allotransplantation of organs such as the kidneys, liver, heart, kidneys, lungs and pancreas, tissues such as the skin, bone marrow, and the like is already commonly performed in hospitals to treat intractable diseases such as terminal organ failure. . In addition, xenotransplantation with donors from mammals other than humans is also being actively studied as a method to replace the lack of allograft donors. In particular, recently, transplantation of stem cells capable of permanently regenerating oneself and differentiating into various kinds of cells constituting the body under appropriate conditions has emerged as one of cell replacement treatments for various refractory diseases.
  • the immune system of a normally functioning recipient recognizes the transplanted organs, tissues, or cells as "non-self" and causes an immune rejection response to the graft.
  • This immune rejection reaction is generally mediated by alloreactive or xenoreactive T cells present in the immune system of the recipient recognizing alloantigens or xenoantigens of the donor tissue.
  • long-term survival of allogeneic or xenografts should be able to avoid the immune system or suppress the immune response of the recipients recognizing foreign antigens.
  • Graft-versus-host disease is caused by donor T-cells activated by host antigen presenting cells, which migrate to target tissues (skin, intestine, and liver) to cause dysfunction of the target organs.
  • the primary standard of care for graft-versus-host disease is to prescribe high concentrations of steroids.
  • 50% of the patients do not respond to the primary treatment, and although it is known that mortality increases once steroid resistance is induced, there is no secondary treatment for steroid-resistant graft-versus-host disease, requiring additional treatment alternatives.
  • the recipient in order to avoid the recipient's immune response to the graft, the recipient is usually given an immunosuppressive agent.
  • Calcineurin inhibitors such as cyclosporin and tacrolimus (FK-506) or azathioprine, rapamycin, mycophenolate mofetil and cyclo Antiproliferative drugs, such as phosphamide, are frequently used for allogeneic kidney, liver, pancreas, and heart transplants.
  • immunosuppressive agents should be administered on a daily basis, and if discontinued they usually result in an immune rejection reaction. Therefore, it should be administered over a long period of time, which may cause kidney, hepatotoxicity, high blood pressure and the like.
  • these drugs are not specific immunosuppressive agents that selectively act only on immune cells that respond only to allogeneic antigens of the graft, and thus may cause side effects such as opportunistic infection or tumor formation such as lymphoma.
  • Another immunosuppressive method is the administration of monoclonal antibodies such as OKT3, Daclizumab or Basiliximab, which also have the problem of opportunistic infection or tumor formation as nonspecific immunosuppressive agents. Therefore, there is a need for the development of new immunosuppressive methods without problems such as drug toxicity and opportunistic infection.
  • MSCs Human mesenchymal stem cells
  • MSCs can be derived from a variety of tissues and are strong candidates for cell-based transplantation or regenerative medicine treatment.
  • Features of MSCs such as migration to damaged tissues, immunosuppressive functions, self-renewal, and multipotency suggest their therapeutic applicability.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a method for selecting mesenchymal stem cells with excellent immunosuppressive ability. As a result, the present inventors have found that immunosuppression of specific immunosuppressive cells in mesenchymal stem cells is suppressed. By discovering the correlation between biomarkers and immunosuppressive ability, we found that when the expression of these biomarkers is increased, the immunosuppressive ability of mesenchymal stem cells is much improved than when only SOCS alone is inhibited. .
  • the present invention provides specific immunosuppressive biomarkers (IDO, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, PTGES, CXCR4, CXCR7, VCAM1,) in mesenchymal stem cells in which the expression or activity of the suppressor of cytokine signaling (SOCS) is suppressed.
  • High-efficiency mesenchymal stem cell selection method for the treatment of immune diseases comprising measuring the levels of ICAM1, ICAM2, TNF-alpha, B7-H1, TRAIL, Fas Ligand It is aimed at providing stem cells.
  • the present invention comprising the step of measuring the level of immunosuppressive biomarkers in mesenchymal stem cells suppressed the expression or activity of a suppressor of cytokine signaling (SOCS), high-efficiency mesenchymal stem cell selection method for the treatment of immune diseases To provide.
  • SOCS suppressor of cytokine signaling
  • the method is characterized in that it comprises the following steps.
  • the method further comprises the step of culturing the mesenchymal stem cells between the steps (a) and (b).
  • the immunosuppressive biomarker is IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9 (CXC motif ligand 9), CXCL10 (CXC motif ligand 10), CXCL11 (CXC motif ligand 11), CXC motif ligand 12 (CXCL12), Prostaglandin E synthase (TGTES), CXC chemokine receptor type 4 (CXCR4), CXC chemokine receptor type 7 (CXCR7), Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM1), Inter Cellular Adhesion Molecule 1 (IMC1) , ICAM2 (Inter Cellular Adhesion Molecule 2), TNF-alpha, B7-H1 (B7 homolog 1), TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand), Fas Ligand is characterized in that at least one selected from the group consisting of.
  • the high potency is characterized in that the immunosuppressive ability.
  • the mesenchymal stem cells are derived from one selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, warton's meat, nerve, skin, amniotic membrane, chorionic membrane, decidual membrane and placenta. It is characterized by.
  • the immune disease is graft-versus-host disease, organ transplant rejection, humoral rejection, autoimmune disease or allergic disease.
  • the autoimmune disease is Crohn's disease, erythema disease, atopy, rheumatoid arthritis, Hashimoto's thyroiditis, pernicious anemia, Edison disease, type 1 diabetes, lupus, chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, thyroid gland Hypogonadism and hyperactivity, scleroderma, Behcet's disease, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, myasthenia gravis, Meniere's syndrome, Guilian-Barre syndrome, Sjogren's syndrome, vitiligo, endometriosis , Psoriasis, systemic scleroderma, asthma or ulcerative colitis.
  • the SOCS expression inhibitor is a small interference RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), miRNA (microRNA), peptide nucleic acids (PNA) and antisense oligonucleotides specific for the SOCS gene It is characterized in that it is selected from the group consisting of.
  • the SOCS activity inhibitor is characterized in that it is selected from the group consisting of antibodies, aptamers and antagonists specific for SOCS protein.
  • the expression level of the biomarker of step (b) is Western blotting, antibody immunoprecipitation, ELISA, mass spectrometry, RT-PCR, competitive RT-PCR (competitive RT-PCR) Real-time RT-PCR (RT-PCR), RNase protection assay (RPA: RNase protection assay, characterized in that it is measured by using a Northern blotting or DNA chip.
  • the present invention also provides a high-efficiency mesenchymal stem cell for the treatment of immune diseases, selected by the above method.
  • the immune disease is graft-versus-host disease, organ transplant rejection, humoral rejection, autoimmune disease or allergic disease.
  • the high potency is characterized in that the immunosuppressive ability.
  • the mesenchymal stem cells are characterized in that they are derived from umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat, muscle, wartons, nerves, skin, amniotic membrane or placenta.
  • the mesenchymal stem cells are characterized in that derived from autologous, taga or allogeneic.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating immunological diseases, containing the high-efficacy mesenchymal stem cells.
  • the present invention also provides a pharmaceutical formulation for treating graft-versus-host disease containing the high-efficacy mesenchymal stem cells.
  • the present invention also provides a method for treating immune diseases, such as graft-versus-host disease, comprising administering the high-efficacy mesenchymal stem cells to a subject.
  • the present invention also provides a therapeutic use of immune diseases such as graft-versus-host disease using the high-efficacy mesenchymal stem cells.
  • specific immunosuppressive biomarkers IDO, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, PTGES, CXCR4, CXCR7, VCAM1, ICAM1 in mesenchymal stem cells in which the expression / activity of the suppressor of cytokine signaling (SOCS) is suppressed , ICAM2, TNF-alpha, B7-H1, TRAIL, Fas Ligand
  • SOCS suppressor of cytokine signaling
  • ICAM2 TNF-alpha
  • B7-H1, TRAIL, Fas Ligand Fas Ligand
  • the present invention can provide a useful method for obtaining functionally superior mesenchymal stem cells having the ability to modulate immune response for the clinical treatment of various immune diseases including graft-versus-host disease and autoimmune diseases. It may be usefully used as a therapy for immune diseases.
  • the prevention and treatment of graft-versus-host disease with mesenchymal stem cells selected by the present invention shows a higher therapeutic potential for allogeneic stem cell transplantation.
  • 1A is a result of red fluorescence staining confirming that SOCS protein expression was inhibited by processing shRNA targeting SOCS to MSC.
  • FIG. 1B is a result of Western blotting confirming that the expression of SOCS protein is suppressed by treating shRNA targeting SOCS to MSC.
  • Figure 2 shows the results of confirming the immunosuppressive properties of MSCs down-regulated SOCS in an in vivo graft-versus-host disease animal model.
  • the present invention comprising the step of measuring the level of immunosuppressive biomarkers in mesenchymal stem cells suppressed the expression or activity of a suppressor of cytokine signaling (SOCS), high-efficiency mesenchymal stem cell selection method for the treatment of immune diseases To provide.
  • SOCS suppressor of cytokine signaling
  • the SOCS protein belongs to the group of negative feedback regulators of cytokine signaling, the Janus kinase / signal transducer and the JAK / STAT pathway. It is known to contain activators of.
  • SOCS Cytokine inducible SH2-containing protein
  • immunosuppressive biomarkers for example, IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9 (CXC motif ligand 9), CXCL10 (CXC motif ligand 10), CXCL11 (CXC motif ligand 11), CXC motif ligand 12 (CXCL12), Prostaglandin E synthase (TGTES), CXC chemokine receptor type 4 (CXCR4), CXC chemokine receptor type 7 (CXCR7), Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM1), Inter Cellular Adhesion Molecule 1 (IMC1) , ICAM2 (Inter Cellular Adhesion Molecule 2), TNF-alpha, B7-H1 (B7 homolog 1), TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand), Fas Ligand may be one or more selected from the group consisting of.
  • IDO indoleamine 2,3-dioxygena
  • PTGES Prostaglandin E synthase
  • VCAM1 Vascular Cell Adhesion Molecule 1
  • CXC7 CXC chemokine receptor type 7
  • ICAM1 Inter Cellular Adhesion Molecule 1
  • the selection method of the present invention (a) after the mesenchymal stem cell culture step of treating the expression or activity inhibitor of SOCS; (b) measuring the expression level of an immunosuppressive biomarker in mesenchymal stem cells whose expression or activity is inhibited; And (c) determining that the expression level is high-efficiency mesenchymal stem cells for the treatment of immune diseases when the expression level is inhibited compared to the control or control of the expression inhibitor or the SOCS.
  • the step (a) and may further comprise the step of culturing the mesenchymal stem cells in a high density between (b), wherein the high-density culture may be to culture at a density of 5,000 to 20,000 cells / cm 2 have.
  • 'high potency' means that the mesenchymal stem cells have an excellent effect on suppressing the immune response and have an effective effect in the treatment of immune-related diseases.
  • mesenchymal stem cell is a multipotent stem cell having the ability to differentiate into ectoderm cells, such as various mesodermal cells or neurons, including bone, cartilage, fat, muscle cells.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from those selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerves, skin, amniotic membrane, chorion, decidual membrane, and placenta.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from humans, fetuses, or mammals except humans. Mammals other than humans may be more preferably canine, feline, ape, animal, cow, sheep, pig, horse, rat, mouse or guinea pig, and the like, without limitation.
  • immune disease is not limited as long as it is a disease caused by immune regulation abnormalities, for example, graft versus host disease, organ transplant rejection, humoral rejection, autoimmune disease or allergic disease may be. .
  • autoimmune diseases are not limited in its type, but Crohn's disease, erythema disease, atopy, rheumatoid arthritis, Hashimoto's thyroiditis, pernicious anemia, Edison's disease, type 1 diabetes, lupus, chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, hypothyroidism Hyperhidrosis, scleroderma, Behcet's disease, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, myasthenia gravis, Meniere's syndrome, Guilian-Barre syndrome, Sjogren's syndrome, vitiligo, endometriosis, psoriasis , Systemic scleroderma, asthma or ulcerative colitis.
  • the allergic disease is not limited in kind, but anaphylaxis, allergic rhinitis, asthma, allergic conjunctivitis, allergic dermatitis, atopic dermatitis (atopic dermatitis), contact dermatitis, urticaria, pruritus, insect allergy, food allergy or drug allergy.
  • the SOCS expression inhibitor is not limited as long as it specifically binds to SOCS gene / mRNA and inhibits expression.
  • siRNA small interference RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • specific to SOCS gene / mRNA miRNA (microRNA)
  • miRNA miRNA
  • PNA peptide nucleic acids
  • antisense oligonucleotides for example, siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), specific to SOCS gene / mRNA, miRNA (microRNA), peptide nucleic acids (PNA) or antisense oligonucleotides.
  • the SOCS activity inhibitor is not limited as long as it inhibits its activity by binding to / compete with the SOCS protein, and may be, for example, an antibody, aptamer or antagonist specific to the SOCS protein.
  • the method of measuring the expression level of the biomarker for example, Western blotting, antibody immunoprecipitation, ELISA, mass spectrometry for protein expression, RT-PCR, competitive RT for mRNA expression. It can be measured using competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), Northern blotting or DNA chip.
  • the present invention provides a high-efficiency mesenchymal stem cell for the treatment of immune diseases, selected by the method, there is no restriction on the origin of the mesenchymal stem cells, for example, autologous, taga or allogeneic origin Can be.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition / pharmaceutical formulation for treating immunological diseases, containing the high-efficacy mesenchymal stem cells.
  • the "pharmaceutical composition” may further include ingredients such as existing therapeutically active ingredients, other adjuvants, pharmaceutically acceptable carriers and the like.
  • pharmaceutically acceptable carriers include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and the like.
  • compositions can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • dose may be adjusted in various ways depending on the weight, age, sex, health condition, diet, frequency of administration, administration method, excretion rate, and severity of the patient.
  • the term "individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, and the like. Mean mammal.
  • pharmaceutically effective amount means the type and severity of the disease to be administered, the age and sex of the patient, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of treatment, the factors including the concurrent drug and other medical fields. It is determined according to well-known factors in the amount can be easily determined by those skilled in the art in an amount capable of obtaining the maximum effect without side effects in consideration of all the above factors.
  • composition of the present invention is not limited in the "administration method" as long as the target tissue can be reached.
  • Examples include oral administration, arterial injection, intravenous injection, transdermal injection, intranasal administration, coronary administration or intramuscular administration.
  • the daily dosage is about 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, preferably administered once to several times a day.
  • Isolation of mesenchymal stem cells was isolated by a conventionally known method. Isolated cells were DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Invitrogen-Gibco, Rockville, MD) containing 10% FBS (fetal bovine serum, Invitrogen-Gibco) and 100 U / mL penicillin / streptomycin (Invitrogen-Gibco). The medium was dispensed at a density of 2 ⁇ 10 3 cells / cm 2 and incubated under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • DMEM Dynamic Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Invitrogen-Gibco penicillin / streptomycin
  • adenoviruses expressing SOCS1 shRNA short hairpin RNA
  • RFP red fluorescent protein
  • ATDMSCs adipose tissue-derived mesenchymal stem cells
  • shRNA sequence targeting SOCS1 was cloned into a human U6 promoter and a TagRFP marker gene containing shuttle vector (pO6A5-U6-mPGK-TagRFP) and prepared as a pO6A5-U6-shSOCS1-mPGK-TagRFP expression vector.
  • the U6-shRNA-SV40-pA region of was recombinantly transferred to a BAC vector.
  • the recovered recombinant adenovirus (Ad5-U6-shSOCS1-mPGK-TagRFP) was grown in HEK-293 cells, and HP4, a PTD (protein transduction domain), was purchased from Peptron.
  • HP4 multiplicity of infection
  • MOI multiplicity of infection
  • sample buffer 60 mM Tris-HCl, pH 6.8 comprising 14.4 mM ⁇ -mercaptoethanol, 25% glycerol, 2% SDS, and 0.1% bromophenol blue
  • sample buffer 60 mM Tris-HCl, pH 6.8 comprising 14.4 mM ⁇ -mercaptoethanol, 25% glycerol, 2% SDS, and 0.1% bromophenol blue
  • the separated proteins were transferred onto a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) using a trans-blot system (Gibco-Invitrogen).
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the PVDF membrane was blocked with TBS (10 mM Tris-HCl with 150 mM NaCl, pH 7.5) containing 5% skim milk powder (BD Sciences, CA, USA) at room temperature for 1 hour and then washed three times with TBS. And primary antibody in TBST containing 3% skim milk powder (10 mM Tris, pH 7.5) containing 150 mM NaCl, and 0.02% Tween-20 (diluted all antibodies 1: 1000) overnight at 4 ° C. Incubated. The next day, the blot was washed three times with TBST and incubated at room temperature with HRP-fused secondary antibody (1: 2000 or 1: 5000 dilution) in TBST containing 3% skim milk powder for 1 hour. After washing three times with TBST, the proteins were visualized with an ECL detection system (Amersham Biosciences).
  • mice Eighty-nine week old NOD / SCID immunodeficient mice (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) were subjected to systemic irradiation of 300 cGy and intravenously administered human peripheral blood monocytes 24 hours later. Specifically, 2 ⁇ 10 7 human peripheral blood mononuclear cells were administered to each mouse together with 1 ⁇ 10 6 mesenchymal stem cells. Thereafter, the same number of mesenchymal stem cells were repeatedly administered on day 7 of administration.
  • Example 2-1 It was confirmed whether the SOCS down-regulated MSC obtained in Example 2-1 exerts immunosuppressive ability in an actual graft-versus-host disease (GVHD) animal model.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • the MSC (red line) treatment group down-regulated SOCS by shRNA was found to significantly increase the survival rate (immunosuppressive capacity) compared to the control group.
  • RNA SOCS expression inhibitor
  • IDO SOCS expression inhibitor
  • CXCL9 CXCL10
  • CXCL11 CXCL12
  • PTGES CXCR4
  • CXCR7 VCAM1, ICAM1, ICAM2, TNF-alpha, B7-H1, TRAIL, and Fas Ligand genes were involved in the immunosuppressive function of mesenchymal stem cells.
  • the present invention can provide a useful method for obtaining functionally excellent mesenchymal stem cells having an immune response control for the clinical treatment of various immune diseases, including graft-versus-host disease, autoimmune diseases, It can be usefully used as a therapy for immune diseases.

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Abstract

본 발명은, SOCS(suppressor of cytokine signaling)의 발현 또는 활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 특정의 면역억제 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법, 이 방법에 의해 선별된 고효능 중간엽 줄기세포, 및 이 고효능 중간엽 줄기세포를 이용한 면역질환 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 이식편대숙주병, 자가면역질환을 포함하는 다양한 면역질환의 임상적 치료를 위한, 면역반응 조절능력을 가지는 기능적으로 우수한 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 유용한 방법을 제공할 수 있는 바, 면역질환 치료요법으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＳＯＣＳ의　발현　또는　활성　억제를　이용한　고효능 줄기세포 선별방법
본 발명은, SOCS(suppressor of cytokine signaling)의 발현 또는 활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 특정의 면역억제 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법, 이 방법에 의해 선별된 고효능 중간엽 줄기세포, 및 이 고효능 중간엽 줄기세포를 이용한 면역질환 치료방법에 관한 것이다.
장기, 조직 또는 세포 이식은 다양한 종류의 질병을 앓고 있는 환자의 생명을 구하는 데 이용될 수 있다. 인간의 신장, 간, 심장, 신장, 폐 및 췌장 등의 장기와 피부 등의 조직, 골수 등 세포 동종이식 (allotransplantation)은 말기 장기 부전 등 난치성 질환을 치료하는 방법으로 병원에서 이미 일반적으로 시행되고 있다. 또한, 인간 이외의 포유동물을 공여자로 하는 이종이식(xenotransplantation)도 동종이식 공여자 부족을 대체하는 방법으로 활발히 연구되고 있는 실정이다. 특히, 최근에는 자기 자신을 영구히 재생할 수 있고, 적절한 조건에서 신체를 구성하는 다양한 종류의 세포로 분화 가능한 줄기세포의 이식이 다양한 난치성 질환의 세포 대체 치료법의 하나로 대두되고 있다.
일반적으로 정상기능을 하는 수혜자의 면역체계는 이식된 장기, 조직이나 세포를 "비자기(non-self)"로 인식하여 이식편(graft)에 대해 면역거부반응을 유발한다. 이러한 면역거부반응은 공여자 조직의 동종항원(alloantigens) 또는 이종항원(xenoantigens)을 인식하는 수혜자의 면역시스템에 존재하는 동종반응성(alloreactive) 또는 이종반응성(xenoreactive) T 세포에 의해 일반적으로 매개된다. 따라서, 동종 또는 이종이식편이 장기간 생존하기 위해서는 외부 항원을 인지하는 수혜자의 면역체계를 피하거나 면역 반응을 억제할 수 있어야 한다.
이식편대숙주병은 숙주의 항원 제시세포에 의해 활성화된 공여자의 T-세포에 의해 유발되며, 상기 세포는 타겟 조직(피부, 장, 및 간)으로 이동하여 표적 기관의 기능이상을 유발한다. 이식편대숙주병의 1차적 표준 치료는 높은 농도의 스테로이드를 처방하는 것이다. 그러나 상기 환자의 50%는 상기 1차 치료법에 반응하지 않으며, 일단 스테로이드 저항성이 유발되면 사망률이 증가한다고 알려져 있음에도, 스테로이드 저항성 이식편대숙주병에 대한 2차적 치료법이 없어 추가적인 치료대안이 필요한 실정이다.
또한, 이식편에 대한 수혜자의 면역 반응을 피하기 위해서 일반적으로 수혜자에게 면역억제제를 투여하게 된다. 싸이클로스포린(cyclosporin) 및 타크롤리무스(tacrolimus, FK-506) 등과 같은 칼시네우린(calcineurin) 억제제나 아자티오프린(azathioprine), 라파마이신(rapamycin), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) 및 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide) 등과 같은 항증식성 약제(antiproliferative drug) 등이 대표적인 면역억제제들로 현재 동종 신장, 간, 췌장, 심장 이식 등에 빈번하게 사용되고 있다.
이들 면역억제제는 하루 기준으로 투여하여야 하며, 만일 투여를 중단할 경우 통상적으로 면역거부반응이 초래된다. 따라서, 장기간에 걸쳐 투여해야 하는데, 이로 인해 신장이나 간독성, 고혈압 등을 유발할 수 있다. 뿐만 아니라, 이들 약물은 이식편의 동종항원에만 반응하는 면역세포에만 선택적으로 작용하는 특이적 면역억제제가 아니므로 비특이적 면역억제에 따른 기회감염이나 림포마와 같은 종양형성 등의 부작용을 유발할 수 있다. 또 다른 면역억제 방법으로 OKT3, 다클리주맵(Daclizumab) 또는 바실릭시맵(Basiliximab) 등의 단클론 항체를 투여하는 방법이 있는데 이들 역시 비특이적인 면역억제제로 기회감염이나 종양 형성의 문제점을 지니고 있다. 따라서, 약물독성이나 기회감염 등의 문제점이 없는 새로운 면역억제법의 개발이 요구된다.
한편, 인간 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 다양한 조직에서 유래될 수 있으며, 세포 기반 이식 또는 재생 의약 치료에 있어서 강력한 후보자이다. 손상된 조직으로의 이동, 면역억제기능, 자가-재생, 및 다분화능과 같은 MSCs의 특징은 이의 치료적 적용 가능성을 제시한다. 현재, MSCs의 주입, 또는 이식을 포함하는 500 여개의 임상이 clinicaltrials.gov에 등록되어 있다. 또한, 이중 약 20%가 MSC의 면역억제능과 관련된다. MSCs의 면역억제 특성이 밝혀졌으며, 대부분의 임상 1상은 생물학적 안정성 문제를 나타내지 않음에도 불구하고, 그 이상의 임상단계에서는 미비한 결과가 도출되고 있다.
더욱이, MSC의 표준화를 위한 배양 방법 또는 프로토콜이 부재하여, 동일한 수여자의 동일한 조직에서 분리한 MSCs의 경우에도 표현형적, 및 기능적 다양성이 관찰되고 있다. 따라서 특정 조건을 부여하여 MSC의 기능을 촉진 또는 억제하는 방법이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 면역억제능이 우수한 중간엽 줄기세포를 선별할 수 있는 방안을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, SOCS(suppressor of cytokine signaling)의 발현/활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 특정의 면역억제 바이오마커와 면역억제능과의 상관관계를 발견하여, 이들 바이오마커의 발현이 증가될 경우 중간엽 줄기세포의 면역억제능이 SOCS만 단독 억제된 경우보다 훨씬 향상됨을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은, SOCS(suppressor of cytokine signaling)의 발현 또는 활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 특정의 면역억제 바이오마커(IDO, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, PTGES, CXCR4, CXCR7, VCAM1, ICAM1, ICAM2, TNF-alpha, B7-H1, TRAIL, Fas Ligand)의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법, 및 이에 의해 선별된 고효능 중간엽 줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, SOCS(suppressor of cytokine signaling)의 발현 또는 활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 면역억제 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a) 중간엽 줄기세포 배양 후 SOCS의 발현 또는 활성 억제제를 처리하는 단계;
(b) 상기 SOCS의 발현 또는 활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 면역억제 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 발현수준이 SOCS의 발현 또는 활성 억제제 미처리 대조군과 비교하여 억제되어 있는 경우 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포인 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 방법은 상기 단계 (a)와 (b) 사이에 중간엽 줄기세포를 고밀도 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 면역억제 바이오마커는 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9(C-X-C motif ligand 9), CXCL10(C-X-C motif ligand 10), CXCL11(C-X-C motif ligand 11), CXCL12(C-X-C motif ligand 12), PTGES(Prostaglandin E synthase), CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4), CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7), VCAM1(Vascular Cell Adhesion Molecule 1), ICAM1(Inter Cellular Adhesion Molecule 1), ICAM2(Inter Cellular Adhesion Molecule 2), TNF-alpha, B7-H1(B7 homolog 1), TRAIL(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand), Fas Ligand로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 고효능은 면역 억제능인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 워튼연육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막 및 태반으로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유래된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 체액성 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 자가면역질환은 크론병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 SOCS 발현 억제제는 SOCS 유전자에 특이적인 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), PNA(peptide nucleic acids) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 SOCS 활성 억제제는 SOCS 단백질에 특이적인 항체, 앱타머 및 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 단계 (b)의 바이오마커의 발현수준은 웨스턴 블랏팅, 항체면역침강법, ELISA, 질량분석법, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 측정하는 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된, 면역질환의 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 체액성 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 고효능은 면역억제능인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 워튼연육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 중간엽 줄기세포는 자가, 타가 또는 동종이계 유래인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 중간엽 줄기세포를 함유하는, 면역질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 중간엽 줄기세포를 함유하는, 이식편대숙주질환 치료용 약학 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 중간엽 줄기세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 이식편대숙주질환 등의 면역질환 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 중간엽 줄기세포를 이용한, 이식편대숙주질환 등의 면역질환 치료용도를 제공한다.
본 발명에 의하면, SOCS(suppressor of cytokine signaling)의 발현/활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 특정의 면역억제 바이오마커(IDO, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, PTGES, CXCR4, CXCR7, VCAM1, ICAM1, ICAM2, TNF-alpha, B7-H1, TRAIL, Fas Ligand) 조합이 이식편대숙주병을 포함하는 면역 관련 질환에 있어서 우수한 면역억제능을 가지는 중간엽 줄기세포를 선별하기 위한 바이오마커로써 이용될 수 있음을 제시한다.
따라서, 본 발명은 이식편대숙주병, 자가면역질환을 포함하는 다양한 면역질환의 임상적 치료를 위한, 면역반응 조절능력을 가지는 기능적으로 우수한 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 유용한 방법을 제공할 수 있는 바, 면역질환 치료요법으로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 선별된 중간엽 줄기세포를 이용한 이식편대숙주병의 예방 및 치료는 동종이계 줄기세포 이식의 더 높은 치료적 가능성을 보여준다.
도 1a는, SOCS를 타겟으로 하는 shRNA를 MSC에 처리하여 SOCS 단백질 발현이 억제된 것을 확인한 적색형광염색 결과이다.
도 1b는, SOCS를 타겟으로 하는 shRNA를 MSC에 처리하여 SOCS 단백질 발현이 억제된 것을 확인한 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 2는, SOCS가 하향 조절된 MSC의 면역억제능 특성을 in vivo 이식편대숙주병 동물모델에서 확인한 결과이다.
본 발명은, SOCS(suppressor of cytokine signaling)의 발현 또는 활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 면역억제 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법을 제공한다.
본 발명에서, SOCS 단백질은 사이토카인(cytokine) 신호전달의 음성적 피드백 조절인자(negative feedback regulator) 그룹에 속하며, 자누스 키나아제/신호 전달인자(Janus kinase/signal transducer) 및 전사(JAK/STAT) 경로의 활성인자(activator)들을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다.
상기 SOCS의 종류에 제한은 없으며, 예를 들어, CISH(Cytokine inducible SH2-containing protein), SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS6, SOCS7일 수 있으며, 가장 바람직하게는 SOCS1 또는 SOCS3일 수 있다.
본 발명에서, 면역억제 바이오마커에 제한은 없으나, 예를 들면 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9(C-X-C motif ligand 9), CXCL10(C-X-C motif ligand 10), CXCL11(C-X-C motif ligand 11), CXCL12(C-X-C motif ligand 12), PTGES(Prostaglandin E synthase), CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4), CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7), VCAM1(Vascular Cell Adhesion Molecule 1), ICAM1(Inter Cellular Adhesion Molecule 1), ICAM2(Inter Cellular Adhesion Molecule 2), TNF-alpha, B7-H1(B7 homolog 1), TRAIL(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand), Fas Ligand로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
이때, PTGES(Prostaglandin E synthase)는 PGE2를 합성하는 기능을, VCAM1(Vascular Cell Adhesion Molecule 1)은 세포 결합 기능을, CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7)은 케모카인(chemokine)의 수용체로서 줄기세포를 염증부위로 모집하는 기능을, ICAM1(Inter Cellular Adhesion Molecule 1)은 염증세포 부착과 이동과 관련된 기능을 하는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명의 선별방법은, (a) 중간엽 줄기세포 배양 후 SOCS의 발현 또는 활성 억제제를 처리하는 단계; (b) 상기 SOCS의 발현 또는 활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 면역억제 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 발현수준이 SOCS의 발현 또는 활성 억제제 미처리 대조군과 비교하여 억제되어 있는 경우 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포인 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 (a)와 (b) 사이에 중간엽 줄기세포를 고밀도로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이때 고밀도 배양은 5,000 내지 20,000 cells/cm2의 밀도로 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에서 '고효능'이란 중간엽 줄기세포의 면역 반응 억제능력이 우수하여 면역 관련 질환의 치료에 효과적인 효능을 갖는 것을 의미한다.
본 발명에서 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 다양한 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)이다. 상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막, 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 것으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아, 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며, 그 유래를 제한하지 않는다.
본 발명에서 "면역질환"은 면역 조절 이상에 의해 발생하는 질환이면 제한이 없으나, 예를 들면 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 체액성 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환일 수 있다.
이때, 자가면역질환은 그 종류에 제한이 없으나, 크론병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염일 수 있다.
이때, 알러지성 질환은 그 종류에 제한이 없으나, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기, 소양증, 곤충 알러지, 식품 알러지 또는 약품 알러지일 수 있다.
본 발명에서 SOCS 발현 억제제는 SOCS 유전자/mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 저해하는 것이면 제한이 없으며, 예를 들면 SOCS 유전자/mRNA에 특이적인 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명에서 SOCS 활성 억제제는 SOCS 단백질에 결합/경쟁하여 그 활성을 저해하는 것이면 제한이 없으며, 예를 들면 SOCS 단백질에 특이적인 항체, 앱타머 또는 길항제일 수 있다.
본 발명에서, 바이오마커의 발현수준을 측정하는 방법에 제한은 없으나, 예를 들면 단백질 발현에 대하여는 웨스턴 블랏팅, 항체면역침강법, ELISA, 질량분석법을, mRNA 발현에 대하여는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된, 면역질환의 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포를 제공하며, 상기 중간엽 줄기세포의 유래에 제한은 없으나, 예를 들면 자가, 타가 또는 동종이계 유래일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 중간엽 줄기세포를 함유하는, 면역질환 치료용 약학 조성물/ 약학 제제를 제공한다.
본 발명에서 "약학 조성물"은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다.
상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 "투여량"은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여횟수, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 "약학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 "투여방법"에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 실험 방법
1-1. 인간 조직유래 중간엽줄기세포의 분리 및 배양
본 실험은 삼성의료원의 연구 심사위원회(Institutional Review Board; IRB)의 승인(IRB No. 2011-10-134)을 받았으며, 모든 샘플은 사전 동의를 얻어 수집하였다. 중간엽 줄기세포의 분리는 종래 알려진 방법으로 분리하였다. 분리된 세포들은, 10% FBS(fetal bovine serum, Invitrogen-Gibco) 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen-Gibco)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Invitrogen-Gibco, Rockville, MD) 배지를 이용해 2 × 103 cells/cm2의 밀도로 분주하여, 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
1-2. shRNA 형질감염
SOCS1 발현을 저해하기 위해, 지방조직 유래 중간엽줄기세포(AT-MSC)에 SOCS1 shRNA(short hairpin RNA) 및 적색형광단백질(RFP)을 발현하는 아데노바이러스를 처리하였다. 구체적으로, SOCS1을 타겟으로 하는 shRNA 서열은 인간 U6 프로모터와 TagRFP 마커 유전자 함유 셔틀 벡터(pO6A5-U6-mPGK-TagRFP)에 클로닝되어 pO6A5-U6-shSOCS1-mPGK-TagRFP 발현벡터로 준비하였으며, 셔틀 벡터의 U6-shRNA-SV40-pA 영역은 BAC 벡터에 재조합하여 트랜스퍼하였다. 회수한 재조합 아데노바이러스(Ad5-U6-shSOCS1-mPGK-TagRFP)는 HEK-293세포에서 증식시켰으며, PTD(protein transduction domain)인 HP4는 펩트론사에서 구입하였다. 중간엽줄기세포에 아데노바이러스 파티클을 트랜스펙션하기 위해, HP4 (100 nM)와 함께 아데노바이러스 파티클을 MOI(multiplicity of infection) 100으로 처리하고 실온에서 30분 동안 무혈청 배지에 배양시켰다. 이후, 배양된 세포를 PBS로 헹구고 Ad-RFP-shSOCS1 및 HP4 preparation으로 배양하고, 2시간 후에 세포를 PBS로 헹구어 혈청함유 배지에서 배양시켰다. 선별된 중간엽줄기세포는 RFP(red fluorescent protein)를 통한 형광 관찰 및 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다.
1-3. 면역블롯팅
세포를 차가운 PBS(Gibco-Invitrogen)로 세척하고, 300 μl의 차가운 RIPA 버퍼 [1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate), 및 1% 소듐 디옥시콜레이트를 포함하는 50 mM Tris-HCl, pH 7.5]에서 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)로 용출하였다. 세포 용출액을 4 ℃에서 10분간 3000g로 원심분리한 후, 상층액을 수집하고, 단백질 농도를 BCA 단백질 어세이 키트(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 결정하였다. 전기영동을 위하여, 30 μg의 단백질을 샘플 버퍼 (14.4 mM β-메르캅토에탄올, 25% 글리세롤, 2% SDS, 및 0.1% 브로모페놀 블루를 포함하는 60 mM Tris-HCl, pH 6.8) 내로 용해시키고, 5분간 끓인 뒤, 10% SDS 환원젤 상에서 분리하였다. 분리된 단백질을 a trans-blot system (Gibco-Invitrogen)을 이용하여 PVDF (polyvinylidene difluoride) 막 (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)상으로 이동시켰다. 상기 PVDF 막을 1시간 동안 실온에서 5% 탈지분유(BD Sciences, CA, USA)를 포함하는 TBS(150 mM NaCl을 포함하는 10 mM Tris-HCl, pH 7.5)로 블로킹한 뒤, TBS로 3회 세척하고, 3% 탈지분유를 포함하는 TBST (150 mM NaCl, 및 0.02% Tween-20을 포함하는 10 mM Tris, pH 7.5) 내의 1차 항체 (모든 항체를 1:1000으로 희석)와 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 블롯을 TBST로 3회 세척하고, 1시간 동안 3% 탈지분유를 포함하는 TBST 내의 HRP-융합된 2차 항체(1:2000 또는 1:5000 희석)와 실온에서 인큐베이션하였다. 이를 TBST로 3회 세척 후, 단백질을 ECL 검출 시스템 (Amersham Biosciences)으로 시각화 하였다.
1-4. 이식편대숙주병 ( GVHD ) 동물모델
8-9주령의 NOD/SCID 면역결핍 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)에 300 cGy의 전신조사법을 실시하고 24시간 후 인간 말초혈액단구세포를 정맥 투여하였다. 구체적으로, 각 마우스에 2 × 107개의 인간 말초혈액단구세포를 1 × 106개의 중간엽줄기세포와 함께 투여하였다. 이후 동일한 개수의 중간엽줄기세포를 투여 7일 째에 반복투여 하였다.
실시예 2: 실험 결과
2-1. SOCS의 발현 억제
SOCS1를 타겟으로 하는 shRNA 발현 아데노바이러스를 지방조직 유래 중간엽줄기세포(AT-MSC)에 형질감염(transduction)시킴으로써, MSC에서 SOCS의 발현 억제를 확인하였다. 그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 적색형광단백질(RFP) 표지(도 1a) 및 웨스턴 블랏팅(도 1b) 결과에서 MSC내 SOCS1 단백질 발현이 유의적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
2-2. SOCS 하향 조절된 MSC의 in vivo 면역억제능 평가
상기 실시예 2-1에서 획득한 SOCS 하향 조절된 MSC가 실제 이식편대숙주병(GVHD) 동물모델에서 면역억제능을 발휘하는지 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, shRNA에 의해 SOCS가 하향 조절된 MSC(적색 라인) 처리군은 대조군에 비하여 생존률(면역억제능)을 현저히 증가시킴을 알 수 있었다.
2-3. SOCS 하향 조절된 MSC에서 추가의 면역억제 바이오마커 발굴
중간엽줄기세포의 유전자 발현에 SOCS 발현 억제가 미치는 영향을 알아보기 위해, SOCS 발현 억제제(shRNA) 처리 전후 중간엽줄기세포의 유전자 발현 프로파일을 비교하였다. 그 결과, 처리 전후의 형태 변화에는 현저한 차이가 나타나지 않았으나, 유전자 발현 프로파일에는 많은 차이가 나타난 것을 확인하였다.
실제로, SOCS 발현 억제제(shRNA) 처리된 중간엽줄기세포에서 다양한 유전자 발현이 증가하였고, 이들 중 IDO, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, PTGES, CXCR4, CXCR7, VCAM1, ICAM1, ICAM2, TNF-alpha, B7-H1, TRAIL, Fas Ligand 유전자는 중간엽줄기세포의 면역억제 기능에 관련되어 있는 것을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 이식편대숙주병, 자가면역질환을 포함하는 다양한 면역질환의 임상적 치료를 위한, 면역반응 조절능력을 가지는 기능적으로 우수한 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 유용한 방법을 제공할 수 있는 바, 면역질환 치료요법으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (20)

  1. SOCS(suppressor of cytokine signaling)의 발현 또는 활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 면역억제 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 선별방법:
    (a) 중간엽 줄기세포 배양 후 SOCS의 발현 또는 활성 억제제를 처리하는 단계;
    (b) 상기 SOCS의 발현 또는 활성이 억제된 중간엽 줄기세포에서 면역억제 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 발현수준이 SOCS의 발현 또는 활성 억제제 미처리 대조군과 비교하여 억제되어 있는 경우 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포인 것으로 판정하는 단계.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a)와 (b) 사이에 중간엽 줄기세포를 고밀도 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 면역억제 바이오마커는 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9(C-X-C motif ligand 9), CXCL10(C-X-C motif ligand 10), CXCL11(C-X-C motif ligand 11), CXCL12(C-X-C motif ligand 12), PTGES(Prostaglandin E synthase), CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4), CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7), VCAM1(Vascular Cell Adhesion Molecule 1), ICAM1(Inter Cellular Adhesion Molecule 1), ICAM2(Inter Cellular Adhesion Molecule 2), TNF-alpha, B7-H1(B7 homolog 1), TRAIL(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) 및 Fas Ligand로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 고효능은 면역 억제능인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 워튼연육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막 및 태반으로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는, 선별방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 체액성 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 크론병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  9. 제 2 항에 있어서, 상기 SOCS 발현 억제제는 SOCS 유전자에 특이적인 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), PNA(peptide nucleic acids) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  10. 제 2 항에 있어서, 상기 SOCS 활성 억제제는 SOCS 단백질에 특이적인 항체, 앱타머 및 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  11. 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 바이오마커의 발현수준은 웨스턴 블랏팅, 항체면역침강법, ELISA, 질량분석법, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 측정하는 것임을 특징으로 하는, 선별방법.
  12. 제 1 항의 방법에 의해 선별된, 면역질환의 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 체액성 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환인 것을 특징으로 하는, 고효능 중간엽 줄기세포.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 고효능은 면역억제능인 것을 특징으로 하는, 고효능 중간엽 줄기세포.
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 고효능 중간엽 줄기세포.
  16. 제 12 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 자가, 타가 또는 동종이계 유래인 것을 특징으로 하는, 고효능 중간엽 줄기세포.
  17. 제 12 항의 고효능 중간엽 줄기세포를 함유하는, 면역질환 치료용 약학 조성물.
  18. 제 12 항의 고효능 중간엽 줄기세포를 함유하는, 이식편대숙주질환 치료용 약학 제제.
  19. 제 12 항의 고효능 중간엽 줄기세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료방법.
  20. 제 12 항의 고효능 중간엽 줄기세포의 면역질환 치료용도.
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