JP5581485B2 - Ec−sodの新規な用途及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明のさらに他の目的は、前記EC−SOD蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記EC−SOD蛋白質を有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記EC−SOD蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記EC−SOD蛋白質の製造方法を提供することである。
さらに、本発明は前記EC−SOD蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
さらに、本発明はEC−SOD蛋白質を有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
さらに、本発明はEC−SOD蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供する。さらに、本発明は(a)EC−SOD蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階;(b)前記発現ベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換する段階;(c)前記形質転換された宿主細胞を培養してEC−SOD蛋白質を発現する段階;(d)発現されたEC−SOD蛋白質の内包体を収得する段階;及び(e)前記内包体の溶解及びリホールディング(refolding)を誘導する段階を含むことを特徴とするEC−SOD蛋白質の製造方法を提供する。
本発明で発現ベクターとは、適当な宿主細胞より目的蛋白質又は目的RNAを発現できるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子製作物を言う。
本発明で用語、“作動可能に連結された(operably linked)”とは、一般的な機能を遂行できるように核酸発現調節配列と、目的とする蛋白質又はRNAをコーデイングする核酸配列が機能的に連結(functional linkage)されていることを言う。例えば、プロモータと蛋白質又はRNAをコーデイングする核酸配列が作動可能に連結され、コーデイングする核酸配列の発現に影響を及ぼし得る。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野で広く知られた遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位−特異的RNA切断及び連結は当該技術分野で一般的に知られた酵素等を使用する。
前記EC−SOD蛋白質はこれに限定はされないものの、好ましくは、天然型又は組換えEC−SOD蛋白質を言う。前記天然型EC−SOD蛋白質はこれに限定はされないものの、マウス又は人間より由来したものであることを特徴とし、最も好ましくは、人間より由来したものであることを特徴とする。前記天然型EC−SOD蛋白質はこれに限定はされないものの、好ましくは、配列番号3及び配列番号5のアミノ酸配列を有することを特徴とし、最も好ましくは、配列番号3を有することを特徴とする。一方、前記組換えEC−SOD蛋白質は、前記天然型EC−SODから組換え技術により製造され、その活性を維持するものであればこれに限定はされないものの、好ましくは、配列番号1アミノ酸配列を有することを特徴とする。
前記EC−SOD蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドは、前記天然型EC−SOD蛋白質又は組換えEC−SOD蛋白質をコーデイングし得るポリヌクレオチドを意味し、これに限定はされないものの、好ましくは、配列番号2、配列番号4及び配列番号6からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする。
上述した通り、EC−SOD蛋白質はこれに限定はされないものの、好ましくは天然型又は組換え蛋白質を言う。前記天然型EC−SOD蛋白質は、これに限定はされないものの、好ましくはマウス又は人間より由来したことであることを特徴とし、最も好ましくは、人間より由来したことを特徴とする。前記天然型EC−SOD蛋白質は、これに限定はされないものの、好ましくは配列番号3及び配列番号5のアミノ酸配列を有することを特徴とし、最も好ましくは、配列番号3を有することを特徴とする。一方、前記組換えEC−SOD蛋白質は前記天然型EC−SODから組換え技術により製造され、その活性を維持するものであればこれに限定はされないものの、好ましくは配列番号1アミノ酸配列を有することを特徴とする。
上述した通り、前記EC−SOD蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドは、前記天然型EC−SOD蛋白質又は組換えEC−SOD蛋白質をコーデイングし得るポリヌクレオチドを意味し、これに限定はされないものの、好ましくは配列番号2、配列番号4及び配列番号6からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする。
本発明で“機能的同等物”とは、配列番号3で表示されるアミノ酸配列を有するEC−SODと実質的に同等な生理活性を示すポリペプチドを言う。
ただし、実施例には本発明を単に例示するものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
EC−SODを過発現するマウスの製造
先ず、マウスより由来したEC−SODを過発現するマウスを下記のような方法で製造した。一方、前記マウスより由来したEC−SOD塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ配列番号6及び配列番号5に記載した。
野生型BDF1マウスは8乃至10週齢BDF1マウス(中央実験動物)を使用した。EC−SOD過発現マウスは8乃至10週齢BDF1マウスを使用し、公知された方法により製造した(H.Y.Ha.et.al.,Biochem Biophys Res Commun,348:450−458,2006)。動物使用の為の実験方法はカトリック医科学研究所生命倫理委員会により承認を受けて使用した。
センスプライマー(配列番号7)
5′−TTG TCT CTA ATA GAG GGT C−3′
アンチセンスプライマー(配列番号8)
5′−TCA AGC CTG TCT ATC TTC T−3′
生物学的活性を有する組換えEC−SOD蛋白質の製造
<1−1>組換えEC−SOD蛋白質発現の為の融合EC−SOD遺伝子のクローニング
生物学的活性を有する組換えEC−SOD蛋白質を製造する為に、人間由来のEC−SODのN−末端部位にある信号ペプチド(signal peptide)を除去して、C−末端部位の13個アミノ酸が除去された209個のアミノ酸からなる、組換えEC−SODを次のような方法でクローニングした(前記組換えEC−SOD塩基配 列と、アミノ酸配列は、それぞれ配列番号2及び配列番号1に記載し、前記人間由来のEC−SOD塩基配列と、アミノ酸配列はそれぞれ配列番号4及び配列番号3に記載した)。
センスプライマー(配列番号9)
5′−tagattctggacgggcgagga−3′
アンチセンスプライマー(配列番号10)
5′−tactcgagtcactctgagtgct−3′
前記<実施例1−1>で選別された菌株を37℃,カナマイシン25mg/mLを含有するLB液体培地で培養した。これをOD(Optical Density)600nmで0.6に達した時、IPTG(1mM)を添加して蛋白質発現を誘導し、37℃で6時間本培養をして組換えEC−SOD蛋白質を発現させた。
発現が終了された培養液で遠心分離により、細胞を収得した後、100mM塩化カルシウムが含有された50mM Tris緩衝溶液(pH7.5)で懸濁し、超音波粉砕機で細胞を破壊した。これを遠心分離して沈殿層のみを分離し、前記100mM塩化カルシウムが含有された50mM Tris緩衝溶液で3回繰返して洗浄した。洗浄された細胞沈殿物には、不溶性蛋白質内包体(inclusion body)を含有している。洗浄された内包体(融合蛋白質含量50%)10mgをTris緩衝溶液(50mM Tris−C1,100mM NaCl,pH7.5)に入れ、8Mウレアを添加して溶解した。室温で2時間完全に懸濁して、遠心分離により相分離し、上層の水溶液層は溶解された不溶性組換えEC−SOD蛋白質内包体を含有していることからこれを収得した(内包体溶液)。
その後、2Mイミダゾールと1Mウレアが含有されたトリス緩衝溶液を濃度勾配を与えてコラムの上部から下部方向に供給した。リホールディング融合蛋白質は0.5Mイミダゾール濃度の溶出緩衝液が供給された時、溶出された(図1参照)。
前記<実施例1−3>から溶出された蛋白質より多量のイミダゾールを除去して、完全にリホールディングさせ、複合体を大きさ別に分離する為に、高速蛋白質精製用液状クロマトグラフィー機器と、ゲル濾過クロマトグラフィー(gel filtration chromatography)コラム(Sepharose 12 column)を利用した。この工程ではトリス緩衝溶液(50mM Tris Cl 100mM NaCl,pH7.5)又はリン酸緩衝溶液(Phosphate Buffered Saline pH7.5)をコラム上部方向に0.5mL/minで流入させ、分離及び精製した。分離された目的蛋白質は限外濾過法で濃縮した。
その結果、本発明の組換えEC−SOD蛋白質を得ることができ、それぞれの精製段階における試料をSDS−PAGEで分析した結果、図2に示した通り、組換えEC−SODが良く分離されたことが分かった。
前記<実施例1−4>で分離、精製された組換えEC−SODが確かであるか、否かを確認する為に、ウェスタンブロット(western blot)を実施した。EC−SOD標準蛋白質には、人間の皮膚角質形成細胞(keratinocyte)細胞株であるHaCaT(ドイツCancer Research N.Fusenig教授より提供)から発現された人間EC−SODを使用した。HaCaTから発現された人間EC−SODと、前記<実施例1−4>で分離、精製された組換えEC−SOD蛋白質等を10%のポリアクリルアミドゲルで電気泳動で分離し、ポリビニリデンフルオライトメンブレーン(Gelman Laboratory,MI,米国)に移した。その後、ポリビニリデンフルオリドメンブレンを5%の脱脂粉乳でブロッキング(blocking)した後、抗EC−SODポリクローナル抗体(1:500,サンタクルズ、USA)と共に培養した。前記膜を水洗した後、パーオキシダーゼが結合されている2次抗体IgG(サンタクルズ、米国)を使って培養し、再度水洗した後、ECL検出キット(GE Healthcare,米国)を利用して製造社の指針に従い発色した。
その結果、図3に示した通り、HaCaTから発現された人間EC−SOD(レーン1)で陽性を示し、分離精製された組換えEC−SOD蛋白質(レーン2)でも検出され、精製された蛋白質が人間EC−SODであることが分かった。
前記分離精製された組換えEC−SOD蛋白質がSODの生物学的活性を有するか否かを確認する為に、SOD Assay Kit−WST(Dojindo Molecular Technology,米国)を利用して製造社の指針に従い活性テストをした。
その結果、図4に示した通り、精製工程中に吸着されずに溶出された試料(209FT)は、活性を示さず金属親和性クロマトグラフィーコラムでリホールディングされた、1次精製された組換えEC−SOD蛋白質(209E1)の活性は、250unit/mg proteinであり、ゲル濾過コラムを利用して分離、精製された組換えEC−SOD蛋白質(209E2)の活性は360unit/mg proteinを呈した。
組換えEC−SOD蛋白質のHaCaT cellにおけるROS(reactive oxygen species)除去効果を見る為に、前記<実施例1−4>にて分離、精製された組換えEC−SOD蛋白質を以下の通り処理した。
皮膚角質形成細胞(HaCaT)を18mmカバースリップに1×104cells/wellに分株した後、10%牛胎児血清(FBS,GIBCO)及び100units/mlペニシリンと、100g/mlストレプトマイシンを1%添加したIMDM(Isocove′s modified Dulbecco′s medium,GIBCO)培地を使用して、5%CO2、37℃の条件で培養した。付着された細胞が約30〜40%コンフルエント(confluent)になったら、牛胎児血清を取除いて24時間培養した。細胞が50〜60%コンフルエント(confluent)になったら、前記EC−SOD10μgで細胞を30分間前処理した。UVB(100J/m2)で3時間照射した後、10MmDCFH−DAと37℃で30分間反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。写真はZeissデジタルカメラを利用して撮影した。
その結果、図5に示した通り、UVBのみ照射した場合(UVB)ROSが除去されなかったものの、UVBを照射して本発明の組換えEC−SODを処理した場合(ECSOD+UVB)、ROSが効果的に除去されたことが分った。
天然型EC−SOD蛋白質の血管新生抑制効果
<2−1>EC−SOD過発現マウスと野生型マウスの形態学的比較
前記<実験例1>にて製造されたマウスより由来したEC−SODを過発現するマウスと、野生型BDF1マウスの背側皮膚に2kJ/m2で24時間間隔でUVBを4回照射した。つまり、前記マウス等の背側皮膚をUVB照射2日前に除毛し、280nm〜340nm波長範囲で305nmの最大エネルギーを有する6個のUVBランプ(FS24T12/UVB/HO,290−320nm,Voltare社、Fairfeild,CT,米国)を使用して、8週齢のマウス24匹に200mJ/cm2で一定に照射した。UVB照射する間ランプの高さは、麻酔されたマウスの背側皮膚表面に0.3mW/cm2で照射されるように調節した。各群のマウス(各群(n−6))等に24時間間隔で4回UVBを照射し、実験の為、4回目照射1時間後にマウスを犠牲にした。犠牲にしたマウスの背側皮膚患部を切開して肉眼で観察した結果を図6に示した。
前記図6に示した通り、野生型マウスに紫外線UVBを照射DQ場合(図6C)には、紫外線を照射しなかった場合(図6A)と比較して新生血管形成、皮膚炎症反応と紅斑が著しく誘導された。しかしながら、EC−SOD過発現マウスでは、紫外線照射前(図6B)と、照射後(図6D)に統計学的に意味のある差が無かった。つまり、紫外線UVB照射により、誘導された野生型マウスにおいて(図6B)の新生血管形成がEC−SOD過発現マウス(図6D)において著しく抑制されることが分った。前記結果からEC−SODは新生血管形成を抑制する機能があることを推定することができた。
前記<実験例1>で製造されたマウスより由来したEC−SODを過発現するマウスにおいて、血管新生過程を誘導する血管内皮細胞成長因子(VEGF)の発現程度をウェスタンブロットを利用して調査した。
前記実施例<2−1>で犠牲にしたEC−SOD過発現マウスと、野生型マウスそれぞれの背皮膚組織又は細胞を抽出溶液(50mMのTris HC1 pH8.0,5mMのEDTA,150mMのNaCl,0.5%のdeoxycholateナトリウム、1%のNonidet P−40,0.1%のSDS,1mMのPMSF,1mMのNaF,1mMのNaVO4さらに、プロテアーゼ抑制剤カクテル(Roche,ドイツ)で均質に抽出した。蛋白質濃度を決定する為に、バイオラド蛋白質キット(Bio−Rad,CA,USA)を使用し、牛胎児血清アルブミン(BSA)を標準物質として使用した。前記蛋白質抽出物等を10%のポリアクリルアミドゲルの上で分離し、ポリビニリデンフルオリドメンブレン(Gelman Laboratory,MI,米国)に移し、ポリビニリデンフルオリドメンブレンを5%の脱脂粉乳でブロッキング(blocking)した後、抗VEGFポリクローナル抗体(1:500,サンタクルズ、米国)と、抗ベータアクチン抗体それぞれと共に培養した。前記膜を水洗した後、パーオキシダーゼが結合されている2次抗体IgG(サンタクルズ、米国)と培養し再び水洗した後、ECL検出キットを利用して発色した。
実験の結果、UVB照射により野生型マウスにおいてVEGFの発現量が増加したものの、UVB照射されたEC−SOD過発現されたマウスでは、VEGFの発現が著しく減少された(図7)。前記の結果からEC−SODが血管新生抑制効果があることが再び確認できた。
EC−SODがVEGFの発現を抑制するか、否かを免疫組織化学的方法により再び確認した。
前記実施例<2−1>において、犠牲にしたEC−SOD過発現マウスと、野生型マウスそれぞれの背皮膚組織を0.5Mのリン酸塩緩衝液(pH7.4)で作った4%のパラホルムアルデヒドで固定させた。流水で水洗後、エタノールで脱水し、パラフィンに包埋させ、5mmの厚さで切片してガラススライドに付着した。前記切片をキシレン溶液を使用して脱パラフィンし、エタノールで含水した後、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。脱パラフィンされた組織切片に3%の過酸化水素を処理してブロッキングした。非特異的結合と背景染色を減らす為に、前記切片を10%羊の血清で処理した。各組織スライドを抗VEGFポリクローナル抗体(1:500,サンタクルズ、米国)で処理し、ストレプタビジン−バイオチンキット(LSAB,Dako,CA,米国)を利用してアビジンーバイオチンーイムノパーオキシダーゼコンプレックス法で視覚化した。染色された組織を水洗した後、ジアミノベンチジン(DAB)で発色し、0.2%のメイアーヘマトキシリン(シグマ、MO,米国)で対照染色を行いその結果を図8に示した。
前記図8に示した通り、野生型マウスにおいて、UVB照射によりVEGFが多く発現されたものの、EC−SODが過発現されたマウスでは野生型マウスに比べてVEGFの発現が著しく抑制され、前記実施例<1−2>の結果と一致する結果を得た。前記結果等から、生体内(in−vivo)で天然型EC−SODが血管新生を誘導するVEGF発現を抑制して血管新生を抑制する効果があることが分った。
細胞外の基質蛋白質を分解するMMP蛋白質は、VEGFと共に、血管新生の重要調節因子である。特に、MMP9はVEGFーVEGFRシステムを介して腫瘍の血管新生過程を調節する因子として知られている(Bergers et al.,Nat. Cell Biol.,2:737−744,2000)。従って、本発明者等はEC−SOD過発現マウスにおいて、UVB照射によるMMP−9発現水準を調査した。
前記実施例<2−1>で犠牲にしたEC−SOD過発現マウスと、野生型マウスそれぞれの背皮膚組織に1mg/ml gelatin(100mg/ml)を混合してSODーPAGEを行った後、ゲルを2.5%トリトンX−100で20分間処理して水洗する。Zymography反応溶液(1M Tris(pH7.5),1M CaCl2,5M NaCl,0.2mM ZnCl2,25%TX−100,0.2% NaN3)で37℃にて16時間反応させ、1時間染色した後、1時間脱色する。オーブンで1時間乾燥させ分析した結果を図9に示した。
前記図9に示した通り、紫外線照射する前の野生型マウスとEC−SOD過発現マウスのMMP−9の発現水準は別段の差がなかった。しかしながら、UVB照射により、野生型マウスはMMP−9の発現が増加するものの、EC−SODマウスの場合には、MMP−9の発現が野生型マウスに比べて著しく抑制される。
前記結果から、生体内で天然型EC−SODがVEGFの発現を抑制するばかりでなく、VEGFーVEGFRシステムを介した血管新生関連信号伝達に関与するMMP−9の発現を抑制して血管新生を効果的に抑制することが分った。
組換えEC−SOD蛋白質の血管新生抑制効果
前記<実施例1>で分離、精製された組換えEC−SOD蛋白質を利用して、血管新生を抑制する効果があるか、否かを調査した。皮膚角質形成細胞(HaCaT)を18mmカバースリップに1×104 cells/wellで分株する。10%牛胎児血清(FBS,GIBCO)及び100units/mlペニシリン(penicillin)と、100g/mlストレプトマイシン(streptomycin)を1%添加したIMDM(Isocove′s modified Dulbecco′s medium,GIBCO)培地を使用して5%CO2、37℃の条件で培養した。付着された細胞が30〜40%コンフルエント(confluent)になったら、牛胎児血清を取除いた後、24時間培養した。細胞が50〜60%コンフルエント(confluent)になったら、EC−SOD10μgで前処理する。30分間、精製された組換えEC−SOD蛋白質で処理した後、紫外線100Jで処理し、24時間後皮膚角質形成細胞株をパラホルムアルデヒドで固定して、免疫染色を実施した。固定された細胞を10%正常羊血清(normal goat serum)を利用してブロッキング(blocking)した後、リン酸緩衝液(PBS)で3回水洗した。ここにVEGF(Vascular endothelial growth factor)に対する免疫染色の為、兎抗VEGF抗体(rabbit anti VEGF antibody,santacuz,米国)でそれぞれ処理した後、4℃で16時間以上反応させた。FITCが融合された抗二十日鼠IgG2次抗体(anti−mouse IgG secondary antibody,zymed,米国)を利用して蛍光染色した後、蛍光顕微鏡(Carl Zeiss,ドイツ)で観察した。
その結果、図10に示した通り、UVBを照射しない対照群(control)に比べてUVBを照射した場合(UVB)VEGFの発現が著しく増加された。さらに、UVB照射した群に前記組換え蛋白質を処理した場合(EC−SOD/UVB)には、VEGFの発現が著しく抑制されることを確認し、組換えEC−SOD蛋白質により、血管新生が抑制されることが分った。
組換えEC−SOD蛋白質によるT細胞増殖及び分化に及ぼす影響
<4−1>組換えEC−SODのT細胞増殖及び分化に及ぼす影響の確認
EC−SODが免疫細胞であるT細胞に影響を及ぼすか、否かを調べるために、特異抗原(Ovalbumin)に反応するTCR(T cell receptor)形質転換マウス(DO.11.10.浦項工大成永哲教授より提供)を使用して下記の通り調査した。
EC−SODがT細胞の増殖に影響を与えるか否かを確認する為、前記形質転換したマウス脾臓より分離した細胞を、抗原であるオブアルブミンペプチド(Ova peptide)と共に、72時間培養し、最後の16時間3Hと培養した後、放射線量を測定してT細胞の増殖を確認した。
その結果、図11に示した通り、EC−SODを添加しない群と、EC−SODをそれぞれ1μg/ml又は10μg/ml添加した群で放射線量の差が殆どなく、EC−SODが殆どT細胞増殖に影響を与えないことが分った。
T細胞の増殖に影響を及ぼさなくてもT細胞の分化に影響を及ぼし得る為、分化を知り得るT細胞のサイトカインを測定した。
脾臓細胞を抗原であるオブアルブミンペプチドと共に、48時間培養後培養培地に生成されたIL−4(interleukin−4)サイトカインを測定した。測定方法は、BD(Becton Dickinson and Company,米国)会社のELISA−kitを利用して、製造社の指針に従い測定した。
その結果、図12に示した通り、EC−SODがIL−4の形成を減少させることが分った。この結果により、EC−SODがT細胞の分化に影響を及ぼし得る(neg.:抗原が処理されない試験群、−:抗原(Ova peptide)のみ処理された試験群、p:抗原(Ova peptide)とPBSに入っているEC−SODを一緒に処理した試験群、NB:抗原(Ova peptide)とSodium borateに含まれているEC−SODを一緒に処理した試験群、全ての試験群は一緒に48時間培養培地に入れて処理された)。
一方、本発明の組換えEC−SODT細胞分化に及ぼす影響を具体的に調べる為に、前記組換えEC−SODをマウスのT細胞に投与してIL−4及びINF−γ等のサイトカインの生成量を比較した。
具体的に特定抗原であるOvaペプチドのみを認知するTCR(T cell receptor)遺伝子過発現マウスであるDO 11.10(浦項工大成永哲教授より提供)脾臓においてCD4細胞をMACS(Miltenyi Biotech)を利用して分離した。抗原提示細胞で正常マウスであるBalb/cマウス脾臓細胞全体をγーirradiationし、Ovaペプチド(1μg/ml,Ova323−339,ペプトロン社)及びMACSで分離したCD4 T細胞と共にRPMI1640培地で10%FBSを入れて培養した。培養過程で、前記<実施例1>で分離精製された組換えEC−SODを前記培養に与えた。72時間後に培養液を採集してELISA(抗体:Becton Dickinson)で培養液内のIL−4とIFN−γの量を定量した。
その結果、図13に示した通り、前記<実施例1>で分離精製された組換えEC−SODは、T細胞において、Thl側のサイトカインであるIFN−γの形成を誘導し、Th2側のサイトカインであるIL−4の形成を抑制することが分った。従って、組換えEC−SODは免疫細胞に影響を及ぼし、特に、T細胞の分化に影響を及ぼすことが分った。
従って、本発明の組換えEC−SODはアレルギー疾患を誘発するTh2細胞の過分化を遮断し、Th1細胞への分化を誘導することにより、アレルギー疾患を治療又は予防に有用に使用できるとこが分った。
天然型EC−SOD蛋白質のT細胞分化に及ぼす影響
前記<実験例1>に記載された人間のEC−SODを過発現させたマウスにOva蛋白質とTh1側に免疫を誘導する免疫補助剤CFA(Complete Freund′s Adjuvant,Sigma社)を、Th2側にはAlum(Aluminum Hydroxide,Pierce社)を混合して、それぞれ25μgずつ足裏と尻尾に免疫処理した後、11日後に炎症が発生したリンパ球で細胞を分離し、EC−SODが細胞増殖とサイトカイン生成に影響を及ぼすか否かを観察した。
前記細胞増殖には、リンパ球細胞5×105を96well plateに培養し、培養3日後に同位元素である3Hを培養液にいれて、16時間後に細胞内の同位元素含量をβ−counterを利用して促進することにより細胞増殖を観察した。さらに、抗原特異的な反応であることを確認する為に、Ova蛋白質の量を異にして細胞増殖を観察した。サイトカイン発現を観察する為に、リンパ球細胞5×106を46well plateに培養し、72時間後に培養液を採取して、ELISAで培養液内のIL−4とIFN−γの量を定量してその結果を図14及び図15に記載した。
前記図14及び図15に記載された通り、Th1分化を誘導するCFAを免疫補助剤として使用した場合、リンパ細胞増殖が正常マウスのリンパ細胞より若干増加することを観察した。IFN−γの発現が増加されたことを観察した。さらに、Th2分化を誘導するAlumを免疫補助剤として使用した時、リンパ細胞増殖が正常マウスのリンパ細胞より減少し、IL−4の発現が減少されたことを観察した。このような結果は、EC−SODがT細胞の分化に影響を及ぼすものの、特に、主にTh1側に分化させ、Th2側への分化を抑制させることが分った。
従って、天然型EC−SODは、アレルギー疾患を誘発するTh2細胞の過分化を遮断してTh1細胞への分化を誘導することにより、アレルギー疾患を治療又は予防に有用に使用できることが分った。
組換えEC−SOD蛋白質の転写因子活性阻害効果確認
紫外線によるNF−κB活性化に対するEC−SOD効果を調べる為に、HaCaT cellを14mm培養スライドに細胞を接種した後、牛胎児血清(fetal bovine serum)が10%含まれたDMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)培地で24時間培養した。24時間培養後、牛胎児血清が1%含まれたDMEM培地で24時間飢餓処理(starvati on)をした。処理後それぞれ10μgのEC−SODを30分間処理した後(前処理)リン酸緩衝液(Phosphate buffered saline,PBS)を利用して細胞を3回水洗した後、NF−κB活性化を誘導する為に、100J/m2の紫外線を照射した。紫外線照射直後、細胞を再びリン酸緩衝液で水洗して牛胎児血清が1%含まれたDMEM培地にEC−SODを前処理濃度と同じく処理して、さらに4時間培養した。以降、細胞をメタノールで5分間固定して免疫染色を実施した。このように固定された細胞を10%正常羊血清(normal goat serum)を利用してブロッキング(blocking)した後、リン酸緩衝液(PBS)で3回水洗した。 ここに、EC−SODとNF−κBに対する免疫染色の為に、二十日鼠抗EC−SOD 抗体(mouse anti EC−SOD antibody,Labfrontier,韓国)と、兎抗NF−κB抗体(rabbit anti NF−κB an tibody,santacuz,米国)をそれぞれ処理し、4℃で16時間反応させた。これをTRITC(tetramethyl rhodamine isothi ocyanate)が融合された抗兎IgG2次抗体(antiーrabbit IgG secondary antibody,serotec,英国)とFITCが融合された、抗二十日鼠IgG2次抗体(antiーmouse IgG se condary antibody,zymed,米国)を利用して蛍光染色した後、hoechst(Sigma,米国)でカウンター染色した。
その結果、図16(200倍比率)に示した通り、対照群(control,EC−SODが形質感染されたHaCaT細胞にUV処理を施していない群)において、NF−κBは細胞質及び核で免疫染色がなされず、NF−κBが不活性されたことが分った(A,D,G,J)。UVB群(HaCaT細胞にUVBを100J/m2で照射した群)では、速やかに核(nuclear)部位と核周囲(perinuclear)部位で、NF−κBが活性化されることが観察された(B,E,H,K)。これに比べて、ECSOD/UVB群(HaCaT cellに本発明の組換えEC−SOD蛋白質を処理し、UVBを100J/m2で照射した群)では、UVB群に比べて著しく核部位のNF−κBの活性化が阻害されることが観察された(C,F,I,L)。このような結果により、本願発明の組換えEC−SODが転写因子であるNF−κBの活性化を抑制することが分った。
従って、本願発明の組換えEC−SODはNF−κBの非正常的な活性を防ぎ、アレルギー等の自己免疫疾患を予防又は治療に有用に使用できることが分った。
組換えEC−SOD蛋白質の人間肥満細胞脱顆粒(degranulation)の減少効果確認
EC−SODが人間肥満細胞の脱顆粒(degranulation)にどのような影響を及ぼすか、否かを調べる為に、トルイジンブルーで染色した後、細胞100個の内、脱顆粒が起こった細胞数を数えてみた。
人間肥満細胞(semi,Human Mast Cell−1(HMC−1),慶熙大学校金炯敏教授より提供)を18×18mmカバースリーブに1×104cells/カバースリーブで分株した。培地は10%牛胎児血清(FBS,GIBCO)及び100units/mlペニシリンと100g/mlストレプトマイシン1%で添加したIMDM(Isocove′s modified Dulbecco′s medium,GIBCO)を使用して5%CO2、37℃の条件で培養した。この細胞は半付着細胞(semi−adhesion)である為、付着された細胞と付着されない細胞の比率は4:6程度であるものの、付着された細胞が約30−40%コンフルエント(confluent)した時、EC−SOD5μgで、1時間前処理した後、カルシウムチャンネルであるA23187 1μMとホルボルミリステートアセテート(Phorbol 12−Myristate 13−Acetate,PMA)50nMで処理して、細胞内のカルシウム濃度を高めた。
12時間後に、リン酸緩衝溶液(PBS)で人間肥満細胞を洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)で10分間固定させた。リン酸緩衝溶液で洗浄し、酸性を帯びた(pH2.3)1%の塩水に溶解されている0.1%トルイジン(toluidine)ブルー溶液で2−3分間染色した。再び水で洗浄した後、95%,100%アルコールで脱水させ、キシレン(xylene)で固定させ、100個の染色させた細胞のうち脱顆粒が起こった細胞数を数えてみた。
その結果、図17Aに示した通り、何等の処理もしていない人間肥満細胞群(対照群,con)で脱顆粒された細胞数は10個、EC−SODを処理した群(EC−SOD)で脱顆粒された細胞数は16個であった。これに比べて肥満細胞を活性化させ、脱顆粒を誘導する為に、細胞内のカルシウム濃度を高めた群(A+P)では脱顆粒された細胞数が55個で、5倍以上増加したものの、EC−SODを前処理して細胞内のカルシウム濃度を高めた群(A+P+EC−SOD)では、脱顆粒された細胞数が25個までさらに減少した。これはEC−SODの作用による活性酸素抑制により、脱顆粒減少が起こったことを示している。肥満細胞脱顆粒に対する顕微鏡写真は図17Bの通りである。
従って、肥満細胞の脱顆粒により肥満細胞内にあったヒスタミン等の媒介物質がでてきて、アレルギー等の炎症反応が起るとの事実を考慮するに、本発明の組換えEC−SODは人間肥満細胞脱顆粒(degranulation)を減少させ、アレルギー疾患を予防又は治療に有用に使用でき得ることが分った。
Claims (4)
- 組換えEC−SOD蛋白質を有効成分とし、前記組換えEC−SOD蛋白質が配列番号1のアミノ酸配列からなる血管新生抑制剤用組成物。
- 前記血管新生抑制剤は、糖尿病、リウマチ性関節炎、動脈硬化、血管腫、血管繊維腫、糖尿病性網膜症、早熟児の網膜症、新生血管性緑内障、新生血管による角膜疾患、退化斑、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫及びニキビからなる群より選ばれた血管新生による疾患の予防又は治療剤であることを特徴とする請求項1記載の血管新生抑制剤用組成物。
- 請求項1に記載のEC−SOD蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とし、前記ポリヌクレオチドが配列番号2の塩基配列からなることを特徴とする血管新生抑制剤用組成物。
- 前記血管新生抑制剤は、糖尿病、リウマチ性関節炎、動脈硬化、血管腫、血管繊維腫、糖尿病性網膜症、早熟児の網膜症、新生血管性緑内障、新生血管による角膜疾患、退化斑、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫及びニキビからなる群より選ばれた血管新生による疾患の予防又は治療剤であることを特徴とする請求項3記載の血管新生抑制剤用組成物。
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