CN113164770A - 间充质干细胞、免疫疾病治疗剂和抗炎症剂 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于，提供新颖治疗剂、即新颖的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂。用于解决上述课题的本发明为一种间充质干细胞，其特征在于，犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高。另外，本发明还包括：一种间充质干细胞，其特征在于，在利用IFNγ处理而在细胞内诱导的IDO作用下由色氨酸合成的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高；以及，一种间充质干细胞，其特征在于，JAK/STAT通路在稳定状态下亢进。

Description

间充质干细胞、免疫疾病治疗剂和抗炎症剂

技术领域

本发明涉及间充质干细胞、免疫疾病治疗剂和抗炎症剂。

背景技术

免疫缺陷疾病系由于免疫系统无法正常工作而发生感染症、或多次复发、或症状加重、或长期持续。若患有免疫缺陷疾病，则保护身体免受细菌、病毒、真菌等外敌的入侵、免受癌细胞那样的异常细胞的攻击的免疫系统的能力受损。其结果，会出现如果免疫功能正常则不会患有的由细菌、病毒、真菌所致的感染症、癌症。

免疫缺陷疾病中，有在出生时就已患上的先天性(原发性)的免疫缺陷疾病、及之后由于某种疾病等而发病的后天性(继发性)的免疫缺陷疾病。后天性免疫缺陷病大多数情况是由长期的严重疾病而导致的，作为这样的严重疾病，可示例出癌症、再生障碍性贫血、白血病、骨髓纤维化、肾功能衰竭、糖尿病、肝病、脾病等。

另外，随着年龄增长，免疫系统也会衰弱，逐渐变得无法区分自身和异物，其结果，变得容易发生自身免疫性疾病。自身免疫性疾病有各种，各种细胞、组织成为攻击的对象。针对这样的自身免疫性疾病，一般通过抑制免疫来调节自身免疫反应等来进行治疗。然而，用于抑制自身免疫反应的药物大多也妨碍身体对感染症等的抵抗能力，因此期望开发出仅具有自身免疫调节作用的新颖治疗药。

间充质干细胞是1982年由Friedenstein首次从骨髓分离出的具有多分化能力的祖细胞(参照非专利文献1)。已经明确的是间充质干细胞存在于骨髓、脐带、脂肪等各种各样的组织中，间充质干细胞移植有望成为针对各种难治性疾病的新颖治疗方法(参照专利文献1～2)。最近获知，在脂肪组织、胎盘、脐带、卵膜等的基质细胞中存在具有同等功能的细胞。因此，有时也将间充质干细胞称为基质细胞(Mesenchymal Stromal Cell，间充质基质细胞)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-157263号公报

专利文献2：日本特表2012-508733号公报

非专利文献

非专利文献1：Pittenger F.M.et al.Science，(1999)，284，pp.143-147

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于，在上述那样的情况下，提供新颖治疗剂、即新颖的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂。

用于解决问题的方案

为了解决上述课题，本发明人等进行了深入研究后发现：以犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高为特征的间充质干细胞(mesenchymal stem(stromal)cell；MSC)对于免疫疾病和炎症性疾病的治疗是有效的，从而完成了本发明。根据本发明，可以提供对于治疗免疫疾病和炎症性疾病有效的治疗剂。即本发明的主旨如下所述。

[1]一种间充质干细胞，其特征在于，犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高。

[2]一种间充质干细胞，其特征在于，在利用IFNγ处理而在细胞内诱导的IDO作用下由色氨酸合成的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高。

[3]一种间充质干细胞，其特征在于，JAK/STAT通路在常规稳定状态下被激活。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的间充质干细胞，其源自脐带组织。

[5]一种免疫疾病治疗剂，其含有[1]至[4]中任一项所述的间充质干细胞。

[6]一种抗炎症剂，其含有[1]至[4]中任一项所述的间充质干细胞。

[7]一种GVHD治疗剂，其含有[1]至[4]中任一项所述的间充质干细胞。

[8]一种免疫疾病的治疗方法，其特征在于，使用犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞。

[9]一种免疫疾病的治疗方法，其特征在于，使用下述间充质干细胞：在利用IFNγ处理而在细胞内诱导的IDO作用下由色氨酸合成的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞。

[10]一种免疫疾病的治疗方法，其特征在于，使用JAK/STAT通路在稳定状态下被激活的间充质干细胞。

[11]根据[8]至[10]中任一项所述的免疫疾病的治疗方法，其中，上述间充质干细胞源自脐带组织。

[12]一种炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，使用犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞。

[13]一种炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，使用下述间充质干细胞：在利用IFNγ处理而在细胞内诱导的IDO作用下由色氨酸合成的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞。

[14]一种炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，使用JAK/STAT通路在稳定状态下被激活的间充质干细胞。

[15]根据[12]至[14]中任一项所述的炎症性疾病的治疗方法，其中，上述间充质干细胞源自脐带组织。

[16]一种GVHD的治疗方法，其特征在于，使用犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞。

[17]一种GVHD的治疗方法，其特征在于，使用下述间充质干细胞：在利用IFNγ处理而在细胞内诱导的IDO作用下由色氨酸合成的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞。

[18]一种GVHD的治疗方法，其特征在于，使用JAK/STAT通路在稳定状态下被激活的间充质干细胞。

[19]根据[16]至[18]中任一项所述的GVHD的治疗方法，其中，上述间充质干细胞源自脐带组织。

发明的效果

根据本发明，可以提供新颖的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂、以及新颖的免疫疾病的治疗方法和炎症性疾病的治疗方法。

附图说明

图1是示出间充质干细胞的平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的细胞内犬尿氨酸量的比较的图。

图2是示出间充质干细胞的平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的培养上清液中的犬尿氨酸量的比较的图。

图3是示出间充质干细胞的平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的培养上清液中的犬尿氨酸量(IDO活性)的比较的图。

图4是示出间充质干细胞的平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的培养上清液中的犬尿氨酸量(IDO活性)的比较的图。

图5是示出间充质干细胞的平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的培养上清液中的犬尿氨酸量(IDO活性)的比较的图。

图6是示出间充质干细胞的平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的培养上清液中的犬尿氨酸量(IDO活性)的比较的图。

图7是示出间充质干细胞的平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的培养上清液中的犬尿氨酸量(IDO活性)的比较的图。

图8是示出平面培养细胞培养上清液中的犬尿氨酸量(IDO活性)的比较的图。

图9是示出间充质干细胞的平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的基于微阵列的基因表达解析结果(SUS中的表达量相对于ADH中的表达量的比)的图。

图10是示出UC-MSC(EXP-SUS)在GVHD模型小鼠中的给药效果的图。

图11是示出UC-MSC(EXP-SUS)在GVHD模型小鼠中的给药效果的图。

图12是示出间充质干细胞的平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的抗炎症效果的图。

图13是示出JAK/STAT信号通路的图。

具体实施方式

以下对本发明的间充质干细胞、免疫疾病治疗剂和抗炎症剂进行详细地说明。

[间充质干细胞]

本发明的间充质干细胞的特征在于，犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高。

犬尿氨酸(Kynurenine)是在细胞内由色氨酸合成烟酸时由吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase：IDO)这种酶产生的代谢产物。已知：色氨酸对于T细胞的增殖是重要的，IDO活性会将色氨酸转化为犬尿氨酸而使其耗尽，从而抑制T细胞的增殖并引起免疫耐受。

犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量是指：在炎症状态下，在利用TNFα、IFNγ处理而诱导的吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)作用下在细胞内由色氨酸合成后被释放至细胞外的犬尿氨酸量。

本发明的间充质干细胞只要与其它细胞相比高表达犬尿氨酸即可，具体而言，本发明的间充质干细胞的、在利用IFNγ处理而在细胞内诱导的IDO作用下由色氨酸合成的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高即可。

与在使用了现有的培养基(例如，含10％血清的MEMα培养基)的培养中得到的间充质干细胞相比，本发明的间充质干细胞只要高表达犬尿氨酸即可，与在使用了含10％血清的MEMα培养基的培养条件下得到的间充质干细胞相比，犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量优选高1.1倍以上、更优选高1.2倍以上、进一步优选高1.5倍以上为宜。

另外，本发明的间充质干细胞与其它细胞相比高表达犬尿氨酸即可，例如，与MRC-5细胞、人新生儿来源皮肤成纤维细胞(HDF)或人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)相比高表达犬尿氨酸即可，与MRC-5细胞、HDF或HUVEC相比，犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量优选高5倍以上、更优选高10倍以上为宜。

例如，与利用现有的培养方法(例如，基于平面培养法的培养)得到的间充质干细胞相比高表达犬尿氨酸即可，与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比，犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量优选高2倍以上、更优选高5倍以上、进一步优选高10倍以上、特别优选高100倍以上为宜。需要说明的是，平面培养法通过使细胞附着于烧瓶、培养皿这样的平面而进行的静置培养来进行培养即可，对容器、培养基等没有特别限定。

需要说明的是，上述犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高包括参与犬尿氨酸合成的IDO高表达或活性高。对于IDO高表达或活性高而言，也与上述同样地进行规定，本发明的间充质干细胞只要与利用现有的培养基(例如，含10％FBS的MEM-α培养基)进行的培养中得到的间充质干细胞相比高表达IDO和/或IDO活性高即可。与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比，IDO高表达和/或活性亢进优选高1.1倍以上、更优选高1.2倍以上、进一步优选高1.5倍以上。

与其它细胞、例如MRC-5细胞、人新生儿来源皮肤成纤维细胞(HDF)、人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)相比，本发明的间充质干细胞的IDO高表达和/或活性亢进。与MRC-5细胞、HDF或HUVEC相比，IDO高表达或活性高，与MRC-5细胞、HDF或HUVEC相比，IDO高表达和/或活性亢进优选高5倍以上、更优选高10倍以上。

与利用现有的培养方法(例如，基于平面培养法的培养)得到的间充质干细胞相比，本发明的间充质干细胞的IDO高表达和/或活性亢进。与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比，IDO高表达和/或活性亢进优选高2倍以上、更优选为5倍以上、进一步优选为10倍以上、特别优选为100倍以上。

已知IDO是通过Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)信号通路而诱导的。已知该JAK/STAT信号通路是由各种细胞因子、生长因子诱发，并参与细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、细胞的存活等的各种作用。

本发明的间充质干细胞的特征在于，除了犬尿氨酸以外还高表达以下所列举的因子。

本发明的间充质干细胞高表达CSF3、CSF2、LIF、IL6、IL6R或STAT4。集落刺激因子3(CSF3)是参与粒细胞的产生、分化的细胞因子。集落刺激因子2(CSF2)是参与粒细胞、巨噬细胞的产生、分化的细胞因子。白血病抑制因子(LIF)是在造血系统、神经系统的细胞分化诱导、肾发育中控制上皮间质转化、母体-胎儿之间的免疫耐受中发挥重要作用的细胞因子。白细胞介素6(IL6)是在各种炎症条件下、在B细胞的成熟中具有各种功能的细胞因子。白细胞介素6受体(IL6R)是IL6的受体。信号传导和转录激活因子4(STAT4)响应细胞因子、生长因子而作为转录因子发挥作用。已知在淋巴细胞中的对IL12的应答、辅助T细胞的分化中起到重要的作用。

进而，本发明的间充质干细胞高表达以下的因子。

睫状神经营养因子受体、生长激素受体、Cbl原癌基因B、E3泛素蛋白连接酶、白细胞介素15、白细胞介素6信号转导子、白细胞介素10、心肌营养素样细胞因子1、细胞周期蛋白D2、白细胞介素11受体α、白细胞介素15受体α、Pim-1原癌基因、丝氨酸/苏氨酸激酶、细胞因子信号转导抑制因子1、信号传导和转录激活因子2,113kDa、白细胞介素19、白细胞介素7、白细胞介素24、白细胞介素22受体α1、细胞因子信号转导抑制因子3、詹纳斯(Janus)激酶2、干扰素(α、β和ω)受体1、干扰素(α、β和ω)受体2、干扰素γ受体2(干扰素γ转导子1)、催乳素、白血病抑制因子受体α、快速发育生长因子同源蛋白2(果蝇)、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物3、白细胞介素4受体、白细胞介素2受体α、七子同源蛋白1(果蝇)(son ofsevenless homolog 1(Drosophila))、瘦素受体、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物3、白细胞介素24、生长激素1、白细胞介素7受体、磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基δ、白细胞介素21和激活STAT蛋白抑制因子4；已知这些因子对于JAK/STAT通路的构成、诱导是重要的。本发明的间充质干细胞中，JAK/STAT通路在稳定状态下被激活，这些因子被高表达。这些因子通常在JAK/STAT通路中具有图13所示的位置关系。

本发明中，间充质干细胞是指：具有分化为属于间充质的一种以上细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等)的分化能力，并能够在维持该能力的状态下增殖的细胞。本发明中使用的间充质干细胞的术语是指与基质细胞相同的细胞，不对两者进行特别区分。另外，还有时简记为间充质类细胞。作为包含间充质干细胞的组织，可列举例如：脂肪组织、脐带、骨髓、脐带血、子宫内膜、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周组织、牙髓、牙胚等。例如脂肪组织来源间充质干细胞是指脂肪组织中含有的间充质干细胞，还可称为脂肪组织来源基质细胞。其中，从对神经病变疾病的治疗有效性的观点、获得容易性的观点等出发，优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、牙髄来源间充质干细胞，更优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞，最优选脐带来源间充质干细胞。

本发明中的间充质干细胞可以是与被处置的对象(被检体)为同种来源或异种来源。作为本发明中的间充质干细胞的种属，可列举出：人、马、牛、绵羊、猪、狗、猫、兔子、小鼠、大鼠，优选为与被处置的对象(被检体)为同种来源细胞。本发明中的间充质干细胞可以源自被处置的对象(被检体)、即为自体细胞，或可以源自同种的其它对象、即为异体细胞。优选为异体细胞。

由于间充质干细胞对于同种异体的被检体也不易发生排斥反应，因此可以使用对预先制备的供体的细胞进行扩大培养并冷冻保存后的细胞，作为本发明的疾病治疗剂中的间充质干细胞。因此，与制备自身的间充质干细胞来使用的情况相比，商品化容易且容易稳定地得到一定效果，从这样的观点出发，本发明中的间充质干细胞更优选为同种异体。

本发明中，间充质干细胞是指：包含间充质干细胞的任意的细胞群。该细胞群的至少20％以上，优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为间充质干细胞。

本发明中，脐带是连接胎儿和胎盘的白色的管状组织，由脐带静脉、脐带动脉、胶状组织(华顿氏胶；Wharton’s Jelly)、脐带基质本身等构成，富含间充质干细胞。脐带优选从与使用本发明的疾病治疗剂的被检体(给药对象)为同种的动物获得，考虑到将本发明的疾病治疗剂对人给药，更优选为人的脐带。

本发明中，脂肪组织是指：含有脂肪细胞和包含微血管细胞等的基质细胞的组织，例如，是将哺乳动物的皮下脂肪手术切除或吸取哺乳动物的皮下脂肪而得到的组织。脂肪组织可以由皮下脂肪获得。优选从与后述的脂肪组织来源间充质干细胞的给药对象为同种的动物获得，考虑到对人给药，更优选为人的皮下脂肪。皮下脂肪的供给个体可以是存活或死亡的，但本发明中使用的脂肪组织优选为从存活个体采集的组织。从个体采集时，吸脂例如可示例出：PAL(动力辅助)吸脂、Erchonia激光吸脂或Body-jet吸脂等，从维持细胞的状态这样的观点出发，优选不使用超声波。

本发明中，骨髓是指填充骨的内腔的实质组织(parenchyma)，为造血器官。骨髓中存在骨髓液，将存在于其中的细胞称为骨髓细胞。骨髓细胞中除了红细胞、粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞等之外还包含间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮祖细胞等。骨髓细胞例如可以由人髂骨、长骨或其它骨采集。

本发明中，所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞之类的各组织来源间充质干细胞是指：分别包含脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞之类的各组织来源间充质干细胞的任意的细胞群。该细胞群的至少20％以上，优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞之类的各组织来源间充质干细胞。

本发明中的间充质干细胞除了犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高之外，例如还可以利用生长特征(例如，从传代至老化为止的群体的倍增能力、倍增时间)、核型分析(例如，正常的核型、母体系统或新生儿系统)、通过流式细胞仪(例如，FACS分析)进行的表面标记物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列；逆转录PCR、实时PCR、传统型PCR等聚合酶链式反应)、miRNA表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如，血浆凝血解析、ELISA、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢组学解析)、本领域中已知的其它方法等进行表征。

(间充质干细胞的制备方法)

犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞的制备方法没有特别限定，例如可以如下方式进行制备。即，可以从脂肪、脐带、骨髓等组织中依据本领域技术人员公知的方法分离间充质干细胞并进行培养，以IDO表达为指标利用细胞分选仪、磁珠等分离、获得犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的细胞。另外，通过使用了特定的培养基的培养，也可以获得间充质干细胞中的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞。优选在该通过诱导而得到的细胞群中细胞群的50％以上为犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的细胞，更优选70％以上为犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的细胞，进一步优选80％以上为犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的细胞，特别优选90％以上为犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的细胞，最优选实质上为犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的细胞的均匀的细胞群。以下对犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞的制备方法进行具体地说明。

间充质干细胞可以通过本领域技术人员公知的方法来制备。以下对脐带组织来源间充质干细胞和脂肪组织来源间充质干细胞的制备方法进行说明，来作为一个例子。

可以通过从经阴分娩和剖宫产而娩出的、包括胎盘和脐带在内的产褥组织中适宜地去除胎盘而回收脐带。由所回收的脐带去除脐带血后，可以进行无菌或抗菌处理。脐带血的去除可通过用含有肝素的溶液等抗凝固溶液冲洗来进行。无菌或抗菌处理没有特别限定，可以涂布聚维酮碘或在添加了青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素等中的1种以上抗生素和/或抗真菌剂的培养基或缓冲液中进行浸渍。另外，根据需要，还可以包括选择性地溶解红细胞的工序。作为选择性溶解红细胞的方法，可以使用本技术领域中公知的方法，例如在利用氯化铵来实现溶解的高渗培养基或低渗培养基中进行孵育等。

本发明的脐带来源细胞是指将脐带作为原材料而制得的细胞群，可以利用公知的制造方法而得到，例如可以利用包括以下的工序(i)～(iii)的方法制造：

(i)切断脐带的工序；

(ii)培养(i)的工序中得到的脐带的工序；以及

(iii)进行传代的工序。

另外，作为此外的该细胞的制备方法，还可以包括(i')通过对脐带进行酶处理来分离组织的工序来代替(i)切断脐带的工序。进而，可以在(i)切断脐带的工序的基础上还包括(i')通过对脐带进行酶处理来分离组织的工序。

本发明的(i)切断脐带的工序中，可以通过将利用上述的方法获得的脐带在包含羊膜、血管、血管周围组织和华顿氏胶的状态下利用机械力(切碎力或剪切力)进行切断来进行。虽然没有特别限定，但通过切断而得到的脐带切片可示例出1至10mm³、1至5mm³、1至4mm³、1至3mm³或1至2mm³的大小。可以通过在包含羊膜、血管、血管周围组织和华顿氏胶的状态下对利用上述方法获得的脐带进行酶处理来分离组织的工序，来进行本发明的(i')通过对脐带进行酶处理来分离组织的工序。虽没有特别限定，但酶处理可示例出使用了胶原酶、分散酶和透明质酸酶等中的1种或2种以上的酶的酶处理。

本发明的(ii)培养(i)的工序中得到的脐带的工序中，使用适合的细胞培养基在适合的细胞密度和培养条件下培养(i)的工序中得到的脐带。

本发明的脐带组织来源间充质干细胞可以利用悬浮培养制造法来制造。作为悬浮培养制造法，有如下方法：将利用任意的方法形成的球体状的细胞团块在培养容器内进行搅拌培养的方法；使细胞粘附于微载体上并搅拌微载体，由此在培养槽内进行搅拌培养的方法等。需要说明的是，搅拌有如下方法：用搅拌器旋转容器内的搅拌叶片的方法；将装有培养液和细胞的袋子放在摇床上连同袋子一起摇动，由此使培养液呈悬浮状态的方法等。另外，悬浮培养制造法中使用的培养基，只要是能培养间充质干细胞的培养基，没有特别限定，可示例出上述那样的培养基。作为微载体，只要能在悬浮培养中使用就没有特别限定，可示例出聚酯、聚苯乙烯、玻璃、葡聚糖、明胶、胶原蛋白等。作为可获得的微载体的具体例，可列举出GE Healthcare公司的Cytodex1、Cytodex3、cytopore1、Cytopore2、Cultisphere、Cytoline 1、Cytoline 2、Corning公司的CellBIND、低浓度Synthemax II、高浓度Synthemax II、正电荷微载体、胶原蛋白包被微载体、可溶性微载体、Pall公司的SoloHill微载体等。对于微载体的材质而言，优选具有可溶性、生物降解性这样的性质，更优选的是，期望除了这些性质之外还无异源性、无动物成分。

脂肪组织来源间充质干细胞可以利用例如美国专利第6,777,231号中记载的制造方法得到，例如，可以利用包括以下的工序(i)～(iii)的方法来制造：

(i)通过酶消化脂肪组织而得到细胞悬浮物的工序；

(ii)使细胞沉淀，将细胞再悬浮于适合的培养基的工序；以及

(iii)在固体表面培养细胞，去除不显示出与固体表面结合的细胞的工序。

工序(i)中使用的脂肪组织优选使用经清洗的脂肪组织。清洗可以通过使用生理学允许的生理盐水溶液(例如磷酸盐缓冲液(PBS))并剧烈地搅拌、使其沉淀来进行。这是为了从组织中去除脂肪组织中包含的杂质(也称为碎片(debris)，例如受损组织、血液、红细胞等)。因此，通常反复地进行清洗和沉淀直至碎片基本上从上清液中去除为止。残留的细胞以各种尺寸的块的形式存在，为了在将细胞本身的损伤抑制到最低限度的情况下使其解离，优选使用减弱或破坏细胞间结合的酶(例如胶原酶、分散酶或胰蛋白酶等)对清洗后的细胞团块进行处理。这样的酶的量和处理时间虽然基于所使用的条件而变化，但是在本技术领域中是已知的。还优选使用自然地离开细胞团块的细胞来替代这样的酶处理、或与这样的酶处理组合使用的方法(改进外植块(explant)法等)。另外，可利用机械搅拌、超声波能量、热能等其它处理法将细胞团块分解，但为了将细胞的损伤抑制到最低限度，优选仅通过酶处理进行。使用酶时，为了将对细胞的有害作用抑制到最低限度，在经过合适的时间后使用培养基等使酶失活的方式是理想的。

通过工序(i)而得到的细胞悬浮物包含聚集状的细胞的浆料或悬浮物以及各种夹杂细胞，例如红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。因此，接下来可以分离、去除聚集状态的细胞和上述夹杂细胞，但由于能够通过后述的工序(iii)中的粘附和清洗来去除，因此可以省略该分离、去除。在分离、去除夹杂细胞的情况下，可以通过将细胞强制分成上清液和沉淀的离心分离来实现。将得到的包含夹杂细胞的沉淀悬浮于生理学允许的溶剂中。虽然有悬浮状的细胞中包含红细胞的担心，但由于红细胞会通过后述的由粘附于固体表面进行的选择而被排除，因此溶解工序并不是必须的。作为选择性地溶解红细胞的方法，可以使用本技术领域中公知的方法，例如在利用氯化铵来实现溶解的高渗培养基或低渗培养基中进行孵育等。溶解后，还可以通过例如过滤、离心沉淀或密度分级，从所需的细胞中分离溶解物。

工序(ii)中，对于悬浮状的细胞，为了提高间充质干细胞的纯度，可以进行1次或连续进行多次清洗、离心分离并再悬浮于培养基中。此外，还可以基于细胞表面标志物谱或基于细胞的尺寸和颗粒性对细胞进行分离。

再悬浮时使用的培养基只要是能培养间充质干细胞的培养基就没有特别限定，这样的培养基还可以通过如下方式制作：在基础培养基中添加血清、和/或添加白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胆固醇、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等中的1种以上的血清替代物。这些培养基还可以根据需要进一步添加脂质、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。

接着，工序(iii)中，对于工序(ii)中得到的细胞悬浮液中的细胞，不使之分化而在固体表面上、在适合的细胞密度和培养条件下使用上述的适合的细胞培养基对其进行培养。本发明中，“固体表面”是指：能够结合/粘附本发明中的脂肪组织来源间充质干细胞的任意材料。在特定的方式中，这样的材料是进行了处理、以促进哺乳类细胞与该表面的结合/粘附的塑料材料。具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，可适宜地使用培养皿、烧瓶等。为了去除非结合状态的细胞和细胞的碎片，在孵育后清洗细胞。

本发明中，可以选择最终保持与固体表面结合/粘附的状态的细胞作为脂肪组织来源间充质干细胞的细胞群。

对于所选择的细胞，可以使用流式细胞仪等利用现有的方法对表面抗原进行解析，以确认其为本发明中的间充质干细胞，还。进而，还可以对分化为各细胞系列的能力进行检测，这样的分化可以利用现有的方法进行。

本发明的细胞的培养中使用的培养基只要是能培养间充质干细胞的培养基就没有特别限定，这样的培养基可以通过在基础培养基中添加血清和/或添加白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胆固醇、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等中的一种以上的血清替代物来制作。这些培养基中还可以根据需要进一步添加脂质、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。

作为上述基础培养基，可列举例如IMDM培养基、Medium 199培养基、伊戈尔最小必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium，EMEM)培养基、MEM-α培养基、杜尔贝科改进伊戈尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium，DMEM)培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、MCDB201培养基和它们的混合培养基等。

作为上述血清，可列举例如人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清、小牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔子血清、大鼠血清等，但不限定于这些。使用血清时，可以在基础培养基中添加5v/v％至15v/v％，优选添加10v/v％。

作为上述脂肪酸，可示例出：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈酸(palmitoyl acid)、棕榈酸(palmitic acid)和硬脂酸等，但不限定于这些。脂质可示例出：磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等，但不限定于这些。氨基酸例如包括：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等，但不限定于这些。蛋白质例如可示例出：大肠杆菌素、还原型谷胱甘肽、纤维连接蛋白和β2-微球蛋白等，但不限定于这些。多糖可示例出糖胺聚糖，糖胺聚糖中尤其可示例出透明质酸、硫酸乙酰肝素等，但不限定于这些。生长因子例如可示例出：血小板来源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等，但不限定于这些。从将本发明中得到的脐带来源间充质干细胞用于细胞移植这样的观点出发，优选使用不包含血清等异源成分(无异源性，xeno-free)的培养基。例如，PromoCell公司、Lonza公司、Biological Industries公司、Veritas公司、R&D Systems公司、Corning公司和乐敦公司等以预先制备的、用于间充质干细胞(基质细胞)的培养基形式提供有这样的培养基。

本发明中的间充质干细胞可以如上所述进行制备，但还可以定义为具有以下特性的细胞；

(1)在标准培养基中的培养条件下，对塑料显示出粘附性、

(2)表面抗原CD44、CD73、CD90为阳性，CD31、CD45为阴性、及

(3)在培养条件下能分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。

从通过上述工序而得到的间充质干细胞中，通过使用了细胞分选仪、磁珠等的免疫学方法选择性分离IDO表达量、犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的细胞，由此能够获得犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞。另外，通过能够诱导犬尿氨酸产生或犬尿氨酸分泌的特定的培养方法、或者利用特定的培养基等进行培养，从而诱导间充质干细胞中的犬尿氨酸产生或犬尿氨酸分泌，也能够有效地获得犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞。作为一个例子，以下对使用细胞分选仪的利用免疫学方法进行的选择性分离的具体方法、使细胞附着于微载体上并搅拌微载体从而在培养槽内进行搅拌培养的方法进行说明。

将通过胰蛋白酶/EDTA溶液等对上述制备的间充质干细胞进行处理而得到的细胞悬浮液离心分离(室温、400G、5分钟)并去除上清液。向细胞中加入染色缓冲液(1％BSA-PBS)，制成1×10⁶个细胞/500μL，通过移液使细胞悬浮液浓度均匀后，分注在新的1.5mL微型管中各50μL。在分注的细胞悬浮液中以5～20μg/mL的浓度添加一抗(抗IDO抗体、抗犬尿氨酸抗体等)使其悬浮后，在遮光/冷藏下反应30分钟～1小时。用染色缓冲液(StainingBuffer)1mL进行3次清洗后，加入染色缓冲液制成50μL，以1～10μg/mL的浓度添加二级抗体使其悬浮后，在遮光/冷藏下反应30分钟～1小时。用染色缓冲液1mL进行3次清洗后，加入PI缓冲液(在染色缓冲液14.4mL中添加碘化丙啶溶液(SIGMA公司制、P4864)28.8μL来制备)300μL并充分悬浮，通过带细胞滤网的管，用荧光激活细胞分选系统(fluorescenceactivated cell sorting，FACS)进行分离。

将上述制备的包含间充质干细胞的细胞悬浮液与微载体混合并添加至培养槽中，使用间充质干细胞用无血清培养基等进行搅拌培养，进行一定时间的悬浮培养，由此与现有的在烧瓶等中的平面培养相比，能够获得IDO表达量、犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的细胞。

(间充质干细胞的冷冻保存)

本发明中的间充质干细胞只要具备免疫疾病治疗效果、炎症性疾病治疗效果，则也可以是适宜重复进行了冷冻保存和融解的细胞。本发明中，冷冻保存可以通过如下方式进行：将间充质干细胞悬浮于本领域技术人员公知的冷冻保存液中进行冷却。悬浮可以通过如下方式进行：根据需要利用胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，转移至冷冻保存容器中进行适宜处理后，加入冷冻保存液。

冷冻保存液可以含有作为冷冻保护剂的二甲基亚砜(DMSO：Dimethylsulfoxide)，但DMSO除了细胞毒性之外还具有对间充质干细胞进行分化诱导的特性，因此优选减少DMSO含量。作为DMSO的替代物，可示例出：甘油、丙二醇或多糖类。使用DMSO时，含有5％～20％浓度，优选含有5％～10％浓度，更优选含有10％浓度。此外还可以包含WO2007/058308中记载的添加剂。作为这样的冷冻保存液，例如还可以使用由BioverdeInc.、NIPPON Genetics Co.,Ltd.、REPROCELL Inc.、ZENOAQ公司、Cosmo Bio Co.,Ltd.、Kohjin Bio Co.,Ltd.、Thermo Fisher Scientific Inc.等提供的冷冻保存液。

冷冻保存上述悬浮的细胞时，在-80℃～-100℃之间的温度(例如，-80℃)下冷冻为宜，可以使用能达到该温度的任意的冷冻仪来进行。虽然没有特别限定，但是为了避免急剧的温度变化，还可以使用程序冷冻仪来适宜控制冷却速度。冷却速度可以根据冷冻保存液的成分进行适宜选择，可以依据冷冻保存液的制造者的说明来进行。

关于保存期，只要在上述条件下经冷冻保存的细胞融解后保持与冷冻前同等性质就没有特别限定，可列举例如：1周以上、2周以上、3周以上、4周以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上、5个月以上、6个月以上、1年以上或更长时间。在更低的温度下保存能够抑制细胞损伤，因此还可以移至液氮上的气相(约-150℃以下至-180℃以上)中进行保存。在液氮上的气相中保存时，可以使用本领域技术人员公知的保存容器来进行。虽然没有特别限定，但是例如保存2周以上时，优选在液氮上的气相中进行保存。

融解后的间充质干细胞可以适宜进行培养至下次冷冻保存前。间充质干细胞的培养使用上述的能培养间充质干细胞的培养基进行，没有特别限定，可以在30～40℃、优选约37℃的培养温度下、在含有CO₂的空气气氛下进行。CO₂浓度为约2～10％，优选为约5～10％。在培养时，在相对于培养容器到达适合的汇合(可列举例如细胞相对于培养容器占50％至80％的情况)后，可以用胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，以适合的细胞密度接种于另行准备的培养容器中继续进行培养。在接种细胞时，作为典型的细胞密度，可示例出：100个细胞/cm²～100000个细胞/cm²、500个细胞/cm²～50000个细胞/cm²、1000～10000个细胞/cm²、2000～10000个细胞/cm²等。在特定的方式中，细胞密度为2000～10000个细胞/cm²。优选进行调节，使得到达适合的汇合的时间为3天～7天。在培养时，还可以根据需要适宜进行培养基交换。

经冷冻保存的细胞的融解可以通过本领域技术人员公知的方法来进行。例如可示例出在37℃的恒温槽内或热水浴中静置或振荡来进行的方法。

本发明的间充质干细胞可以是任意状态的细胞，例如可以是将培养中的细胞剥离并回收的细胞，还可以是在冷冻保存液中冷冻的状态的细胞。使用将扩大培养而得到的相同批次的细胞分成小份进行冷冻保存后的细胞时，在稳定地得到同样的作用效果方面、操作性优异方面等是优选的。冷冻保存状态的间充质干细胞可以在即将使用之前进行融解并以悬浮于冷冻保存液的状态下输液或直接混合于培养基等溶液中。另外，可以利用离心分离等方法去除冷冻保存液后输液或悬浮于培养基等溶液中。此处，本发明中的“输液”是指：对人进行治疗时所使用的溶液，没有特别限定，溶液可列举例如：生理盐水、日本药典生理盐水、5％葡萄糖液、日本药典葡萄糖注射液、林格氏液、日本药典林格氏液、乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、1号液(初始溶液)、2号液(脱水补充剂)、3号液(维持液)、4号液(术后恢复液)等。

[免疫疾病治疗剂和抗炎症剂]

本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂含有上述的本发明的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞。根据本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂，能够将免疫疾病治疗剂和抗炎症剂用于预防、抑制或治疗。本发明的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂所包含的间充质干细胞，可以适用上述间充质干细胞项目的说明。

本发明的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂中，只要在不损害本发明的效果的范围内，则除了上述间充质干细胞以外还可以根据其用途、形态按照常规方法使其含有药学上可接受的载体、添加物。作为这样的载体、添加物，可列举例如：等渗剂、增稠剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、稳定化剂、螯合剂、油性基质、凝胶基质、表面活性剂、悬浮化剂、粘结剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、发泡剂、流动化剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、甜味剂、酸味剂、着色剂、呈味剂、香料或清凉化剂等，但不限定于这些。作为代表性的成分，可列举例如以下的载体、添加物等。

作为载体，可列举例如：水、含水乙醇等的水性载体；作为等渗剂(无机盐)，可列举例如：氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等；作为多元醇，可列举例如：甘油、丙二醇、聚乙二醇等；作为增稠剂，可列举例如：羧乙烯基聚合物、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、藻酸、聚乙烯醇(完全或部分皂化物)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇等；作为糖类，可列举例如：环糊精、葡萄糖等；作为糖醇类，可列举例如：木糖醇、山梨醇、甘露糖醇等(它们可以是d构型、l构型或dl构型中的任意者)；作为防腐剂、杀菌剂或抗菌剂，可列举例如：二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、烷基二氨基乙基甘氨酸盐酸盐、苯甲酸钠、乙醇、苯扎氯铵、苄索氯铵、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、山梨酸、山梨酸钾、氨丁三醇、脱氢醋酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、羟基喹啉硫酸盐、苯乙醇、苄醇、双胍化合物(具体而言，聚己缩胍盐酸盐(聚六亚甲基双胍盐酸盐)等)、Glokill(Rhodia公司制商品名)等；作为pH调节剂，可列举例如：盐酸、硼酸、氨基乙基磺酸、ε-氨基己酸、柠檬酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸氢钠、碳酸钠、硼砂、三乙醇胺、单乙醇胺、二异丙醇胺、硫酸、硫酸镁、磷酸、多聚磷酸、丙酸、草酸、葡萄糖酸、富马酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、葡萄糖酸内酯、乙酸铵等；作为稳定化剂，可列举例如：二丁基羟基甲苯、氨丁三醇、甲醛次硫酸氢钠(RONGALIT)、生育酚、焦亚硫酸钠、单乙醇胺、单硬脂酸铝、单硬脂酸甘油酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；作为油性基质，可列举例如：橄榄油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油等植物油、中链脂肪酸甘油三酯等；作为水性基质，可列举例如：聚乙二醇400等；作为凝胶基质，可列举例如：羧乙烯基聚合物、胶质等；作为表面活性剂，可列举例如：聚山梨醇酯80、氢化蓖麻油、脂肪酸甘油酯、山梨坦倍半油酸酯等；作为悬浮化剂，可列举例如：白蜂蜡、各种表面活性剂、阿拉伯胶、阿拉伯胶粉末、黄原胶、大豆卵磷脂等；作为粘结剂，可列举例如：羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇等；作为赋形剂，可列举例如：蔗糖、乳糖、淀粉、玉米淀粉、结晶纤维素、轻质硅酸酐等；作为润滑剂，可列举例如：蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸镁、滑石等；作为崩解剂，可列举例如：低取代度羟丙基纤维素、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；作为发泡剂，可列举例如：碳酸氢钠等；作为流动化剂，可列举例如：偏硅酸铝钠、轻质硅酸酐等。

本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂根据目的可以以各种形态、例如固体制剂、半固体制剂、液体制剂等各种各样的剂型来提供。例如可以以固体制剂(片剂、粉末、散剂、颗粒剂、胶囊剂等)、半固体制剂[软膏剂(硬软膏剂、软软膏剂等)、霜剂等]、液体制剂[洗剂、萃取剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、注射剂(包括输液剂、嵌入式注射剂、缓释型注射、使用时制备型的注射剂)、透析用剂、气雾剂、软胶囊剂、营养剂等]、贴剂、巴布剂等的形态加以利用。另外，本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂还可以以油性或水性的赋形剂中的溶液或乳液等的形态加以利用。进而，本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂还可以通过喷雾来用于患部，本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂还可以以喷雾后在患部凝胶化或片化的形态加以利用。本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂还可以在将上述间充质干细胞制成片状或立体结构体后用于患部。

就本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂而言，可以使用生理盐水、日本药典生理盐水、5％葡萄糖液、日本药典葡萄糖注射液、林格氏液、日本药典林格氏液、乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、碳酸氢盐林格氏液、1号液(初始溶液)、2号液(脱水补给液)、3号液(维持液)、4号液(术后恢复液)等输液、或DMEM等细胞培养用培养基进行悬浮或稀释来使用，优选用生理盐水、5％葡萄糖液、1号液(初始溶液)，更优选用5％葡萄糖液、1号液(初始溶液)进行悬浮或稀释来使用。

本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂为液体制剂时，免疫疾病治疗剂或抗炎症剂的pH只要在药物上、药理学上(制药上)或生理学上可接受的范围内，就没有特别限定，作为一个例子，可列举出为2.5～9.0，优选为3.0～8.5，更优选为3.5～8.0的范围。

本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂为液体制剂时，对于免疫疾病治疗剂或抗炎症剂的渗透压，只要在生物体可接受的范围内就没有特别限制。作为本发明的组合物的渗透压比的一个例子，可列举出优选为0.7～5.0，更优选为0.8～3.0，进一步优选为0.9～1.4的范围。就渗透压的调节而言，可以使用无机盐、多元醇、糖醇、糖类等利用该技术领域中已知的方法来进行。渗透压比基于第十五次修订日本药典而设为试样的渗透压相对于286mOsm(0.9w/v％氯化钠水溶液)的渗透压的比，渗透压参考日本药典中记载的渗透压测定法(冰点下降法)进行测定。需要说明的是，渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)或者使用市售的渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)或者如下来制备：将氯化钠(日本药典标准试剂)在500～650℃下干燥40～50分钟后，在干燥器(硅胶)中进行自然冷却，准确称量出其中的0.900g，溶解于纯化水中准确地制成100mL。

本发明的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂对对象的给药途径可列举出：口服给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、动脉内给药、脐带静脉内给药、脑室内给药、髄腔内给药、腹腔内给药、舌下给药、直肠给药、阴道给药、眼内给药、经鼻给药、吸入、经皮给药、植入物、向器官表面的喷雾及通过粘贴片状物等进行的直接给药等，从发明的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂的有效性的观点出发，优选为动脉内给药、静脉内给药和脑室内给药，从减轻对象者的负担的观点出发，更优选为静脉内给药、肌肉内给药、鼻腔内给药。

就本发明的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂而言，其用量(给药量)可以根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)及本发明的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂的剂型等而不同，从发挥充分的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂的治疗效果的观点出发，有优选其量较多的倾向，另一方面，从抑制副作用的出现的观点出发，有优选其量较少的倾向。通常，在对成人给药时，以细胞数计，为1×10³～1×10¹²个/次，优选为1×10⁴～1×10¹¹个/次，更优选为1×10⁵～1×10¹⁰个/次、进一步优选为5×10⁶～1×10⁹个/次。另外，以患者的单位体重的给药量计，为1×10～5×10¹⁰个/kg，优选为1×10²～5×10⁹个/kg，更优选为1×10³～5×10⁸个/kg、进一步优选为1×10⁴～5×10⁷个/kg。对新生儿给药时，以细胞数计，为1×10³～1×10¹¹个/次，优选为1×10⁴～1×10¹⁰个/次，更优选为1×10⁵～1×10⁹个/次、进一步优选为5×10⁵～5×10⁸个/次。另外，以患者的单位体重的给药量计，为1×10～5×10¹⁰个/kg，优选为1×10²～5×10⁹个/kg，更优选为1×10³～5×10⁸个/kg，进一步优选为1×10⁴～5×10⁷个/kg。需要说明的是，可以将本用量作为1次量而进行多次给药，还可以将本用量分成多次来给药。

本发明的免疫疾病治疗剂和抗炎症剂可以与一种或两种以上的其它药剂一起给药。作为其它药剂，可列举出可以用作免疫疾病治疗剂或抗炎症剂的任意药剂，可列举例如：阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、达克珠单抗、依法利珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、美泊利单抗(Mepolizumab)、OKT3、奥马珠单抗、帕利珠单抗、培克珠单抗(Pexelizumab)、利妥昔单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗等单克隆抗体；阿法赛特(Alefacept)、地尼白介素(DENILEUKINDIFTITOX)、依那西普等融合蛋白；阿那白滞素等可溶性细胞因子受体；IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-11、G-CSF、GM-CSF等细胞因子；马来酸阿扎他定、马来酸溴苯那敏、马来酸氯苯那敏、富马酸氯马斯汀、盐酸赛庚啶、马来酸d氯苯那敏、盐酸苯海拉明、盐酸双苯比拉林、盐酸羟嗪、盐酸甲地嗪、盐酸异丙嗪、酒石酸异丁嗪、柠檬酸曲吡那敏(Tripelennaminecitrate)、盐酸曲吡那敏(tripelennamine hydrochloride)、盐酸曲普利啶、阿伐斯汀、西替利嗪、地氯雷他定、依巴斯汀、非索非那定、左西替利嗪、氯雷他定、咪唑斯汀等H1阻断剂；西咪替丁等H2阻断剂；二丙酸倍氯米松、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松、曲安奈德、地塞米松、甲基强的松龙等皮质类固醇；色甘酸、奈多罗米等肥大细胞稳定剂；沙丁胺醇等β激动剂；道诺霉素、依托泊苷、6-巯基嘌呤等细胞毒性药物；抗组胺剂、NSAID、肾上腺素、胰高血糖素、阿司匹林。另外，也可以在给予本发明的免疫疾病治疗剂或抗炎症剂的同时结合进行低温疗法。

本发明的间充质干细胞可以用于各种自身免疫性疾病和炎症性疾病，作为具体的疾病，可列举出GVHD、软骨分解、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣性关节炎、脊柱关节炎、骨关节炎、痛风、银屑病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、充血性心力衰竭、脑中风、主动脉瓣狭窄、肾功能衰竭、肾病综合征、尿毒症、红斑狼疮、胰腺炎、过敏症、纤维化、贫血、动脉粥样硬化、再狭窄、化疗/放疗相关并发症、I型糖尿病、II型糖尿病、肝功能衰竭、自身免疫性肝炎、丙型肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、暴发型肝炎、乳糜泻、非特异性结肠炎、小肠淋巴管扩张症、蛋白丢失性肠病、克罗恩病、变应性结膜炎、糖尿病性视网膜病、干燥综合症、特应性疾病、葡萄膜炎、过敏性鼻炎、食物性过敏、过敏反应、自身免疫性疾病、药物过敏症、肥大细胞增生症、哮喘、石棉沉着病、矽肺、慢性阻塞性肺病、慢性肉芽肿性炎症、囊肿性纤维化、组织细胞增多病、结节病、肾小球肾炎、血管炎、皮炎、HIV相关恶病质、脑型疟疾、强直性脊柱炎、麻风病、COPD、肺纤维化、纤维肌痛、食道癌等癌、胃食管反流病、巴雷特食管、再生不良性贫血、移植物抗宿主疾病、镰状细胞疾病、CVID、高IgM综合征、IgA缺乏症、暂时性低丙种球蛋白血症、X连锁无丙种球蛋白血症、慢性皮肤黏膜念珠菌病、迪乔治综合征、X连锁淋巴增殖综合征、毛细血管扩张性共济失调症、软骨毛发发育不全、联合免疫缺陷病、高IgE综合征、MHC缺乏、重症联合免疫缺陷、威斯科特-奥尔德里奇综合征、白细胞异常-白化病综合征、慢性肉芽肿病、白细胞粘附缺陷病、IFN-γ受体缺乏、白细胞介素(IL)-12缺乏、IL-12受体β1缺乏、ZAP-70缺乏、血管性水肿等。

本发明还包括如下免疫疾病的治疗方法：特征在于使用犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞的免疫疾病的治疗方法；特征在于使用下述间充质干细胞的免疫疾病的治疗方法，所述间充质干细胞为在利用IFNγ处理而在细胞内诱导的IDO作用下由色氨酸合成的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞；特征在于使用JAK/STAT通路在稳定状态下被激活的间充质干细胞的免疫疾病的治疗方法。另外，本发明还包括如下炎症性疾病的治疗方法：特征在于使用犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞的炎症性疾病的治疗方法；特征在于使用下述间充质干细胞的炎症性疾病的治疗方法，所述间充质干细胞为在利用IFNγ处理而在细胞内诱导的IDO作用下由色氨酸合成的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞；特征在于使用JAK/STAT通路在稳定状态下被激活的间充质干细胞的炎症性疾病的治疗方法。进而，本发明还包括如下GVHD的治疗方法：特征在于使用犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞的GVHD的治疗方法；特征在于使用下述间充质干细胞的GVHD的治疗方法，所述间充质干细胞为在利用IFNγ处理而在细胞内诱导的IDO作用下由色氨酸合成的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高的间充质干细胞；特征在于使用JAK/STAT通路在稳定状态下被激活的间充质干细胞的GVHD的治疗方法。需要说明的是，各术语的说明可以使用上述的间充质干细胞、免疫疾病治疗剂、抗炎症剂、GVHD治疗剂中的说明。

实施例

以下列举实施例和试验例对本发明进行详细地说明，但本发明不受这些实施例等的限定。

[脐带来源间充质干细胞(UCMSC-EXP、UCMSC-CP)的制备和培养]

利用Cytotherapy,18,229-241,2016所述的方法采集脐带来源细胞。简而言之，在东京大学医学科学研究所伦理委员会的批准下，将得到了提供者的同意而采集的脐带切成1至2mm³的碎片，接种于培养皿上，覆盖Cellamigo(Tsubakimoto Chain Co.)，得到在添加了10％胎牛血清(FBS)和抗生素的α-最小必需培养基(MEM-α)中培养的、基于“改进外植块法”的脐带来源间充质干细胞(以下称为“UCMSC-EXP”)。

同样地，利用Cytotherapy,18,229-241,2016所述的方法采集脐带来源细胞，在获得东京大学医科学研究所的伦理委员会的批准后，将得到提供者的同意而采集的脐带切成1至2mm³的大小，用胶原酶进行处理后进行离心分离(400×g下5分钟)，将得到的细胞使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司制)在培养瓶中进行粘附培养，从而利用“胶原酶法”得到脐带来源间充质干细胞(以下称为“UCMSC-CP”)。

需要说明的是，对于传代数，将由脐带组织利用前述的改进外植块法或胶原酶法得到的细胞作为第一代细胞(P1)，通过进行传代而增加传代数，记载为第二代细胞(P2)、第三代细胞(P3)。

使用细胞剥离液(TrypLE Select(1X))将得到的UCMSC-EXP和UCMSC-CP剥离，移至离心管中，以400×g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，加入适量细胞冷冻保存液(STEM-CELLBANKER(Xenoac公司))使其悬浮。将该细胞悬浮溶液分注于内旋盖冷冻管中，在冷冻仪内以-80℃保存。然后，移至液氮上的气相中继续保存。

[平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的细胞内犬尿氨酸量的测定]

将前述的、利用改进外植块法得到的源自脐带组织的冷冻细胞UCMSC-EXP唤醒，将包含细胞的细胞悬浮液和微载体混合并添加至培养槽中，使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行搅拌培养，得到悬浮培养8天的细胞(以下称为“EXP-SUS”)。同样地，将前述的UCMSC-EXP唤醒，将细胞接种于细胞培养瓶中并使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行平面培养，培养8天，得到平面培养细胞(以下称为“EXP-ADH”)。提取利用上述方法以8天的培养期得到的平面培养细胞(EXP-ADH)或悬浮培养细胞(EXP-SUS)的细胞内容物，通过毛细管电泳法和LC-MS进行蓄积于细胞内的代谢产物的综合解析(代谢组学解析)。其结果，可知：与EXP-ADH相比，EXP-SUS的细胞内犬尿氨酸蓄积量增高(图1)。另外，利用ELISA法(Immundiagnostik GmbH、产品编号K7728)对培养上清液中的犬尿氨酸量进行定量。通过这些定量方法，也得到与EXP-ADH相比EXP-SUS的培养8天后的细胞内犬尿氨酸蓄积量高的结果(图2)。由此获知，通过在稳定状态下悬浮培养而使细胞内犬尿氨酸的产生亢进。

[悬浮培养细胞(SUS)和平面培养细胞(ADH)的犬尿氨酸产生和IDO活性的测定1]

将前述的、利用胶原酶法得到的源自脐带组织的冷冻细胞UCMSC-CP唤醒，将包含细胞的细胞悬浮液和微载体混合并添加至培养槽中，使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行搅拌培养，得到悬浮培养4天的细胞(以下称为“CP-SUS”)。同样地，将前述的UCMSC-CP唤醒，将细胞接种于细胞培养瓶中并使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行平面培养，培养4天，得到平面培养细胞(以下称为“CP-ADH”)。添加最终浓度为100ng/mL和200ng/mL的量的IFNγ(产品编号：AF-300-02、PeproTeck,Inc.公司制)，利用使用了欧氏液(Ehrlich试剂)的比色法测定了48小时后的细胞上清液中的犬尿氨酸量(IFNγ的浓度100ng/mL组和200ng/mL组)。另外，为了确认该反应是由IDO介导的，还设置了添加IFNγ(100ng/mL)的同时也添加了IDO抑制剂(30nM、Epacadostat、CAS No：1204669-58-8)的组(抑制剂组)。需要说明的是，作为比较对象，对于未添加IFNγ的对照组也进行培养上清液中的犬尿氨酸的定量。另外，利用WST-8(Cell Counting Kit-8、同仁化学研究所)测定各间充质干细胞的细胞活性，对犬尿氨酸的测定值进行校正。将结果示于图3。通过IDO抑制剂抑制了犬尿氨酸产生，因此能够将各试样的犬尿氨酸产生能力作为指标来评价IDO活性。

可知，在任意的条件下，CP-SUS响应IFNγ刺激而释放到培养上清液中的犬尿氨酸量均大于CP-ADH。由此可知：与CP-ADH相比，CP-SUS中的由IFNγ刺激引起的IDO的诱导和激活、与此相伴的犬尿氨酸在细胞内的产生和向培养上清液中的分泌能力高(图3)。

[悬浮培养细胞(SUS)和平面培养细胞(ADH)的犬尿氨酸产生和IDO活性的测定2]

将前述的脐带组织来源冷冻细胞(UCMSC-EXP)唤醒，将包含细胞的细胞悬浮液和微载体混合并添加至培养槽中，使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行搅拌培养，得到悬浮培养8天的细胞(以下称为“EXP-SUS”)。同样地，将前述的脐带组织来源冷冻细胞(UCMSC-EXP)唤醒，将细胞接种于细胞培养瓶中并使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行平面培养，培养4天后进行传代并进而培养4天，得到平面培养细胞(以下称为“EXP-ADH”)。添加最终浓度为50ng/mL和100ng/mL的量的IFNγ(产品编号：AF-300-02、PeproTeck,Inc.公司制)，利用使用了欧氏液(Ehrlich试剂)的比色法测定了64小时后的细胞上清液中的犬尿氨酸量(IFNγ的浓度50ng/mL组和100ng/mL组)。需要说明的是，作为比较对象，对于未添加IFNγ的对照组也进行培养上清液中的犬尿氨酸的定量。另外，利用WST-8(Cell Counting Kit-8、同仁化学研究所)测定各间充质干细胞的细胞活性，对犬尿氨酸的测定值进行校正，将各试样的犬尿氨酸产生能力作为指标评价了IDO活性。将EXP-ADH的对照组的IDO/WST8值设为1，计算出IDO活性比率(图4)。

可知，在任意的条件下，EXP-SUS的IDO活性均高于EXP-ADH。由此可知：与EXP-ADH相比，EXP-SUS的由IFNγ刺激引起的IDO的诱导和激活、与此相伴的犬尿氨酸在细胞内的产生和向培养上清液中的分泌能力高。

[悬浮培养细胞(SUS)和平面培养细胞(ADH)的犬尿氨酸产生和IDO活性的测定3]

将前述的脐带组织来源冷冻细胞(UCMSC-CP)唤醒，将包含细胞的细胞悬浮液和微载体混合并添加至培养槽中，使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行搅拌培养，得到悬浮培养8天的细胞(以下称为“CP-SUS”)。同样地，唤醒UCMSC-CP，将细胞接种于细胞培养瓶中并使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行平面培养，培养8天，得到平面培养细胞(以下称为“CP-ADH”)。添加最终浓度为50ng/mL和100ng/mL的量的IFNγ(产品编号：AF-300-02、PeproTeck,Inc.公司制)，利用使用了欧氏液(Ehrlich试剂)的比色法测定了64小时后的细胞上清液中的犬尿氨酸量(IFNγ的浓度50ng/mL组和100ng/mL组)。需要说明的是，作为比较对象，对于未添加IFNγ的对照组也进行IDO活性的测定。另外，利用WST-8(Cell Counting Kit-8、同仁化学研究所)测定各间充质干细胞的细胞活性，对犬尿氨酸的测定值进行校正，将各试样的犬尿氨酸产生能力作为指标评价了IDO活性。将CP-ADH的对照组的IDO/WST8值设为1，计算出IDO活性比率(图5)。

可知，在任意的条件下，CP-SUS的IDO活性均高于CP-ADH。由此可知：与CP-ADH相比，CP-SUS的由IFNγ刺激引起的IDO的诱导和激活、与此相伴的犬尿氨酸在细胞内的产生和向培养上清液中的分泌能力高。

[悬浮培养细胞(SUS)和平面培养细胞(ADH)的犬尿氨酸产生和IDO活性的测定4]

将前述的脐带组织来源冷冻细胞(UCMSC-CP)唤醒，将包含细胞的细胞悬浮液和微载体混合并添加至培养槽中，使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行搅拌培养，得到悬浮培养8天的细胞(以下称为“CP-SUS”)。同样地，将前述的脐带组织来源冷冻细胞(UCMSC-CP)唤醒，将细胞接种于细胞培养瓶中并使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行平面培养，培养8天，得到平面培养细胞(以下称为“CP-ADH”)。添加最终浓度为50ng/mL和100ng/mL的量的IFNγ(产品编号：AF-300-02、PeproTeck,Inc.公司制)，利用使用了欧氏液(Ehrlich试剂)的比色法测定了90小时后的细胞上清液中的犬尿氨酸量(IFNγ的浓度50ng/mL组和100ng/mL组)。需要说明的是，作为比较对象，对于未添加IFNγ的对照组也进行IDO活性的测定。另外，利用WST-8(Cell Counting Kit-8、同仁化学研究所)测定各间充质干细胞的细胞活性，对犬尿氨酸的测定值进行校正，将各试样的犬尿氨酸产生能力作为指标评价了IDO活性。将CP-ADH的对照组的IDO/WST8值设为1，计算出IDO活性比率(图6)。

可知，在任意的条件下，CP-SUS的IDO活性均高于CP-ADH。由此可知：与CP-ADH相比，CP-SUS的由IFNγ刺激引起的IDO的诱导和激活、与此相伴的犬尿氨酸在细胞内的产生和向培养上清液中的分泌能力高。

[悬浮培养细胞(SUS)和平面培养细胞(ADH)的犬尿氨酸产生和IDO活性的测定5]

将前述的脐带组织来源冷冻细胞(UCMSC-EXP)唤醒，将包含细胞的细胞悬浮液和微载体混合并添加至培养槽中，使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行搅拌培养，得到悬浮培养8天的细胞(以下称为“EXP-SUS”)。同样地，将前述的脐带组织来源冷冻细胞(UCMSC-EXP)唤醒，将细胞接种于细胞培养瓶中并使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)进行平面培养，培养8天，得到平面培养细胞(以下称为“EXP-ADH”)。添加最终浓度为50ng/mL和100ng/mL的量的IFNγ(产品编号：AF-300-02、PeproTeck,Inc.公司制)，利用使用了欧氏液(Ehrlich试剂)的比色法测定了90小时后的细胞上清液中的犬尿氨酸量(50ng/mL组和100ng/mL组)。需要说明的是，作为比较对象，对于未添加IFNγ的对照组也进行IDO活性的测定。另外，利用WST-8(Cell Counting Kit-8、同仁化学研究所)测定各间充质干细胞的细胞活性，对犬尿氨酸的测定值进行校正，将各试样的犬尿氨酸产生能力作为指标评价了IDO活性。将EXP-ADH的对照组的IDO/WST8值设为1，计算出IDO活性比率(图7)。

可知：在任意的条件下，EXP-SUS的IDO活性均高于EXP-ADH。由此可知：与EXP-ADH相比，EXP-SUS的由IFNγ刺激引起的IDO的诱导和激活、与此相伴的犬尿氨酸在细胞内的产生和向培养上清液中的分泌能力高。

[脐带组织来源间充质干细胞和其它细胞的犬尿氨酸产生和IDO活性的测定]

将前述的脐带组织来源冷冻细胞(UCMSC-CP)唤醒，将细胞接种于细胞培养瓶中并使用间充质干细胞用无血清培养基(乐敦公司)或含10％血清的MEMα培养基进行平面培养，培养8天，分别得到平面培养细胞(以下分别称为“UCMSC-SF”、“UCMSC-MEM”)。另外，将MRC-5细胞(ATCC)、人新生儿来源皮肤成纤维细胞(HDF、ScienCell Research Laboratories公司)解冻，使用含10％血清的MEMα培养基进行3天平面培养，分别得到平面培养细胞。进而，将人脐带静脉内皮细胞(HUVEC、PromoCell公司)解冻，使用内皮细胞生长培养基(PromoCell公司制、产品编号C-22210)进行3天平面培养，得到平面培养细胞。分别将UCMSC-SF、UCMSC-MEM、MRC-5、HDF和HUVEC以30000个细胞/cm²培养4天，回收了培养上清液。利用使用了欧氏液(Ehrlich试剂)的比色法测定了培养上清液中的犬尿氨酸量。另外，利用WST-8(Cell Counting Kit-8、同仁化学研究所)测定各间充质干细胞的细胞活性，对犬尿氨酸的测定值进行校正，将各试样的犬尿氨酸产生能力作为指标评价了IDO活性(图8)。

可知，与UCMSC-MEM相比，UCMSC-SF的IDO活性高。另外可知，与MRC-5、HDF和HUVEC相比，UCMSC-SF和UCMSC-MEM的IDO活性高。由此可知：与在含10％血清的MEMα中培养的脐带组织来源间充质干细胞相比，在间充质干细胞用无血清培养基中培养的脐带组织来源间充质干细胞的细胞内的犬尿氨酸产生和向培养上清液中的分泌能力高。另外可知，与MRC-5、HDF和HUVEC相比，脐带组织来源间充质干细胞的细胞内的犬尿氨酸产生和向培养上清液中的分泌能力高。

[平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的基于微阵列解析的比较]

由利用上述方法通过8天的培养期得到的平面培养细胞(EXP-ADH)、或悬浮培养细胞(EXP-SUS)利用常规方法提取总RNA，合成了cDNA。通过Agilent公司的SurePrint G3Human GE微阵列8x60K Ver.3.0对表达基因进行了综合解析。其结果，京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)中登记的与JAK-STAT信号通路相关的155个基因中的33个，在稳定状态下在EXP-SUS中的表达与EXP-ADH相比提高了1.5倍以上。将EXP-SUS中的表达量相对于EXP-ADH中的表达量的比(表达量比)按降序排列时依次为CSF3、CSF2、LIF、IL6、IL6R、STAT4、CNTFR、GHR、CBLB、IL15、IL6ST、IL10、CLCF1、CCND2、IL11RA、IL15RA、PIM1、SOCS1、STAT2、IL19、IL7、IL24、IL22RA1、SOCS3、JAN2、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、PRL、LIFR、SPRY2、AKT3、IL4R。图9示出排在前9位的基因的表达量比。

[IFNγ刺激UC-MSC中的IDO表达的定量解析]

利用上述方法，将培养7天、14天或21天而得到的平面培养细胞(EXP-ADH)、或悬浮培养细胞(EXP-SUS)的冷冻储存物解冻，接种于细胞培养板中并添加IFNγ(产品编号300-02、厂商PEPROTECH)，培养2天。然后使用NucleoSpin RNA(产品编号740955.50、厂商MACHERY-NAGEL)提取总RNA，通过PrimeScript(注册商标)RT reagent Kit(PrimeScript(注册商标)RT reagent Kit产品编号RR037B、厂商Takara)合成eDNA，使用SYBR(注册商标)Premix Ex Taq(商标)II(产品编号RR081A、厂商Takara)并利用PikoRea196(厂商Thermo)进行实时PCR，利用PikoReal Software2.0(厂商Thermo)进行解析。求出将各培养天数下的ADH的IDO表达量设为1时的SUS的IDO表达量(表1)。使用的引物序列如下所述。

IDO：GGG ACA CTT TGC TAAAGG CG(F；序列号1)和GTC TGA TAG CTG GGG GTT GC(R；序列号2)

GAPDH：AGC CTC AAG ATC ATC AGC AAT G(F；序列号3)和ATG GAC TGT GGT CATGAG TCC TT(R；序列号4)

在任意的培养天数的细胞中，EXP-SUS的由IFNγ刺激引起的IDO表达均超过EXP-ADH。

[表1]

	IDO表达量(相对于ADH)(％)
		第7天	111.5
第14天	143.9
		第21天	136.8

[GVHD模型小鼠中的UC-MSC给药效果的评价]

将人PBMC移植于NOG小鼠(5×10⁶个细胞/个体)中，自1周后每周1次从尾静脉给予悬浮培养细胞(EXP-SUS)，总计4次。需要说明的是，高用量组(EXP-SUS high)和低用量组(EXP-SUS low)在一次给予中分别给予1×10⁷个细胞/kg、2×10⁶个细胞/kg的细胞。总计6周的经过观察的结果是，观察到与对照组相比EXP-SUS给药组抑制了由GVHD导致的体重减少(图10)和由GVHD导致的生存率降低(图11)。由该结果可知，EXP-SUS对GVHD是有效的。

[UC-MSC中的抗炎症效果的研究]

将作为人来源单核细胞的THP1细胞以3×10⁴个细胞/孔接种于12孔板，添加佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(PMA、产品编号162-23591、FUJIFILM Wako Pure ChemicalCo.,)100nM并培养3天。将通过上述方法培养8天而得到的平面培养细胞(EXP-ADH)或悬浮培养细胞(EXP-SUS)的冷冻储存物解冻，以40000个细胞/孔接种于细胞培养插件中，设置于接种了PMA刺激THP1细胞的孔中，添加脂多糖(LPS、产品编号14874-24、InvivoGen)1μg/mL。2天后由THP1细胞提取总RNA，利用实时PCR法解析了CCL2基因表达量(图12)。使用的引物序列如下所述。

CCL2：AAGAAGCTGTGATCTTCAAGAC(F；序列号5)和CCATGGAATCCTGAACCCA(R；序列号6)

与无LPS刺激(未处理组)相比，LPS刺激使CCL2mRNA表达上调(LPS组)，但通过与EXP-SUS和EXP-ADH的共培养而使其表达得到抑制。还得到了EXP-SUS时抑制能力更大的结果(图12)。由该结果可知：EXP-SUS和EXP-ADH对炎症是有效的，特别是EXP-SUS，具有优异的抗炎症效果。

产业上的可利用性

根据本发明，可以提供免疫疾病治疗剂和抗炎症剂。

序列表

<110> 日本乐敦制药株式会社（ROHTO Pharmaceutical Co., Ltd.）

国立大学法人东京大学（The University of Tokyo）

<120> 间充质干细胞、免疫疾病治疗剂和抗炎症剂

<130> KP16929W

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 1

gggacacttt gctaaaggcg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 2

gtctgatagc tgggggttgc 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 3

agcctcaaga tcatcagcaa tg 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 4

atggactgtg gtcatgagtc ctt 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 5

aagaagctgt gatcttcaag ac 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 6

ccatggaatc ctgaaccca 19

Claims (7)

1.一种间充质干细胞，其特征在于，犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高。

2.一种间充质干细胞，其特征在于，在利用IFNγ处理而在细胞内诱导的IDO作用下由色氨酸合成的犬尿氨酸产生量或犬尿氨酸分泌量高。

3.一种间充质干细胞，其特征在于，JAK/STAT通路在稳定状态下被激活。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞，其源自脐带组织。

5.一种免疫疾病治疗剂，其含有权利要求1至4中任一项所述的间充质干细胞。

6.一种抗炎症剂，其含有权利要求1至4中任一项所述的间充质干细胞。

7.一种GVHD治疗剂，其含有权利要求1至4中任一项所述的间充质干细胞。

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