KR101019470B1 - Ｅｃ ｓｏｄ 단백질을 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한질병의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ＥＣ ＳＯＤ 단백질을 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 천연형 또는 재조합 EC SOD 단백질을 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 천연형 또는 재조합 EC SOD 단백질은 혈관신생을 유도하는 VEGF 및 MMP-9의 발현을 억제하여 혈관신생을 억제하는 효과가 우수하므로 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

EC SOD, 혈관신생, VEGF

Description

ＥＣ ＳＯＤ 단백질을 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating angiogenesis-induced diseases containing EC SOD protein}

도 1은 자외선 조사에 의한 마우스의 등 피부 조직의 형태상 변화를 나타낸 사진이다 (A: 야생형 마우스, B: EC SOD 과발현 마우스, C:야생형 마우스에 UVB를 조사, D: EC SOD 과발현 마우스에 UVB를 조사).

도 2는 자외선 조사에 의한 마우스의 조직에서 VEGF의 발현 양상을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. Actin은 로딩 대조군으로 사용하였다(WT : 야생형 마우스, TG : EC SOD 과발현 마우스).

도 3은 마우스에 UVB를 조사한 다음 VEGF의 발현 양상을 면역조직화학적 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다 (A: 야생형 마우스, B: EC SOD 과발현 마우스, C:야생형 마우스에 UVB를 조사, D: EC SOD 과발현 마우스에 UVB를 조사).

도 4는 마우스에 UVB를 조사한 다음 MMP-9의 발현 양상을 자이모그래피로 분석한 결과이다 (레인 1 : 야생형 마우스, 레인 2 : EC SOD 과발현 마우스, 레인 3 : 야생형 마우스에 UVB 조사, 레인 4 : EC SOD 과발현 마우스에 UVB 조사).

도 5는 본 발명에 따른 재조합 EC SOD 단백질을 고속 단백질 정제용 액상 크 로마토그래피한 결과를 나타낸 그래프이다 (A: 선평형구간, B:시료투입구간, C:컬럼세척구간, D:재접힘구간, E:재접힘 평형 구간, F:용출구간, G:컬럼세척구간, X축:시간 및 부피(시:분:초, mL), Y축:UV 흡광도 (Unit))

도 6은 본 발명에 따른 재접힘 및 정제된 재조합 EC SOD 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 쿠마시-블루 단백질 염색 사진이다 (M:분자량 사이즈 마커, A:8M 우레아 완충용액으로 용해된 내포체(재접힘 정제전의 시료), B:컬럼에 흡착되지 않고 용출된 내포체 불순물, C:재접힘 정제후 용출된 EC-SOD, D:탈염정제후 한외여과법으로 농축된 EC-SOD).

도 7은 피부각질형성세포주에 자외선을 조사하고 본 발명의 재조합 EC SOD처리에 따른 VEGF의 발현 양상을 면역조직화학적 방법으로 조사한 결과이다(A: 대조군, B: UVB 조사, C: 재조합 EC SOD 처리 + UVB 조사, D: 재조합 EC SOD 처리).

본 발명은 EC SOD 단백질을 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 천연형 또는 재조합 EC SOD(extracellular superoxide dismutase)을 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

활성산소를 제거할 뿐만 아니라 다른 항산화 효소가 작용할 수 있도록 하여 세포를 보호하는 기능을 가지는 SOD(superoxide dismutase)는 구리와 아연 원자를 가지고 있는 Cu/Zn SOD(SOD 1), 망간 원자를 가지고 있는 Mn SOD(SOD 2) 및 세포 표면 또는 세포 외액에 존재하는 EC SOD(extracellular superoxide dismutase)로 구분된다.

특히, EC SOD는 Cu/Zn SOD와 같이 구리 및 아연 원자를 가지고 있으나, C-말단 쪽에 헤파린 결합 도메인(heparin binding domain)이 존재한다는 특징이 있다. EC SOD는 헤파린 결합 도메인을 가지고 있기 때문에 세포막의 헤파린에 결합되어 세포막을 보호하는 역할을 할 것으로 추정되고 있다. 문헌에 따르면, EC SOD는 혈장과 세포 외 기질 등에서 생체 방어작용을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다(Marklund et al, Biochem . J. 266, 213-219, 1990; Su et al., Am J Respir Cell Mol Biol., Feb 16(2), 162-70, 1997; Luoma et al., Thromb . Vasc . Bio. 18, 157-167,1998). EC SOD의 헤파린 결합 도메인이 핵 위치 신호(nuclear localization signal)로 작용하여 흉선(thymus)과 고환 세포(testis cell)에서 핵 안에 위치하여 산화적 스트레스로부터 게놈 DNA를 보호하고 산화 환원 반응에 민감한 전사작용을 조절한다고 보고된 바 있다(Ookawara T et al., BBRC, 296, 54-61, 2002). 본 발명자들은 대한민국 특허 제10-0676502호에서 EC SOD가 피부세포 내 활성산소종을 제거하며 표피세포의 과증식을 억제하여 건선 등의 피부질환을 치료하는 효과가 있음을 개시한 바 있다.

한편, 혈관신생(Angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈 관이 형성되는 과정으로, 정상적으로는 배아의 발달(embryonic development)시, 상처의 치유, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화 때만 일어나며 그 외의 정상적인 조건에서는 거의 일어나지 않는 현상이다. 그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못할 때 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있는데, 병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증, 당뇨병이 있고, 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염등이 있으며, 류마티스 관절염과 같은 만성 염증성 질환, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환이 있으며, 종양에서 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다(Ophthalmol 102, 1261-1262, 1995; J Am Acad Derm 34(3):486-497, 1996; Circultion 93(4):632-682, 1996; Cell 86: 353-364, 1996).

상기 혈관신생 과정은 종양 사이토카인, 혈관내피세포 성장인자 (VEGF) 및 염기 섬유아세포 성장인자 (bFGF)에 의하여 내피세포의 성장을 촉진시키는 단계, 메탈로프로테아제(MMP)에 의하여 세포외 기질 단백질을 분해시키는 단계, 세포막 접착분자, 내피세포 분화 및 관 형성에 의하여 매개되는 내피세포의 이동 단계와 같은 여러 단계로 구성되어 있다 (Bussolino, F.et al., Trends Biochem . Sci . 22:251-256, 1997; Kuwano, M. et al., Intern . Med . 40:565-572, 2001; Risau, W. Angiogenesis and endothelial cell function. Arzneimittelforschung 44:416-417, 1994). 따라서 상기 과정들의 저해는 혈관신생과 연관된 암 및 다른 인간의 질병의 치료를 위한 새로운 치료 전략으로서 대두되게 되었다. 상기 목적을 위하여 다양한 종류의 혈관신생 억제제가 개발이 되었다. 상기 억제제는, 자연적이거나 또는 합성된 물질로서, 단백질 분해효소 억제제, 티로신 인산화 효소의 억제제, 케모카인, 인터루킨 및 기질 단백질의 분해 절편을 포함한다(Abedi, H. et. al., J. Biol. Chem . 272:15442-15451, 1997; Cao, Y., Int . J. Biochem . Cell Biol. 33:357-369, 2001; Fong, T. A et al., Cancer Res . 59:99-106, 1999; Kwon, H. J. et al., Acalycigorgia inermis. J. Microbiol . Biotechnol . 11:656-662, 2001. ). 상기 항혈관신생 분자들은 내피세포 증식, 이동, 단백질 분해활성 및 관 형성의 억제뿐만 아니라 세포 자살 (apoptosis)의 유도를 포함하는 여러 과정에 영향을 미친다 (Folkman, J. et. al., Semin . Cancer Biol . 3:89-96, 1992; Kishi, K. et al., Nippon Rinsho 58:1747-1762, 2000; Marme, D., Onkologie 1:1-5, 2001). 상기 분자들의 항혈관신생 기능은 in vitro 및 in vivo 에서 잘 연구되었는데, 몇몇 물질은 현재 임상시험을 실시하고 있다 (Deplanque, G. et. al., Eur . J. Cancer 36:1713-1724, 2000; Liekens, et. al., Biochem . Pharmacol . 61:253-270, 2001; Mross, K., Drug Resist . Updat . 3: 223-235, 2000).

활성산소종이 혈관신생의 주요한 조절자라고 보고되고 있으나(Jolanta Grzenkowicz-Wydra, et.al., Mol Cell Biochem ., 264(1-2):169-81, 2004), 활성산소종을 제거하는 SOD와 혈관신생과의 관련성에 대하여는 별로 규명된 것이 없다. 최근에 SOD 중에서 구리와 아연 원자를 가지고 있는 Cu/Zn SOD(SOD 1)를 과발현시 키면 혈관신생이 촉진되어 상기 SOD1을 억제하면 혈관신생을 억제한다는 보고(Jolanta Grzenkowicz-Wydra, et.al., Mol Cell Biochem ., 264(1-2):169-81, 2004)가 있었고, SOD1의 억제제인 ATN-224이 혈관신생을 억제하여 항암제로 사용될 수 있음이 보고되고 있고, 현재 임상 2상 진행 중으로 보고되고 있다(Juarez et al. Clin Cancer Res ., 12: 4974-4982, 2006). 그러나 EC SOD와 혈관신생의 관련성에 대하여는 보고된 바가 전혀 없다.

본 발명자들은 EC SOD에 대한 연구를 하던 중에, EC SOD의 과발현 마우스에서 UV 조사에 의한 혈관신생이 억제되는 것을 확인하였고, 대장균 시스템에서 제조된 생리적 활성이 있는 재조합 EC SOD도 혈관신생 억제 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 천연형 또는 재조합 EC SOD 단백질, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 천연형 또는 재조합 EC SOD 단백질을 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물을을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 EC SOD 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는 공지된 방법에 의해 EC SOD 과발현 마우스를 제조하고 상기 마우스에 UVB를 조사한 후 조직의 형태변화를 야생형 마우스와 비교하였다. 그 결과, 야생형 마우스에서는 UVB 조사에 의해 혈관신생이 유도되었으나, EC SOD 과발현 마우스에서는 UVB 조사에 의한 혈관신생이 현저히 억제되어 있음을 확인할 수 있었다(실시예 <1-2> 참조).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 EC SOD 과발현 마우스에서 자외선 조사에 의한 혈관내피세포성장인자(VEGF) 및 MMP-9의 발현정도를 웨스턴 블랏, 면역조직화학적 방법 및 자이모그래피 방법을 이용하여 조사하였다. 그 결과, 자외선 조사에 의해 야생형 마우스에서는 VEGF 및 MMP-9의 발현이 증가되었으나, EC SOD 과발현 마우스에서는 VEGF 및 MMP-9의 발현이 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다(실시예 2 및 3 참조). 상기 실험 결과로부터, EC SOD가 혈관신생을 유도하는 VEGF의 발현을 억제하고 혈관신생을 조절하는 MMP-9의 발현을 억제하여 혈관신생을 억제하는 것을 알 수 있었다.

또한 본 발명자들은 또 다른 실시예에서 헤파린 결합 도메인이 제거된 재조합 EC SOD(209E-EC-SOD)를 대장균에서 발현시킨 다음 분리하여 재접힘과 정제과정을 거친 재조합 EC SOD 단백질(209E-EC-SOD)을 생산하여 상기 단백질이 혈관신생을 억제하는지 확인하였다. 그 결과, 자외선 조사에 의해 VEGF의 발현이 유도되나, 상기 재조합 EC SOD 단백질(209E-EC-SOD)을 처리한 경우에는 상기 VEGF의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다(실시예 4 참조).

따라서, EC SOD는 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 상기 혈관신생에 의한 질환으로는 암, 당뇨병, 류마치스 관절염, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 당뇨병성 망막증, 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 모세관확장증, 화농성 육아종 및 여드름을 들 수 있다.

상기 본 발명의 조성물에 포함되는 EC SOD 단백질은 천연형 또는 재조합 EC SOD 단백질 또는 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 말한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 EC SOD 단백질의 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다.

상기에서 EC SOD는 사람 및 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는 사람으로부터 유래된 단백질을 말한다. 상기 사람 EC SOD는 N-말단영역의 개시 메치오닌 아미노산을 포함하여 18번째의 알라닌까지는 시그날 펩타이드로 활성형 EC-SOD는 상기 시그날 펩타이드가 제거된 222개의 아미노산으로 구성되어 있으며, C-말단 영역(아미노산 잔기 210번～215번)에 헤파린 결합 도메인(heparin binding domain)을 가지고 있다. 사람 EC SOD의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타낸 바와 같다. 또한, 상기에서 EC SOD는 헤파린 결합 도메인이 포함된 C-말단 영역(아미노산 잔기 210번～222번)이 제거된 것일 수 있다. 상기 헤파린 결합 도메인이 제거된 EC SOD(209E-EC-SOD)의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 바와 같다.

본 발명에서 '기능적 동등물'이란 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 EC SOD와 실질적으로 동등한 생리 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.

상기에서 '동등한 생리활성'이란 혈관신생을 억제하는 활성을 말한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(homology)을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는 EC SOD의 SNP로 알려진 폴리펩티드일 수 있다. 상기 기능적 동등물 이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 1의 펩타이드와 적어도 70% 이상의, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 1의 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 서열번호 1의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한 상기 서열 동질성은 두개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두개의 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연개되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(indentical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다. 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 발명의 EC SOD 단백질은 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 천연형 또는 재조합 EC SOD 단백질을 코딩하는 DNA 서 열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 폴리펩티드'라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol . Chem., 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 펩타이드는 당분야에 공지된 기술로 화학적으로 합성할 수 있다 (Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 즉, 본 발명의 펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다 (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)). 특히, 바람직한 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase synthesis)을 이용하는 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드는 보호된 아미노산간의 응축반응 (condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 규명된 아미노산 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해 (acid decomposition) 또는 아미놀리시스 (aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다 (Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press, 1980).

본 발명에 따른 펩타이드의 합성을 위해 사용할 수 있는 고체상의 담체는 이 분야에서 통상 사용되는 담체로서 예를 들어, 치환된 벤질 형태의 폴리스티렌 레진 (polystyrene resins of substituted benzyl type), 히드록시메틸페닐아세틱 아미드 형태의 폴리스티렌 레진, 치환된 벤즈히드릴폴리스티렌 레진, 펩타이드에 결합할 수 있는 기능기를 가진 폴리아크릴아미드 레진 등을 사용할 수 있다. 아미노산 응축 또한 통상의 방법일 수 있으며, 예를 들어 디시클로헥실카보디이미드(DDC), 산 무수물(acid anhydride) 및 활성화 에스테르 (activated ester) 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 합성에 사용된 보호기들은 통상의 펩타이드 합성에 사용되는 보호기들로서 산 분해, 환원 또는 아미놀리시스와 같은 통상의 방법에 의해 쉽게 제거되는 것들이다. 아미노 보호기들의 구체적인 예로는 포밀; 트리플루오로아세틸; 벤질옥시카보닐; (오르쏘- 또는 파라-) 클로로벤질옥시카르보닐 및 (오르쏘- 또는 파라-) 브로모벤질옥시카르보닐과 같은 치환된 벤질옥시카르보닐; t-부톡시카보닐 및 t-아밀록시카보닐과 같은 지방족 옥시카보닐 등이 있다. 아미노산의 카복실기들은 에스테르기로 전환시킴으로써 보호할 수 있다. 에스테르기로는 벤질 에스테르, 메톡시벤질 에스테르와 같은 치환된 벤질 에스테르; 시클로헥실 에스테르, 시클로헵틸 에스테르 또는 t-부틸 에스테르와 같은 알킬 에스테르 등이 있다. 구아니디노기는 보호기가 필요하지 않지만, 니트로; 또는 토실, 메톡시벤젠술포닐 또는 메시틸렌술포닐과 같은 아릴술포닐에 의해 보호될 수 있다. 이미다졸의 보호기로는 토실, 벤질 및 디니트로페릴 등이 있다. 트립토판의 인돌기는 보호기가 없어도 되며 포밀 등으로 보호기를 붙일수도 있다.

탈보호 및 담체로부터 펩타이드를 분리하는 것은 여러 스캐빈저 (scavenger)하에 무수 하이드로 플루오라이드에 의해 수행될 수 있다. 스캐빈저의 예로는 아니솔, (오르쏘-, 메타-, 파라-) 크레솔, 디메틸술파이드, 씨오크레솔, 에탄엔디올 및 머캅토피리딘 등을 들 수 있는데 이들은 펩타이드 합성에서 통상 사용되는 것들 이다.

유전공학적 방법에 의해 제조된 재조합 펩타이드 또는 화학적으로 합성된 펩타이드는 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법 등 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.

상기 혈관신생에 의한 질병은 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 발현 및 MMP(matrix metalloproteinase)-9의 발현에 의해 유발되는 것을 모두 포함한다. 상기 질병의 예로는 암, 당뇨병, 류마치스 관절염, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 당뇨병성 망막증, 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 모세관확장증, 화농성 육아종 및 여드름 등이 있다.

또한, 본 발명은 천연형 또는 재조합 EC SOD 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 가진다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 조성물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터를 유효성분으로 한다. 상기 본 발명에 따른 발현 벡터는 EC SOD 또는 헤파린 결합 도메인이 제거된 단백질의 cDNA 및 이들의 발현을 조절할 수 있는 발현 조절 서열을 포함하고 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 천연에서 분리되거나 당업계에 공지된 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기에서 “발현 조절 서열(expression control sequence)”이란 특정한 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 상기 발현 조절 서열로는 전사를 실시하기 위한 프로모터, 상기 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함될 수 있다.

상기 발현 벡터를 삽입시킨 후, 감염(infection), 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction) 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

플라스미드 발현 벡터를 이용한 유전자 전달 방법은 포유동물 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서, FDA로부터 승인받은 인간에게 사용할 수 있는 방법이다(Nabel, E. G., et al., Science, 249:1285-1288, 1990). 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392 (PharMingen) 등이 대표적이다. 상기 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입 (transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 표적 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio . Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio . Chem ., 263:14621-14624, 1988).

또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus), 아비폭스바이러스(avipox virus) 및 렌티 바이러스(lenti virus) 등이 포함된다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다(Miller, A.D., Nature, 357:455-460, 1992). FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec . Cell Biol ., 6:2895-2902, 1986). 비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다(Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155, 1992; Jaffe et al., Nature Genetics, 1:372-378, 1992; Lemarchand et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:6482-6486, 1992). 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics, 1:379-384, 1992). 렌티 바이러스는 레트로 바이러스의 일종으로 1990년대 후반부터 개발되기 시작한 새로운 레트로 바이러스 수송체로서 HIV 골격(backbone)을 변형한 것이다. 기존의 레트로바이러스 수송체들과 달리 세포분열 주기에 영향을 받지 않아 분열이 활발한 세포뿐 만 아니라 분열이 활발하지 않은 세포에서도 유전자 발현 효율이 비교적 좋다. 따라서 조혈 줄기세포 등과 같이 분열이 느린 세포에서도 다른 바이러스성 수소체보다 발현 효율이 좋아 최근 조혈 줄기세포 각질세포를 이용한 세포 치료 분야에서 유전자 전달용 수송체로서 연구가 활발히 진행되고 있다. 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 다른 방법, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다.

상기 천연형 또는 재조합 EC SOD 단백질 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레 오티는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형으로는 등장성 수용액 또는 현탁액 형태와 같은 주사용 제형 및 연고제 형태의 제형이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지 된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예 : 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예 : 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니며, 생명공학적 기법을 이용하거나 또는 기존 제조법을 이용하여 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.

바람직하게는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입과 같은 방법으로 비경구적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 주사용으로 제형화된 본 발명에 따른 약학적 조성물을 4～6mm의 가는 바늘로 피부 아래층에 일정량을 주입하거나 또 는 30 게이지(gage) 주사바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법인 메소 테라피(Messo therapy)법에 의해 투여할 수 있다. 또한, 피부에 적용할 경우 연고제와 같은 형태로 제형화하여 경피 투여할 수 있다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 특히, 본 발명의 EC SOD 단백질을 유효성분으로 하는 약학적 조성물의 경우에는 피부에 직접 도포하는 경피 투여방법에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 단백질 전달방법과 관련된 생명공학적 기법을 이용하여 투여될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.0001 내지 100㎎/㎏의 범위로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약 0.01 내지 1mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

EC - SOD 과발현 마우스의 형태적 조사

EC-SOD 과발현 마우스와 야생형 마우스에 UVB를 조사하여 형태학적으로 어떤 변화가 일어나는지를 육안으로 관찰하였다.

<1-1> EC - SOD 과발현 마우스의 제조

먼저 EC-SOD 과발현 마우스를 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

야생형 BDF1마우스는 8 내지 10 주령 BDF1 마우스(중앙실험동물)를 사용하였다. EC-SOD 과발현 마우스는 8 내지 10 주령 BDF1 마우스를 사용하여 공지된 방법에 의해 제조하였다(H. Y. Ha. et.al., Biochem Biophys Res Commun , 348: 450-458, 2006). 동물 사용을 위한 실험방법은 카톨릭 의과학 연구소 생명윤리 위원회에 의해 승인 받아 사용하였다.

구체적으로 한국생명공학 연구소에서 교잡종 마우스(C57BL/6 X CBA의 F1)를 구입하고, 다배란 유기를 위하여 PMSG(pregnant mare's serum gonadotropin)와 hCG(human chrionic gonadotropin)를 48시간 간격으로 각각 5IU씩 자성생쥐의 복강내로 주사한 다음, 동일계통의 웅성생쥐와 1:1로 합사시켰다. 다음날 아침 질전을 확인하여 질전이 있는 개체만 도살하여 난관을 절취한 다음 난관팽대부로부터 수정란을 회수하였다. 배양액은 0.4% BSA가 첨가된 M16 배양액을 사용하였다.

피부 조직에 선별적인 EC SOD 과발현이 유도된 마우스를 만들기 위하여, 마우스 EC SOD의 cDNA를 포함하는 pCRII TOPO 벡터(한림대학교 의과대학, 서준교 교수로부터 제공받음)에서 제한 효소로 마우스 EC SOD의 cDNA 부분을 잘라 인간 케라틴 K14 프로모터를 포함하고 있는 pBS KS벡터에 삽입하였다. 또한 이 벡터에 닭의 오브알부민 폴리(A)(ovalbumin poly(A))를 삽입하여 시험관내(in vitro)에서의 발현을 용이하게 하였다. 수정란에 DNA를 주입하기 위하여 발현 백터를 제한 효소 Hind와 XhoI으로 잘라 사용하였다. 제한 효소로 절단한 DNA는 1% 아가로스젤에 전기영동한 후 투석(dialysis)하여 회수한 후 페놀클로로포름으로 분리 정제하였다. 이를 10mM Tris (pH 7.4/ 0.2mM EDTA) 농도에서 투석하여 최종농도가 4ng/㎕가 되게 하였다. 외래유전자를 포함하는DNA 용액을 1세포기 수정란의 전핵으로 주입하였다. 외래유전자가 주입된 수정란들을 2세포기까지 배양한 후 건강한 상태의 수정란만을 선별하였다. 발정이 온 암컷 ICR을 수컷과 합사시킨 후 이튿날 질전을 확인하여 확인된 것을 대리모로 사용하였다. 2세포기까지 잘 자란 수정란을 15-20개 정도를 취하여 대리모의 난관팽대부로 미세관을 이용해서 이식한 후 근육층과 표피를 봉합하였다. 이식 후 태어난 산자를 3주정도 키운 다음 이들의 꼬리를 1cm 정도를 자른 다음 용해완충액(lysis buffer)에 넣어 55℃에서 처리한 다음 페놀(phenol) 첨가하여 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 상기 게놈 DNA를 하기의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭함으로써 형질전환 여부를 확인하였다. PCR 조건은 94℃에서 1회, 94℃에서 30초간, 51℃에서 30초간, 72.5℃에서 45초간 30회 반복 한 후 72.5℃에서, 5분간 1회 실시하였다.

센스 프라이머(서열번호 5)

5'- TTG TCT CTA ATA GAG GGT C-3'

안티센스 프라이머(서열번호 6)

5'-TCA AGC CTG TCT ATC TTC T-3'

<1-2> EC - SOD 과발현 마우스와 야생형 마우스의 형태학적 비교

상기 EC-SOD 과발현 마우스와 야생형 BDF1마우스의 등쪽 피부에 2 kJ/m2 로 24시간 간격으로 UVB를 4번 조사하였다. 즉, 상기 마우스들의 등쪽 피부를 UVB 조사 이틀 전에 제모하고, 280nm ~ 340nm 파장 범위에서 305 nm의 최대에너지를 지니는 6개의 UVB 램프 (FS24T12/UVB/HO, 290-320 nm, Voltare사, Fairfei1d, CT, USA)를 사용하여, 8주령된 마우스 24마리에 200 mJ/cm2 로 일정하게 조사하였다. UVB 조사 동안, 램프의 높이는 마취된 마우스의 등쪽 피부 표면에 0.3 mW/cm2로 조사되도록 조절하였다. 각 그룹의 마우스(각 그룹(n =6))들에 24 시간 간격으로 4번 UVB를 조사하였고, 실험을 위해 4번째 UVB 조사 1 시간 후에 마우스를 희생시켰다.

희생시킨 마우스의 등쪽 피부 환부를 절개하여 육안으로 관찰한 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 도 1에 나타난 바와 같이, 야생형 마우스에 자외선 UVB를 조사한 경우(도 1C)에는 자외선을 조사하지 않은 경우(도 1A)와 비교하여 신생혈관 형성, 피부 염증반응과 홍반이 현저히 유도되었다. 그러나 EC-SOD 과발현 마우스에서는 자외선 조사 전(도 1B)과 조사 후(도 1D)에 통계학적으로 의미 있는 차이가 없었다. 즉, 자외선 UVB 조사에 의해 유도된 야생형 마우스에서(도 1B)의 신생혈관 형성이 EC-SOD 과발현 마우스(도 1D)에서 현저히 억제됨을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 EC-SOD가 신생혈관 형성을 억제하는 기능이 있음을 추정할 수 있었다.

<실시예 2>

EC - SOD 과발현 마우스에서의 혈관내피세포성장인자 억제효과

<2-1> 웨스턴 블럿

EC-SOD 과발현 마우스에서 혈관신생과정을 유도하는 혈관내피세포성장인자(VEGF)의 발현정도를 웨스턴 블랏을 이용하여 조사하였다.

상기 실시예 <1-2>에서 희생시킨 EC-SOC 과발현 마우스와 야생형 마우스 각각의 등피부 조직 또는 세포를 추출용액 (50 mM의Tris HCl pH 8.0, 5 mM의 EDTA, 150 mM의 NaCl, 0.5%의 deoxycholate 나트륨, 1%의 Nonidet P-40, 0.1%의 SDS, 1 mM의 PMSF, 1 mM의 NaF, 1 mM의 NaVO4 ∥ 그리고 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche, 독일))으로 균질화하여 추출하였다. 단백질 농도를 결정하기 위하여 바이오라드 단백질 키트(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하고, 우혈청 알부민(BSA)을 표준물질로 사용하였다. 상기 단백질 추출물들을 10%의 폴리아크릴아마이드 겔 위에서 분리한 후, 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(Gelman Laboratory, MI, USA)으로 옮긴 다음에, 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인을 5%의 탈지분유로 블로 킹(blocking)한 후, 항-VEGF 다클론 항체(1: 500, 산타크루즈, USA)와 항 베타-액틴 항체 각각과 함께 배양하였다. 상기 막을 수세한 후, 퍼옥시다아제가 결합되어 있는 이차 항체 IgG (산타크루즈, USA)를 붙여 다시 수세한 후, ECL 검출 키트를 이용하여 발색하였다.

실험결과, UVB 조사에 의해 야생 마우스에서 VEGF의 발현양이 증가하였으나, UVB 조사된 EC-SOD 과발현된 마우스에서는 VEGF의 발현이 현저히 감소되었다(도 2). 상기 결과로부터 EC-SOD가 혈관신생억제 효과가 있음을 다시 확인할 수 있었다.

<2-2> 면역조직화학적 조사( Immunohistochemical examination )

EC-SOD가 VEGF의 발현을 억제하는지 여부를 면역조직화학적 방법에 의해 다시 확인하였다.

상기 실시예 <1-2>에서 희생시킨 EC-SOC 과발현 마우스와 야생형 마우스 각각의 등피부 조직을 0.5 M의 인산염 완충액(pH 7.4)으로 만든 4%의 파라포름알데하이드로 고정하였다. 흐르는 물로 수세한 후, 에탄올로 탈수한 다음, 파라핀으로 포매시킨 다음 5mm 두께로 절편하여 유리 슬라이드에 부착하였다. 상기 절편을 자일렌 용액을 사용하여 탈파라핀하였고, 에탄올로 함수한 후 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 탈파라핀된 조직절편에 3%의 과산화수소수를 처리하여 블로킹하였다. 비특이적 결합과 배경염색을 줄이기 위하여, 상기 절편을 10% 염소 혈청을 처리하였다. 각 조직 슬라이드에 항-VEGF 다클론 항체(1: 500, 산타크루즈, USA)를 처리한 후, 스트렙타비딘-바이오틴 키트(LSAB, Dako, CA, USA)를 이용하여 아비딘-바이오틴-이뮤노퍼옥시다아제 콤플렉스 방법으로 시행하였다. 염색된 조직을 수세한 다음에 디아미노벤지딘(DAB)으로 발색하였으며, 0.2%의 메이어 헤마톡실린(시그마, MO, USA)으로 대조염색을 수행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스에서 UVB 조사에 의해 VEGF가 많이 발현되었으나, EC-SOD가 과발현된 마우스에서는 야생형 마우스에 비하여 VEGF의 발현이 현저히 억제되어 상기 실시예 <2-1>의 결과와 일치된 결과를 얻었다.

상기 결과들로부터, EC-SOD가 혈관신생을 유도하는 VEGF 발현을 억제하여 혈관신생을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

<실시예 3>

EC - SOD 과발현 마우스에서의 MMP -9의 발현 수준 조사

세포외 기질 단백질을 분해하는 MMP 단백질은 VEGF와 함께 혈관신생의 중요 조절인자이다. 특히 MMP9은 VEGF-VEGFR 시스템을 통해 종양의 혈관신생 과정을 조절하는 인자로 알려져 있다(Bergers et al., Nat . Cell Biol ., 2: 737-744, 2000).

따라서 본 발명자들은 EC-SOD 과발현 생쥐에서 UVB 조사에 의한 MMP-9의 발현수준을 조사하였다.

상기 실시예 <1-2>에서 희생시킨 EC-SOC 과발현 마우스와 야생형 마우스 각각의 등피부 조직 에 1mg/ml gelatin (100mg/ml)을 섞어 SDS-PAGE를 수행한 다음, 겔을 2.5% 트리톤 X-100로 20분 동안 처리한 후 물로 수세한다. Zymography 반응 용액(1M Tris (pH7.5), 1M CaCl2, 5M NaCl, 0.2mM ZnCl2, 25% TX-100, 0.2% NaN3)으로 37 ℃에서 16 시간동안 반응 시킨 후, 1시간 동안 염색한 후 1시간 동안 탈색한다. 오븐에서 1시간 동안 말려 분석한 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사를 조사하기 전의 야생형 마우스와 EC-SOD 과발현 마우스의 MMP-9의 발현 수준은 별다른 차이가 없었다. 그러나 UVB 조사에 의해 야생형 마우스는 MMP-9의 발현이 증가되나, EC-SOD 마우스의 경우에는 MMP-9의 발현이 야생형 마우스에 비해 현저히 억제된다.

상기 결과들로부터 EC-SOD가 VEGF의 발현을 억제할 뿐만 아니라 VEGF-VEGFR 시스템을 통한 혈관신생 관련 신호전달에 관여하는 MMP-9의 발현을 억제하여 혈관신생을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4>

생물학적 활성을 가지는 재조합 EC - SOD 단백질의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 1 내지 3에서 EC-SOD 과발현 마우스에서 혈관신생 억제 효과를 확인하였다. 본 발명자들은 EC-SOD의 혈관신생억제 효과를 in vitro 상에서 확인하기 위하여, 먼저 생물학적 활성을 가지는 재조합 EC-SOD 단백질을 제조하고, 상기 단백질이 혈관신생을 억제하는지 여부를 확인하였다.

<4-1> 재조합 209E- EC - SOD 단백질의 제조

EC-SOD의 N-말단 부위에 있는 signal peptide를 제거하고 C-말단 부위의 13개 아미노산이 제거된 209개의 아미노산으로 이루어진 209E-EC-SOD를 다음과 같은 방법으로 클로닝하였다.

인간 EC SOD cDNA를 포함하는 pUC 18-hEC SOD(스웨덴, Clinical chemistry, Marklund professor로부터 제공받음) 벡터를 주형으로 하기 프라이머(서열번호7 및 서열번호 8)를 이용하여 PCR 증폭함으로써 인간 EC SOD의 cDNA를 제조하였다. PCR증폭 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 1분 (30회), 72℃에서 5분의 조건에서 PfuI 중합효소를 이용하여 수행하였다.

센스 프라이머 (서열번호 7)

5’-tagattctggacgggcgagga-3‘

안티센스 프라이머 (서열번호 8)

5‘-tactcgagtcactctgagtgct-3’

증폭된 유전자 산물을 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 절단한 후 동일한 제한효소로 절단된 pET28a 벡터(NovaGene, 미국)에 4℃에서 12시간 T4 ligase를 이용하여 접합하였다.

상기 벡터를 대장균 DH5a에 형질감염시킨 다음, 상기 형질전환체를 카나마이신 25mg/mL을 함유하는 LB 고체배지에서 배양한 다음, 선별하였다. 선별된 형질전환체에 209E-EC-SOD 유전자가 제대로 삽입되었는지 여부를 유전자 서열분석을 실시하여 확인하였다. 209E-EC-SOD 유전자가 삽입된 것이 확인된 형질전환체에서 벡터 를 분리하여 과발현용 대장균 숙주세포인 BL21(NovaGene, 미국)에 삽입하여 카나마이신 25mg/mL을 함유하는 LB 고체배지에서 배양하면서 과발현균주를 선별하였다. 선발된 균주는 카나마이신 25mg/mL을 함유하는 LB 액체배지 5mL에서 12시간 동안 종배양한 다음, 선배양을 위해 1/20의 배율로 100mL의 상기와 같은 배지에 접종하였다. 배양액이 OD (Optical Density) 600에서 0.6에 도달될 때 IPTG로 최종 1mM이 되게 단백질 발현을 유도하여 37℃ 에서 6시간 본 배양을 하였다.

발현이 종료된 배양액을 원심분리에 의해 수득한 후에 100mM 염화칼슘이 함유된 50mM Tris 완충용액(pH 7.5)으로 현탁하여 초음파 분쇄기로 세포를 파괴하였다. 파괴된 세포는 원심분리에 의해 침전층만을 분리한 후에 같은 완충용액으로 3회 반복하여 세척하였다. 세척된 세포침전물은 불용성 단백질 내포체를 함유하고 있으며 이를 8M 우레아가 함유된 상기 Tris 완충용액에 상온에서 2시간 동안 완전히 현탁한 후 원심분리에 의해 상분리를 하였다. 상층의 수용액층은 용해된 불용성 재조합 209E-EC-SOD 단백질 내포체(inclusion body)를 함유하고 있다.

세척된 내포체(융합단백질 함량 50%) 10 mg을 Tris 완충용액 (50mM Tris-Cl, 100mM NaCl, pH 7.5)에 넣은 후 8M 우레아를 첨가하여 용해하였다. 용해된 내포체 용액 5 ml을 메탈 친화성 수지가 채워진 평형상태의 크로마토그래피 칼럼(3ml)의 위 방향으로 1mL/min로 주입하였다.

주입이 끝난 후 흡착되지 않은 고형 물질들을 제거하기 위해 8M 우레아가 포함된 완충 6 ml을 칼럼 상부 방향으로 1mL/min로 주입하였다. 다음으로, 1M 우레아가 함유된 트리스 완충용액 45ml를 칼럼 상부 방향으로 0.5mL/min로 선형적 농도 구배를 주면서 주입하여, 변성제인 우레아를 천천히 제거하여 단백질의 재접힘을 유도하였다. 그 후 2M 이미다졸과 1M 우레아가 함유된 트리스 완충용액을 농도 구배를 주어 칼럼의 상부로부터 하부방향으로 공급하였다. 재접힘된 융합단백질은 0.5M 이미다졸 농도의 용출 완충액이 공급되었을 때 용출되었다(도 5 참조).

용출된 단백질로부터 다량의 이미다졸을 제거하기 위해 탈염컬럼을 이용하여 Tris 완충용액 (50mM Tris-Cl, 100mM NaCl, pH 7.5)으로 교체하였고 한외여과법으로 농축하였다. 상기 재접힘 재조합 EC SOD 단백질, 정제된 재조합 EC SOD 단백질 및 한외여과법으로 농축된 재조합 EC SOD 단백질을 SDS-PAGE로 분석하여 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 방법에 의해 정제되고 농축된 재조합 EC-SOD는 생물학적으로 활성형인 것을 알 수 있었다.

<4-2> 재조합 209E- EC - SOD 단백질의 혈관신생억제 효과 조사

상기 실시예 <4-2>에서 제조된 재조합 209E-EC-SOD 단백질이 혈관신생을 억제하는 효과가 있는지 조사하였다.

피부각질형성세포(독일 Cancer Research의 N. Fusenig 교수에게 제공받음)를18 mm 커버슬립에 1X104 cells/well로 분주한다. 10% fetal bovine serum (FBS, GIBCO) 및 100 units/㎖ penicillin과 100 g/㎖ streptomycin을 1%로 첨가한 IMDM (Isocove's modified Dulbecco's medium, GIBCO) 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양한다. 부착된 세포가 30∼40% confluent할 때, fetal bovine serum 을 없애준 후 24시간 배양한다. 세포가 50∼60% confluent할 때 SOD 5 μg을 전 처리한다. 30분 동안 상기 실시예 <4-2>에서 제조된 재조합 209E-EC-SOD 단백질를 처리한 후 자외선을 100J 처리 후 24시간에 피부각질형성세포주를 파라포름알데하이드로 고정하여, 상기 실시예 <2-2>에 기재되어 있는 방법과 동일하게 VEGF를 형광염색하여 면역조직화학적 분석을 실시하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, UVB를 조사하지 않은 대조군(도 7의 A)에 비하여 UVB를 조사한 경우 VEGF의 발현이 현저히 증가(도 7의 B)되었다. 그리고 UVB 조사한 군에 상기 재조합 단백질을 처리한 경우에는 VEGF의 발현이 현저히 억제(도 7의 C)되는 것을 확인하여 재조합 209E-EC-SOD 단백질에 의해 혈관신생이 억제됨을 알 수 있었다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 천연형 또는 재조합 EC SOD 단백질은 혈관신생을 유도하는 VEGF 및 MMP-9의 발현을 억제하여 혈관신생을 억제하는 효과가 우수하므로 혈관신생에 의한 질병의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> BIO CLUE & SOLUTION CO.,LTD. SHIN, Dong-Heon <120> Composition for preventing or treating angiogenesis-induced diseases containing EC SOD protein <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(240) <223> Human EC SOD <400> 1 Met Leu Ala Leu Leu Cys Ser Cys Leu Leu Leu Ala Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 Asp Ala Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala 20 25 30 Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu 35 40 45 Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Thr Leu His Ala Ala Cys Gln 50 55 60 Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly 65 70 75 80 Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe 85 90 95 Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala 100 105 110 Ile His Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr 115 120 125 Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln His Pro Gly 130 135 140 Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg 145 150 155 160 Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg 165 170 175 Ala Val Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn 180 185 190 Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys 195 200 205 Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu 210 215 220 His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala 225 230 235 240 <210> 2 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(209) <223> 209E-EC-SOD <400> 2 Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala Glu Trp 1 5 10 15 Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu Val Met 20 25 30 Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Thr Leu His Ala Ala Cys Gln Val Gln 35 40 45 Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly Val Val 50 55 60 Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe Phe Ala 65 70 75 80 Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala Ile His 85 90 95 Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr Gly Pro 100 105 110 His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln His Pro Gly Asp Phe 115 120 125 Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg Ala Gly 130 135 140 Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg Ala Val 145 150 155 160 Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Gln Ala 165 170 175 Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys Val Val 180 185 190 Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu His Ser 195 200 205 Glu <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgctggcgc tactgtgttc ctgcctgctc ctggcagccg gtgcctcgga cgcctggacg 60 ggcgaggact cggcggagcc caactctgac tcggcggagt ggatccgaga catgtacgcc 120 aaggtcacgg agatctggca ggaggtcatg cagcggcggg acgacgacgg cacgctccac 180 gccgcctgcc aggtgcagcc gtcggccacg ctggacgccg cgcagccccg ggtgaccggc 240 gtcgtcctct tccggcagct tgcgccccgc gccaagctcg acgccttctt cgccctggag 300 ggcttcccga ccgagccgaa cagctccagc cgcgccatcc acgtgcacca gttcggggac 360 ctgagccagg gctgcgagtc caccgggccc cactacaacc cgctggccgt gccgcacccg 420 cagcacccgg gcgacttcgg caacttcgcg gtccgcgacg gcagcctctg gaggtaccgc 480 gccggcctgg ccgcctcgct cgcgggcccg cactccatcg tgggccgggc cgtggtcgtc 540 cacgctggcg aggacgacct gggccgcggc ggcaaccagg ccagcgtgga gaacgggaac 600 gcgggccggc ggctggcctg ctgcgtggtg ggcgtgtgcg ggcccgggct ctgggagcgc 660 caggcgcggg agcactcaga gcgcaagaag cggcggcgcg agagcgagtg caaggccgcc 720 720 <210> 4 <211> 627 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tggacgggcg aggactcggc ggagcccaac tctgactcgg cggagtggat ccgagacatg 60 tacgccaagg tcacggagat ctggcaggag gtcatgcagc ggcgggacga cgacggcacg 120 ctccacgccg cctgccaggt gcagccgtcg gccacgctgg acgccgcgca gccccgggtg 180 accggcgtcg tcctcttccg gcagcttgcg ccccgcgcca agctcgacgc cttcttcgcc 240 ctggagggct tcccgaccga gccgaacagc tccagccgcg ccatccacgt gcaccagttc 300 ggggacctga gccagggctg cgagtccacc gggccccact acaacccgct ggccgtgccg 360 cacccgcagc acccgggcga cttcggcaac ttcgcggtcc gcgacggcag cctctggagg 420 taccgcgccg gcctggccgc ctcgctcgcg ggcccgcact ccatcgtggg ccgggccgtg 480 gtcgtccacg ctggcgagga cgacctgggc cgcggcggca accaggccag cgtggagaac 540 gggaacgcgg gccggcggct ggcctgctgc gtggtgggcg tgtgcgggcc cgggctctgg 600 gagcgccagg cgcgggagca ctcagag 627 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 5 ttgtctctaa tagagggtc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 6 tcaagcctgt ctatcttct 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 7 tagattctgg acgggcgagg a 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 8 tactcgagtc actctgagtg ct 22

Claims (6)

1. 헤파린 결합 도메인이 제거된 재조합 EC SOD(extracellular superoxide dismutase) 단백질을 유효성분으로 하는 암, 당뇨병, 류마치스 관절염, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 당뇨병성 망막증, 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 모세관확장증, 화농성 육아종 및 여드름으로 이루어진 그룹에서 선택된 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 EC SOD 단백질은 서열번호 2의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
4. 제 1항의 EC SOD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물.
6. 삭제

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