ES2875278T3

ES2875278T3 - Célula madre con SOCS suprimido y capacidad inmunosupresora mejorada y uso de la misma

Info

Publication number: ES2875278T3
Application number: ES16864488T
Authority: ES
Inventors: Keon Hee Yoo; Hong Hoe Koo; Myoung Woo Lee; Dae Seong Kim
Original assignee: Cellnlife Inc
Current assignee: Cellnlife Inc
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2021-11-10
Anticipated expiration: 2036-10-31
Also published as: JP6620239B2; KR20170054262A; US20180320178A1; EP3375866A1; JP2018536403A; EP3375866B1; US10961533B2; EP3375866A4

Abstract

Método para inducir la actividad inmunosupresora de una célula madre mesenquimal derivada de ser humano in vitro, comprendiendo el método: (a) inhibir la expresión o actividad de un supresor de la señalización de citoquinas (SOCS) en la célula madre mesenquimal; (b) tratar la célula madre mesenquimal con interferón gamma; y (c) cultivar la célula madre mesenquimal a una densidad de 5.000 células/cm2 a 20.000 células/cm2.

Description

DESCRIPCIÓN

Célula madre con SOCS suprimido y capacidad inmunosupresora mejorada y uso de la misma

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para inducir la actividad inmunosupresora de células madre mediante la inhibición de la expresión o actividad de SOC^s.

Técnica anterior

El trasplante de órganos, tejidos o células puede usarse para salvar la vida de pacientes que padecen una gran variedad de enfermedades. El alotrasplante de órganos humanos, tales como los riñones, el hígado, el corazón, los pulmones y el páncreas, de tejidos humanos, tales como la piel y de células humanas, tales como la médula ósea, es un método para tratar enfermedades intratables, tales como la insuficiencia orgánica terminal y ya se usa de manera generalizada en los hospitales. Además, se ha investigado activamente el xenotrasplante usando como donantes a mamíferos, a excepción de los seres humanos, que es un método que puede sustituirse debido a la falta de donantes para alotrasplantes. En particular, el trasplante de células madre que pueden regenerarse permanentemente y diferenciarse en diversos tipos de células que constituyen el organismo en condiciones adecuadas ha surgido recientemente como una de las terapias de sustitución celular para diversas enfermedades intratables.

Generalmente, el sistema inmunitario de un receptor, que funciona normalmente, reconoce el órgano, el tejido o las células trasplantados como “no propios”, lo que induce una respuesta de rechazo inmunitario a un injerto. Esta respuesta de rechazo inmunitario suele estar mediada por las células T alorreactivas o xenorreactivas presentes en el sistema inmunitario del receptor, que reconocen los aloantígenos o xenoantígenos de los tejidos del donante. Por tanto, para la supervivencia a largo plazo de los aloinjertos o xenoinjertos, éstos deben poder evitar el sistema inmunitario del receptor que reconoce un antígeno extraño o suprimir la respuesta inmunitaria. Para evitar la respuesta inmunitaria del receptor a un injerto, generalmente se administran inmunosupresores a los receptores. Algunos ejemplos representativos de inmunosupresores incluyen, pero no se limitan a, los inhibidores de la calcineurina, tales como la ciclosporina y el tacrólimus (FK-506) y los fármacos antiproliferativos, tales como la azatioprina, la rapamicina, el micofenolato de mofetilo y la ciclofosfamida y estos inmunosupresores se usan actualmente con frecuencia en los alotrasplantes de riñón, hígado, páncreas y corazón.

Estos inmunosupresores deben administrarse a diario y, cuando se interrumpe su administración, suele producirse una respuesta de rechazo inmunitario. Por tanto, estos inmunosupresores deben administrarse durante un largo periodo de tiempo, lo que puede provocar nefrosis tóxica, hepatotoxicidad o hipertensión. Además, estos fármacos no son inmunosupresores específicos que actúan selectivamente sólo sobre las células inmunitarias que responden únicamente a los aloantígenos de un injerto, por lo que pueden provocar efectos secundarios tales como infecciones oportunistas debidas a la inmunosupresión inespecífica o la formación de tumores tales como linfomas. Como otro método de inmunosupresión, existe un método de administración de un anticuerpo monoclonal, tal como OKT3, daclizumab o basiliximab, pero estos anticuerpos monoclonales son inmunosupresores no específicos y presentan problemas tales como infecciones oportunistas o la formación de tumores. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un nuevo método de inmunosupresión que no presente problemas tales como toxicidad debida a los medicamentos, infecciones oportunistas o similares.

Por su parte, las células madre mesenquimales (MSC) humanas pueden derivarse de diversos tejidos y son firmes candidatas para el trasplante celular o el tratamiento de medicina regenerativa.

Las características de las MSC, tales como migración a tejidos dañados, función inmunosupresora, autorrenovación y multipotencia, abren la posibilidad de su aplicación terapéutica. En la actualidad, se han registrado en ClinicalTrials.gov unos 500 ensayos clínicos que incluyen la inyección o el trasplante de MSC. Además, aproximadamente el 20% de los ensayos clínicos están asociados con la capacidad inmunosupresora de las MSC. Aunque se han descubierto las propiedades inmunosupresoras de las MSC y la mayoría de los ensayos clínicos de fase 1 no presentan problemas de estabilidad biológica, los ensayos clínicos posteriores han arrojado malos resultados.

Además, dado que no existe un método o protocolo de cultivo para la estandarización de las MSC, también se ha observado una diversidad fenotípica y funcional en el caso de las MSC aisladas del mismo tejido del mismo receptor. Por tanto, se necesita un método para fomentar o inhibir la función de las MSC impartiendo condiciones específicas.

Divulgación

Problema técnico

Como resultado de haber realizado intensos esfuerzos para desarrollar un método para potenciar la capacidad inmunosupresora de las células madre, los inventores de la presente invención verificaron que la inhibición de la expresión de SOCS en las células madre podía potenciar la capacidad inmunosupresora de las mismas, completando así la presente invención.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para inducir la actividad inmunosupresora de una célula madre a través de la inhibición de la expresión o actividad del supresor de la señalización de citoquinas (SOCS).

Solución técnica

La presente invención se refiere al objeto definido en las reivindicaciones.

Además, se da a conocer una célula madre que tiene una capacidad inmunosupresora en la que se suprime la expresión o actividad de un supresor de la señalización de citoquinas.

A continuación, en el presente documento, la presente invención se describirá con detalle.

En la presente invención, una proteína supresora de la señalización de citoquinas (SOCS) pertenece al grupo de reguladores de retroalimentación negativa de la señalización de citoquinas y se sabe que incluye a la quinasa Janus/transductor de señales y activadores de la ruta JAK/STAT. Además, según un informe reciente, las proteínas SOCS pueden actuar como reguladores negativos de la señalización de los receptores tirosina quinasa (RTK), incluidos los receptores de insulina (IR), el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y KIT.

El tipo de SOCS no está limitado y los ejemplos de SOCS incluyen la proteína que contiene SH2 inducible por citoquinas (CISH), SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, So Cs 6 y SOCS7. Además, lo más preferible es que el SOCS sea SOCS1 o SOCS3.

El término “célula madre”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula indiferenciada que tiene la capacidad de diferenciarse en diversos tejidos corporales y estas células madre pueden clasificarse como células madre totipotentes, células madre pluripotentes y células madre multipotentes.

En la presente invención, la célula madre puede ser una célula madre embrionaria, una célula madre mesenquimal, una célula madre cancerosa o una célula madre pluripotente inducida, dependiendo del origen o tipo de la misma. Además, el término “célula madre mesenquimal (MSC)”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula madre multipotente que tiene la capacidad de diferenciarse en diversas células mesodérmicas, incluyendo hueso, cartílago, adipocitos y células musculares, o células ectodérmicas, tales como células nerviosas. La célula madre mesenquimal puede derivarse, preferiblemente, de una seleccionada del grupo que consiste en cordón umbilical, sangre de cordón umbilical, médula ósea, grasa, músculo, nervios, piel, membranas amnióticas, membranas coriónicas, membranas deciduales y placentas. Además, la célula madre mesenquimal puede derivarse de un ser humano, un embrión o un mamífero excepto un ser humano. El mamífero, excepto un ser humano, puede ser, más preferiblemente, un animal canino, un animal felino, un mono, una vaca, una oveja, un cerdo, un caballo, una rata, un ratón, una cobaya o similares y el origen no está limitado.

En una realización específica de la presente invención, para aumentar la capacidad inmunosupresora de las células madre mesenquimales, se prepararon MSC reguladas por disminución por SOCS1 o SOCS3 usando ARNip y ARNhc para inhibir la expresión de SOCS. Posteriormente, se confirmó que las MSC reguladas por disminución por SOCS no sólo inhibían la proliferación de células T in vitro, sino que también suprimían la inmunidad y, por tanto, aumentaban la tasa de supervivencia en un modelo animal de enfermedad de injerto contra huésped in vivo.

Por consiguiente, se da a conocer una composición para inducir la actividad inmunosupresora de una célula madre, que incluye un inhibidor de la expresión o actividad del supresor de la señalización de citoquinas (SOCS).

El inhibidor de la expresión del supresor de la señalización de citoquinas (SOCS) puede ser un nucleótido antisentido, un ARN de horquilla corta (ARNhc), un ARN de interferencia pequeño (ARNip), ácidos nucleicos peptídicos (ANP), ADNzimas o ribozimas que se unen complementariamente al ARNm que codifica para el supresor de la señalización de citoquinas (SOCS).

Además, el inhibidor de la actividad de SOCS puede ser un compuesto, un péptido, un peptidomimético, un análogo del sustrato, un aptámero, un anticuerpo o un antagonista de SOCS que se une específicamente a SOCS, u otros extractos o compuestos que presentan la actividad inhibidora de SOCS.

Además, se da a conocer una composición para inhibir la inmunidad, que incluye, como principio activo, la célula madre que tiene una capacidad inmunosupresora en la que se suprime la expresión o actividad de un supresor de la señalización de citoquinas (SOCS).

La composición puede estar destinada a la prevención o al tratamiento del rechazo humoral, una enfermedad de injerto contra huésped, el rechazo tras un trasplante de órganos, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad alérgica.

El tipo de enfermedad autoinmunitaria no está limitado, pero puede ser enfermedad de Crohn, eritema, atopia, artritis reumatoide, tiroiditis de Hashimoto, anemia maligna, enfermedad de Edison, diabetes de tipo 1, lupus, síndrome de fatiga crónica, fibromialgia, hipotiroidismo, hipertiroidismo, esclerodermia, enfermedad de Behcet, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, miastenia grave, enfermedad de Meniere, síndrome de Guilian-Barre, síndrome de Sjogren, leucoplasia, endometriosis, psoriasis, esclerodermia sistémica, asma o colitis ulcerosa.

Además, la enfermedad alérgica puede ser anafilaxia, rinitis alérgica, asma, conjuntivitis alérgica, dermatitis alérgica, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, urticaria, prurito, alergias a insectos, alergias alimentarias o alergias a fármacos.

El principio activo incluye una disolución de cultivo de células madre que incluye la célula madre, un concentrado del cultivo o similares.

Cuando la composición se prepara como una composición farmacéutica para inhibir la inmunidad, la composición puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable. El portador farmacéuticamente aceptable, que se usa habitualmente en formulación, puede ser lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio o aceite mineral, pero la presente invención no se limita a los ejemplos anteriores. La composición farmacéutica puede incluir adicionalmente, además de los componentes descritos anteriormente, un lubricante, un agente humectante, un edulcorante, un potenciador del sabor, un agente emulsionante, un agente de suspensión, un conservante o similares.

La composición farmacéutica para inhibir la inmunidad puede administrarse por vía oral o parenteral. Los ejemplos no limitativos de administración parenteral incluyen inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección muscular, inyección intraperitoneal, administración endotelial, administración tópica, administración intranasal, administración intrapulmonar y administración intrarrectal. Tras la administración oral, dado que las proteínas o los péptidos se digieren, una composición oral debe formularse de manera que el fármaco activo esté recubierto o protegido de la digestión en el estómago. Además, la composición puede administrarse mediante un dispositivo arbitrario que puede administrar el principio activo a una célula diana.

Una dosis adecuada de la composición farmacéutica para la inhibición de la inmunidad puede recetarse de manera variada según factores tales como el método de formulación, el método de administración, la edad, el peso corporal, el sexo y las condiciones patológicas de los pacientes, la dieta, el momento de administración, la vía de administración, la velocidad de excreción y la sensibilidad a la reacción. Una dosis adecuada de la composición oscila entre 100 (102) células/kg y 100.000.000 (108) células/kg para un adulto. El término “cantidad farmacéuticamente eficaz”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad suficiente para prevenir o tratar el cáncer o una enfermedad provocada por la angiogénesis.

La composición puede formularse usando un portador farmacéuticamente aceptable y/o un aditivo según un método que puede llevarse a cabo fácilmente por un experto habitual en la técnica, que va a prepararse en forma de dosis unitaria o que va a estar contenida en un recipiente multidosis. A este respecto, la formulación puede ser una disolución en aceite o un medio acuoso, una suspensión, un jarabe, una disolución emulsionante, un extracto, polvo, gránulos, un comprimido o una cápsula y puede incluir, además, un agente dispersante o estabilizante. Además, la composición puede administrarse como agente terapéutico individual o en combinación con otros agentes terapéuticos, y puede administrarse consecutiva o simultáneamente junto con un agente terapéutico convencional. Además, la composición puede administrarse una vez o administrarse adicionalmente según sea necesario.

Además, una realización de la presente invención proporciona un método para inducir la actividad inmunosupresora de una célula madre, incluyendo la inhibición de la expresión o actividad de un supresor de la señalización de citoquinas (SOCS) en la célula madre.

La inhibición de la expresión o actividad del supresor de la señalización de citoquinas (SOCS) puede realizarse mediante un inhibidor de la expresión o actividad de SOCS y su definición es la misma que la descrita anteriormente. Además, la célula madre puede tratarse adicionalmente con interferón gamma (IFN-y).

Tal como se describió anteriormente, tras el tratamiento con interferón gamma en un procedimiento de cultivo celular, en la célula madre, puede aumentarse la expresión de HLA-DRA (complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, cadena DR alfa), CD274 (B7H1, homólogo 1 de B7) indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), molécula de adhesión intercelular 2 (ICAM2), ligando 8 de quimioquina (motivo C-C) (CCL8), ligando 9 de quimioquina (motivo C-X-C) (CXCL9) o ligando 10 de quimioquina (motivo C-X-C) (CXCL10).

Además, la célula madre puede cultivarse a alta densidad y, en este momento, el cultivo a alta densidad puede realizarse a una densidad de 5.000 células/cm2 a 20.000 células/cm2.

Tal como se describió anteriormente, en el caso del cultivo a alta densidad, en la célula madre, puede aumentarse la expresión de la prostaglandina D2 sintasa (PTGDS), de la prostaglandina E sintasa (PTGES), de la proteína de adhesión celular vascular 1 (VCAM1), del receptor de quimioquinas (motivo C-X-C) tipo 7 (CXCR7) o de la proteína de unión a UL161 (ULBP1).

El tratamiento con IFN-y y el cultivo a alta densidad pueden realizarse antes o después del tratamiento con el inhibidor de la expresión o actividad de SOCS. Además, el tratamiento con IFN-y también puede realizarse antes o después del cultivo a alta densidad o durante el cultivo a alta densidad.

Además, el tratamiento con IFN-y puede realizarse inmediatamente antes o uno o dos días antes del trasplante al organismo.

Efectos ventajosos

Según la presente invención, la inhibición de la expresión o actividad del supresor de la señalización de citoquinas (SOCS) puede potenciar la capacidad inmunosupresora de una célula madre. Por consiguiente, la célula madre con una capacidad inmunosupresora potenciada puede ser adecuada para su uso como agente terapéutico celular eficaz en una enfermedad autoinmunitaria, un rechazo de trasplante de órganos o una enfermedad alérgica.

Descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra los resultados de la verificación in vitro de la capacidad inmunosupresora de las células madre mesenquimales (MSC) reguladas por disminución por SOCS.

La figura 2 ilustra los resultados de la tinción fluorescente roja (A) y los resultados de transferencia de tipo Western (B) de la verificación de que se inhibió la expresión de la proteína SOCS en las MSC tratadas con ARNhc que selecciona como diana un SOCS.

La figura 3 ilustra los resultados de la verificación de la capacidad inmunosupresora de las MSC reguladas por disminución por SOCS en un modelo animal de enfermedad de injerto contra huésped in vivo.

La figura 4 ilustra los resultados de la verificación de los niveles de expresión de SOCS en las MSC tratadas con IFN-y.

La figura 5 ilustra los resultados de la evaluación comparativa de una diferencia en la capacidad inmunosupresora entre las MSC reguladas por disminución por SOCS y las MSC reguladas por disminución por SOCS tratadas además con IFN-y en un modelo animal de enfermedad de injerto contra huésped (EICH) in vivo.

La figura 6 ilustra los resultados de la verificación de un aumento en la expresión de PTGES, que es un gen marcador inmunosupresor, cuando las MSC se cultivaron a alta densidad.

La figura 7 ilustra los resultados de la verificación de un aumento en la expresión de CXCR7, que es un gen marcador inmunosupresor, cuando las MSC se cultivaron a alta densidad.

Mejor modo

A continuación, en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: método experimental

1-1. Aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales derivadas de tejidos humanos

El presente experimento fue aprobado (IRB 2011-10-134) por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Centro Médico Samsung y todas las muestras se recogieron con el consentimiento previo. El aislamiento de las células madre mesenquimales se llevó a cabo mediante un método conocido convencionalmente. Las células aisladas se dispensaron a una densidad de 2 * 103 células/cm2 usando medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen-Gibco, Rockville, MD) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS, Invitrogen-Gibco) y penicilina/estreptomicina 100 U/ml (Invitrogen-Gibco), y se incubaron a 37°C bajo el 5% de CO².

1-2. Transfección de ARNip

Las MCS se sembraron 24 horas antes de la transfección de ARNip para obtener un 50% de confluencia el día de la transfección. Las células se transfectaron con el reactivo Lipofectamine 2000 (Gibco-Invitrogen, Rockville, MD) según las instrucciones del fabricante.

Brevemente, las células se trataron con un complejo de ARNip-Lipofectamine 2000 y se incubaron en una incubadora de CO²a 37°C durante 18 horas. Posteriormente, el medio se sustituyó por un medio de cultivo recién preparado (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con bajo contenido en glucosa que contenía FBS al 10% (Invitrogen-Gibco) y penicilina/estreptomicina 100 U/ml (Invitrogen-Gibco)) y luego se incubaron adicionalmente las células transfectadas durante de 0 horas a 24 horas hasta que el gen diana se reguló por disminución eficazmente. El ARNip y el ARNip aleatorizado (sc-37007), que seleccionan como diana cada uno de SOCS1 (sc-40996) y SOCS3 (sc-41000), se adquirieron ambos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

1-3. Transfección de ARNhc

Para inhibir la expresión de SOCS1, se trataron células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AT-MSC) con ARN de horquilla corta (ARNhc) de SOCS1 y un adenovirus que expresa la proteína roja fluorescente (RFP). En particular, se clonó una secuencia de ARNhc que selecciona como diana SOCS1 en un vector lanzadera (pO6A5-U6-mPGK-TagRFP) que contenía un promotor U6 humano y un gen marcador TagRFP para construir el vector de expresión pO6A5-U6-shSOCS1-mPGK-TagRFP y la región U6-ARNhc-SV40-pA del vector lanzadera se transfirió a un vector BAC por recombinación. El adenovirus recombinante recuperado (Ad5-U6-shSOCS1-mPGK-TagRFP) se hizo proliferar en células HEK-293 y el HP4, que es un dominio de transducción de proteínas (PTD), se adquirió de Peptron Corporation. Para transfectar las células madre mesenquimales con partículas de adenovirus, se trataron las partículas de adenovirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 junto con HP4 (100 nM) y se incubaron en un medio libre de suero a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, las células cultivadas se aclararon con PBS y se incubaron con Ad-RFP-shSOCS1 y la preparación de HP4, y después de 2 horas, las células se aclararon con PBS y se incubaron en un medio que contenía suero. Las células madre mesenquimales seleccionadas se identificaron mediante la observación de la fluorescencia a través de una proteína roja fluorescente (RFP) y mediante transferencia de tipo Western.

1.4. Inmunotransferencia (transferencia de tipo Western)

Las células se lavaron con PBS frío (Gibco-Invitrogen) y se eluyeron con un cóctel de inhibidores de proteasas (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) en 300 |il de un tampón RIPA frío [Tris-HCl 50 mM que contenía Triton X-100 al 1%, NaCl 150 mM, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% y dioxicolato de sodio al 1%, pH 7,5]. El eluido celular se centrifugó a 3.000 g x a 4°C durante 10 minutos. Se recogió el sobrenadante y se determinó la concentración de proteínas mediante un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific). Para la electroforesis, se lisaron 30 |ig de proteínas en un tampón de muestra (Tris-HCl 60 mM que contenía betamercaptoetanol 14,4 mM, glicerol al 25%, SDS al 2% y azul de bromofenol al 0,1%, pH 6,8), se hirvieron durante 5 minutos y después se separaron en un gel reductor de SDS al 10%. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, RU) usando un sistema Trans-Blot (Gibco-Invitrogen). La membrana de PVDF se bloqueó con TBS (Tris-HCl 10 mM que contenía NaCl 150 mM, pH 7,5) que contenía leche desnatada en polvo al 5% (BD Sciences, CA, EE.UU.) a temperatura ambiente durante 1 hora y, a continuación, se lavó tres veces con TBS y se incubó con anticuerpos primarios (todos los anticuerpos diluidos 1:1000) en TBST (Tris 10 mM que contenía NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,02%, pH 7,5) que contenía leche desnatada en polvo al 3% a 4°C durante la noche. Al día siguiente, la transferencia se lavó tres veces con TBST y se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (diluidos 1:2.000 o 1:5.000) en TBST que contenía leche desnatada en polvo al 3% a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con TBST, las proteínas se visualizaron con un sistema de detección ECL (Amersham Biosciences).

1-5. Tinción inmunocitoquímica

Las células madre mesenquimales se trataron con formaldehído al 4%, que es una disolución fijadora y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos en un estado de bloqueo de la luz, seguido de lavado tres veces con PBS. Para detectar las proteínas (PTGES, CXCR7) expresadas en las células, las células se trataron con Triton X-100 al 0,25% y se dejaron reaccionar en estado de bloqueo de la luz a temperatura ambiente durante 5 minutos para potenciar la permeabilidad celular. Posteriormente, las células se lavaron de nuevo tres veces y se trataron con una disolución de bloqueo de FBS al 5% para permitir que se produjera la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavaron de nuevo, se trataron con anticuerpos primarios adquiridos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) y después se dejaron reaccionar adicionalmente a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, volvieron a aclararse las células tres veces, se trataron con anticuerpos secundarios de cabra anti-IgG de ratón conjugados con Alexa Fluor®488 (Invitrogen-Gibco), para permitir que se produjera la reacción a temperatura ambiente, durante 1 hora, y luego se adquirieron imágenes de las células usando un sistema de microscopio confocal Carl Zeiss LSM 700 (Jena, Alemania).

1-6. Ensayo de proliferación de células T (ensayo de incorporación de BrdU)

Las MSC se sembraron a una densidad de 1,25 * 104 células/ml en DMEM con alto contenido en glucosa complementado con FBS al 10% en una placa de 96 pocillos. Después de 24 horas, se añadieron 10 |ig/ml de mitomicina-C (Sigma-Aldrich) para inhibir la proliferación celular. Las células tratadas se incubaron a 37°C durante 2 horas más y luego se aclararon cinco veces con un medio de cultivo. Posteriormente, se separaron 1 * 105 células mononucleares de sangre periférica humana (hPBMC) mediante centrifugación en gradiente y se añadieron a cada pocillo para fomentar la proliferación de células T con 1 |ig/ml de fitohemaglutinina (PHA, Sigma-Aldrich). A continuación, las hPBMC activadas por PHA se incubaron sobre MSC con condiciones mutuamente diferentes durante 3 ó 4 días antes de añadir 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU). Los niveles de crecimiento se midieron después de 18 horas usando un kit de ensayo disponible de Roche Applied Science (Mannheim, Alemania).

1-7. Modelo animal de enfermedad de injerto contra huésped (EICH)

Se sometieron ratones inmunodeficientes NOD/SCID de 8 a 9 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) a una irradiación corporal total de 300 cGy y, después de 24 horas, se les administraron por vía intravenosa, células mononucleares de sangre periférica humana. Específicamente, se administraron 2 * 107 células mononucleares de sangre periférica humana a cada ratón junto con 1 * 106 células madre mesenquimales. Posteriormente, el mismo número de células madre mesenquimales se administró repetidamente a cada ratón el día 7 de la administración.

Ejemplo 1: evaluación de la capacidad inmunosupresora in vitro de las MSC reguladas por disminución por SOCS Para suprimir un SOCS en las MSC, se inhibió la expresión de SOCS1 o SOCS3 usando ARNip. Como resultado, tal como se ilustra en la figura 1A, se confirmó que la expresión de SOCS1 o SOCS3 se inhibió significativamente en las respectivas MSC.

Además, las MSC inhibidas por SOCS se incubaron con hPBMC inducidas por PHA y la actividad proliferativa de las mismas se confirmó mediante el porcentaje de células BrdU+. Como resultado, tal como se ilustra en la figura 1B, se confirmó que las MSC tratadas con ARNip de SOCS1 o ARNip de SOCS3 inhibían significativamente la proliferación celular de las hPBMC.

Ejemplo 2: evaluación de la capacidad inmunosupresora in vivo de las MSC reguladas por disminución por SOCS Se transdujo un adenovirus que expresa ARNhc que selecciona como diana SOCS1 en células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AT-MSC) para identificar la inhibición de la expresión de SOCS en las MSC. Como resultado, tal como se ilustra en la figura 2, a partir de los resultados del marcaje con la proteína roja fluorescente (RFP) (A) y de los resultados de la transferencia de tipo Western (B), se confirmó que la expresión de la proteína SOCS1 en las MSC se inhibía significativamente.

Además, se examinó si las MSC reguladas por disminución por SOCS mostraban una capacidad inmunosupresora en un modelo animal de enfermedad de injerto contra huésped (EICH) real. Como resultado, tal como se ilustra en la figura 3, se confirmó que un grupo tratado con MSC (línea roja) en el que el SOCS se había regulado por disminución por ARNhc aumentaba significativamente la tasa de supervivencia (capacidad inmunosupresora) en comparación con un control.

Ejemplo 3: nivel de expresión de SOCS en MSC tratadas con IFN-y

Para potenciar la capacidad inmunosupresora, las MSC se trataron con IFN-y y, a continuación, se analizó la expresión de un supresor de la señalización de citoquinas (SOCS) mediante inmunotransferencia.

Como resultado, tal como se ilustra en la figura 4, se confirmó que la expresión de SOCS (SOCS1 y SOCS3), que se sabe que regula una señal de citoquinas, tal como IFN-y, cambiaba con el tiempo. Esto significa que la expresión de un SOCS cambia para regular la señal por IFN-y.

Ejemplo 4: evaluación de la capacidad inmunosupresora tras el tratamiento de MSC reguladas por disminución por SOCS con IFN-y

La capacidad inmunosupresora de las MSC reguladas por disminución por SOCS obtenidas en el ejemplo 2 se evaluó por comparación con la capacidad inmunosupresora de las MSC reguladas por disminución por SOCS tratadas además con IFN-y en un modelo animal de enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) in vivo.

Como resultado, tal como se ilustra en la figura 5, se confirmó que, en comparación con el grupo tratado con MSC (línea azul) en el que el SOCS se había regulado por disminución por ARNhc, el grupo tratado con MSC reguladas por disminución por SOCS (línea roja) tratado adicionalmente con IFN-y aumentó significativamente la tasa de supervivencia (capacidad inmunosupresora).

Ejemplo 5: verificación del aumento en la expresión génica inmunosupresora en las MSC cultivadas a alta densidad Se evaluó si la capacidad inmunosupresora se potenciaba adicionalmente mediante el cultivo a alta densidad, confirmando un aumento en la expresión de los genes de la prostaglandina E sintasa (PTGES) y del receptor de quimioquinas (motivo C-X-C) tipo 7 (CXCR7) cuando las MSC se cultivaban a alta densidad (5.000 células/cm2). 5.1. Verificación del aumento en la expresión de PTGES

Como resultado de realizar transferencia de tipo Western (A) y tinción inmunocitoquímica (B) usando anticuerpos específicos para PTGES, tal como se ilustra en la figura 6, se confirmó que la expresión de la proteína PTGES aumentó significativamente durante el cultivo a alta densidad (5.000 células/cm2) en comparación con el cultivo a baja densidad (200 células/cm2).

5-2. Verificación del aumento en la expresión de CXCR7

Como resultado de realizar transferencia de tipo Western (A) y tinción inmunocitoquímica (B) usando anticuerpos específicos para CXCR7, tal como se ilustra en la figura 7, se confirmó que la expresión de la proteína CXCR7 aumentó significativamente durante el cultivo a alta densidad (5.000 células/cm2) en comparación con el cultivo a baja densidad (200 células/cm2).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para inducir la actividad inmunosupresora de una célula madre mesenquimal derivada de ser humano in vitro, comprendiendo el método:

(a) inhibir la expresión o actividad de un supresor de la señalización de citoquinas (SOCS) en la célula madre mesenquimal;

(b) tratar la célula madre mesenquimal con interferón gamma; y

(c) cultivar la célula madre mesenquimal a una densidad de 5.000 células/cm2 a 20.000 células/cm2.

2. Método in vitro para fabricar una célula madre mesenquimal derivada de ser humano con la actividad inmunosupresora inducida, que comprende realizar las etapas del método según la reivindicación 1.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la célula madre mesenquimal se deriva de una seleccionada del grupo que consiste en cordón umbilical, sangre de cordón umbilical, médula ósea, grasa, músculo, nervios, piel, membranas amnióticas, membranas coriónicas, membranas deciduales y placentas.