JP2018527403A

JP2018527403A - Ｓｏｄ３を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む炎症性疾患の予防又は治療用組成物

Info

Publication number: JP2018527403A
Application number: JP2018515146A
Authority: JP
Inventors: スンカン、キョン; ユンキム、テ
Original assignee: KANGSTEM BIOTECH CO., LTD
Current assignee: KANGSTEM BIOTECH CO., LTD
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2016-09-19
Publication date: 2018-09-20
Anticipated expiration: 2036-09-19
Also published as: WO2017048097A1; EP3351254A4; KR102245312B1; CN108430480A; EP3351254A1; US20240075072A1; US11730766B2; CN108430480B; US20180344774A1; JP6992983B2; KR20170032872A

Abstract

本発明は、SOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物を提供する。本発明者は、SOD3を過剰発現する間葉系幹細胞が一般的なMSCに比べて、より強い抗酸化活性、免疫調節機能を有することを確認しており、従って、SOD3を過剰発現するMSCは、炎症性疾患や自己免疫疾患、臓器移植拒否反応等について、効果的な治療剤になれる。

Description

本出願は、2015年9月15日に出願された韓国特許出願第10-2015-0130377号に基づく優先権を主張し、前記明細書全体は参照により本出願に援用する。

本発明は、SOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物に関するもので、より詳細には、SOD3（extracellular superoxide dismutase）を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関するものである。

炎症性疾患とは、複数の外部刺激又は内部要因により、人体の様々な臓器や組織に、炎症性免疫細胞の浸潤に加え浮腫、発赤及び疼痛が表れ、組織学的変化を示す状態を意味する。これらの炎症は、損傷組織及び移動細胞において生産される、多様な化学伝達物質により引き起こされ、これら化学伝達物質は、炎症過程の形態によって多様なものが知られている。正常な場合、生体は、炎症反応を介して発症要因を中和させ、除去して、傷ついた組織を再生させて、正常な構造と機能を回復させるが、そうでない場合には、慢性炎症のような疾病状態に進行することもある。

これらの炎症性疾患を治療するための、最も一般的な炎症性疾患の予防又は治療剤は、大きくステロイド性及び非ステロイド性の、炎症性疾患の予防又は治療用剤に区分され、このうち殆どの合成炎症性疾患の予防又は治療用剤は、主作用以外に多様な副作用を伴う場合が多いので、効果が卓越し、副作用が少ない炎症性疾患の予防又は治療剤の開発が切実に要求されているのが実情である。

一方、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell、MSC)は、間葉組織系統に分化する能力を有する多分化能前駆細胞である。この細胞は、多様な細胞で適応及び先天性免疫反応を調節して、潜在的な免疫調節効果を伝達することができ、自己免疫疾患を治療するための新たな選択肢として浮上している。また、免疫抑制及び抗炎症効果（特許文献１、２）を有するだけでなく、T細胞の活性化及び増殖を抑制することが知られている（非特許文献１）。

しかし、MSCは、一般的な抗炎症効果についてのみ公知されているだけで、炎症関連疾患に対してより強力な効果を有するように最適化されたMSC幹細胞治療剤は、未だに開発が不十分な実情である。従って、炎症性疾患の予防又は治療に適したMSC治療剤の開発が切実に要求される。

欧州特許第2298861号明細書米国特許出願公開第20120269774号明細書

Li ZJ et al., PloS ONE 8(10)： 77159, 2013

そこで、本発明者らは、副作用が著しく少ないながらも、炎症性疾患の予防及び治療に適した幹細胞を含む炎症性疾患の治療剤について研究を行い、間葉系幹細胞（MSC)においてSOD3を過剰発現すると、免疫調節と抗酸化効果等の機能が著しく向上することを見出し、本発明を完成した。

従って、本発明の目的は、SOD3（extracellular superoxide dismutase）を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、炎症性疾患の治療用製剤を製造するための、SOD3を過剰発現する幹細胞の使用を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記SOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む薬学的組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与することを特徴とする、炎症性疾患の治療方法を提供することである。

前記の目的を達成するために、本発明は、SOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するために本発明は、炎症性疾患の治療用製剤を製造するための、SOD3を過剰発現する幹細胞の使用を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために本発明は、前記SOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む薬学的組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与することを特徴とする、炎症性疾患の治療方法を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。

別段の定めがない限り、本発明に使用される技術的及び科学用語は、本発明が属する分野で通常の知識を有する者が理解するのと同じ意味を有し、下記の文献の記載を参照する（Singleton et al.、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology、2nd Ed.、1994; Janeway, C.、Travers, P.、Walport, M.、Shlomchik、Immunobiology、5th Ed.、2001）。

本発明は、SOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

本発明に係る前記薬学的組成物は、SOD3を有効成分として含む組成物でもあって、有効成分としてSOD3からなる組成物でもあり、又は有効成分として本質的にSOD3からなる組成物でもある。

本明細書で、用語“〜を含む”とは、“含有する”又は“特徴とする”と同じ意味で使用され、本発明に係る組成物又は方法において、具体的に言及されていない追加的な構成成分又は方法の段階等を排除しない。また、用語“〜からなる”とは、別に記載されていない追加的な要素、段階又は成分等を除外することを意味する。用語“本質的に〜からなる”とは、組成物又は方法の範囲において、記載された物質又は段階と共にこれの基本的な特性に実質的に影響を与えない物質又は段階等を含むことを意味する。

本発明で“タンパク質”とは、ポリペプチド又はペプチドとの互換性をもって使用され、例えば、天然状態のタンパク質から一般的に発見されるような、アミノ酸残基の重合体を意味する。

前記“SOD3”とは、細胞外スーパーオキシドディスムターゼ（extracellular superoxide dismutase、EC-SOD）タンパク質であって、３種のスーパーオキシドディスムターゼ（superoxide dismutase）タンパク質のうち、細胞外に分泌されるタンパク質を意味する。ヒトの野生型（wild-type、WT）SOD3タンパク質のアミノ酸配列は、NCBI Genbank databaseのNP_003093.2等のaccession numberで公知であり、ヒトのSOD3タンパク質をコードするmRNAの塩基配列は、NM_003102.2等のaccession numberで公知である。

SOD3タンパク質は、陰イオンの不均化（dismutation)反応を触媒し、細胞外に分泌され、細胞外基質（extracellular matrix）に存在し、抗血管新生、抗炎症、抗化学走性、抗癌活性等の効果を示す。具体的には、皮膚癌、色素沈着性疾患、光老化、皮膚炎、表皮増殖疾患、乾癬、アトピー、蕁麻疹及びアレルギー等の疾患治療に有効な効果を有しており（韓国特許第10-0676502号公報）、血管新生による疾病の予防及び治療にも効果があることが知られている（韓国特許第10-1019470号公報）。また、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、乳癌、甲状腺癌、脳癌、頭頸部癌、悪性黒色腫、リンパ腫等の癌疾患にも、有効な効果を有することが知られている（韓国公開特許第10-2008-108876号公報）。

本発明においてSOD3は、ヒト及びマウスを含む哺乳動物に、好ましくはヒトに由来するタンパク質を意味し、最も好ましくは、配列番号１で示されるヒトの野生型SOD3タンパク質のアミノ酸配列、又は配列番号３で示される組換えSOD3タンパク質のアミノ酸配列（209E-S0D3）を含むものでもある。

前記ヒトの野生型SOD3は、N-末端部位の開始メチオニンのアミノ酸を含めて18番目のアラニンまではシグナルペプチドとなっており、活性化されたSOD3は、前記シグナルペプチドが除去された222個のアミノ酸でからなる。SOD3のC-末端領域（アミノ酸残基210番〜215番）には、ヘパリン結合ドメインを有している。シグナルペプチドを含む240個のアミノ酸からなる、全長のヒトのSOD3アミノ酸配列は、配列番号１で示された通りである。

また、本発明でのSOD3は、全長のヒトのSOD3の内、N-末端部位のシグナルペプチドと、C-末端部位のヘパリン結合ドメインを含む13個のアミノ酸（アミノ酸残基210番〜222番）とが除去された、209個のアミノ酸からなるものでもある。前記シグナルペプチドとヘパリン結合ドメインが除去されたSOD3タンパク質は、本発明において209E-SOD3又は209Eと呼ぶことができ、好ましくは、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有することができる。前記209E-SOD3は、抗-SOD3抗体とも結合することができ、野生型SOD3と同じ酵素活性及びROS除去活性を有することが確認された（韓国公開特許第10-2008-108876号公報）。

本発明におけるSOD3は、野生型SOD3又は209E-SOD3タンパク質と実質的に同等な生理活性を有する機能的同等物（functional equivalent)、機能的誘導体（functional derivative)、及び前記SOD3タンパク質の断片が全て含まれる。実質的に同等な生理活性とは、野生型SOD3と同等な水準の酵素活性及び／又は細胞外分泌特性と細胞内透過性を有することを意味し、SOD3と同等な酵素活性により、幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞において過剰発現されたとき、幹細胞の免疫及び炎症調節能力を向上させることになる。前記幹細胞の免疫及び炎症調節能力とは、具体的には、炎症による免疫細胞の浸潤抑制、前炎症性Ｔ細胞の増殖と分化及び前炎症性伝達物質／サイトカインの発現の抑制、炎症調節能を有する制御性T細胞の増殖と分化及び制御性T細胞関連サイトカインの発現増加、NF-κBシグナル伝達系のリン酸化抑制等を意味し、本明細書で述べた本発明のSOD3を過剰発現する幹細胞が有する特性で記載した通りである。

前記SOD3の機能的同等物は、好ましくは配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列と、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上の配列相同性（homology）を有するポリペプチドでもある。また、前記機能的同等物は、本発明のSOD3のアミノ酸配列のうち、一部の付加、置換又は欠失の結果、生成されるものでもある。前記でアミノ酸の置換は、好ましくは保存的置換である。天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例は次の通りである：脂肪族アミノ酸（Gly、Ala、Pro)、疎水性アミノ酸（Ile、Leu、Val)、芳香族アミノ酸（Phe、Tyr、Trp)、酸性アミノ酸（Asp、Glu)、塩基性アミノ酸（His、Lys、Arg、Gln、Asn)、及び硫黄含有アミノ酸（Cys、Met)。又は、前記機能的同等物には、本発明のSOD3のアミノ酸配列上でアミノ酸の一部が欠失された変異体も含まれる。前記アミノ酸の欠失又は置換は、好ましくはSOD3タンパク質の生理活性に直接的に関連していない領域に位置している。また、前記SOD3のアミノ酸配列の両末端又は配列内に幾つかのアミノ酸が付加された変異体も含まれる。例えば、209E-SOD3のように、SOD3の酵素活性には影響を与えないながらも、SOD3全長の一部分が除去されたペプチドでもあって、SOD3タンパク質と実質的に同等な生理活性を有するSNP等、SOD3の多型性タンパク質でもある。

本発明の機能同等物の範囲には、本発明のSOD3タンパク質の基本骨格及びこれの生理活性を維持しながら、タンパク質の一部化学構造が変異したポリペプチド誘導体も含まれる。例えば、これに限定されるものではないが、本発明のSOD3タンパク質の安定性、細胞内透過性、貯蔵性、揮発性又は溶解度等を変更させるための構造変更がこれに含まれる。

本発明の薬学的組成物に有効成分として含まれるSOD3を過剰発現する幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞でもある。

本発明の“間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell、MSC)”は、骨(bone)、軟骨(cartilage)、脂肪組織(fat tissue)、腱、神経組織(nerve tissue)、繊維芽細胞(fibroblast)及び筋肉細胞(muscle cell)等の具体的な臓器の細胞に分化する前の、多分化前駆細胞(multipotent progenitor)を意味する。本発明において、間葉系幹細胞は、分化されていない状態、つまり幹細胞の状態で組成物中に含まれる。本発明の間葉系幹細胞は哺乳類から由来するものでもあって、好ましくはヒトから由来するものでもある。

本発明の間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、胎盤、骨髄、脂肪組織、筋肉、羊水及び羊膜からなる群より選ばれた組織に由来するものでもある。好ましくは、本発明の間葉系幹細胞は、臍帯血又は胎盤由来の間葉系幹細胞でもあって、最も好ましくは、臍帯血由来の間葉系幹細胞でもある。臍帯血又は胎盤由来の間葉系幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞よりも分化能力及び増殖能力が優れた特徴を有する。

本発明で使用される用語、臍帯血とは、哺乳動物の胎盤と胎児を連結する臍帯静脈から採取された血液を意味する。前記臍帯血は、出産時、供与者の臍帯静脈から容易に採取することができる。より具体的には、通常の膣式分娩の場合には、出産後、子宮内に未だ胎盤が残っている状態で、外に娩出された臍帯静脈から採取することができる。又は帝王切開の場合には、出産後、胎盤も子宮外に娩出された状態で、臍帯静脈から採取する。

本明細書において、“胎盤幹細胞”とは、形状、細胞表面標識又は１次培養後継代数に関係なく、哺乳類胎盤に由来する幹細胞又は前駆細胞として、組織培養基質（tissue culture substrate）、例えば、組織培養プラスチック又はフィブロネクチン被覆組織培養板に付着することを意味する。しかし、本明細書において“胎盤幹細胞”とは、栄養膜細胞（trophoblast)を指すものではない。細胞は、幹細胞の特徴のうち少なくとも一つ、例えば少なくとも一つ以上の細胞類型に分化することができる能力等を備えていれば幹細胞である。

胎盤又は臍帯血から、当業界に公知された方法によって、間葉系幹細胞を分離することができる。前記間葉系幹細胞の分離は、従来知られていた分離方法によっても分離することができる。例えば、密度差を利用した分離法(density gradient fractionation)、免疫選択（immunoselection)及び接着性の差を利用した分離法（differential adhesion separation）等がある。臍帯血又は胎盤から間葉系幹細胞を分離、培養する方法は、従来使用されてきた方法をすべて使用することができる。

前記で分離された間葉系幹細胞の培養は、当業界に公知された細胞培養用培地で行うことができ、例えば、これに限定はされないが、DMEM培地、McCoys 5A培地、Eagle's基本培地、CMRL培地、Glasgow最小必須培地、Ham's F-12培地、Iscove's modified Dulbecco's培地、Liebovitz' L-15培地、RPMI 1640培地、KSB-3基本培地等がある。また、本発明で細胞培養培地には、必要に応じて、１種類以上の補助成分を添加することができ、牛胎児血清、馬、又はヒト等の血清をはじめ、微生物の汚染を防ぐための抗生剤及び抗真菌剤等を使用することができる。

分離又は培養された幹細胞は、使用前まで当業界に公知された方法により保存することができる。一般的に、幹細胞は、凍結保護(cryoprotection)処理した後、冷凍保管することができる。前記凍結保護処理は、当業界に公知されたDMSO、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、i-エリトリトール、D-リビトール、D-マンニトール、D-ソルビトール、i-イノシトール、D-ラクトース又は塩化コリンのような凍結保護剤を利用して行うことができる。

本発明に係るSOD3を過剰発現する幹細胞は、SOD3をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを、幹細胞に形質導入させて得たものでもある。

本明細書において、用語“発現（expression）”とは、細胞におけるタンパク質又は核酸の生成を意味し、“過剰発現(overexpression)”とは、正常な状態又は一般的な状態よりも、特定遺伝子の発現水準が過度に増加したことを意味する。本発明において、SOD3を過剰発現する幹細胞は、具体的には、SOD3タンパク質の発現水準が増加して、SOD3タンパク質の活性が増加している幹細胞である。

本明細書において、“ポリヌクレオチド(polynucleotide)”又は核酸は、一本鎖又は二重鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド（DNA)又はリボヌクレオチド（RNA)を意味する。別段の制限がない限り、天然に生成されるヌクレオチドと類似した方法で核酸にコードされる、天然ヌクレオチドの公知されたアナログも含まれる。

幹細胞からSOD3を過剰発現させる最も一般的な方法は、SOD3遺伝子を含むポリヌクレオチドを幹細胞に人為的に又は実験的に導入して、SOD3遺伝子のコピー数(copy number)を増加させることである。元来の細胞が有していたものではない、外因性(exogenous)ポリヌクレオチドを細胞内に導入することを、形質移入(transfection)、さらに、これにより細胞の遺伝的形質が変化する現象を、形質転換(transformation)と称する。前記外因性ポリヌクレオチドが、ウイルス又はウイルス由来のベクターを介して細胞内に導入される過程を形質導入(transduction)と呼ぶ。本明細書では、用語“形質転換”、“形質移入”及び“形質導入”は、外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入して野生型と異なる遺伝的形質を有するようになったもの又はそのような過程を称するものであって、類似した意味で使用される。

本発明でSOD3をコードするポリヌクレオチドは、哺乳類に由来するSOD3遺伝子でもあって、好ましくは、配列番号２で示されるヒトの野生型SOD3をコードする塩基配列、又は配列番号４で表示される209E-SOD3をコードする塩基配列を含むものでもある。

また、前記SOD3をコードするポリヌクレオチドは、ヒトのSOD3の塩基配列、好ましくは配列番号２又は配列番号４で表示される塩基配列と実質的に同一性を示す配列も含む。実質的な同一性は、ヒトのSOD3をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と、比較対象となる任意の他の塩基配列とを最大限に対応するように配置して、当該技術分野で通常的に利用される分析方法とアルゴリズムを利用して、配列を比較分析する場合、少なくとも70％以上の相同性を示す配列を意味する。前記SOD3をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と実質的に同じ塩基配列によりコードされるタンパク質は、SOD3タンパク質、好ましくは配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質の機能的同等物でもある。SOD3タンパク質の機能的同等物に関しては、本明細書で先に述べた通りである。

本明細書において、“組換え発現ベクター”とは、適切な宿主細胞において目的タンパク質又は目的核酸を発現することができるベクターとして、ポリヌクレオチド挿入物が発現されるように作動可能に連結された、重要な調節要素を含む遺伝子コンストラクトを意味する。“作動可能に連結された(operably linked)”とは、一般的な機能を遂行するように、核酸発現調節配列と、目的とするタンパク質又はRNAをコードする核酸配列とが、機能的に連結されていることを意味する。つまり、タンパク質又はRNAをコードする核酸配列が、発現調節配列によって、遺伝子発現が可能になる方式で連結されたことを意味するもので、例えば、プロモーターと、タンパク質又はRNAをコードする核酸配列とが、作動可能に連結されなければ、コードする核酸配列の発現に影響を与えることになる。組換えベクターとの作動的な連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位特異的DNA切断及び連結は、当該技術分野で一般的に知られた酵素等を使用する。

本発明の組換え発現ベクターは、クローニング分野で通常的に使用されるベクターであれば、その種類は特に制限されず、その例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクター等を含むが、これに制限されない。好ましくは、ウイルスに由来するベクターを使用することができる。前記プラスミドには、大腸菌由来のプラスミド(pBR322、pBR325、 pUC118、pUC119、pET-22b(+))、バチルスサブチリス由来のプラスミド（pUB110、pTP5）及び酵母由来のプラスミド（YEp13、YEp24、YCp50）等があり、前記のウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、又はワクシニアウイルスのような動物ウイルス、バキュロウイルスのような昆虫ウイルス等が使用でき、これに制限されない。

本発明に係る核酸を含む発現ベクターは、当業界に公知の方法、例えば、これに限定はされないが、一過性形質移入(transient transfection)、マイクロインジェクション、形質導入(transduction)、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム介在形質移入(liposome-mediated transfection)、DEAEデキストラン介在形質移入(DEAE dextran-mediated transfection)、ポリブレン介在形質移入(polybrene-mediated transfection)、エレクトロポレーション法(electroporation)、遺伝子銃(gene gun)、及び細胞内に核酸を導入するための公知の方法により、幹細胞内に導入することができる。

本発明に係るSOD3を過剰発現する幹細胞は、SOD3をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを、好ましくはエレクトロポレーション法、又はウイルス介在形質導入方法を利用して、間葉系幹細胞に導入して形質転換したものでもある。

また、本発明の幹細胞は、組換えウイルスベクターを利用して、次の段階を経て製造することができる：（a)シャトルベクター、SOD3をコードする核酸及び／又はタンパク質形質導入ドメインが、作動可能に連結されたDNAコンストラクトを含む組換えウイルスベクターを製造する段階;(b)前記組換えウイルスベクターを、ウイルス生産細胞株に形質移入させてSOD3発現組換えウイルスを製造する段階;及び（c)前記SOD3発現組換えウイルスで間葉系幹細胞を感染させる段階。

前記シャトルベクターは、PUB110、PGX1416、PGX1417、PUL61、PSA77及びPGX1418等があり、本発明の一実施例では、ColE1のpCA14(Invitrogen)を使用した。本発明のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及び鳥ポックスウイルスベクターからなる群より選ばれることを特徴とする。好ましくは、アデノウイルスベクターでもある。

本発明に係るSOD3で形質転換されてSOD3を過剰発現する間葉系幹細胞(MSC)は、免疫抑制機能を有する遺伝子の発現が増加しており、炎症反応で好中球及び樹状細胞の機能と浸潤を調節することにより、強力な免疫調節能力を発揮する。さらに、SOD3を過剰発現するMSCは、前炎症性伝達物質／サイトカインの発現量を著しく減少させ、特にTLR-7とNF-κBの活性化を抑制することが確認された。本発明者の実施例は、SOD3を過剰発現するMSCが、炎症性疾患に対して効果的な治療法になり得ることを示唆する。

本発明のSOD3を過剰発現する幹細胞は、下記特性のうち、少なくとも一つの特性を有することを特徴とする。

（a)CD4＋ T細胞、CD8＋ T細胞、好中球、樹状細胞からなる群より選ばれた複数の浸潤を抑制する特性を示す。
（b)CD4＋ T細胞、CD8＋ T細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞の分化及び増殖は抑制して、制御性T細胞の分化と増殖は促進する特性を示す；
（c)IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17、IL-20、IL-22、IL-23、TNF-α、IFN-γ、CXCL1及びCCL20からなる群より選ばれた一つ以上の炎症性サイトカインの発現を抑制する一方、制御性T細胞関連サイトカインであるIL-10とTGF-βの発現は、増加させる特性を示した；
（d)NF-κB、p38、JNK、STAT1及びSTAT3からなる群より選ばれたいずれか一つ以上のリン酸化を抑制する特性を示す；
（e)体内cAMPの水準を増加させる特性を示す。
（f)icIL-1Ra、TGF-β、IL-10、HO-1、IDO-1等の免疫抑制機能がある遺伝子の発現を増加させる特性を示す。

本発明者らの多様な細胞実験と動物実験を通じて明らかになった、SOD3を過剰発現する幹細胞、特に間葉系幹細胞の免疫調節能力は、具体的に下記の通りである。

本発明の一実施例では、SOD3で形質転換されたMSC(SOD3-MSC)と共培養したHaCaT細胞では、TNF-αとIFN-γの刺激により誘導される前炎症性サイトカイン(proinflammatory cytokine)の発現水準が、形質転換していないMSCと共培養したHaCaTに比べて著しく減少し、逆に抗炎症サイトカインとして知られているTGF-βの発現は増加したことを観察した。

また、他の一実施例では、SOD3-MSCでは形質転換されていないMSC、又は対照群としてLacZで形質転換されたMSC(LacZ-MSC)と比べて、icIL-1Ra、TGF-β、IL-10、HO-1、及びIDO-1のような、多様な免疫抑制機能を有する遺伝子の発現水準が、大幅に増加したことが確認された。これは、SOD3を過剰発現するMSCは、そうでないMSCと比べて、過剰な免疫反応を抑制する免疫調節能力が、大幅に向上したことを示すものである。特にHO-1とIDO-1は、炎症性サイトカインとTh17による反応を抑制して、免疫細胞のアポトーシスを誘導する等の免疫調節活性があることが報告されている。従って、SOD3を過剰発現するMSCは、HO-1又はIDO-1の発現増加を通じて、喘息、乾癬、アトピー等の自己免疫疾患及び臓器移植患者において発生する可能性のある炎症と移植拒否反応を、効果的に調節できることを理解することができる。

本発明の他の一実施例では、MSCと共培養した混合リンパ球培養実験で、形質転換していないMSCと比べて、SOD3-MSCと共培養をした場合に、CD4＋ T細胞とCD8＋ T細胞の分化と増殖が抑制されることを確認した。また、本発明の他の一実施例では、未分化T細胞をそれぞれ異なるMSC(MSC、LacZ-MSC、SOD3-MSC、MSC+DETCA)と共培養しながら、Th1、Th2、Th17、制御性T細胞に分化誘導した結果、SOD3-MSCは、SOD3を過剰発現していないMSCと比べて、未分化T細胞の制御性T細胞への分化は促進させ、Th17と異なるT細胞への分化は抑制することをさらに確認した。

本発明の他の実施例では、炎症性疾患のうち、乾癬のような急性発疹性皮膚炎のモデルとしてマウスの実験を行い、MSCを投与したマウスよりも、SOD3-MSCを投与したマウスの皮膚から、紅斑、角質化等の皮膚症状と、皮膚の厚さ、免疫細胞の皮膚への浸潤現象等で測定される慢性急進性皮膚炎の病変とが、より効果的に改善された。また、細胞実験で確認した結果と同様に、SOD3-MSCを投与したマウスでは、前炎症性伝達物質の発現はより効果的に抑制し、制御性T細胞と関連したIL-10の発現は増加させることが確認された。さらに、シグナル伝達経路に対する実験で、特にNF-κBシグナル伝達体系を抑制することを確認した。

また、卵白タンパク質で誘発されるアトピー類似皮膚炎症のマウスモデルにおいても、MSCを投与したマウスより、SOD3-MSCを投与したマウスでは、炎症病変が著しく改善されることを確認した。

従って、以上の細胞実験と動物実験の結果は、SOD3の過剰発現により、MSCの免疫調節能力が著しく向上することを示し、SOD3を過剰発現するMSCは、炎症性疾患の予防又は治療において、従来の何等の処理もしていないMSCよりも、効果的な幹細胞治療剤として使用できることを示唆している。

本明細書において、“治療”とは、治療される個体又は細胞の、自然的過程を変更させようとする臨床的施術を意味し、臨床的病理の予防のためにも行うことができる。治療の望ましい効果は、疾病の発生又は再発抑制、症状の緩和、疾病の任意の直接又は間接的な病理学的結果の減少、疾病の進行速度の減少、疾病状態の改善、好転、緩和又は改善された予後等を含む。

本明細書で使用される用語“予防”とは、疾病の発症を抑制し、進行を遅延させる、すべての行為を意味する。

本発明における予防又は治療の標的である炎症性疾患は、好ましくは、Th2又はTh17介在性疾患でもある。前記“Th2又はTh17介在性疾患”とは、Th2細胞又はTh17細胞によって介在される疾患を意味する。本発明でのTh2又はTh17介在性疾患は、より好ましくは、臓器移植拒否反応、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、炎症性眼疾患、アトピーを含む炎症性皮膚疾患及びアレルギー性疾患からなる群より選ばれたものでもある。

前記Th2介在性疾患は、Th2細胞により介在される疾患であって、特にアレルギーを起こす抗原（アレルゲン）特異的なTh2細胞の生成及び活性で誘発される疾患を意味する。Th2細胞は、CD4とT細胞受容体(TCR)を発現する免疫細胞であって、GATA3転写因子等の作用によりIL-4、IL-5、IL-6、IL-13等のサイトカインを分泌し、体液性免疫に関与する。Th2細胞が自己抗原(autoantigen)に対して過剰活性化されると、肥満細胞(mast cell)とIgEが関与するアレルギーと過剰免疫反応が起こることが知られている。アトピー性皮膚炎、アトピーと関連した他の皮膚疾患、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息等を含むTh2媒介疾患において、Th2の分化を抑制するか、又は、活性を抑制することにより、Th2介在性疾患を治療できることが理解できる。

前記Th17介在性疾患は、Th17細胞の過剰な分化に因るTh17/制御性T細胞間の不均衡又はTh17細胞の過剰な活性に因り発生するか、又は病状が悪化する疾患を意味する。Th17細胞は、代表的な前炎症性（proinflammatpry)細胞であって、未感作CD4+ T細胞が、TGFβとIL-6が存在する環境で抗原性刺激を受けると、RORγt、STAT-3等の転写因子の作用を通じて分化する。成熟したTh17細胞は、炎症性サイトカインであるIL-17、IL-21、IL-22等を分泌し、炎症が始まった末梢組織に浸潤して、大食細胞、樹状細胞、繊維母細胞、血管内皮細胞、破骨細胞等と相互作用して、炎症性サイトカインとその他の炎症性因子の分泌を増幅させて、組織損傷を引き起こす。このようなTh17細胞は、多様な自己免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患及び臓器移植拒否反応等から主要病因性細胞において明らかになった。一方、制御性T細胞は、Th17細胞とは逆に、炎症を調節する役割をする細胞として、未感作CD4＋ T細胞が、TGFβが存在する抗原から適切な抗原性刺激を受けると、Foxp3等の転写因子を発現して分化するようになる。成熟した制御性T細胞は、TGFβとIL-10等のサイトカインを通じて、T細胞の増殖と活性を減少させるものと知られている。特に免疫系で自己寛容(self-tolerance)に重要な役割を果たし、マウスモデル等の動物実験で制御性T細胞活性を調節して自己免疫疾患と臓器移植拒否反応を治療できる可能性を提示している。

前記制御性T細胞とTh17細胞はそれぞれ、炎症を抑え、炎症を増幅させる、相反した機能を有するが、これらは同じ前駆細胞から分化され、健康な正常状態では、二つの細胞間の均衡を成している。未感作CD4＋ T細胞がTGFβと抗原性刺激によって分化するときに存在する炎症性サイトカインの種類によって、制御性T細胞又はTh17細胞への分化の方向が決定されるが、病因性Th17細胞が過分化され、活性が過剰になり、相互の役割を適切に牽制しなければならない制御性T細胞とTh17細胞の均衡が崩れると、Th17介在性疾患が誘発されるのである。従って、前記Th17介在性疾患において、Th17細胞の増殖と分化は抑制し、制御性T細胞の分化を誘導することにより、免疫細胞間の均衡と恒常性を回復して、前記Th17介在性疾患を治療できることが分かった。

本発明者らは、実施例から細胞実験と動物実験を通じて、SOD3を過剰発現するように形質転換されたMSC(SOD3-MSC)が、Th2又はTh17細胞の分化は抑制し、制御性T細胞の分化は増加させることを確認した。特定T細胞分化条件では、SOD3-MSCと共培養した未感作CD4＋ T細胞は、MSCと共培養していない対照群又はSOD3を過剰発現していないMSCと共培養したT細胞と比べて、IL-4、GATA3等のTh2マーカーと、RORγtとIL-17等のTh17マーカーの発現量は、著しく減少し、Foxp3、TGFβ、IL-10等の制御性T細胞マーカーの発現量は、逆に大幅に増加し、SOD3-MSCが、Th2及びTh17の分化は抑制して、制御性T細胞の分化は増進させることを確認した(実施例<1-7>)。また、慢性急進性皮膚炎症のマウスモデルにおいても、SOD3-MSCを導入したマウスの皮膚では、SOD3を過剰発現していないMSCと比べて、IL-6、IL-17とIL-22等、Th2とTh17関連前炎症性サイトカインの発現量は著しく減少し、逆に制御性T細胞関連炎症調節サイトカインであるIL-10の発現は大幅に増加したことを観察した(実施例<2-3>)。また、前記急進性皮膚炎症のマウスモデルとアトピー類似皮膚炎症のマウスモデルにおいて、SOD3-MSCは、SOD3を過剰発現していないMSCと比べて、症状を改善させる優れた効果があった。以上の実験結果は、SOD3を過剰発現するMSCが、Th2又はTh17介在疾患の効果的な細胞治療剤となれることを示唆している。

また、本発明で炎症性疾患は、より具体的には、急性又は慢性臓器移植拒否反応、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性皮膚疾患、多発性硬化症、膵炎、外傷誘発ショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、嚢胞性線維症、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、骨関節炎、痛風、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、腸疾患性脊椎炎、若年性関節症、若年性強直性脊椎炎、反応性関節症、感染性関節炎、後感染性関節炎、ルー・ゲーリック病、結節性多発動脈炎、過敏性血管炎、ルー・ゲーリック肉芽腫症、リウマチ性多発性筋肉痛、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着関節症、仮性痛風、非関節リウマチ、粘液嚢炎、腱鞘炎、上顆炎、神経障害性関節疾患(neuropathic joint disease、charcot joint)、出血性関節症(hemarthrosis)、アレルギー性紫斑病、肥厚性骨関節症、多中心性細網組織球腫、脊椎側弯症(scoliosis)、血色素症、強皮症、高脂蛋白血症、低ガンマグロブリン血症、家族性地中海熱(familial Mediterranean fever)、ベーチェット病、全身性紅斑性狼瘡、回帰熱、敗血症、敗血症性ショック、急性呼吸困難症候群、多発性臓器不全、慢性閉塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease)、リウマチ性関節炎(rheumatoid arthritis)、急性肺損傷(acute lung injury)、気管支肺形成障害(broncho-pulmonary dysplasia)、第１型糖尿病、第２型糖尿病、動脈硬化、アルツハイマー性痴呆、家族性感冒自己炎症性症候群(familial cold autoinflammatory syndrome)、マックルウェルズ症候群(Muckle-Wells syndrome)、新生児発症多発性炎症性疾患(neonatal multisystem inflammatory disease)、慢性肉芽神経皮膚関節症候群（chronic infantile neurologic cutaneous articular syndrome)、成人発症型ステイル病（adult-onset Still's disease)、接触性皮膚炎、胞状奇胎（hydatidiform mole)、PAPA症候群（syndrome of pyogenic arthritis、pyoderma gangrenosum and acne)、高免疫グロブリンD症候群（hyperimmunoglobulin D syndrome）、クリオピリン関連周期的症候群（cryopyrin-associated periodic syndrome）、角膜炎、結膜炎、網膜炎、網膜血管炎、ブドウ膜炎、眼瞼炎、アレルギー性結膜炎、乾性眼(dry eye)、全身性硬皮症（progressive systemic sclerosis）、多発性筋炎(polymyositis)、自己免疫脳脊髄炎、重症筋無力症(myasthenia gravis)、結節性多発性動脈炎(polyarthritis nodosa)及び繊維組織炎(fibromyalgia syndrome)からなる群より選ばれる一つ以上の疾患でもある。

本明細書において、“臓器移植の拒絶反応(transplant rejection)”とは、具体的には、心臓、肺、心臓及び肺複合、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、腸(bowel)又は角膜等の固形臓器の移植後に、移植を受けた患者の体内免疫細胞が移植器官に浸潤して攻撃することにより、アポトーシスと組織壊死等を誘発して発生する、急性又は慢性の移植拒否反応、及び、骨髄移植後移植片対宿主病（graft-versus-host disease、GVHD）でもある。

前記炎症性疾患の中で、炎症性皮膚疾患は、乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、接触性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、バラ色粃糠疹、扁平苔癬、血管炎、毛孔性紅色粃糠疹、蜂窩織炎、毛嚢炎、癰腫、天疱瘡、水疱性(bullous)天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管浮腫、脈管炎、紅斑及び皮膚好酸球増加症からなる群より選ばれる一つ以上の疾患であることを特徴とする。

また、SOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体及び希釈剤を追加的に含めることができる。前記薬学的に許容される担体及び希釈剤は、幹細胞及びこれの移植を受ける受益者に対して生物学的及び生理学的に親和的なものでもある。薬学的に許容される希釈剤の例としては、これに限定はされないが、塩水、水溶性緩衝液、溶媒及び／又は分散剤(dispersion media)を挙げられる。

また、本発明は、SOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む、自己免疫疾患又は臓器移植拒否反応の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

前述した通り、自己免疫疾患又は臓器移植拒否反応には、共通的に前炎症性Th17細胞が重要に関与しており、本発明者らが究明したところによると、SOD3を過剰発現するMSCは、Th17の増殖と分化は抑制して、炎症を調節する制御性T細胞の分化は促進させる。また、SOD3を過剰発現するMSCは、icIL-1Ra、TGF-β、IL-10、HO-1及びIDO-1のような多様な免疫抑制機能を有する遺伝子の発現水準が大幅に増加させ、過剰な免疫反応を抑制する免疫調節能力が大幅に向上していることを確認した。これにより、通常の技術者は、本発明に係るSOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む薬学的組成物を通じて過剰な免疫反応を抑制することにより、自己免疫疾患と臓器移植拒否反応の予防又は治療の効果が期待できることが分かった。

前記“臓器移植拒否反応”とは、前述した通り、例えば、心臓、肺、心臓及び肺複合、肝臓、腎臓等の固形臓器の移植後に、移植を受けた患者において発生する、急性又は慢性の移植拒否反応、及び骨髄移植後移植患者から発生する移植片対宿主病でもある。

また、前記“自己免疫疾患”とは、体内の免疫システムが、外部から由来する抗原ではなく、内部の正常細胞又はタンパク質を攻撃して発生する疾患であって、具体的な例としては、全身紅斑性狼瘡、狼瘡、リウマチ関節炎、自己免疫性肝炎、自己免疫溶血性疾患、薬剤誘発性自己免疫性溶血性貧血、自己免疫内耳疾患、メニエール病、第１型糖尿病、狼瘡、ベーチェット病、クローン病、ギラン・バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、硬皮症、多発性硬化症、結節性多発動脈炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、白斑、尋常性天疱瘡(Pemphigus vulgaris)、皮膚筋炎、重症筋無力症(myasthenia gravis)、アディソン病(Addison’s disease)等がある。

臓器移植拒否反応と自己免疫疾患は全て、過剰炎症反応を伴う場合が多いので、炎症性疾患にも分類が可能で、先に本明細書で炎症性疾患として記載した疾患の一部がこれに該当することもあり得る。

また、本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与した後、活性成分の迅速、遅速又は遅延された放出を提供することができるように、当業界に公知された方法を使用して剤形化することができる。

前記本発明の薬学的組成物は、注射剤の形で製剤化されることが好ましく、投与経路には経皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下内、鼻腔内、脊髄腔内、口腔内経路を含め得るが、これに限定はされない。本発明の実施例では、マウスにSOD3で形質転換したMSCを、局所皮下注射投与して治療効果を確認した。

また、本発明の薬学的組成物は、導管法を使用して投与されることもあるが、末梢静脈アプローチにおいて、細胞は、単一の塊又は複数個の、より小さい分取量で、導管を通じて注射することができる。導管を利用した細胞の投与は、例えば、標準末梢静脈内導管、中央静脈導管、又は肺動脈導管を通じた静脈内伝達を含めることができる。

本発明の薬学的組成物の投与量は、投与経路、投与時間、治療回数、治療期間、治療が必要な個体の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、薬剤に対する感度、食餌及び排泄率等、多様な要因を考慮して、当業者が上述した特定用途に応じた適切な有効量を決定することができる。前記“有効量”とは、個体に投与したとき、炎症性疾患や自己免疫疾患、臓器移植拒否反応等の改善、治療、予防、検出又は診断効果を示すことに十分な量を意味し、前記の“個体”とは、動物、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトを含む動物でもあって、動物から由来する細胞、組織、器官等でもある。前記個体は、治療が必要な患者でもある。

本発明の方法は、炎症反応を抑制するために必要なだけの幹細胞を利用することができる。例えば、前記の幹細胞は、1×10²個、1×10⁵個、1×10⁷個、1×10⁸個、1×10⁹個又はさらに多くの幹細胞を含むことができる。本発明の一実施例では、2×10⁶個のSOD3で形質転換したMSCをマウスモデルに皮下注射した。

前記投与は、一日に一回又は数回に分けて投与することもできる。本発明の薬学組成物は、単独で投与されるか、又は炎症性疾患や自己免疫疾患、臓器移植拒否反応等の予防又は治療に効果があることが知られている他の治療剤と併用して投与することもでき、併用投与する場合、他の治療剤と順次的又は同時に投与することができる。前記単独投与又は併用投与時、本発明の薬学組成物の投与量は、副作用のない最小限の量で最大の効果を得られる量を投与することが好ましく、これは当業者により容易に決定することができる。

また、本発明は、炎症性疾患の治療用製剤を製造するための、SOD3を過剰発現する幹細胞の使用を提供する。

前記使用と関連して、本発明に係るSOD3を過剰発現する幹細胞、特にSOD3を過剰発現する間葉系幹細胞の炎症調節活性と、これに基づいた炎症性疾患の治療効果、さらに、SOD3を過剰発現する幹細胞の製作方法に対しては、本明細書で前述した通りである。

また、本発明は、SOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む薬学的組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与することを特徴とする、炎症性疾患の治療方法を提供する。

本発明に係る前記薬学的組成物は、SOD3を有効成分として含む組成物でもあり、有効成分としてSOD3からなる組成物でもあって、又は有効成分として本質的にSOD3からなる組成物でもある。

前記炎症性疾患の治療方法と関連して、本発明に係るSOD3を過剰発現する幹細胞、特にSOD3を過剰発現する間葉系幹細胞の炎症調節活性と、これに基づいた炎症性疾患の治療効果、治療効果を表すための有効量及び投与方法等は、本明細書で述べたことを参考にすることができる。

従って、本発明はSOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物を提供する。SOD3で形質転換され、SOD3を過剰発現する間葉系幹細胞は、通常のMSCに比べてより強い抗酸化活性、免疫調節機能を有していて、従って、SOD3形質導入MSCは、炎症性疾患、自己免疫疾患又は臓器移植拒否反応等に対して効果的な治療剤であることができる。

図１は、SOD3で形質転換されたMSC(SOD3-MSC)又は対照群MSC(MSC)のSOD3発現様相を確認するRT-PCR(図１A)、ウエスタンブロット(図１B)、SOD3酵素活性(図１C)の実験結果を示す。図２は、SOD3-MSC又はMSCにおいて、TNF-αとIFN-γ刺激で生成される活性酸素種を観察するための蛍光染色写真と、蛍光光度計の測定結果を示したグラフである。図３は、SOD3形質転換が、MSCの細胞増殖に及ぼす影響を確認するための、時間依存的MTTアッセイの結果(図３A)と、測定された細胞の数(図３B)を示したグラフである。図４は、SOD3-MSC又はMSCが、HaCaT細胞の炎症関連サイトカインの発現に及ぼす影響を確認するためのRT-PCR実験の結果を示す。図５は、MSC、LacZで形質転換されたMSC(LacZ-MSC)、SOD3で形質転換されたMSC(SOD3-MSC)において、RT-PCRで測定した細胞内IL-1Ra(icIL-1Ra)、可溶性IL-1Ra(sIL-1Ra)、非スプライスIL-1Raの発現水準(図５A)及びiclL-1Ra mRNA水準の定量分析(図５B)、HO-1、DIO-1、TGF-β、Galectin-1、IL-10の発現水準(図５C)、該当細胞の培養培地において免疫アッセイで測定したPGE2の水準(図５D)を示す。図６は、陰性対照群(control(-))、陽性対照群(control(+))、さらに実験条件により、何の処理もしていないMSC(MSC)、LacZ形質転換されたMSC(LacZ-MSC)、SOD3形質転換されたMSC(SOD3-MSC)、DETCA処理したSOD3形質転換されたMSC(SOD3-MSC+DETCA)と、それぞれを共培養した混合リンパ球反応の実験における、CD4＋ T細胞とCD8＋ T細胞増殖を測定するための、CFSEベースのフローサイトメトリー(FACS)の結果を示す。DETCAはSOD3酵素抑制剤である。図７は、図６のFACSの結果を定量化したグラフを示す。縦軸の刺激指数（％）は、刺激を加えたときの細胞数／刺激を加えていないときの細胞数の百分率を示す。図８は、T細胞の系統特異的なコア転写因子とサイトカインの発現水準を測定するRT-PCRの結果を示すグラフである。図９は、制御性T細胞系統特異的なコア転写因子及びサイトカインの発現水準を測定するRT-PCRの結果(上段)と、MSCが制御性T細胞分化に及ぼす影響を示すフローサイトメトリーの結果(下段)を示す。図10は、IMQで誘発された慢性急進性皮膚炎症のマウス実験の概要の模式図である。図11は、IMQで誘発された慢性急進性皮膚炎症生体モデル実験で、各実験群マウスの病変進行を示す、マウスの背中の皮膚写真である。図12は、IMQで誘発された慢性急進性皮膚炎症のマウス実験で、Ｈ＆Ｅ染色した各実験群のマウスの背中の皮膚切片の顕微鏡写真である。図13は、IMQで誘発された慢性急進性皮膚炎症のマウス実験で、各実験群のマウスの背中の皮膚の表皮厚さの測定結果を比較する棒グラフである。図14は、IMQで誘発された慢性急進性皮膚炎症のマウス実験で、各実験群のマウスの脾臓に浸潤したT細胞、好中球(Gr1+)及び樹状細胞(CD11c+)の比率を示したグラフである。図15は、IMQで誘発された慢性急進性皮膚炎症のマウス実験で、各実験群のマウスの皮膚に浸潤したT細胞、好中球(Gr1+)及び樹状細胞(CD11c+)を免疫組織化学法で染色して分析した顕微鏡写真である。矢印は、染色された細胞を示したものである。図16は、IMQで誘発された慢性急進性皮膚炎症生体モデル実験で、各実験群のマウスの皮膚に浸潤したT細胞、好中球(Gr1+)及び樹状細胞(CD11c+)の数を示したグラフである。図17は、IMQで誘発された慢性急進性皮膚炎症のマウス実験で、各実験群のマウスの皮膚で発現された前炎症性伝達物質のmRNA水準を測定したRT-PCRの結果を示すグラフである。図18は、IMQで誘発された慢性急進性皮膚炎症生体モデル実験で、各実験群のマウスの皮膚に存在するTLR-7、NF-κB、JNK、p38、STAT1、STAT3、JAK1、JAK2の発現量とリン酸化水準を示すウエスタンブロット実験結果を示す。図19は、IMQで誘発された慢性急進性皮膚炎症生体モデル実験で、各実験群のマウスの血漿から測定したcAMPの濃度を示す棒グラフである。図20は、卵白タンパク質(OVA)で誘発されるアトピー類似皮膚炎症のマウス実験の過程を示す模式図である。図21は、卵白タンパク質(OVA)で誘発されるアトピー類似皮膚炎症のマウス実験で、各実験群のマウスの病変進行を示す皮膚の写真である。

以下、本発明を詳細に説明する。

但し、下記の実施例は、本発明を例示するのみで、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。

＜実験方法＞
MSCの培養及び同定
ヒトの臍帯血に由来する間葉系幹細胞(hUCB-MSC)は、提供者の同意のもとで、ヒトの臍帯の血液サンプルから収集した。臍帯血サンプルは、採取後、抗凝固剤として作用するクエン酸リン酸グルコースを含む採血パックに保管した。実験のための処理は、24時間以内に実施した。Ficoll-Paque PLUS濃度勾配（Amersham Biosciences）の下で遠心分離して、単核細胞分画を分離した。HBSS（Jeil Biotech Services）で洗浄して、低血糖Dulbecco’s modified Eagle培養液(DMEM、Invitrogen Corp)、20％牛胎児血清(Gibco-BRL)、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム及び1％の抗生剤／抗真菌剤(Life Technologies)で再懸濁した。抗生剤／抗真菌剤は、100U／mlペニシリン、100μg／mlのストレプトマイシン、25μg／mlのアムホテリシンBを含む。7日後、付着していない細胞は除去し、付着した細胞を、二種の培養液を週毎に変えながら培養した。細胞は、5％CO₂、37℃の湿潤条件で培養した。融合性細胞の約60％を0.1％トリプシン-EDTAで分離して、培養プレートに移し入れた。

hUCB-MSCの免疫表現型を分析して、MSCと関連した抗原陽性マーカーの存在と、造血系統マーカーの不在をフローサイトメトリー(Epics XL, Beckman Coulter)で調査した。陽性マーカーとしてはCD90(Thy-1)、CD105(endoglin)及びSH3(CD73)があり、造血系統マーカーにはCD34、CD45及びCD31のような内皮細胞マーカーがある。細胞はHLA class Iには陽性であったが、HLA-DRには陰性であった。それぞれの蛍光標識モノクローナル抗体は、Becton Dickinsonから購入した。

エレクトロポレーション法を利用したSOD3形質転換とSOD3過剰発現の確認
本明細書の図1乃至4の実験結果は、エレクトロポレーション法で、SOD3形質転換されたMSCを利用した。エレクトロポレーション法(electroporation)とは、MSCにNeon^TMプロトコル(Invitrogen)により、電気刺激(1000 voltage, 1 pulse)を加えて細胞膜の透過性を増加させた後、DNAを細胞内に導入し、DNAの過剰発現の有無はタンパク質を収得してウエスタンブロットするか、又はヒトのSOD3の遺伝子(Genbank accession number NM_003102.2)をPCRで増幅させて1.5％アガロースゲルで確認した。増幅プログラムは、94℃ 5min；94℃ 40s、57℃ 30s、72℃ 60s（35サイクル）；72℃ 10min；4℃ 0-∞で構成した(∞:無限大、特定された時間がないことを意味する)。

SOD3形質導入のためのアデノウイルス発現ベクター及び形質導入条件
本明細書で図５乃至21の実験結果は、アデノウイルスでSOD3形質導入されたMSCを利用した。ヒトのSOD3を含むpRC／CMV hSOD3ベクターは、相同組換え(homologous recombination)でE1シャトルベクターであるpCA14に挿入した。併合シャトルベクターとベクターdE1-k35/lacZは相同組換えにより、再結合させて最終的にdE1-k35/SOD3コンストラクトを製造した。組換えアデノウイルスを含む上澄み液は、プラークから分離して293細胞において増殖させた。用意されたヒトのSOD3遺伝子又はLacZ遺伝子を含むアデノウイルスは、10の感染多重度(multiplicity of infection, MOI)で間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)に形質導入した。

SOD3の酵素活性測定
SOD3の酵素活性は、スーパーオキシドラジカルを測定して確認した。20μlの試料に200Mキサンチン(sigma)とPBS上の50M WST-1(dojindo)を混合して0.0005unit XOD(sigma)を処理した後、ホルマザン色素シグナル発生を分光学的に測定した。

MTTアッセイ
MSCの細胞増殖を測定するために、MTTアッセイを実施した（Man et al., 2006； Wei chert et al., 1991）。6x10³ cell MSCを24時間培養して、培養されたMSCを、エレクトロポレーション法を利用して、ヒトのSOD3遺伝子で形質転換させた後、24時間、48時間、72時間時点において、MTT(5mg/ml)を、当該ウェルに20μlを処理して、4時間追加培養した。培地を除去して、ウェル当たり100μlジメチルスルホキシドで細胞を溶解させ、吸収波長595nmで吸光度を測定した(Bio-Tek instruments、Winooski、VT、USA)。

TNF-αとIFN-γ刺激によりMSCから生成される活性酸素腫の測定
MSCは6-ウェルプレートに分配して、24時間培養した後、10ng/ml TNF-αと100 U/ml IFN-γで1時間刺激した。30分間ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で細胞を安定させた後、37℃で30分間10μM 2,7-ジクロロフルオレセインジアセタート(H2DCF-DA)で染色した。蛍光波長513nm及び励起波長488nmの条件で、共焦点顕微鏡(confocal microscopy)でDCF蛍光を通じてROSを観察して、蛍光光度計(synergy, Bio Tek、US)で蛍光度を測定した。

免疫抑制分子(immunosuppressive molecule)の発現分析
MSCで発現される免疫抑制機能を有する遺伝子発現を分析するために、次のような方法でMSCを培養して、TNF-α及びIFN-γで刺激した状態及び刺激がない状態で遺伝子発現を分析した：

０日め：60mm培養皿にMSC(1x10⁴ cells/cm²)を培養した後(培地体積: 3ml)、70-80％培養密度で細胞を培養する。

１日目：上記培養されたMSCを、野生型SOD3を含むアデノウイルス又は対照群ウイルス(AdLacZ)で24時間感染させ、SOD3が形質導入されるようにする。

２日目：ウイルス感染24時間後に、新しいMSC成長培地と交換する。

３日目：24時間追加培養し、TNF-α(10ng/ml)とIFN-γ(100unit/ml)を添加して、刺激した細胞及び刺激していない細胞を得て、mRNA水準を測定して、その遺伝子発現分析を遂行する。

遺伝子発現分析のためにQuantiTect Reverse Transcription Kit(qiagen)を利用して、1μlトータルRNAからcDNAを合成した。簡単に、gDNA wipeout Bufferを用いて鋳型RNAからゲノムDNA(genomic DNA)を除去し、42℃で2分間培養した後、すぐに氷で保存した。その後、逆転写酵素(reverse transcriptase)、RTバッファー及びRTプライマーミックスを鋳型RNAと混合した後、42℃で15分、95℃で3分間反応を行った。合成されたcDNAは、使用するまで-20℃で保管した。その後、0.25鋳型、1μlの当該プライマー、10μl TOPポリメラーゼ混合液、及び8.75μlの蒸留水を混合して、最終嵩20μlでRT-PCRを行った。PCRの結果は、1％アガロースゲルで電気泳動して確認した。RT-PCRとリアルタイムPCRに使用されたプライマー配列は以下の通りであり、Bioneer（Korea）に注文し、製作した：icIL-1Ra forward 5'-TTATGGGCAGCAGCTCAGTT-3'（配列番号15)、reverse 5'-TTGACACAGGACAGGCACAT-3'（配列番号16）; sIL-1Ra forward 5'-TCCGCAGTCACCTAATCACTC-3'（配列番号17）、reverse 5'-TTGACACAGGACAGGCACAT-3'（配列番号18）; unspliced IL-1Ra forward 5'-GGCCTCCGCAGTCACCTAATCACTCT-3'（配列番号19）、reverse 5'-GGTCGCACTATCCACATCTGGG-3'（配列番号20）; HO-1 forward 5'-CCTGGTGTCCCTTCAATCAT-3'（配列番号21）、reverse 5'-GGCGATGAGGTGGAATACAT-3'（配列番号22）; IDO-1 forward 5'-TGTGAACCCAAAAGCATTTTTC-3'（配列番号23）、reverse 5'-AAAGACGCTGCTTTGGCC-3'（配列番号24）; TGF-βforward 5'-CCCAGCATCTGCAAAGCTC-3'（配列番号25）、reverse 5'-GTCAATGTACAGCTGCCGCA-3'（配列番号26）; Galectin-1 forward 5'-GGTCTGGTCGCCAGCAACCTGAAT-3'（配列番号27）、reverse 5'-TGAGGCGGTTGGGGAACTTG-3'（配列番号28）; IL-10 forward 5'-AAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCG-3'（配列番号29）、reverse 5'-AGCTATCCCAGAGCCCCAGATCCGATTTTGG-3'（配列番号30）; GAPDH forward 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3'（配列番号31）、reverse 5'-AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'（配列番号32）

プロスタグランジンE2の免疫アッセイ
プロスタグランジンE2(prostaglandin E2、PGE2)の測定は、すべての標準物質とサンプルに対して2回ずつ繰り返して行った。100μlの標準希釈物質(standard diluent、Tissue culture media)は、NSBとBo（0pg/mL 標準物質）に入れて、100μlの標準物質を適切なウェルに添加した。これと同様に、100μlのサンプルを、該当ウェルに添加した。以後50μlアッセイバッファーをNSBウェルに添加して50μl blue conjugateを全活性（TA）とブランクウェルを除いた残りのそれぞれのウェルに添加した。以後50μlのyellow antibodyを各ウェルに添加してプレートシェイカー(〜500rpm)で2時間反応させた。400μlの洗浄溶液で各ウェルを3回洗浄した。最後の洗浄後、各ウェルのバッファーをすべて除去し、リントフリーのペーパータオルを利用して、残っている洗浄バッファーをすべて除去した後、5μl blue conjugateをTAウェルに添加した。次に200μlのpNpp基質溶液を各ウェルに添加した。室温で振盪せずに45分間反応を行い、それぞれのウェルに50μlの停止溶液を添加した後、405nmでの吸光度を測定した。

Ｔ細胞の増殖分析
MSC及びSOD3で形質転換したMSCと共培養したCD4＋及びCD8＋ T細胞の増殖を確認するために、CFSE(carboxyfluorescein diacetate succinimidly ester)-MLR分析を実施した。24ウェルプレート(Costar, Corning)に１×10⁶ 個のCFSE標識された反応細胞(responder cell、C57BL/6マウスの脾臓細胞)を入れて、3000cGYで放射能処理した１×10⁶個の刺激細胞(stimulator cell、Balb/cマウスの細胞)で刺激を実施して、３回繰り返した。CFSE標識は、反応細胞を 200×10⁶ cell/mlの密度でPBSに再懸濁した。5μMの最終濃度でCFSE(Molecular probes, Inc.)を添加して、細胞を光に晒すことなく、室温で10分間振盪培養した。冷RPMI1640培養(Gibco)培地を添加して、細胞のCFSE標識を中断させ、5分間氷に保管した。細胞を分離して培養培地で2回洗浄した後、再懸濁した。CFSEで標識された反応細胞と放射線処理された刺激細胞は、培養培地中で 2×10⁶ cells/mlの密度に調製され、24ウェルプレートで合計1ml嵩になるように、MSC又はSOD3で形質転換されたMSCとT細胞とを10：1の割合で混合して、37℃、5％ CO₂、湿度100％の条件で共培養した。5日間培養した後、細胞を収得して2回洗浄した後、PBSで再懸濁した。反応細胞の下流因子は、FITC結合抗-マウスCD4及びPE結合抗-マウスCD8(BD biosciences pharminogen)を使用して定量した。

Ｔ細胞分化分析
未感作(naive)CD4＋ T細胞は、MACSカラム(Miltenyi Biotech)を利用して、C57BL/6マウスのリンパ節と脾臓から、陰性選別(negative selection)により分離した。分離された細胞は、プレートに付着したCD3抗体と、10％FBS、2mMグルタミン、1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地に添加したCD28抗体(2μg/ml)を利用して活性化した。Th1分化条件(Th1 polarizing conditions; 10μg/ml anti-IL4 Ab、10ng/ml IL-12)、Th2分化条件(Th2 polarizing conditions; 10μg/ml anti-IFN-γ Ab、10ng/ml IL-4)、Th17分化条件(Th17 polarizing conditions; 20ng/ml IL-6、5ng/ml TGF-β、10μg/ml IFN-γ 抗体、10μg/ml IL-4 抗体)又は制御性T細胞分化条件(Treg polarizing conditions; 5ng/ml TGF-β、10ng/ml IL-2)で細胞を分化させた後、MSC又はSOD3形質導入MSCと10：1の割合で4日間共培養した。CD4＋ T細胞の分化のためのサイトカインと抗体は、BD Bioscienceから購入した。培養4日後、細胞を収得して、Th1、Th2、Th17、又は制御性T細胞分化に特異的な分子又はサイトカインを利用して、mRNA発現様相を分析した。

実験動物と疾患モデル
実験に使用したマウスは、8週目のC57BL/6マウスで、特定の病原菌がない状態で、標準マウス飼料と水で飼育して、保健福祉部の指示により、カトリック大学カトリック倫理委員会の規定に基づいて扱った。

マウスの皮膚に慢性急進性炎症を誘発するために、マウスの背中の毛を剃って除去して、12日間、1日1回、62.5mgの市販のイミキモド（imiquimod、IMQ)クリーム（5％、Aldara 3M pharmaceuticals）を、剃られたマウスの皮膚に塗布した。

アトピー類似皮膚炎症を誘発するためにSPF条件で飼ったマウスに、OVAタンパク質10μgと抗原補強剤である水酸化アルミニウム4mgを混合して、実験開始(D0)、7日目(D7)、14日目(D14)に腹腔内に注入して、動物を感作させた。実験開始21日目から、OVA 100μgを 100μlのPBSに溶かして 1x1cm² サイズのガーゼに浸してパッチを作り、除毛したマウスの背中に貼って、7日間免疫反応を誘導した。35日から一週間、再び同じ方法で、OVAパッチで免疫反応を誘導した。実験開始後42日目に、MSC、LacZ-MSC、さらに、SOD3-MSCを病変部位に注射して、49日目に皮膚の変化を肉眼で観察した。

MSCのマウス皮下注射
IMQとオボアルブミンを利用した動物実験でMSCの皮下注射は、各実験条件に合ったMSCを、2x10⁶の細胞数で、マウス皮下に注射し、MSC皮下注射に対する対照群としては、MSCの代わりに同じ嵩のリン酸塩緩衝食塩水(PBS)を皮下注射した。

マウスの皮膚 cAMP濃度分析
IMQ塗布6日目及び12日目のマウスから背中の皮膚細胞と血漿を得て、cAMP濃度を測定した。cAMP濃度分析には、cAMP ELISA kit(BD immunocytometry)を使用した。

マウスモデルの組織学的評価と蛍光組織染色
IMQ塗布6日目及び12日目のマウスから背中の皮膚細胞を収得し、4％パラホルムアルデヒド(PFA)に固定した後、パラフィンに包埋した。皮膚のサンプルは、回転式ミクロトーム（Leica)を利用して、4μm厚さの組織切片を準備した。その後、キシレン(xylene)を利用して脱脂し、濃度勾配アルコールで脱水した。前記前処理した組織切片は、ヘマトキシリンとエオシンで染色した（H&E染色）。蛍光組織染色実験は、組織切片をCD4、CD8、CD11c、Gr-1等に対する１次抗体で反応させた後、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647等の適切な蛍光標識された２次抗体で反応させて実施した。

マウス脾臓細胞フローサイトメトリー（flow cytometry analysis)
各実験群のマウスから全体の脾臓細胞を得て、MACSバッファー(0.5％BSAを含むPBS)に再懸濁し、FITC結合抗マウスCD4抗体、PE結合抗マウスCD8抗体、APC結合抗マウスGr1抗体及びPE結合抗マウスCD11c抗体と反応させた。抗体反応30分後にMACSバッファーで洗浄し、遠心分離して、FACS分析を実行するためにMACSバッファー500μlに再懸濁した。

マウスの皮膚遺伝子発現分析のためのRT-PCRとリアルタイム定量PCR
RNAはTRIzol試薬(Invitrogen)を利用して、マウスの背中の皮膚から得た。cDNAは、1μgのトータルRNAから逆転写システム(Qiagen)を利用して合成した。IL-1α（QT00113505）、IL-1β（QT00021385）、IL-4（QT00160678）、IL-6（QT00182896）、IL-10（QT00106169）、IL-17（QT00103278）、IL-20（QT00126735）、IL -22（QT00128324）、IL-23（QT01663613）、IFNγ（QT00000525）、TNF-α（QT01079561）、TGF-β（QT00025718）、CXCL-1（QT00199752）、CCL20（QT00261898）及びGAPDH（QT02448075）のプライマーセットは、Qiagen社から購入した(上記括弧内の数字は、カタログ番号)。Foxp3、T-bet、GATA3、RORγt、SOD3の発現量を確認するためのプライマー配列は下記の通りである：Foxp3 forward GCAACAGCACTGGAACCTTC（配列番号5)、Foxp3 reverse GCATTGCTTGAGGCTGCGTA（配列番号6);T-bet forward AGCCAGCCAAACAGAGAAGA（配列番号7)、T-bet reverse AATGTGCACCCTTCAAACCC（配列番号8);GATA3 forward ACATGTCATCCCTGAGCCAC（配列番号9)、GATA3 reverse AGGAACTCTTCGCACACTTG（配列番号10）;RORγtforward GCCTACAAT GCCACCACC（配列番号11）、RORγtreverse ATT GAT GAG AAC CAG GGC（配列番号12）; SOD3 forward TGTTGGAGCAGAGGAGAAGCTCAAC（配列番号13）; SOD3 reverse AAGCTCTCTTGGAGCAGCTGGAAA（配列番号14）。GAPDH mRNAを内因性対照群（endogenous control）とした。PCRは、Rotor-Gene 6000(Corbett)とQuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen)を利用して実施した。増幅プログラムは95℃で10分を1サイクル、95℃で20秒、55℃で20秒、72℃で20秒を35サイクルで構成した。

マウスの皮膚タンパク質の発現分析のためのウエスタンブロット
タンパク質サンプルは、マウスの背中の皮膚から得た。同じ量のタンパク質を各レーンにローディングして電気泳動し、メンブレンにタンパク質を転写して、標的タンパク質は、標的タンパク質特異的な１次抗体で反応させて、化学発光システム(GE healthcare Life Science)で感知した。

統計分析
データは、平均±標準偏差(mean±SD)で表示し、統計的有意性は、独立したグループに対するスチューデントのｔ検定、又はANOVAで判断した。統計的に有意な差は本明細書の図面で＊、$、＃等で表示した。別途記載していない場合、全ての実験は３回繰り返した。

＜実施例１＞
SOD3を過剰発現する間葉系幹細胞の製作と効能検証

＜1-1＞SOD3で形質転換されたMSCのSOD3過剰発現確認
ヒトのSOD3遺伝子で形質転換された間葉系幹細胞のSOD3タンパク質発現様相とSOD3酵素活性を調べた。

MSCはエレクトロポレーション法を利用して、ヒトのSOD3遺伝子で形質転換して、24時間後に収得して、RT-PCRとウエスタンブロットを実施して、タンパク質発現量を確認した。SOD3酵素活性は、24時間培養した細胞培養液に存在するスーパーオキシドラジカルの量を測定して確認した。

図１に示した通り、SOD3で形質転換したMSC(SOD3-MSC)では、形質転換していないMSC(MSC)と比べてSOD3のmRNA(図１A)とSOD3タンパク質(図１B)を過剰発現することが分かった。また、SOD3の活性においても、SOD3-MSCは、MSCに比べて著しく高いSOD3活性を示した(図１C)。SOD3で形質転換されたMSCは、SOD3を過剰発現して高いSOD3酵素活性を有することを確認した。

＜1-2＞SOD3で形質転換されたMSCの活性酸素種生成量減少
SOD3で形質転換されたMSCで、TNF-α／IFN-γ刺激により生成される活性酸素種(ROS)の量を調べた。

MSCはエレクトロポレーション法を利用して、ヒトのSOD3遺伝子で形質転換し、TNF-α(10ng/ml)とIFN-γ(100U/ml)で１時間刺激し，生成されるROSはH2DCF-DAで蛍光染色し、蛍光光度計を用いて測定した。

図２に示した通り、形質転換していないMSCでは、TNF-α/IFN-γ刺激により、ROSが多量発生して強い蛍光を示したが、SOD3-MSCでは、TNF-α/IFN-γで刺激した後でも、PBSを処理した対照群（control）と大きく変わらず、却って蛍光が減少する傾向を示した。つまり、SOD3-MSCは、形質転換していないMSCに比べて、活性酸素種生成能が大幅に抑制されていることを確認した。

＜1-3＞SOD3の形質転換がMSCの細胞増殖に及ぼす影響
SOD3形質転換がMSCの細胞増殖に及ぼす影響を、MTTアッセイを用いて調べた。

図３に示した通り、形質転換していないMSCと比べて、SOD3-MSCは、形質転換24時間後、72時間まで細胞増殖が向上されており(図３A)、細胞の数も著しく増加したことが分かった(図３B)。以上の結果は、SOD3による形質転換が、MSCの細胞増殖を促進することを示す。SOD3で形質転換されたMSCの細胞増殖活性が増加したことは、今後、炎症性疾患の細胞治療剤等として開発される場合、治療効率がさらに高まる可能性を示している。

＜1-4＞SOD3で形質転換されたMSCの炎症関連サイトカインの発現抑制効果
SOD3で形質転換されたMSCが、炎症反応の重要な伝達物質であるサイトカインの発現量に及ぼす影響を調べた。

エレクトロポレーション法で形質転換されたSOD3-MSC又はMSCを、ヒトの角質形成細胞(keratinocyte)であるHaCaT細胞株と共培養しながら、TNF-αとIFN-γで12時間刺激した後、HaCaT細胞を収得して、HaCaT細胞が発現する多様な炎症性サイトカインの水準をqRT-PCTで測定した。

図４に示した通り、MSCと共培養したHaCaT細胞では、TNF-αとIFN-γの刺激により、IL-1α、IL-1β、TNF-α、及びCCL-20のサイトカインのmRNA発現水準が大幅に増加したが、SOD3を過剰発現するSOD3で形質転換されたMSCと共培養したHaCaT(SOD3-MSC)では、前記サイトカインの発現量が効果的に抑制されることを確認した。 CXCL-1の場合、形質転換していないMSCと共培養したHaCaT(MSC)では、TNF-αとIFN-γの刺激により発現量が殆ど変わらなかったが、SOD3-MSCと共培養したHaCaTでの発現量は、さらに減少した。一方、抗炎症サイトカインであり、制御性T細胞のマーカーであるTGF-βの場合には、TNF-αとIFN-γで刺激していない状態でSOD3-MSCで共培養したHaCaTが、MSCと共培養したHaCaTより高い発現水準を示し、TNF-αとIFN-γ処理により、その増加幅がさらに大きくなることを観察した。

以上の結果は、SOD3を過剰発現して分泌するMSCは、そうでないMSCと比べて、共培養した隣接HaCaT細胞において、TNF-αとIFN-γで誘発される炎症性サイトカインの発現をより効果的に抑制し、抗炎症性サイトカインの発現は大幅に向上させることにより、炎症反応を多角的で効果的に調節できることを示している。

＜1-5＞SOD3で形質転換されたMSCの免疫抑制関連分子の発現分析
SOD3で形質転換されたMSCで発現される、免疫抑制関連物質の発現様相を分析した。

MSCを培養してAdLacZ又はAdSOD3アデノウイルスで形質導入し、TNF-α(10ng/ml)とIFN-γ(100U/ml)で刺激するか、又は刺激していない状態でRT-PCRを利用して、細胞内IL-1Ra(intracellular IL-1Ra, icIL-1Ra)、水溶性IL-1Ra(sIL-1Ra)、非スプライスIL-1Ra、HO-1、IDO-1、TGF-β、ガレクチン-1、及びIL-10の細胞内mRNA発現水準を測定した(図５のA乃至C)。icIL-1Raの相対的な発現水準は、リアルタイムPCRで分析し(図５B)、GAPDHを対照群に利用した。また、MSCを培養した上澄み液を得て、PGE2 ELISA kit(Enzo Life Sciences、NY、USA)を用いてPGE2濃度を測定した。

図５のA乃至Cに示した通り、SOD3を過剰発現するように形質転換されたMSC(SOD3-MSC)では、形質転換されていないMSC(MSC)又は対照群としてLacZに形質転換されたMSC(LacZ-MSC)と比べて、icIL-1Ra、TGF-β、IL-10、HO-1、及びIDO-1のような多様な免疫抑制機能を有する遺伝子の発現水準が、大幅に増加したことが分かった。興味深いことに、TNF-αとIFN-γで刺激されたMSCでは、IDO-1とIL-10の発現が増加したが、SOD3-MSCでは、これら遺伝子の発現がさらに増加した。反面、SOD3の過剰発現が、MSCのPGE2の分泌量(図５D)やガレクチン-1の発現水準には大きな影響を及ぼさないことが分かった。

IL-1Raを投与された臓器移植患者において、臓器に浸潤した白血球(graft-infiltrating leukocyte)の数が急激に減少したことが報告されたことがある(Shiraishi M et al., J Surg Res., 58(5):465-470, 1995)。従って、SOD3を過剰発現するMSCでは、IL-1Raの発現が大幅に増加するので、これを通じてより効果的に、臓器移植患者における炎症反応と移植拒否を抑制できることを予想することができる。

一方、TGF-βとHO-1は、in vitro及びin vivoにおいて、IL-10の生産と免疫抑制制御性T細胞の生成を促進する一方、前炎症性サイトカインは抑制するものと関連付けられれてきた。 HO-1は、p-STAT3-RORγt経路を抑制することにより、RORγtとFOXP3の発現の速度を調節してTh17の反応を抑制し、抗炎症作用を示すことが確認されたため、喘息、乾癬、アトピー性皮膚炎等の新たな治療剤のターゲットとなっている。また、ヒトのMSCは、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ-1(IDO-1)の発現誘導が可能であることが知られているが、IDO-1は、T細胞の増殖を抑制し、免疫細胞においてアポトーシス(apoptosis)を誘発することにより、免疫抑制を誘導して、急性移植片対宿主病のような自己免疫疾患の重要な調製因子と認められてきた。従って、以上の実施例で確認した通り、MSCにおいてSOD3を過剰発現することにより、HO-1やIDO-1のような、トリプトファンの異化作用経路の活性化を誘導することが、多数の自己免疫疾患の強力な治療剤のターゲットになれることを提示する。

＜1-6＞SOD3で形質転換されたMSCがT細胞の増殖に及ぼす影響
SOD3で形質転換されたMSCが、T細胞の分化及び増殖抑制に及ぼす影響を調べた。

異種のマウス(C57BL/6とBalb/c)から分離したT細胞を、実験条件に応じてMSCを入れない、又は、何の処理もしていないMSC、LacZ形質導入されたMSC、SOD3-形質導入されたMSCと共培養しながら、CFSE基盤混合リンパ球反応実験(CFSE based-mixed lymphocyte reaction、MLR)を実施し、CD4＋又はCD8＋細胞についてフローサイトメトリーを実施して(図6)、フローサイトメトリーの結果を定量分析した(図７)。

図７に示した通り、MSCと共培養していない場合(No MSCs)と比べて、何の処理もしていないMSC(MSC)又はLacZ-形質導入MSC(LacZ-MSC)と共培養した場合には、CD4＋ T細胞とCD8＋ T細胞の増殖が抑制され、SOD3-形質導入MSC(SOD3-MSC)と共培養した場合には、T細胞の増殖がさらに抑制された。一方、SOD3-MSCにSOD3阻害剤であるDETCAを一緒に処理した場合には(SOD3-MSC + DETCA)、T細胞増殖抑制効果は何の処理もしていないMSCとほぼ類似した水準を示した。つまりSOD3-形質導入MSCのT細胞増殖抑制効果は、過剰発現されたSOD3の酵素活性によって、形質導入されていないMSCより増進されたものであることが分かった。

＜1-7＞SOD3で形質転換されたMSCがT細胞の分化に及ぼす影響
SOD3-形質導入MSCが、T細胞の分化に及ぼす影響を調べた。

未感作(naive)T細胞を、Th1、Th2、Th17、又は制御性T細胞、それぞれの分化条件で、実験条件に応じて何の処理もしていないMSCLacZ-MSC又はSOD3-MSCと共培養して、分化誘導されたT細胞が発現する分化関連の主要転写因子の発現水準をリアルタイムqRT-PCRで測定した。

図８に示した通り、Th1、Th2、Th17分化条件で培養したT細胞の系統特異的な転写因子と、サイトカインであるIFNγ、T-bet、IL-4、GATA3、IL-17、RORγt、CCL20の発現様相を、mRNAを測定して確認した結果、MSCと共培養していない対照群(図７で(+))と比べて、何も処理していないMSC又はLacZ-MSCと共培養したT細胞では、前記遺伝子の発現が減少し、SOD3-MSCと共培養した細胞では、前記転写因子とサイトカインの発現がさらに、著しく減少したことを確認した。 SOD3-MSCによる遺伝子発現抑制効果は、Th17細胞の特異的な遺伝子のIL-17、RORγt、CCL-20でさらに強く表れた。一方、SOD3-MSCの共培養にSOD3酵素阻害剤であるDETCAを追加した場合には、SOD3-MSCの前記遺伝子発現抑制効果が、MSC又はLacZ-MSCと類似したものに表れ、これはSOD3- MSCによる遺伝子発現抑制上昇効果は、SOD3の酵素活性によるものであることを示す。

図９に示した通り、制御性T細胞分化条件で培養したT細胞の系統特異的な転写因子と、サイトカインであるFoxp3、TGF-β、IL-10の発現様相を、mRNAを測定して確認した結果、MSCと共培養していない対照群(図９の(+))と比べて、何も処理していないMSC又はLacZ-MSCと共培養したT細胞では、前記遺伝子の発現が増加し、SOD3-MSCと共培養した細胞では、前記転写因子とサイトカインの発現がより顕著に増加したことを確認した。特に、SOD3-MSCによるFOXP3の発現増加効果は、フローサイトメトリーにより、細胞水準で確認することができた(図９下段)。一方、SOD3-MSCの共培養にSOD3酵素阻害剤であるDETCAを追加した場合には、SOD3-MSCの前記遺伝子発現抑制効果が、MSC又はLacZ-MSCと類似したものと示され、これは、SOD3-MSCによる制御性T細胞関連遺伝子発現増加の上昇効果は、SOD3の酵素活性によるものであることを示す。

これは、SOD3形質導入により、元来のMSCのT細胞分化調節効果が著しく増加したことを示し、特に炎症性疾患から病因細胞として作用するTh17細胞の分化は低めて、炎症を調節する効果を有する制御性T細胞の分化を誘導して、より効果的に炎症を抑制できる可能性を提示する。

＜実施例２＞
イミキモドで誘発された慢性急進性皮膚炎症生体モデル

＜2-1＞SOD3で形質転換されたMSCの皮膚炎症症状の抑制効果

実施例１で観察された、SOD3を過剰発現するMSCのT細胞の増殖と分化に対する調節効果を基に、SOD3で形質転換されたMSCが、体内で炎症を調節する効果があるかを調べた。

先天免疫体系のシグナル伝達を活性化させ、乾癬と類似した急進性皮膚炎症を誘発するものと知られているイミキモドを、剃毛したマウスの背中の皮膚に毎日塗布して、皮膚の炎症反応を誘発した。図10の実験の概要に基づいて、IMQ塗布前に、各実験群のマウス(群ごとに5匹のマウス)に、処理条件に応じて、何の処理もしていないMSC、LacZ-形質導入されたMSC、SOD3-形質導入されたMSCを、2x10⁶ ずつ皮下注射して、剃毛したマウスの背中にIMQを12日間持続的に塗布した後、皮膚に生じる炎症反応を比較観察した。皮膚の炎症症状を定量的に分析するために、マウスの背中の皮膚組織を採取して、組織標本をH＆E染色して、皮膚表皮の厚さを測定した。

図11に示した通り、MSCを皮下注射せずにIMQを塗布したマウスでは、IMQを塗布していない対照群（control）と比べて、2-3日後から肉眼で確認可能な紅斑、脱皮及び皮膚が厚くなる等の症状が、炎症症状を伴って表れた。このような症状は、実験開始後6日目（Day 6）に明らかに観察することができ、実験開始後12日目（Day12）まで、これらの症状が継続進行した。何の処理もしていないMSC又はLacZ-形質導入MSCを注射したマウスの場合、IMQで誘発された皮膚の症状が緩和する傾向を示した。一方、SOD3-形質導入されたMSCを注射したマウスは、MSC又はLACZ-MSCを注射したマウスと比べて、紅斑、脱皮等の症状が肉眼でも識別可能な程度に著しく減少したことを観察した。

図12と図13で示した通り、対照群と各実験群のマウスの背中の皮膚組織切片から測定した皮膚表皮の厚さも、肉眼で観察した皮膚の炎症状態と類似した結果を確認することができた。MSCを注射せずにIMQを塗布した場合、皮膚表皮の厚さは対照群に比べて著しく増加し、MSC又はLacZ-MSCを注射した場合、IMQによる皮膚表皮の厚さの増加が減少した。一方、SOD3-MSCを注射したマウスでは、IMQ塗布後、表皮の厚さが殆ど増加しておらず、IMQを塗布していない対照群と類似した水準であり、MSC又はLACZ-SOD3注射したマウスと比べても表皮の厚さが著しく薄いことが確認できた。

以上の結果は、SOD3を用いた形質転換によりSOD3を過剰発現するMSCが、皮膚炎症を緩和する上で、通常のMSCに比べて優れた効果があることを示している。

＜2-2＞SOD3で形質転換されたMSCの好中球及び樹状細胞の浸潤抑制効果
IMQで皮膚炎症が誘発されたマウスの脾臓と皮膚の免疫細胞の構成と動員(recruitment)を調べた。

実験条件によって、それぞれのMSCを注射したマウスの脾臓を構成するCD4＋ T細胞、CD8＋ T細胞、好中球(neutrophil、 Gr1+ cell)、樹状細胞(dendritic cell、 CD11c+ cell)をフローサイトメトリーで調査し(図14)、IMQ塗布した背中の皮膚組織の切片を、他の種類の免疫細胞のマーカーに対して染色して、細胞数を測定した(図15-図16)。

図14に示した通り、IMQ処理したマウスの脾臓では、IMQ処理していない対照群マウスと比べて、CD4 ＋T細胞とCD8 ＋T細胞が減少し、MSCを注射したマウスからは、CD4＋ T細胞とCD8＋ T細胞が多少増加することが分かった。これに反して、脾臓の好中球と樹状細胞は、IMQ処理により、脾臓において数が増加しており、SOD3-MSC処理により、好中球と樹状細胞の数は減少した。

図15と図16に示した通り、皮膚では、IMQ処理によりCD3＋ T細胞、CD8＋ T細胞（データ図示せず）、好中球（Gr1+）及び樹状細胞（CD11c+）が全て大幅に増加し、MSC又はLacZ-MSC処理したマウスでは、IMQで誘発される皮膚の免疫細胞浸潤現象が減少した。SOD3-MSCを処理したマウスでは、他のMSC処理した場合よりも、浸潤現象がさらに抑制され、皮膚組織に存在するT細胞、好中球、樹状細胞が全て著しく減少したことが観察された。

＜2-3＞ SOD3で形質転換されたMSCの炎症反応伝達物質の発現抑制効果
IMQで皮膚炎症が誘発されたマウスの、背中の皮膚のサイトカイン発現様相を、qRT-PCRで測定した。

図17に示した通り、IMQ塗布により多様な炎症性サイトカインのmRNA水準が大幅に増加し、MSC又はLacZ-MSC注射したマウスでは、これらサイトカインの発現量が多少減少する傾向があった。SOD3-MSCを注射したマウスでは、これらの炎症性サイトカインの発現抑制効果が他のMSCと比べて最大に示された。具体的には、Th17細胞が発現するIL-17、IL-22、及び、主な炎症性媒介サイトカインであるIL-23、IL-1β、IL-6、TNF-α等の発現量が、SOD3-MSCによって著しく減少したことを確認した。

一方、抗炎症サイトカイン(anti-inflammatory cytokine)であって、制御性T細胞の炎症調節と関連したIL-10の場合、他の炎症性サイトカインとは異なり、MSC処理により発現量が多少増加し、SOD3-MSCでは、IL-10の増加効果がはるかに優れたものと観察された。

以上の結果は、SOD3の導入により、MSCの炎症調節作用がさらに効果的に増加したことを示し、多様なサイトカインの発現と作用を複合的に調節して炎症性疾患の症状を緩和できることを示唆している。

＜2-4＞SOD3で形質転換されたMSCが炎症関連シグナル伝達に及ぼす影響
IMQはTLR-7及び／又はTLR-8を活性化させ、下位のNF-κBシグナル伝達体系を介して生物学的効果を示すことが知られている。これにSOD3を過剰発現するか、又はMSCを初めとするMSCの処理がTLR-7/TRL-8による信号伝達に及ぼす影響を、IMQ塗布した皮膚を利用してウエスタンブロット実験で調べた。

図18に示した通り、IMQ塗布したマウス等の皮膚では、TLR-7とリン酸化されたNF-κBが活性化されて発現水準も増加したことを確認した(図18A)。 IMQで活性化されたTLR-7のシグナル伝達は、MSC又はLacZ-MSCの処理により減少する傾向を示し、SOD3-MSCによってはさらに著しく減少した。 STAT1/3とJAK1に対しても類似した結果を観察したが、SOD3-MSCは特に、NF-κBのシグナル伝達体系について重点的に著しく抑制効果を示した。

＜2-5＞血漿と細胞でのcAMP濃度の増加
炎症は、体内に流入した抗原がT補助細胞を刺激して、T補助細胞が増殖しながら炎症誘発物質を分泌することで誘発される。 T補助細胞の増殖は、細胞分裂を司る二つの物質であるcAMPとcGMPの割合が変化しながら起こるが、cGMPが高くなると細胞分裂が早くなり、cAMPが高くなると細胞分裂が遅くなる。これらの比率の均衡が崩れると炎症性疾患に罹病する確率が高くなるが、例えば、乾癬患者では、細胞又は血漿内にcGMPの濃度が高い場合が多い。これに実験条件により、それぞれのMSCを処理したマウスの血漿でのcAMPの濃度を測定した。

図19に示した通り、MSC又はLacZ-MSCを注射したマウスの血漿のcAMPの水準は、対照群と比べてcAMP水準が増加し、特にSOD3-MSC注射したマウス血漿のcAMP水準が最も高いことが測定された。IMQ塗布6日目にこのような傾向がさらに明確になった。これらの結果は、SOD3-MSCが細胞的ストレスからの保護機能を果たすことを意味する。

＜実施例３＞
卵白アルブミンにより誘発されるアトピー類似皮膚炎生体モデル

SOD3を過剰発現するMSCの生体内(in vivo)炎症調節効果を、他の動物モデルを利用して確認した。卵白タンパク質(ovalbumin, OVA)を抗原として、Balb/Cマウスにおいてアトピー類似皮膚炎を誘発し、MSCによる炎症抑制効果を比較観察した。

図20の実験の概要に基づいてSPF条件で育てたマウスにOVAタンパク質と抗原補強剤である水酸化アルミニウムを混合して実験を開始（D0）、7日目（D7）、14日目（D14）に腹腔内に注入して動物を感作させた。実験開始21日目から、OVA 100μgを100μlのPBSに溶かして1x1cm² サイズのガーゼに浸してパッチを作成し、除毛したマウスの背中に貼って、7日間免疫反応を誘導した。35日から一週間、再び同じ方法で、OVAパッチで免疫反応を誘導した。実験開始後42日目に、実験条件によってMSC、LacZ-MSC、又はMSC-SOD3を病変部位に注射して(群ごとに5匹のマウス)、49日目に皮膚の変化を肉眼で観察した。

図21に示した通り、MSCを注入せずにOVA処理だけをしたマウス(OVA)の背中の皮膚は、対照群（control）に比べて、皮膚が荒く、角質化が進行し、赤く膨らむ等の皮膚炎症が進行していることを確認できた。何の処理もしていないMSCを注入したマウス(OVA+MSC)又はLacZ-MSCを注入したマウス(OVA+LacZ-MSC)では、OVAのみを処理したマウスに比べて、皮膚の炎症がある程度改善される効果を示した。SOD3-MSCを注入したマウス(OVA+SOD3-MSC)では、皮膚の角質と炎症反応が殆ど消える等、肌の状態が対照群と類似した状態に改善され、特に、他のMSCを注入したマウスと比べて、はっきりした炎症改善効果を確認できた。以上の結果は、SOD3を過剰発現するMSCが、皮膚の炎症緩和において、一般的なMSCに比べて優れた効果があることを示している。

SOD3を過剰発現する間葉系幹細胞は、通常の間葉系幹細胞に比べて、より強い抗酸化活性、免疫調節機能及び細胞性免疫調節機能を有している。SOD3を過剰発現する間葉系幹細胞は炎症性疾患や自己免疫疾患、臓器移植拒否反応に対してより効果的な幹細胞治療剤の開発に有用に利用することができる。

Claims

SOD3(extracellular superoxide dismutase)を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
前記幹細胞は、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、胎盤、骨髄、脂肪組織、筋肉、羊水及び羊膜からなる群より選ばれた組織に由来することを特徴とする、請求項２記載の組成物。
前記炎症性疾患は、Th2又はTh17介在性疾患であることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
前記Th2又はTh17介在性疾患は、臓器移植拒否反応、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性皮膚疾患及びアレルギー性疾患からなる群より選ばれたことを特徴とする、請求項４記載の組成物。
前記炎症性疾患は、急性又は慢性の臓器移植拒否反応、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性皮膚疾患、多発性硬化症、膵臓炎、外傷誘発ショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、嚢胞性線維症、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、骨関節炎、痛風、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、腸疾患性脊椎炎、若年性関節症、若年性強直性脊椎炎、反応性関節症、感染性関節炎、後感染性関節炎、ルー・ゲーリック病、結節性多発動脈炎、過敏性血管炎、ルー・ゲーリック育児腫症、リウマチ性多発性筋肉痛、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着関節症、仮性通風、非関節リウマチ、粘液嚢炎、腱鞘炎、上顆炎、神経障害性関節疾患、出血性関節症、アレルギー性紫斑病、肥厚性骨関節症、多中心性細網組織球腫、脊椎側弯症、血色素症、強皮症、高脂タンパク血症、低ガンマグロブリン血症、家族性地中海熱、ベーチェット病、全身性紅斑性狼瘡、回帰熱、多発性硬化症、敗血症、敗血症性ショック、急性呼吸困難症候群、多発性臓器不全、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性関節炎、急性肺損傷、気管支肺形成障害、第１型糖尿病、第２型糖尿病、動脈硬化、アルツハイマー性痴呆、家族性寒冷自己炎症症候群、マックル-ウェルズ症候群、新生児発症多発性炎症性疾患、慢性乳児神経皮膚関節症候群、成人発症型ステイル病、接触性皮膚炎、疱状奇胎、PAPA症候群、高免疫グロブリンD症候群、クリオピリン関連周期症候群、角膜炎、結膜炎、網膜炎、網膜血管炎、ブドウ膜炎、眼瞼炎、アレルギー性結膜炎、乾性眼、全身性硬皮症、多発性筋炎、自己免疫脳脊髄炎、重症筋無力症、結節性多発性動脈炎及び繊維組織炎からなる群より選ばれる一つ以上の疾患であることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
前記炎症性皮膚疾患は乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、接触性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、バラ色鼻腔疹、扁平苔癬、血管炎、毛孔性紅色鼻腔疹、蜂窩織炎、毛嚢炎、甕症、天疱瘡、水泡性天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管浮腫、脈管炎、紅斑及び皮膚好酸球増加症からなる群より選ばれる一つ以上の疾患であることを特徴とする、請求項６記載の組成物。
前記SOD3は配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１記載の組成物。
前記SOD3を過剰発現する幹細胞は、SOD3をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを幹細胞に形質感染させて得たことを特徴とする、請求項１記載の組成物。
前記組換え発現ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ｓｚクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及び鳥ポックスウイルスベクターからなる群より選ばれたことを特徴とする、請求項９記載の組成物。
前記SOD3をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２又は配列番号４で表示される塩基配列を含むことを特徴とする、請求項９記載の組成物。
炎症性疾患の治療用製剤を製造するための、SOD3を過剰発現する幹細胞の使用。
SOD3を過剰発現する幹細胞を有効成分として含む薬学的組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与することを特徴とする、炎症性疾患の治療方法。