CN109439630B

CN109439630B - 调控辅助伴侣分子进而调控树突状细胞处于特定功能成熟状态的方法及应用

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Publication number: CN109439630B
Application number: CN201811313481.6A
Authority: CN
Inventors: 刘书逊; 易琳; 曹雪涛
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2018-11-06
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2038-11-06
Also published as: CN109439630A

Abstract

本发明涉及通过调控辅助伴侣分子进而调控树突状细胞处于特定功能成熟状态的方法及应用。本发明证实了辅助伴侣分子HSP70L1和DNAJC2在人单核细胞向树突状细胞分化中有一种特定表达的动态规律，在此基础上选取特定时间，促进它们的表达或者抑制它们的表达，能分别抑制和促进人单核来源树突状细胞的分化和功能成熟，利用该树突状细胞可进一步地获得免疫应答能力改变的T细胞。从而，可基于上述设计药物，应用于自身免疫性疾病和抗肿瘤和病毒等的治疗领域，具有广泛的应用前景。

Description

调控辅助伴侣分子进而调控树突状细胞处于特定功能成熟状态的方法及应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及调控辅助伴侣分子进而调控树突状细胞处于特定功能成熟状态的方法及应用。

背景技术

新合成的肽链离开核糖体需要穿越核糖体结构中的“隧道”。在隧道周边围绕着的是结合于核糖体的多个蛋白分子和核糖体RNA，它们发挥对多种新生肽链的“辅助翻译”功能，其中尤为重要的是分拣、折叠以及共价修饰新生多肽链。新生肽链从最初合成的线性到最终形成正确的空间构像，需要多种蛋白的辅助，这些蛋白被称为“伴侣”或“辅助伴侣”分子。

在结合核糖体的“伴侣”和“辅助伴侣”分子中，最为保守的是一个异二聚体复合物，在酵母中称为核糖体相关复合物(ribosome-associated complex，RAC)，在哺乳类细胞中简写为mRAC(mammalian RAC)。RAC和mRAC都是由一个含有J功能域的蛋白和一个热休克蛋白70(Heat-shock protein 70KD，HSP70)同源分子构成。含有J功能域的亚基在人类细胞中则命名为MPP11(M-phase phosphoprotein 11)，又名DNAJC2(Dnal homolog subfamilyC member 2)和ZRF-1(Zuotin-related factor 1)；HSP70同源分子的亚基在人类细胞中是本申请人上世纪90年代率先发现并命名的HSP70L1(HSP70-like molecule 1)(Wan T,ZhouX,Chen G,An H,Chen T,Zhang W,Liu S,Jiang Y,Yang F,Wu Y,Cao X.Novel heat shockprotein Hsp70L1activates dendritic cells and acts as a Th1polarizingadjuvant.Blood.2004；103(5):1747-54)，国际命名为HSPA14。

RAC和mRAC都是稳定的复合物，两个亚基间的相互作用并不受它们结合核苷酸的影响。目前对哺乳类mRAC功能的认识仍然有限，但是根据序列和结构的保守性，一般认为mRAC具有RAC相似的功能。

发明内容

在本发明的第一方面，提供一种使单核细胞向特定成熟状态树突状细胞分化的方法，所述方法选自：

(1)在单核细胞向树突状细胞分化早期提高HSP70L1和/或DNAJC2的表达，从而使其分化为低成熟的树突状细胞；或

(2)在单核细胞向树突状细胞分化中晚期或晚期抑制HSP70L1和/或DNAJC2的表达，从而促进其分化为功能成熟的树突状细胞。

在一个优选例中，所述的低成熟的树突状细胞表达共刺激分子和MHC分子的能力被抑制(即低水平地表达共刺激分子和MHC分子)；或所述的功能成熟的树突状细胞表达共刺激分子和MHC分子的能力被促进(即高水平地表达共刺激分子和MHC分子)。

在另一优选例中，所述的分化早期为：诱导分化培养起始后的第1～40小时，较佳地为6～36小时，更佳地为8～24小时，进一步更佳地为10～18小时；或所述的分化中晚期或晚期为诱导分化培养起始后的第80～150小时，较佳地为90～144小时，更佳地为96～130小时，进一步更佳地为96～120小时。

在另一优选例中，所述的提高HSP70L1和/或DNAJC2的表达包括：在细胞中过表达HSP70L1和/或DNAJC2；较佳地，以包含HSP70L1和/或DNAJC2基因表达盒的表达构建物在细胞中进行过表达；更佳地，所述的表达构建物为病毒载体。

在另一优选例中，所述的诱导分化培养是指以细胞因子进行诱导，所述的细胞因子包括：GM-CSF，IL-4，TNFα，CD40L，IFN-α；较佳地，所述的细胞因子为GM-CSF与选自IL-4，TNFα，CD40L，IFN-α的任一或多个因子的组合；进一步更佳地为GM-CSF+IL4。

在另一优选例中，所述抑制HSP70L1和/或DNAJC2的表达包括：在细胞中沉默HSP70L1和/或DNAJC2；较佳地，包括：以特异性干扰HSP70L1和/或DNAJC2表达的干扰分子来沉默；更佳地，以选自SEQ ID NO:1～6的干扰分子进行HSP70L1的沉默，或以选自SEQ IDNO:7～8的干扰分子进行DNAJC2的沉默。

在另一优选例中，所述的使单核细胞向特定成熟状态树突状细胞分化的方法为非治疗性的方法。

在另一优选例中，所述的使单核细胞向特定成熟状态树突状细胞分化的方法为体外方法。

在本发明的另一方面，提供一种HSP70L1和/或DNAJC2的调节剂的用途，用于使单核细胞向树突状细胞特异性分化；所述表达调节剂选自：上调剂，较佳地其为包含HSP70L1和/或DNAJC2基因表达盒的表达构建物，其用于使细胞分化为低成熟的树突状细胞；或下调剂，较佳地其为特异性干扰HSP70L1和/或DNAJC2表达的干扰分子，其用于使细胞分化为功能成熟的树突状细胞。

在一个优选例中，所述的表达构建物为病毒载体；或

所述的干扰分子选自针对HSP70L1的选自SEQ ID NO:1～6的小干扰分子，或针对DNAJC2的选自SEQ ID NO:7～8的小干扰分子。

使单核细胞向特定成熟状态树突状细胞分化的方法所述的用途为非治疗性的用途。

在本发明的另一方面，提供一种用于使单核细胞向树突状细胞特异性分化的调节剂，其为干扰分子或携带该干扰分子的表达载体，所述干扰分子选自：针对HSP70L1的选自SEQ ID NO:1～6的小干扰分子；或针对DNAJC2的选自SEQ ID NO:7～8的小干扰分子；较佳地，所述的干扰分子构成组合，所述组合选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。

在本发明的另一方面，提供一种制备免疫应答能力低下(如免疫应答无能)的T淋巴细胞(或细胞培养物)的方法，包括：以前述的步骤(1)的方法获得低成熟的树突状细胞，以该树突状细胞与T淋巴细胞(如CD4+T淋巴细胞)接触，获得免疫应答能力低下(如免疫应答无能)的T淋巴细胞。

在本发明的另一方面，提供一种制备免疫应答能力增强的T淋巴细胞(或细胞培养物)的方法，包括：以前述的步骤(2)的方法获得功能成熟的树突状细胞，以该树突状细胞与T淋巴细胞(如CD4+T淋巴细胞)接触，获得免疫应答能力增强(如免疫应答无能)的T淋巴细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、定量PCR检测人单核细胞向树突状细胞分化过程中HSP70L1或DNAJC2的表达。新鲜分离的单核细胞为d0天，其余各点为单核细胞在GM-CSF+IL4诱导培养基下向树突状细胞分化的不同时间(d1，d2，d3，d4，d5，d6，d7)。DNAJC2或HSP70L1的相对表达＝各时间点DNAJC2或HSP70L1的表达相对于内参GAPDH表达/d0时间点DNAJC2或HSP70L1的表达相对内参GAPDH表达。

图2、WB检测HSP70L1或DNAJC2的表达。选取分化第一天的人单核来源树突状细胞，经AdDANJC2或AdHSP70L1转染后48h，WB检测HSP70L1或DNAJC2的表达。

图3、AdHSP70L1和AdDNAJC2介导的基因修饰早期分化人单核细胞来源树突状细胞低水平表达共刺激分子和MHC-II分子。在人单核来源树突状细胞的分化不同时间点，进行AdHSP70L1和AdDNAJC2介导的基因修饰，48小时后，流式细胞检测共刺激分子CD86和MHC-II(HLA-DR)的表达(A)；在分化18h，进行AdHSP70L1，AdDNAJC2和AdHSP70L1+AdDNAJC2介导的基因修饰，48小时后，流式细胞检测共刺激分子CD86和MHC-II(HLA-DR)的表达(B)。

图4、AdHSP70L1和AdDNAJC2介导的基因修饰早期分化人单核细胞来源树突状细胞诱导同种T细胞免疫应答无能。在人单核来源树突状细胞的分化后10小时，进行AdHSP70L1和AdDNAJC2介导的基因修饰，48h后与CFSE标记的同种CD4+T淋巴细胞按照1：20培养，5天后流式细胞检测CD4+T淋巴细胞增殖情况。

图5、定量PCR检测HSP70L1或DNAJC2的表达。选取分化96h的人单核来源树突状细胞，经干扰RNA转染后24h，定量PCR检测HSP70L1或DNAJC2的表达。DNAJC2或HSP70L1的相对表达＝siDNAJC2或siHSP70L1处理组的表达相对于各自内参GAPDH表达/对照SiRNA处理组DNAJC2或HSP70L1的表达相对其内参GAPDH表达。

图6、靶向干扰HSP70L1和DNAJC2在中晚期人单核细胞来源树突状细胞显著上调表达共刺激分子和MHC分子。在人单核来源树突状细胞的中-晚期的分化不同时间点，进行siHSP70L1和siDNAJC2介导的抑制，48小时后，流式细胞检测共刺激分子CD86和MHC-II(HLA-DR)的表达。左上数字：Y参数量；右下数字：X参数量。

图7、靶向干扰HSP70L1和DNAJC2在中晚期人单核细胞来源树突状细胞显著增强同种T细胞免疫应答。在人单核来源树突状细胞分化的96小时，进行siHSP70L1或siDNAJC2介导的表达抑制，48h后与CFSE标记的同种CD4+T淋巴细胞按照1:20培养，5天后流式细胞检测CD4+T淋巴细胞增殖情况。

具体实施方式

发明人经过长期而深入的研究，首次揭示了辅助伴侣分子HSP70L1或DNAJC2在人单核细胞向树突状细胞分化的过程中具有分化前期先降低，在分化中晚期后升高的动态表达规律，在此基础上发现在分化的特定时期进行针对HSP70L1或DNAJC2的调控，可以调控树突状细胞处于特定的成熟状态；进一步地，将该树突状细胞与T淋巴细胞接触，或利用该树突状细胞处理/刺激T淋巴细胞，可调控T细胞的免疫应答的能力。

更具体地，本发明人在研究中发现组成核糖体相关复合物的HSP70L1和DNAJC2在人单核细胞向树突状细胞分化的过程中具有分化开始先降低，在分化中晚期后升高的动态表达规律，在此基础上，构建了携带HSP70L1或者DNAJC2的表达构建物和靶向HSP70L1或者DNAJC2的下调剂，在人单核细胞来源树突状细胞分化发育的不同时期，基于这两个分子的表达，反其道而行之，利用上述重组病毒载体或下调剂，对其进行基因修饰或者干扰处理。结果证明，在分化早期经过HSP70L1或者DNAJC2的基因修饰、提高它们在树突状细胞中的表达，则使树突状细胞分化为一种低成熟的树突状细胞，低水平的表达共刺激分子和MHC分子，能够诱导T细胞的免疫应答无能；反之，在分化晚期利用HSP70L1或者DNAJC2下调剂处理树突状细胞，能够使其高水平的表达共刺激分子和MHC，有效的激发同种T细胞免疫应答。因此，基于分化时机选择制备的HSP70L1或者DNAJC2基因修饰的树突状细胞，和靶向抑制HSP70L1或者DNAJC2表达的树突状细胞可以作为细胞治疗产品，分别应用于抗炎和抗自身免疫，抗肿瘤和感染性疾病的治疗。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，所述的“提高表达”、“过表达”、“促进表达”、“上调表达”可以互换使用，是指细胞内HSP70L1和/或DNAJC2的含量(如表达量)超过未转入该外源基因的细胞的水平；如与转入前的细胞相比，其含量高20％，较佳地高50％；更佳地高100％以上，如高200％，300％...500％或更高。一种“过表达”的情形是将外源的HSP70L1和/或DNAJC2的编码基因转入细胞中且发生表达。

如本文所用，所述的“低表达”、“下调表达”、“抑制表达”或“阻滞表达”可互换使用，是指细胞中某一基因含量(如表达量)显著低于其正常水平(如与野生型细胞相比，其表达量低20％，较佳地低50％；更佳地低100％以上，如低200％，300％...500％或更低)，所述的低表达还包括不表达的情况。低表达可通过基因敲除、基因沉默、蛋白抑制等本领域熟知的技术来实现。

如本文所用，所述的“分化早期”为单核细胞向树突状细胞分化培养起始后的第1～40小时，较佳地为6～36小时，更佳地为8～24小时，进一步更佳地为10～18小时。

如本文所用，所述的“晚期或晚期”单核细胞向树突状细胞分化培养起始后的第80～150小时，较佳地为90～144小时，更佳地为96～130小时，进一步更佳地为96～120小时。

如本文所用，所述的“低成熟的树突状细胞”是指成熟度低于常规诱导培养的树突状细胞，体现在其表达共刺激分子和MHC分子的能力被抑制，所述的抑制是显著性的或具有统计学意义的，例如被抑制5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、30％以上、50％以上等。应理解，本领域技术人员在本发明的提示下，在实验中可以意识到这种成熟状态的变化。

如本文所用，所述的“功能成熟的树突状细胞”是指成熟度高于常规诱导培养的树突状细胞，体现在其表达共刺激分子和MHC分子的能力被提高/促进，所述的提高/促进是显著性的或具有统计学意义的，例如提高/促进5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、30％以上、50％以上等。应理解，本领域技术人员在本发明的提示下，在实验中可以意识到这种成熟状态的变化。

辅助伴侣分子HSP70L1或DNAJC2

辅助伴侣分子DNAJC2是一个DnaJ/HSP40(热休克蛋白40)家族蛋白，也被称为J蛋白，在原核生物和真核生物的进化过程中具有高度的保守性。人DNAJC2分子，由621个氨基酸构成(SEQ ID NO:17)，其中J功能域位于N端，C端含有2个重复的SANT功能域样的结构域，具有结合DNA的功能。DNAJC2在细胞内，存在着胞浆和胞核两种分布，说明除了“辅助伴侣”作用，位于核内的DNAJC2可能还参与基因的表达调控。作为“辅助伴侣”分子，DNAJC2主要是激活“伴侣分子”HSP70的ATP酶活性。由于ATP的水解作为必不可少的环节，DnaJ/HSP40蛋白便决定了HSP70能否与之底物蛋白相互作用，并增强它们之间的稳定性。DNAJC2还是一个表观调控因子，其功能在于它包含的SANT功能域，参与细胞不对称分裂、细胞周期、细胞凋亡、分化以及肿瘤的发生发展等过程。DNAJC2发挥表观调控的机制在于，它可以结合在119位赖氨酸单泛素化修饰的组蛋白H2A(H2AK119ub)，促进多梳蛋白复合物(PRC1)与H2AK119ub的解离，从而将多梳蛋白PRC1蛋白复合物所抑制的基因转换为活化状态，从而参与细胞分化的调控。

辅助伴侣分子HSP70L1(SEQ ID NO:18)的N端具有大多数HSP70家族成员共有的ATPase功能域，C端含有一个肽结合功能域，因此归属于HSP70家族。当细胞处于稳态的条件时，HSP70L1(HSPA14)存在于胞浆，作为mRAC的另一个组分，人HSP70L1是否具有DANJC2的“辅助伴侣”功能，目前尚不明确。但是，本发明人研究发现，在应激时，细胞会释放HSP70L1，细胞外的HSP70L1与同家族的HSP70类似，具有免疫刺激作用。这种作用依赖于抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)的存在，尤其是树突状细胞(dendritic cell，DC)。HSPA14可以与APC表面的TLR2/TLR4以及其他未知受体结合，激活细胞内的NF-kB和MARKs通路，诱导炎性细胞因子的释放和DC的功能成熟，从而激活固有免疫应答和适应性TH1免疫应答。

本发明还包括HSP70L1多肽或DNAJC2多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的HSP70L1或DNAJC2多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个，1个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个，1个)氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)与HSP70L1多肽或DNAJC2多肽的天然序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地95％(如98％，99％)以上序列同源性的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括HSP70L1或DNAJC2的活性片段和活性衍生物。

任何一种HSP70L1多肽或DNAJC2多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，HSP70L1多肽或DNAJC2多肽的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白，其仍然能保持全长的HSP70L1多肽或DNAJC2多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长HSP70L1多肽或DNAJC2多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长HSP70L1多肽或DNAJC2多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

编码HSP70L1多肽或DNAJC2多肽或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。术语“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。多核苷酸的变异体也是可用的，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

调控方法及调节剂

基于本发明人的新发现，本发明提供了所述的HSP70L1多肽或DNAJC2多肽其编码基因的用途，用于作为调控靶点，诱导单核细胞来源的树突状细胞特异性分化。

在一种方式下，在单核细胞在向树突状细胞分化的早期过表达HSP70L1和/或DNAJC2，从而使其分化为低成熟的树突状细胞；利用该树突状细胞可进一步地获得免疫应答能力下调(如免疫应答无能)的T淋巴细胞。

在另一种方式下，在单核细胞向树突状细胞分化中晚期或晚期抑制HSP70L1和/或DNAJC2的表达，从而促进其分化为成熟的树突状细胞；利用该树突状细胞可进一步地获得免疫应答能力增强的T淋巴细胞。

本发明还涉及HSP70L1和/或DNAJC2或其编码基因的上调剂或下调剂及其用途。由于HSP70L1和/或DNAJC2的上调剂或下调剂可调节HSP70L1和/或DNAJC2的表达和/或活性等，因此，所述的HSP70L1和/或DNAJC2的上调剂或下调剂也可通过对HSP70L1和/或DNAJC2的影响来调节单核细胞向树突状细胞分化。

任何可调节HSP70L1和/或DNAJC2蛋白的活性、调节HSP70L1和/或DNAJC2蛋白的稳定性、促进或抑制HSP70L1和/或DNAJC2蛋白的表达、延长或减少HSP70L1和/或DNAJC2蛋白有效作用时间、或促进或降低HSP70L1和/或DNAJC2基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节单核细胞向树突状细胞分化的有效物质。

在得知了所述的HSP70L1和/或DNAJC2的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的HSP70L1和/或DNAJC2蛋白的表达或活性。比如可通过一定的途径将携带HSP70L1和/或DNAJC2编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的HSP70L1和/或DNAJC2蛋白。

作为本发明的一种实施方式，将HSP70L1和/或DNAJC2基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，在细胞分化的早期将所述的带有外源基因的重组载体导入到细胞中，使细胞分化为低成熟的树突状细胞，利用该树突状细胞可进一步地获得免疫应答能力下调(如免疫应答无能)的T淋巴细胞。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含HSP70L1和/或DNAJC2的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。其它增加HSP70L1和/或DNAJC2表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强HSP70L1和/或DNAJC2的表达。或者通过增强子来增强该HSP70L1和/或DNAJC2的表达等。

在得知了所述的HSP70L1和/或DNAJC2的用途后，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来在单核细胞向树突细胞分化的中晚期降低HSP70L1和/或DNAJC2蛋白的表达或使之缺失表达，比如将沉默HSP70L1和/或DNAJC2的干扰分子递送到靶点上，使得细胞不表达或降低表达HSP70L1和/或DNAJC2。

利用小分子干扰的方式包括但不限于：siRNA或miRNA调控的基因沉默，正义RNA引起的共抑制(Cosuppression)，反义RNA抑制，病毒介导的基因沉默(Virus Induced GeneSilencing，VIGS)，发卡式RNA(hairpinRNA，hpRNA)介导的基因沉默等，这些也可被应用于本发明中。

作为本发明的一种优选方式，所述的HSP70L1和/或DNAJC2的下调剂是一种HSP70L1和/或DNAJC2特异性的小干扰RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。

小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

作为本发明的特别优选的方式，提供了几组效果良好的小干扰RNA分子，所述的小干扰RNA分子可特异性地干扰HSP70L1和/或DNAJC2基因的表达，与其它的人类核酸序列没有显著的同源性；经验证其具有良好的干扰效果。所述的小干扰RNA分子构成组合，所述组合选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6；或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。

本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了HSP70L1和/或DNAJC2这一靶点与细胞分化的相关性以后，可以以各种途径方便地制备出所述的小干扰RNA，从而用于特定的分化。所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到体内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到体内。

此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。

所述的干扰分子包括经修饰的干扰分子，从而提高其干扰作用，或提高其稳定性等；较佳地，所述的修饰包括但不限于：对骨架部分磷酸基团进行硫代修饰、2’核酸进行甲氧基修饰或3’端偶联胆固醇等。

所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

作为本发明的一种可选方式，所述的HSP70L1和/或DNAJC2的下调剂是一种特异性与HSP70L1和/或DNAJC2多肽结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用HSP70L1和/或DNAJC2蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达HSP70L1和/或DNAJC2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier，N.Y.，1981)。

本发明的实施结果表明，利用HSP70L1或DNAJC2的基因修饰(过表达)需要在人单核细胞向树突状细胞分化的早期施行，只有这个时期才能够将树突状细胞分化维持在低成熟阶段，具有负向调控T细胞应答的调节性DC的特征：转染时机非常重要，在分化的分化培养起始后的第1～40小时，较佳地为6～36小时，更佳地为8～24小时，进一步更佳地为10～18小时是特别合适的。若是超过72小时转染，大多数人单核来源树突状细胞此时都已自发升高这两个分子，再进行过表达，则将无法诱导调节性DC的生成。

本发明的实施结果也表明，抑制HSP70L1和/或DNAJC2的表达需要在人分化培养的中晚期进行，所述的分化中晚期或晚期为分化培养起始后的第80～150小时，较佳地为90～144小时，更佳地为96～130小时，进一步更佳地为96～120小时。只有这个时期才能够充分活化树突状细胞的功能。处理时机非常重要，超出本发明所限定的范围(特别是优选的范围)，不能实现人单核来源树突状细胞的活化程度的最大化。

免疫应答能力改变的细胞

基于本发明的新发现，还提供了一种应答能力下调的T淋巴细胞或T淋巴细胞培养物(或组合物)，所述细胞由单核来源树突状细胞诱导T淋巴细胞分化获得，所述的单核细胞在向树突状细胞分化的早期过表达了HSP70L1和/或DNAJC2。以及，本发明提供了一种应答能力增强的T淋巴细胞或T淋巴细胞培养物(或组合物)，所述细胞由单核来源树突状细胞诱导淋巴T细胞分化获得，所述的单核细胞在向树突状细胞分化的中晚期或晚期HSP70L1和/或DNAJC2的表达被下调。

使细胞过表达外源基因(在本发明中为转录因子)的方法是本领域技术人员所熟知的。编码转录因子的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的病毒(如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒)、细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。包含编码转录因子的多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化细胞，以使其能够表达所述的转录因子。

培养细胞的方法可参照本领域已知的技术。富集(或分离纯化细胞的方法也是本领域人员熟知的，例如可基于T细胞所表达的特殊蛋白或分子标记来选择收集(例如采用特异性抗体或配体)。

与现有技术比，本发明具有以下独特的技术效果：

本发明的一个方面通过靶向已知编码序列的HSP70L1或者DNAJC2，利用现有技术实现高表达这两个分子于人单核来源树突状细胞，通过研究发明了一种基于分化时间的制备方法；时间选择不适合，将无法达到调节性树突状细胞的特征。

本发明的另一方面通过研究，筛选出了一种靶向已知分子HSP70L1或者DNAJC2的干扰RNA序列，并利用此序列通过处理处于不同分化时间的人单核来源树突状细胞的筛选，获得了一种充分活化的人单核来源树突状细胞，能够实现激发和增强免疫应答的目的。

不同于目前治疗炎性和自身免疫性疾病、以及抗肿瘤抗感染的化合物类药物本发明是基于树突状细胞的细胞类药物靶点；不同于利用病原相关分子模式来源的以及外源性细胞因子等形式的免疫调节剂或者抑制剂，本发明是靶向细胞内的信号分子，通过一种基于分化时间选择制备的树突状细胞技术方案，可以克服上述药物的缺点，用于将来基于树突状细胞介导的细胞免疫治疗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、HSP70L1和DNAJC2在人单核细胞向树突状细胞分化过程中的表达

本发明中CD14和CD4免疫磁珠购自Miltenyl Biotec公司；RPMI1640、DMEM培养基、胎牛血清FBS和Ficoll1.077购自PAA公司；人GM-CSF和IL-4购自R&D公司；引物合成委托生工生物技术公司完成，引物序列如下所述：

用于定量PCR检测HSP70L1的引物：

5’-TGTAGTTATTACTGTCCCGTTTG-3’(SEQ ID NO:9)；

5’-GATAAGGATGTTCCTCCAAGC-3’(SEQ ID NO:10)。

用于定量PCR检测DNAJC2的引物：

5’-AAGAACATTAGTTGGACAATGCATAC-3’(SEQ ID NO:11)；

5’-TCTTTGTTTTTCTTTAGCTTCTTGC-3’(SEQ ID NO:12)。

人单核来源树突状细胞的制备：取健康志愿者抗凝血200ml，应用Ficoll1.077密度梯度离心，获得人外周血单个核细胞；免疫磁珠法分离人单核细胞，简言之，将2×10⁸人外周血单个核细胞与200μl CD14免疫磁珠于4℃孵育15分钟；将结合了免疫磁珠的人外周血单个核细胞置于磁场中，洗去阴性细胞，从柱中冲出阳性细胞，即为人外周血CD14⁺单核细胞。将新鲜分离的人CD14⁺单核细胞(Mo)按照10⁶个细胞/ml培养在含有10％FBS、人GM-CSF(500U/ml)、人IL-4(10ng/ml)的RPMI 1640培养基中。收集上述培养不同时间的人单核来源树突状细胞，提取总mRNA，定量RT-PCR检测处于不同分化时间HSP70L1和DNAJC2的表达。

结果显示，HSP70L1和DNAJC2在人单核细胞向树突状细胞分化过程中具有早期降低中晚期升高后又降低的特征(图1)。

实施例2、AdHSP70L1和AdDNAJC2介导的基因修饰人单核细胞来源树突状细胞的制备及其生物学特性

本发明中限制性内切酶和Taq酶购自NEB公司；携带HSP70L1或者DNAJC2编码序列的重组腺病毒委托汉恒生物技术公司制备；荧光标记的抗体购自BD Bioscience公司；引物合成委托生工生物技术公司完成，引物序列如下所述：

克隆全长HSP70L1的引物：

5’-CCGCTCGAGATGGCGGCCATCGGAGTTC-3’(SEQ ID NO:13)；

5’-CGCGGATCCAGATGCTATCTCAATAGAGATTGC TTCAC-3’(SEQ ID NO:14)。

克隆全长DNAJC2引物：

5’-CCGCTCGAGATGCTGCTTCTGC CAA G CG-3’(SEQ ID NO:15)；

5’-CGCGGATCCTTTCTTGGCTCTACTTGCATTCAG-3’(SEQ ID NO:16)。

HSP70L1或者DNAJC2基因修饰的人单核来源树突状细胞的制备：人外周血单核细胞来源树突状细胞制备如实施例1所述；提取培养7天的人单核来源树突状细胞总mRNA，RT-PCR扩增全长HSP70L1和DNAJC2CDS；克隆至T载体；送汉恒生物技术公司，委托构建重组腺病毒载体；按照MOI＝100转染AdHSP70L1或AdDNAJC2，获得重组细胞，48h后WB检测HSP70L1或者DNAJC2的表达(图2)；

在单核细胞向树突状细胞分化的不同时间，按照MOI＝100转染AdHSP70L1，AdDNAJC2或AdHSP70L1+AdDNAJC2，继续培养48-72小时；对基于分化时间制备的HSP70L1或DNAJC2的基因修饰人单核来源树突状细胞进行：1)标记共刺激分子和MHC-II，流式细胞仪检测这些分子的表达(图3)；2)与CFSE-标记的同种T淋巴细胞、相同供着来源成熟单核来源树突状细胞按照1:20共培养4天，检测T细胞增殖情况(图4)。

结果显示，AdHSP70L1和AdDNAJC2介导的基因修饰人单核细胞来源树突状细胞能够高表达HSP70L1或者DNAJC2(图2)；只有在分化的早期进行基因修饰，使HSP70L1或/和DNAJC2高水平的表达能够抑制单核来源树突状细胞的分化成熟，表现在低水平地表达共刺激分子和MHC分子(图3A)，共同高表达这两个分子抑制水平更加强烈(图3B)，在分化早期过表达HSP70L1或DNAJC2的树突状细胞能够诱导T细胞应答的无能(图4)。

实施例3、干扰HSP70L1或者DNAJC2表达的人单核来源树突状细胞的制备及其生物学特性

设计靶向HSP70L1或者DNAJC2siRNA的序列，如下：

下调HSP70L1的干扰siRNA序列选自：

SEQ ID NO:1：5’-CCAGCUGUUGUUGCUUACUCAGAAA-3’；

SEQ ID NO:2：5’-UUUCUGAGUAAGCAACAACAGCUGG-3’；

SEQ ID NO:3：5’-UAUCUCUCAGCGUCAUGGAAGUUAA-3’；

SEQ ID NO:4：5’-UUAACUUCCAUGACGCUGAGAGAUA-3’；

SEQ ID NO:5：5’-UCAACCUUGGGAAGUGCCAACUGUU-3’；

SEQ ID NO:6：5’-AACAGUUGGCACUUCCCAAGGUUGA-3’。

下调DNAJC2的干扰siRNA序列选自：

SEQ ID NO:7：5’-ACUCAUGCAAGACCUGGAAUCAUUU-3’；

SEQ ID NO:8：5’-AAAUGAUUCCAGGUCUUGCAUGAGU-3’。

转染试剂为Interferin，购自Polyplus公司。人单核来源树突状细胞(MoDC)的诱导方法如实施例1中所述；用含有10％FBS的RPMI 1640培养基重悬人MoDC，调整浓度为10⁶个细胞/ml。siRNA采用50nM，按照转染试剂说明书转染于培养6天的人单核来源树突状细胞。24h后收集细胞，提取总RNA，进行RT和定量PCR反应鉴定干扰效率(图5)；于人单核来源树突状细胞的分化不同时间，转染能够下调HSP70L1或DNAJC2的siRNA，48h后收集细胞，进行：(1)标记共刺激分子和MHC-II，流式细胞仪检测这些分子的表达(图6)；(2)与CFSE-标记的同种T淋巴细胞按照1:20共培养4天，检测T细胞增殖情况(图7)。

结果显示，用本发明所述siRNA序列靶向干扰人单核细胞来源树突状细胞中的HSP70L1和DNAJC2，能够有效地抑制HSP70L1或者DNAJC2表达(图5)；在抑制HSP70L1方面，尤以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6两者组合应用的效果最为理想。

并且，只有在分化的中晚期来干扰这两个分子的表达，才能够显著地增强单核来源树突状细胞的分化成熟，表现在其高水平地表达共刺激分子和MHC分子(图6)，并具有增强T细胞应答的活性(图7)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> 调控辅助伴侣分子进而调控树突状细胞处于特定功能成熟状态的方法及应用

<130> 189216

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 小干扰RNA(siRNA)

<400> 1

ccagcuguug uugcuuacuc agaaa 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 小干扰RNA(siRNA)

<400> 2

uuucugagua agcaacaaca gcugg 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 小干扰RNA(siRNA)

<400> 3

uaucucucag cgucauggaa guuaa 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 小干扰RNA(siRNA)

<400> 4

uuaacuucca ugacgcugag agaua 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 小干扰RNA(siRNA)

<400> 5

ucaaccuugg gaagugccaa cuguu 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 小干扰RNA(siRNA)

<400> 6

aacaguuggc acuucccaag guuga 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 小干扰RNA(siRNA)

<400> 7

acucaugcaa gaccuggaau cauuu 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 小干扰RNA(siRNA)

<400> 8

aaaugauucc aggucuugca ugagu 25

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

tgtagttatt actgtcccgt ttg 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

gataaggatg ttcctccaag c 21

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

aagaacatta gttggacaat gcatac 26

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

tctttgtttt tctttagctt cttgc 25

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

ccgctcgaga tggcggccat cggagttc 28

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

cgcggatcca gatgctatct caatagagat tgcttcac 38

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

ccgctcgaga tgctgcttct gccaagcg 28

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

cgcggatcct ttcttggctc tacttgcatt cag 33

<210> 17

<211> 621

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Met Leu Leu Leu Pro Ser Ala Ala Asp Gly Arg Gly Thr Ala Ile Thr

1 5 10 15

His Ala Leu Thr Ser Ala Ser Thr Leu Cys Gln Val Glu Pro Val Gly

20 25 30

Arg Trp Phe Glu Ala Phe Val Lys Arg Arg Asn Arg Asn Ala Ser Ala

35 40 45

Ser Phe Gln Glu Leu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Ser Glu Glu Ser Glu

50 55 60

Asp Glu Glu Leu Gln Leu Glu Glu Phe Pro Met Leu Lys Thr Leu Asp

65 70 75 80

Pro Lys Asp Trp Lys Asn Gln Asp His Tyr Ala Val Leu Gly Leu Gly

85 90 95

His Val Arg Tyr Lys Ala Thr Gln Arg Gln Ile Lys Ala Ala His Lys

100 105 110

Ala Met Val Leu Lys His His Pro Asp Lys Arg Lys Ala Ala Gly Glu

115 120 125

Pro Ile Lys Glu Gly Asp Asn Asp Tyr Phe Thr Cys Ile Thr Lys Ala

130 135 140

Tyr Glu Met Leu Ser Asp Pro Val Lys Arg Arg Ala Phe Asn Ser Val

145 150 155 160

Asp Pro Thr Phe Asp Asn Ser Val Pro Ser Lys Ser Glu Ala Lys Asp

165 170 175

Asn Phe Phe Glu Val Phe Thr Pro Val Phe Glu Arg Asn Ser Arg Trp

180 185 190

Ser Asn Lys Lys Asn Val Pro Lys Leu Gly Asp Met Asn Ser Ser Phe

195 200 205

Glu Asp Val Asp Ile Phe Tyr Ser Phe Trp Tyr Asn Phe Asp Ser Trp

210 215 220

Arg Glu Phe Ser Tyr Leu Asp Glu Glu Glu Lys Glu Lys Ala Glu Cys

225 230 235 240

Arg Asp Glu Arg Arg Trp Ile Glu Lys Gln Asn Arg Ala Thr Arg Ala

245 250 255

Gln Arg Lys Lys Glu Glu Met Asn Arg Ile Arg Thr Leu Val Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Ser Cys Asp Pro Arg Ile Lys Lys Phe Lys Glu Glu Glu Lys

275 280 285

Ala Lys Lys Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Ala Glu Ala Lys Arg Lys

290 295 300

Glu Gln Glu Ala Lys Glu Lys Gln Arg Gln Ala Glu Leu Glu Ala Ala

305 310 315 320

Arg Leu Ala Lys Glu Lys Glu Glu Glu Glu Val Arg Gln Gln Ala Leu

325 330 335

Leu Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ile Gln Lys Lys Ala Ile Lys Lys Glu

340 345 350

Arg Gln Lys Leu Arg Asn Ser Cys Lys Thr Trp Asn His Phe Ser Asp

355 360 365

Asn Glu Ala Glu Arg Val Lys Met Met Glu Glu Val Glu Lys Leu Cys

370 375 380

Asp Arg Leu Glu Leu Ala Ser Leu Gln Cys Leu Asn Glu Thr Leu Thr

385 390 395 400

Ser Cys Thr Lys Glu Val Gly Lys Ala Ala Leu Glu Lys Gln Ile Glu

405 410 415

Glu Ile Asn Glu Gln Ile Arg Lys Glu Lys Glu Glu Ala Glu Ala Arg

420 425 430

Met Arg Gln Ala Ser Lys Asn Thr Glu Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly

435 440 445

Asn Gly Ser Lys Asn Trp Ser Glu Asp Asp Leu Gln Leu Leu Ile Lys

450 455 460

Ala Val Asn Leu Phe Pro Ala Gly Thr Asn Ser Arg Trp Glu Val Ile

465 470 475 480

Ala Asn Tyr Met Asn Ile His Ser Ser Ser Gly Val Lys Arg Thr Ala

485 490 495

Lys Asp Val Ile Gly Lys Ala Lys Ser Leu Gln Lys Leu Asp Pro His

500 505 510

Gln Lys Asp Asp Ile Asn Lys Lys Ala Phe Asp Lys Phe Lys Lys Glu

515 520 525

His Gly Val Val Pro Gln Ala Asp Asn Ala Thr Pro Ser Glu Arg Phe

530 535 540

Glu Gly Pro Tyr Thr Asp Phe Thr Pro Trp Thr Thr Glu Glu Gln Lys

545 550 555 560

Leu Leu Glu Gln Ala Leu Lys Thr Tyr Pro Val Asn Thr Pro Glu Arg

565 570 575

Trp Glu Lys Ile Ala Glu Ala Val Pro Gly Arg Thr Lys Lys Asp Cys

580 585 590

Met Lys Arg Tyr Lys Glu Leu Val Glu Met Val Lys Ala Lys Lys Ala

595 600 605

Ala Gln Glu Gln Val Leu Asn Ala Ser Arg Ala Lys Lys

610 615 620

<210> 18

<211> 509

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Met Ala Ala Ile Gly Val His Leu Gly Cys Thr Ser Ala Cys Val Ala

1 5 10 15

Val Tyr Lys Asp Gly Arg Ala Gly Val Val Ala Asn Asp Ala Gly Asp

20 25 30

Arg Val Thr Pro Ala Val Val Ala Tyr Ser Glu Asn Glu Glu Ile Val

35 40 45

Gly Leu Ala Ala Lys Gln Ser Arg Ile Arg Asn Ile Ser Asn Thr Val

50 55 60

Met Lys Val Lys Gln Ile Leu Gly Arg Ser Ser Ser Asp Pro Gln Ala

65 70 75 80

Gln Lys Tyr Ile Ala Glu Ser Lys Cys Leu Val Ile Glu Lys Asn Gly

85 90 95

Lys Leu Arg Tyr Glu Ile Asp Thr Gly Glu Glu Thr Lys Phe Val Asn

100 105 110

Pro Glu Asp Val Ala Arg Leu Ile Phe Ser Lys Met Lys Glu Thr Ala

115 120 125

His Ser Val Leu Gly Ser Asp Ala Asn Asp Val Val Ile Thr Val Pro

130 135 140

Phe Asp Phe Gly Glu Lys Gln Lys Asn Ala Leu Gly Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Ala Gly Phe Asn Val Leu Arg Leu Ile His Glu Pro Ser Ala Ala

165 170 175

Leu Leu Ala Tyr Gly Ile Gly Gln Asp Ser Pro Thr Gly Lys Ser Asn

180 185 190

Ile Leu Val Phe Lys Leu Gly Gly Thr Ser Leu Ser Leu Ser Val Met

195 200 205

Glu Val Asn Ser Gly Ile Tyr Arg Val Leu Ser Thr Asn Thr Asp Asp

210 215 220

Asn Ile Gly Gly Ala His Phe Thr Glu Thr Leu Ala Gln Tyr Leu Ala

225 230 235 240

Ser Glu Phe Gln Arg Ser Phe Lys His Asp Val Arg Gly Asn Ala Arg

245 250 255

Ala Met Met Lys Leu Thr Asn Ser Ala Glu Val Ala Lys His Ser Leu

260 265 270

Ser Thr Leu Gly Ser Ala Asn Cys Phe Leu Asp Ser Leu Tyr Glu Gly

275 280 285

Gln Asp Phe Asp Cys Asn Val Ser Arg Ala Arg Phe Glu Leu Leu Cys

290 295 300

Ser Pro Leu Phe Asn Lys Cys Ile Glu Ala Ile Arg Gly Leu Leu Asp

305 310 315 320

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asp Asp Ile Asn Lys Val Val Leu Cys Gly

325 330 335

Gly Ser Ser Arg Ile Pro Lys Leu Gln Gln Leu Ile Lys Asp Leu Phe

340 345 350

Pro Ala Val Glu Leu Leu Asn Ser Ile Pro Pro Asp Glu Val Ile Pro

355 360 365

Ile Gly Ala Ala Ile Glu Ala Gly Ile Leu Ile Gly Lys Glu Asn Leu

370 375 380

Leu Val Glu Asp Ser Leu Met Ile Glu Cys Ser Ala Arg Asp Ile Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Val Asp Glu Ser Gly Ala Ser Arg Phe Thr Val Leu Phe

405 410 415

Pro Ser Gly Thr Pro Leu Pro Ala Arg Arg Gln His Thr Leu Gln Ala

420 425 430

Pro Gly Ser Ile Ser Ser Val Cys Leu Glu Leu Tyr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Lys Asn Ser Ala Lys Glu Glu Thr Lys Phe Ala Gln Val Val Leu Gln

450 455 460

Asp Leu Asp Lys Lys Glu Asn Gly Leu Arg Asp Ile Leu Ala Val Leu

465 470 475 480

Thr Met Lys Arg Asp Gly Ser Leu His Val Thr Cys Thr Asp Gln Glu

485 490 495

Thr Gly Lys Cys Glu Ala Ile Ser Ile Glu Ile Ala Ser

500 505

Claims

1.一种使单核细胞向特定成熟状态树突状细胞分化的方法，其特征在于，所述方法用于非治疗目的，所述方法选自：

(1)在单核细胞向树突状细胞分化早期提高HSP70L1或DNAJC2的表达，从而使其分化为低成熟的树突状细胞；所述的分化早期为：诱导分化培养起始后的第6～36小时；或

(2)在单核细胞向树突状细胞分化中晚期或晚期抑制HSP70L1或DNAJC2的表达，从而促进其分化为功能成熟的树突状细胞；所述的分化中晚期或晚期为诱导分化培养起始后的第96～130小时。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的低成熟的树突状细胞表达共刺激分子和MHC分子的能力被抑制。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的功能成熟的树突状细胞表达共刺激分子和MHC分子的能力被促进。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的分化早期为：诱导分化培养起始后的第8～24小时。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的分化早期为：诱导分化培养起始后的第10～18小时。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的分化中晚期或晚期为诱导分化培养起始后的第96～120小时。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提高HSP70L1或DNAJC2的表达包括：在细胞中过表达HSP70L1或DNAJC2，以包含HSP70L1或DNAJC2基因表达盒的表达构建物在细胞中进行过表达。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的表达构建物为病毒载体。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制HSP70L1或DNAJC2的表达包括：在细胞中沉默HSP70L1或DNAJC2。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抑制HSP70L1或DNAJC2的表达包括：以特异性干扰HSP70L1或DNAJC2表达的干扰分子来沉默。

11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于：以SEQ ID NO: 1和2、SEQ ID NO: 3和4、或SEQ ID NO: 5和6的干扰分子进行HSP70L1的沉默，或以SEQ ID NO: 7和8的干扰分子进行DNAJC2的沉默。

12. 一种HSP70L1或DNAJC2的调节剂的用途，用于使单核细胞向树突状细胞特异性分化；所述调节剂选自：

上调剂，其为包含HSP70L1或DNAJC2基因表达盒的表达构建物，其用于使细胞分化为低成熟的树突状细胞；或

下调剂，其为特异性干扰HSP70L1或DNAJC2表达的干扰分子，其用于使细胞分化为功能成熟的树突状细胞；

所述方法用于非治疗目的。

13. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的表达构建物为病毒载体；或所述的干扰分子是针对HSP70L1的SEQ ID NO: 1和2、SEQ ID NO: 3和4、或SEQ ID NO: 5和6的小干扰分子，或针对DNAJC2的SEQ ID NO: 7和8的小干扰分子。

14.一种制备免疫应答能力低下的T淋巴细胞的方法，其特征在于，该方法包括：以权利要求1的(1)的方法获得低成熟的树突状细胞，以该树突状细胞与T淋巴细胞接触，获得免疫应答能力低下的T淋巴细胞。

15.一种制备免疫应答能力增强的T淋巴细胞的方法，其特征在于，该方法包括：以权利要求1的(2)的方法获得功能成熟的树突状细胞，以该树突状细胞与T淋巴细胞接触，获得免疫应答能力增强的T淋巴细胞。