WO2012075911A1 - 重组人prx-6蛋白在治疗烧烫伤和/或角膜损伤中的用途 - Google Patents

重组人prx-6蛋白在治疗烧烫伤和/或角膜损伤中的用途 Download PDF

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WO2012075911A1
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prx
corneal
treatment
pharmaceutical composition
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李建远
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Li Jianyuan
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    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
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    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
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    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01015—Peroxiredoxin (1.11.1.15)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology and medicine, and in particular to the use of recombinant human Prx-6 protein for the treatment of burns and/or corneal damage. Background technique
  • Burns and burns are common diseases, frequently-occurring diseases, and also traumatic diseases with high disability rates.
  • the lighter also brings great pain to the injured person.
  • the severe one often damages the organ function, causing great inconvenience to the patient's work and life.
  • the burn is more likely to occur in the exposed part of the person, the scar after healing is destroyed.
  • the appearance of the person will also have an adverse effect on the patient's psychology. Therefore, for moderately mild burns/scalds, the healing period should be shortened as much as possible, the patient's pain should be reduced, and scar formation should be minimized.
  • complications such as various organ damage and secondary infection caused by reperfusion should be minimized.
  • the commonly used method for clinical treatment of burns is usually treated with bandage therapy or exposure therapy after early wound treatment.
  • wound anti-infective treatment should be carried out.
  • anti-infective drugs selected for debridement one is Chinese herbal preparations, such as Sijiqing, Maodongqing, Coptis, Cork, etc.; It is a chemical drug preparation, such as hydrogen peroxide, neostigmine, and methane sulfonate; the third is antibiotic preparations such as penicillin and gentamicin.
  • these drugs can be used on a large scale, especially if the concentration is too large or when the powder is used, it often causes poisoning or visceral damage. In addition, these drugs generally have a certain degree of irritability, which often causes pain to the patient during use.
  • the eye is the most sensitive part of UV radiation. Studies have shown that ultraviolet light with a wavelength of 230 nm can be absorbed by the corneal epithelium, and ultraviolet light at 280 nm has the greatest damage to the cornea. 6 to 10 hours after exposure to ultraviolet light, foreign body sputum pain and subsequent symptoms such as photophobia and tearing may occur, and corneal epithelial edema, shedding, and decreased transparency may occur.
  • the main treatments are symptomatic, systemic analgesic and sedative drugs, cold eyelids, and bandage shading.
  • a small amount of local anesthetic 0.5% dicaine may be instilled into the conjunctival sac, and antibiotic eye drops are used to prevent secondary infection.
  • Most of them have no treatment measures for corneal epithelial cell damage repair and free radical scavenging.
  • Prxs Peroxiredoxins
  • Prx 1-5 is a 2_Cys enzyme and thioredoxin is an electron donor
  • Prx-6 protein is the only 1-Cys enzyme in mammals
  • GSH glutathione
  • Prx-6 protein was first isolated in the bovine eye ciliary body, also known as LTW4, antioxidant protein 2, Clara cell protein 26, p67 phagocytic oxidase (phox) binding protein, keratinocyte growth factor (KGF).
  • lKDa The regulation gene 1 and the like, composed of 224 amino acids, the molecular weight of 25. lKDa. Analysis of the crystal structure of the protein revealed a thioredoxin fold consisting of 80 amino acids, which contained four ⁇ -sheets and two t-helices.
  • Prx-6 protein has anti-oxidative damage function.
  • Cell-level studies have shown that overexpression of Prx-6 protein can significantly reduce lipid peroxidation and reduce plasma membrane damage. Inhibition of Prx-6 protein expression, significant lipid peroxidation, lipid membrane damage and cell death can be observed. Die.
  • In vivo level studies showed that Prx-6 transgenic mice had a significant protective effect on hyperoxia injury; Prx-6 knockout mice had significantly reduced antioxidant damage.
  • these studies are mainly concerned with the anti-oxidative damage of Prx-6 protein in heart, lung or skin tissues, and do not involve the use of Prx-6 protein in the treatment of burns and/or corneal damage.
  • a Pn-6 protein for the manufacture of a medicament for the treatment of burns and/or corneal damage.
  • the Prx-6 protein is a human Prx-6 protein or an active fragment thereof or a derivative thereof.
  • the Prx-6 protein is a recombinant protein.
  • the Prx-6 protein comprises a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an active fragment of positions 5-169 of SEQ ID NO: 2, or an expression tag thereof A fusion protein formed by (eg, 6-His).
  • a pharmaceutical composition for treating burns and/or corneal damage comprising a Prx-6 protein and a pharmaceutically acceptable carrier, and
  • the pharmaceutical composition is an external preparation or an ophthalmic preparation.
  • the Prx-6 protein is a human Prx-6 protein or an active fragment thereof or a derivative thereof.
  • the Prx-6 protein is a recombinant protein.
  • the external preparation is a cream, a spray, or a drop.
  • the ophthalmic preparation is an eye drop, an ophthalmic gel or an eye ointment.
  • the pharmaceutical composition further contains other drugs for treating burns.
  • a method of treating burns and/or corneal damage comprising the steps of:
  • the Prx-6 protein or the pharmaceutical composition described in the second aspect of the invention is administered on the burnt wound surface.
  • the Prx-6 protein or the pharmaceutical composition described in the second aspect of the invention is dropped or coated into the conjunctival sac.
  • the treatment of burns includes: promoting wound healing and reducing inflammatory response of the wound.
  • the treatment of corneal damage comprises: inhibiting the formation of corneal neovascularization; repairing damaged corneal epithelial cells; reducing corneal edema, restoring corneal transparency and vision; scavenging free radical antioxidants, promoting inflammatory lesions Organization recovery.
  • the subject is a mammal (including a human).
  • the applying comprises applying or spraying.
  • the administration comprises instillation or application.
  • Figure 1 shows the results of PCR amplification of the Prx-6 gene.
  • Lane 1 blank control;
  • lane 2 Prx-6;
  • M molecular weight standard.
  • Figure 2 shows the affinity chromatogram of Prx-6 protein. Peak 1 : heteroprotein; peak 2: Prx-6 mesh protein.
  • FIG 3 shows the purified electropherogram of Prx-6 protein (12% SDS-PAGE).
  • Lane 1 Protein molecular weight standard (Fermentas); Lane 2: Purified and desalted Prx-6 protein; Lane 3: Peak 1; Lane 4: Loading through protein; Lane 5: Broken supernatant (sample loaded).
  • FIG 4 shows the antioxidant protective effect of recombinant Prx-6 protein on HEF cells (P ⁇ 0.05).
  • Figure 5 shows the antioxidant protective effect of recombinant Prx-6 protein on H9C2 cells (P ⁇ 0.05).
  • Figure 6 shows the results of scald treatment of mice with recombinant Prx-6 protein. In the figure, each picture (2-9d) from left to right is: control group (2); Prx-6 group (2); Prx-6+ MEBO group (2); MEBO group (2) only).
  • Figure 7 shows the results of treatment of rat corneal damage with a recombinant Prx-6 protein using a slit lamp microscope.
  • the pictures are from left to right: control group (2); Prx-6 group (2). From top to bottom: before UV irradiation; after UV irradiation; treatment for 4 days; treatment for 8 days; treatment for 12 days.
  • Prx-6 protein has antioxidant activity.
  • HEF Hex-6 protein has antioxidant activity.
  • Prx-6 protein actually has the effect of promoting healing of burns and burns, and thus can be used for treating burns and burns.
  • the recombinant human Prx-6 protein of the present invention can be directly applied to the surface of the wound, and can immediately converge on the wound surface of the burned I to inhibit exudation.
  • the film is formed to eliminate internal and external infections, which can accelerate the growth of new granulation tissue and promote the healing of burned and burned tissues. At the same time, it has the advantages of small stimulation, effective control of infection and short treatment.
  • Prx-6 protein has the effect of repairing corneal damage caused by ultraviolet rays.
  • the recombinant human Prx-6 protein of the present invention can be directly dropped into the conjunctival sac, which can effectively inhibit the formation of corneal neovascularization; remove a large amount of oxygen free radicals generated by ultraviolet rays, repair damaged corneal epithelial cells, and promote inflammatory lesions.
  • Tissue recovery pain relief; relieve corneal edema, restore corneal transparency and vision. It has the advantages of small stimuli, effective infection control, and short treatment.
  • the present invention has been completed on this basis.
  • the terms "protein of the invention”, “polypeptide of the invention”, “Peroxiredoxins protein”, “prdx6 protein”, “Prx-6 protein”, “peroxidative redox protein”, etc., are used interchangeably and are meant to have a human A protein or polypeptide of the Prx-6 amino acid sequence. They may or may not contain the starting methionine. It should be understood that these terms include both human (source) proteins as well as homologs or homologs of the same function in other mammals such as dogs, cattle, sheep, monkeys, rodents (eg, mice). protein. Furthermore, the term includes wild-type and mutant Prx-6 proteins.
  • the cDNA sequence of human prx-6 gene GenBank accession number: NM-004905.2, as shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of human Prx-6 has accession number NP-004896, as shown in SEQ ID NO: 2.
  • the protein can be obtained by a DNA recombination technique conventional in the art.
  • a particularly preferred class of proteins are prx-6 analogs, i.e., homologous proteins of prx-6 in other mammals (e.g., cattle, sheep, rabbits, dogs, monkeys, mice, etc.).
  • the coding sequences of homologous proteins of these other species can be obtained by hybridization or amplification according to the sequence of prdx6, and these homologous proteins are obtained by a conventional recombinant method.
  • the protein of the invention may be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide, a synthetic polypeptide, preferably a recombinant polypeptide.
  • the polypeptide of the invention may be glycosylated, or may be non-glycosylated, depending on the host used in the recombinant production protocol. Polypeptides of the invention may also or may not include an initial methionine residue.
  • the invention also encompasses active fragments, derivatives and analogs of the human Prx-6 protein.
  • active fragment refers to a polypeptide that substantially retains the same biological function or activity of the native human Prx-6 protein of the invention.
  • the polypeptide fragment, derivative or analog of the present invention may be (i) a polypeptide having one or more conservative or non-conservative amino acid residues (preferably conservative amino acid residues) substituted, and such substituted amino acid residues It may or may not be encoded by the genetic code, or (ii) a polypeptide having a substituent group in one or more amino acid residues, or (iii) a mature polypeptide and another compound (such as a compound that extends the half-life of the polypeptide, for example a polypeptide formed by fusion of the formed polypeptide, or (iv) an additional amino acid sequence fused to the polypeptide sequence (eg, a leader or secretion sequence or a sequence or proprotein sequence used to purify the polypeptide, or A fusion protein for the formation of an antigenic IgG fragment).
  • conservative amino acid residues preferably conservative amino acid residues
  • human Prx-6 polypeptide refers to a polypeptide having the sequence of SEQ ID NO. 2 of human Prx-6 protein activity.
  • the term also encompasses variant forms of the sequence of SEQ ID NO. 2 that have the same function as the human Prx-6 protein. These variants include, but are not limited to, a number (usually 1-50, preferably 1-30, more preferably 1-20, optimally 1-10) amino acid deletions, insertions And/or substitution, and addition of one or several (usually within 20, preferably within 10, more preferably within 5) amino acids at the C-terminus and/or N-terminus.
  • a number usually 1-50, preferably 1-30, more preferably 1-20, optimally 1-10 amino acid deletions, insertions And/or substitution, and addition of one or several (usually within 20, preferably within 10, more preferably within 5) amino acids at the C-terminus and/or N-terminus.
  • adding one or more amino acids at the C-terminus and/or N-terminus usually does not alter the function of the protein.
  • the term also includes active fragments and active derivatives of the human Prx-6 protein.
  • a preferred active fragment is a polypeptide having the amino acid sequence set forth at positions 5-169 of SEQ ID NO: 2.
  • the invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a safe and effective amount of a prx-6 protein of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • Such carriers include, but are not limited to, saline, buffer, dextrose, water, glycerol, ethanol, poloxamer, carbomer, and combinations thereof.
  • the protein of the invention may be formulated in a non-toxic, inert, and pharmaceutically acceptable aqueous carrier medium wherein the pH is usually from about 5 to about 8, preferably from about 6 to about 8, preferably at a pH of about for 6.8-7.6, although the pH may vary depending on the nature of the substance being formulated and the condition being treated.
  • the formulated pharmaceutical compositions can be administered by conventional routes including, but not limited to, topical, oral, intramuscular, intravenous, subconjunctival injections. A preferred way is to apply directly to the burned wound and around. Another preferred mode is direct instillation or application into the conjunctival sac.
  • the pharmaceutical preparation should be matched to the mode of administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in the form of an injection, for example, by a conventional method using physiological saline or an aqueous solution containing glucose and other adjuvants.
  • Pharmaceutical compositions such as ointments, drops, sprays, tablets and capsules can be prepared by conventional methods.
  • Pharmaceutical compositions such as injections, solutions, tablets and capsules are preferably manufactured under sterile conditions.
  • the amount of active ingredient administered is a therapeutically effective amount, for example from about 1 microgram per kilogram body weight to about 10 milligrams per kilogram body weight per day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be in the form of an eye drop, an ophthalmic gel or an eye ointment, and is preferably produced under aseptic conditions.
  • the active ingredient is administered in a therapeutically effective amount, for example, from about 10 micrograms per kilogram of body weight to about 10 milligrams per kilogram of body weight per day.
  • specific doses should also consider factors such as the route of administration, the health of the patient, etc., which are within the skill of the skilled physician.
  • the proteins of the invention may also be used with other therapeutic agents for treating burns.
  • the proteins of the invention may also be used with other therapeutic agents for treating corneal damage.
  • the protein of the present invention can be directly applied or sprayed on the burned wound at a dosage of 0.1-0.5 mg/cm 2 ; or the protein of the present invention can be directly dropped at a dose of 0.05-0.2 mg/time. Into or into the conjunctival sac.
  • the main advantages of the invention include:
  • Corneal damage caused by ultraviolet radiation, after instillation or application of Prx-6 protein, can effectively inhibit the formation of corneal neovascularization; remove a large number of oxygen free radicals generated by ultraviolet rays, repair damaged corneal epithelial cells, Promotes recovery of inflammatory lesions, relieves pain; relieves corneal edema, restores corneal transparency and vision. It has the advantages of small stimulation, effective infection control and short treatment.
  • Prx-6 protein is a human-derived protein, safe to use, non-toxic and side effects, and has good medicinal properties.
  • Human Prx-6 protein is prepared into an injection form, a spray, a drop, a paste, etc., and is convenient to use.
  • a pair of specific primers were designed and synthesized based on the gene sequence encoding the Prx-6 mature protein (upstream primer: 5, - tatccatatgcccggaggtctgcttc-3 ' (SEQ ID NO: 3), downstream primer: 5, - ttactcgagaggctggggtgtgtagcg-3 '(SEQ ID NO: 4)), the enzyme cleavage sites are Ndel and Xho, respectively, extracted by human conventional epididymal mRNA (or laboratory-prepared human epididymis cDNA library) as a template for RT-PCR amplification. The results are shown in Figure 1. A 688 bp amplified fragment corresponding to the theoretical value was detected.
  • the amplified fragment was isolated (the fragment of interest was recovered from the agarose gel using a gel recovery kit) and double digested with Ndel and ol. Then, the double-digested fragment was ligated into the pET32b(+) expression vector (purchased from Novagen) which had been linearized with NI and ⁇ I, and transformed into conventional E. coli D?1 ( ⁇ ' (purchased from 1 ⁇ 0 ⁇ 611). Positive clones were screened by colony PCR and sequenced to confirm the correctness of the sequence and expression reading frame, and the recombinant expression plasmid pET32b(+) / Prx-6 was obtained. The expression vector expressed Prx- The 6 protein was ligated with 8 amino acids LEHHHHHH at the C-terminus to facilitate isolation and purification.
  • Example 2 Expression of Prx-6 protein
  • Example 3 Purification of Prx-6 protein
  • the centrifuged bacteria were suspended in buffer A (20 mM phosphate buffer, 150 mM sodium chloride, pH 7.2), sonicated in an ice bath, and centrifuged at 20000 g for low temperature (4 degrees) for 15 min to obtain a supernatant to be purified. sample. After equilibrating the nickel affinity chromatography column with buffer A, the sample was applied to the column, and then the column was washed with buffer A containing 50 mM imidazole to remove the heteroprotein (peak 1), and the target protein was eluted with buffer A containing 300 mM imidazole. Down (peak 2) (see Figure 2).
  • HEF cells are commonly used human embryonic fibroblasts (Zavada et al., Nature New Biology, 240: 124-125 (1972); or US 7,811, 817).
  • the cells were cultured with medium (high glucose DMEM + 5% FBS), cultured for 48 hours, and after the cells were grown to 90% confluence, the Prx-6 protein (Prdx-6-His fusion) obtained in Example 3 was firstly fused according to the following experimental method. The protein was added to the culture system, and H 2 O 2 was added. After 30 min, the cell viability was measured by MTT method.
  • Experimental design orthogonal test
  • Factor 1 H 2 O 2 level (lmM, 0.5 mM, 0.25 mM, 0.125 mM, 0 mM)
  • Factor 2 Prdx-6-His level (0.5 mg/ml, 0.25 mg/mK 0.125 mg/mK 0 mg/ml) )
  • 3 ⁇ 40 2 has a strong toxic effect on cells, and its cell survival rate is 47% when its concentration is 0.125 mM. As the H 2 O 2 concentration is increased, the greater the damage caused.
  • the 0.25 mg/ml protein enabled HEF cells to withstand a certain degree of H 2 O 2 damage to a concentration of 0.125 mM.
  • Example 5 Antioxidant activity of Prx-6 protein (H9C2 cell oxidative damage test) Test method:
  • H9C2 cells are commonly used rat cardiomyocytes (US 7,482,320).
  • the cells were cultured in medium (high glucose DMEM + 10% FBS), cultured for 48 hours, and after the cells were grown to 90% confluence, the Prx-6 protein (Prdx-6-His fusion) obtained in Example 3 was firstly fused according to the following experimental method. The protein was added to the culture system, and 3 ⁇ 40 2 was added. After 30 min, the cell viability was measured by MTT method.
  • Experimental design orthogonal experiment
  • Factor 1 H 2 O 2 levels (0.5 mM, 0.25 mM, 0.125 mM, 0.0625 mM, 0 mM)
  • Factor 2 Prx-6-His levels (0.5 mg/ml, 0.25 mg/mK 0.125 mg/mK 0 mg/ Ml)
  • 3 ⁇ 40 2 has a strong toxic effect on cells.
  • the Prx-6-His protein When the Prx-6-His protein is present in the system, the cell survival rate increases significantly, and as the concentration of Prx-6 protein increases, the survival rate increases accordingly. For example, under the condition that the concentration of H 2 O 2 is 0.0625 mM, the concentration of Prx-6 increases (from 0 to 0). 0.5mg/ml), cell viability increased by 1. 4% ⁇ 97 ⁇ 38%) This indicates that Prx-6-His protein is resistant to oxidative damage of ⁇ 2 ⁇ 2 . The 0.5 mg/ml Prx-6 protein enabled H9C2 cells to withstand a certain degree of H 2 O 2 damage of 0.0625 mM.
  • Example 6 Therapeutic effect of Prx-6 protein on burns and burns
  • Control group MEBO moist burn ointment, batch number Z20000004 (commonly used for the treatment of burn drugs, as a positive control drug).
  • control group (coating protein-free buffer), Prx-6 protein treatment group (lmg/ml Prx-6 protein), MEBO+Prx-6 protein positive control group (lmg/ml Prx- first) 6 protein, re-coated MEBO moist burn ointment), MEBO positive control group (Tu Meibao moist burn ointment), lh medication after scald, dressing 3 times a day.
  • the lmg/ml Prx-6 protein solution was applied to the wound wound of the mouse in an amount of 400 ul, which was reduced to 0.1 mg/cm 2 , and the MEBO moist burn ointment was uniformly applied to the wound surface, and the thickness was about 1 mm.
  • Prx-6 protein lyophilized powder 0.1%, phosphate buffer 20 mM (pH 7.0) 85%, 20% glycerol, Kappa resin 1%, Fragrance 0.3%.
  • Example 8 Therapeutic effect of Prx-6 protein on corneal injury
  • Control group normal saline.
  • control group drip saline
  • Prx-6 protein treatment group drop 2 mg/ml Prx-6 protein
  • Prx-6 protein l-4 g The recombinant human Prx-6 protein was prepared into a gel, and the contents of each component were as follows: Prx-6 protein l-4 g, 6 g carbomer 941, methylparaben 0.5 g, and 20 mM phosphate buffer (pH 7.0). ) to 1000g.
  • Example 10 Therapeutic effect of active fragments
  • Examples 6 and 8 were repeated except that the full-length Prx-6 protein represented by SEQ ID NO.: 2 was replaced with the Prx-6 active fragment shown at position 5-169 of SEQ ID NO.: 2.

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Description

重组人 Prx-6蛋白在治疗烧烫伤和 /或角膜损伤中的用途
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域， 具体地说， 涉及重组人 Prx-6蛋白在 治疗烧烫伤和 /或角膜损伤方面的用途。 背景技术
烧烫伤是常见病， 多发病， 也是致残率较高的创伤性疾病。 轻者也给伤 者带来很大痛苦， 重者常常损害器官功能， 给患者的工作和生活造成很大的 不便， 同时因为烧烫伤较多发生在人的暴露部位， 愈合后的疤痕毁坏伤者的 容貌， 还会给患者的心理造成不良影响， 因此， 对中轻度的烧 / 烫伤则要 尽量缩短愈合期， 减少病人痛苦， 并尽量减少疤痕形成。 对严重烧烫伤者应 尽量减少再灌注引起的各种脏器损伤及继发感染等并发症。
目前临床治疗烧伤常采用的方法， 一般是在进行创面早期处理后， 采用 包扎疗法或采用暴露疗法进行治疗。 无论采用哪种方法， 在早期清创时， 都 要进行创面抗感染处理，清创所选用的抗感染药物主要有三类： 一是中草药 制剂， 如四季青、 毛冬青、 黄连、 黄柏等； 二是化学药物制剂， 如双氧水、 新洁尔灭、 甲磺灭脓； 三是抗生素制剂如青霉素、 庆大霉素。 由于大多数药 物均可从创面吸收， 大面积使用这些药物， 尤其浓度过大或使用粉剂时常常 可引起中毒或内脏损害。再者这些药物一般都有一定的剌激性，在使用时常 常会给患者增加痛苦。
眼睛是对紫外辐射最为敏感的部位。 研究表明， 波长 230nm的紫外线可 全部为角膜上皮吸收， 280nm的紫外线对角膜损伤力最大。 暴露于紫外线 后 6〜10小时会出现异物剌痛感和随之而来的畏光、流泪等症状，严重的会 发生角膜上皮水肿、 脱落、 透明度下降等。
在紫外线辐射较强的地区， 上述影响十分明显。 如： 在阳光照耀的海面 上或沙漠中长期了望的士兵、 海员， 常有暗适应能力下降的现象出现； 在空 气稀薄的雪山高原上， 工作人员因受雪面强烈反射的紫外反射的损伤， 易患 雪盲症；人们在雪地、沙漠或海面上暴露时间过长，因受紫外辐射影响较强， 易患日光性眼炎； 焊工直接暴露在电弧光下每天累计 15分钟， 即可发生上 述病症， 称为电光性眼炎。
目前治疗主要为对症、 全身用止痛镇静药物， 冷敷眼睑， 包扎遮光， 严 重者可在结膜囊内滴入少量局部麻醉药 0.5 %地卡因， 并用抗生素眼药水预 防继发感染。大多都没有针对角膜上皮细胞损伤的修复、清除自由基等治疗 措施。
Peroxiredoxins (Prxs)是新近发现的一类非硒依赖过氧化物酶家族蛋 白， 广泛存在于各种生物体内。 根据 Prxs蛋白保守 cys个数的不同（1个或 2个）， 可分为 1-Cys或 2-Cys亚类 。 迄今， 已在哺乳动物组织中发现了 6 种 Prxs蛋白。其中 Prx 1-5为 2_Cys酶，以硫氧还蛋白作为电子供体； Prx-6 蛋白是哺乳动物中唯一的 1-Cys酶，以谷胱苷肽 (GSH)为电子供体（还原剂）。
Prx-6蛋白首先是在牛眼睫状体中被分离获得的， 又名 LTW4、 抗氧化蛋 白 2、 Clara细胞蛋白 26、 p67吞噬细胞氧化酶（phox)结合蛋白、 角质化细 胞生长因子（KGF)调节基因 1等， 由 224个氨基酸组成， 分子量为 25. lKDa。 分析该蛋白的晶体结构，发现了一个由 80个氨基酸组成的硫氧还蛋白折叠， 其中包含四个 β 折叠和两个 t 螺旋。
大量研究表明，硫氧还蛋白折叠结构在一些参与氧化还原反应的蛋白（如 硫氧还蛋白、 谷氧还蛋白、 GPxl蛋白、 谷胱甘肽 S-转移酶等）中普遍存在。 另外， 尽管 Prx-6和 GPxl蛋白的一级结构只有 17%的同源性， 但是它们的 三级结构具有极高的同源性。这种结构上的相似性， 预示着这两种蛋白在功 能上的相关。
从初期细胞实验到近年来动物体内实验， 越来越多的研究证明了 Prx-6 蛋白具有抗氧化损伤功能。细胞水平的研究表明， 过表达 Prx-6蛋白能明显 减少脂质过氧化作用， 降低细胞质膜损伤； 抑制 Prx-6蛋白的表达， 可观察 到明显的脂质过氧化、 脂膜损伤及细胞凋亡。 活体水平研究表明， Prx-6转 基因小鼠对高氧损伤有显著的保护作用； Prx-6敲除小鼠的抗氧化损伤能力 明显降低。 但是， 这些研究主要是关于 Prx-6蛋白在心脏、 肺或皮肤组织中 的抗氧化损伤作用， 并未涉及到 Prx-6蛋白在治疗烧烫伤和 /或角膜损伤方 面的用途。
综上所述， 目前尚缺乏令人满意的治疗烧烫伤和 /或角膜损伤的药物， 因 此本领域迫切需要开发新的能够用于治疗烧烫伤和 /或角膜损伤的药物。 发明内容
本发明的目的是提供重组人 Prx-6蛋白在治疗烧烫伤和 /或角膜损伤方 面的应用。 在本发明的第一方面， 提供了一种 Pn -6蛋白在制备治疗烧烫伤和 /或角 膜损伤的药物中的用途。
在另一优选例中， 所述的 Prx-6蛋白是人 Prx-6蛋白或其活性片段或其衍 生产物。
在另一优选例中， 所述的 Prx-6蛋白是重组蛋白。
在另一优选例中， 所述的 Prx-6蛋白包括氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所 示的蛋白或 SEQ ID NO: 2中第 5-169位所示的活性片段， 或其与表达标签 (如 6-His)形成的融合蛋白。
在本发明的第二方面，提供了一种用于治疗烧烫伤和 /或角膜损伤的药物 组合物， 所述的药物组合物含有 Prx-6蛋白以及药学上可接受的载体， 并且 所述的药物组合物为外用制剂或眼用制剂。
在另一优选例中， 所述的 Prx-6蛋白是人 Prx-6蛋白或其活性片段或其衍 生产物。
在另一优选例中， 所述的 Prx-6蛋白是重组蛋白。
在另一优选例中， 所述的外用制剂是膏剂、 喷雾剂、 或滴剂。
在另一优选例中， 所述的眼用制剂是滴眼液、 眼用凝胶或眼膏。
在另一优选例中， 所述的药物组合物还含有其他治疗烧烫伤的药物。 在本发明的第三方面， 提供了一种治疗烧烫伤和 /或角膜损伤的方法， 包 括步骤：
对需要治疗的对象， 在烧烫伤的创面上施用 Prx-6蛋白或本发明第二方 面中所述的药物组合物。
对需要治疗的对象， 将 Prx-6蛋白或本发明第二方面中所述的药物组合 物滴入或涂入结膜囊内。
在另一优选例中， 所述的烧烫伤的治疗包括： 促进伤口愈合和减少创面 的炎症反应。 在另一优选例中， 所述的角膜损伤的治疗包括： 抑制角膜新生血管的生 成； 修复受损的角膜上皮细胞； 减轻角膜水肿， 恢复角膜透明度及视力； 清 除自由基抗氧化， 促进炎症病变组织恢复。
在另一优选例中， 所述的对象是哺乳动物 (包括人)。
在另一优选例中， 所述的施用包括施涂或喷涂。
在另一优选例中， 所述的施用包括滴入或涂入。
应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文（如实施 例）中具体描述的各技术特征可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方 案。 限于篇幅， 在此不再一一累述。 附图说明
图 1显示了 Prx-6基因 PCR扩增结果。 泳道 1 :空白对照;泳道 2: Prx-6； M: 分子量标准品。
图 2显示了 Prx-6 蛋白亲和纯化色谱图。 峰 1 : 杂蛋白； 峰 2 : Prx-6目 的蛋白。
图 3显示了 Prx-6蛋白纯化电泳图（12%SDS-PAGE)。 泳道 1 : 蛋白分子 量标准品（Fermentas);泳道 2 : 亲和层析纯化并脱盐后的 Prx-6蛋白； 泳道 3 : 峰 1 ; 泳道 4: 上样穿出蛋白； 泳道 5 : 破菌上清 (上样的样品）。
图 4显示了重组 Prx-6蛋白对 HEF细胞的抗氧化保护作用 (P<0.05)。 图 5显示了重组 Prx-6蛋白对 H9C2细胞的抗氧化保护作用 (P<0.05)。 图 6显示了重组 Prx-6蛋白治疗小鼠烫伤的结果。 图中， 各图片 (2-9d) 从左至右依次为： 对照组 (2只）； Prx-6组 (2只）； Prx-6+美宝组 (2只）； 美宝 组 (2只）。
图 7显示了用裂隙灯显微镜观察重组 Prx-6蛋白治疗大鼠角膜损伤的结 果。 图中， 各图片从左至右依次为： 对照组 (2只）； Prx-6组 (2只）。 从上至 下依次为： 紫外线照射前； 紫外线照射后； 治疗 4天； 治疗 8天； 治疗 12 天。 具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 除了发现 Prx-6蛋白具有抗氧化作用 可保护 HEF等细胞之外， 还首次发现：
(I) Prx-6蛋白居然具有促进烧伤和烫伤愈合的作用，因此可用于治疗烧烫 伤。 具体地， 本发明的重组人 Prx-6蛋白可直接涂覆于伤口表面， 对于烧 I 烫伤创面可立即收敛， 抑制渗出。 涂后即刻成膜， 杜绝内外感染， 能加快新 生肉芽组织生长， 促进烧烫伤组织愈合， 同时具有剌激性小、 可有效控制感 染、 疗程短等优点。
(II) Prx-6蛋白具有修复紫外线造成的角膜损伤的作用。 具体地， 本发明 的重组人 Prx-6蛋白可直接滴入结膜囊内， 能有效的抑制角膜新生血管的生 成； 清除紫外线产生的大量氧自由基， 修复受损的角膜上皮细胞， 促进炎症 病变组织恢复， 减轻疼痛； 减轻角膜水肿， 恢复角膜透明度及视力。 具有剌 激性小、 可有效控制感染、 疗程短等优点。
在此基础上完成了本发明。
Prx-6蛋白
如本文所用， 术语"本发明蛋白"、 "本发明多肽"、 "Peroxiredoxins蛋白"、 "prdx6蛋白"、 "Prx-6蛋白" "过氧化氧化还原蛋白"等可互换使用， 都指具有 人 Prx-6氨基酸序列的蛋白或多肽。 它们可含有或不含起始的甲硫氨酸。 应 理解， 这些术语既包括人 (源)的蛋白， 也包括在其他哺乳动物 (如狗、 牛、 羊、 猴、 啮齿动物 (如小鼠))中的具有同种功能的同系物或同源蛋白。 此外， 该术语包括野生型和突变型 Prx-6蛋白。
人 prx-6基因的 cDNA序列 GenBank登录号： NM— 004905.2， 如 SEQ ID NO: 1所示。 人 Prx-6的氨基酸序列的登录号为 NP— 004896， 如 SEQ ID NO: 2所示。
应理解， 由于人等哺乳动物的 prdx6蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是 已知的， 可以用本领域常规的 DNA重组技术而获得其蛋白。
一类特别优选的蛋白是 prx-6类似物， 即在其他哺乳动物 (如牛、 羊、 兔、 狗、 猴、 鼠等)中 prx-6的同源蛋白。 这些其他物种的同源蛋白的编码序列， 可根据 prdx6的序列， 通过杂交或扩增的方法而获得， 进而通过常规重组方 法获得这些同源蛋白。
本发明的蛋白可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。 根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非 糖基化的。 本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人 Prx-6蛋白的活性片段、 衍生物和类似物。 如本文所用， 术语 "活性片段" 、 "衍生物"和 "类似物"是指基本上保持本发明的天然 人 Prx-6蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物 或类似物可以是 (i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨 基酸残基)被取代的多肽， 而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由 遗传密码编码的， 或 (ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或 (iii)成熟多肽与另一个化合物 (比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇) 融合所形成的多肽， 或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多 肽 (如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列， 或与抗 原 IgG片段的形成的融合蛋白）。 根据本文的教导， 这些片段、 衍生物和类 似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语"人 Prx-6多肽"指具有人 Prx-6蛋白活性的 SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与人 Prx-6蛋白相同功能的、 SEQ ID NO. 2 序列的变异形式。 这些变异形式包括 (但并不限于)： 若干个 (通常为 1-50个， 较佳地 1-30个， 更佳地 1-20个， 最佳地 1-10个)氨基酸的缺失、 插入和 /或 取代， 以及在 C末端和 /或 N末端添加一个或数个 (通常为 20个以内， 较佳 地为 10个以内， 更佳地为 5个以内)氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相 近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。 又比如， 在 C 末端和 /或 N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。 该 术语还包括人 Prx-6蛋白的活性片段和活性衍生物。 一种优选的活性片段是 氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2中第 5-169位所示的多肽。 药物组合物和施用方法
本发明还提供了药物组合物， 它含有安全有效量的本发明 prx-6蛋白和 药学上可接受的载体或赋形剂。 这类载体包括 (但并不限于)： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 泊洛沙姆、 卡波姆及其组合。
例如， 可将本发明蛋白配制于无毒的、 惰性的和药学上可接受的水性载 体介质中， 其中 pH通常约为 5-8， 较佳地 pH约为 6-8， 最佳地 pH约为 6.8-7.6, 尽管 pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。 配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药， 其中包括 (但并不限 于)： 局部给药、 口服、 肌内、 静脉内、 结膜下注射。 一种优选的方式是直 接施涂在烧烫伤的创面和周围。另一种优选的方式是直接滴入或涂入结膜囊 内。
药物制剂应与给药方式相匹配。 本发明的药物组合物可以被制成针剂形 式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制 备。 诸如膏剂、 滴剂、 喷雾剂、 片剂和胶囊之类的药物组合物， 可通过常规 方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量， 例如每天约 1微克 /千克体重-约 10毫克 / 千克体重。 本发明的药物组合物还可以被制成滴眼液、 眼用凝胶或眼膏的形 式， 宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量， 例如每天约 10 微克 /千克体重-约 10毫克 /千克体重。 当然， 具体剂量还应考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。 此外， 本发明的 蛋白还可与治疗烧烫伤的其他治疗剂一起使用。
本发明的蛋白还可与治疗角膜损伤的其他治疗剂一起使用。
在优选例中，可将本发明蛋白按 0.1-0.5mg/cm2创面的用量直接施涂或喷 涂在烧烫伤的创面； 或， 可将本发明蛋白按 0.05-0.2mg/次的用量直接滴入或 涂入结膜囊内。 本发明的主要优点包括：
(1) 开发了人 Prx-6蛋白新的医疗用途， 开拓了一个新的应用领域。
(1.1)烧烫伤创面涂覆 Prx-6蛋白后可立即收敛， 抑制渗出， 杜绝内外感 染， 能加快新生肉芽组织生长， 促进烫伤组织愈合， 同时具有剌激性小、 可 有效控制感染。
(1.2) 紫外线照射照成的角膜损伤， 在滴入或涂入 Prx-6蛋白后， 能有效 的抑制角膜新生血管的生成；清除紫外线产生的大量氧自由基， 修复受损的 角膜上皮细胞， 促进炎症病变组织恢复， 减轻疼痛； 减轻角膜水肿， 恢复角 膜透明度及视力。 具有剌激性小、 可有效控制感染、 疗程短等优点。
(2) Prx-6蛋白是源自人的蛋白， 使用安全无毒副作用， 有很好的药用前 旦
J¾。
(3)人 Prx-6蛋白做成注射剂型、 喷雾剂、 滴剂、 膏剂等， 使用方便。
(4)人 Prx-6蛋白做成滴眼液、 眼用凝胶或眼膏等， 使用方便。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法， 通常按照常规条件， 例如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手 册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或 按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则份数和百分比按重量计。 实施例 1. pET32b (+) / Prx-6表达载体构建
根据编码 Prx-6成熟蛋白的基因序列设计并合成了一对特异引物 (上游引 物： 5， - tatccatatgcccggaggtctgcttc-3 ' (SEQ ID NO: 3) , 下游引物： 5， - ttactcgagaggctggggtgtgtagcg-3 '(SEQ ID NO: 4))， 酶切位点分别为 Ndel及 Xho 以常规方法抽提的人附睾 mRNA (或实验室制备的人附睾 cDNA文库) 为模板， 进行 RT-PCR扩增。 结果见图 1， 检测到与理论值相符的 688bp的 扩增片段。
分离扩增片段 (用胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的片段)， 用 Ndel 及^ ol进行双酶切。 然后， 将经过双酶切的片段连接到已用 N I和^^ I 切成线性的 pET32b(+)表达载体 (购自 Novagen)中， 转化常规的大肠杆菌 丁0?1(^'(购自 1^ 0§611)。 通过菌落 PCR的方法筛选阳性克隆， 并测序进 一步证实序列及表达阅读框的正确性， 得到重组表达质粒 pET32b(+) / Prx-6。该表达载体所表达的 Prx-6蛋白在 C端附加 8个氨基酸 LEHHHHHH, 以便于分离纯化。 实施例 2. Prx-6蛋白的表达
将质粒 pET32b(+) I Prx-6转化大肠杆菌 Origami B(DE3)(购自 Novagen) , 将阳性克隆接种于含 lOOug/ml氨苄青霉素的 LB培养基中， 37度摇床培养 过夜。 次日按 1 : 100转接于含 100ug/ml氨苄青霉素的 LB培养基中， 37度 摇床培养至菌密度 OD600=0.6〜0.8后， 加入 IPTG至终浓度 0.4mM以诱导 目的蛋白 Prx-6的表达， 3-4h后离心收集菌体。 实施例 3. Prx-6蛋白的纯化
将离心收集的菌体重悬于缓冲液 A中（20mM 磷酸盐缓冲液， 150mM 氯 化钠， pH7.2)， 冰浴中超声破碎， 20000g低温 (4度)离心 15min取上清为待 纯化的样品。 使用缓冲液 A平衡镍亲和层析柱后， 将样品上柱， 然后用含 50mM 咪唑的缓冲液 A冲洗柱子去除杂蛋白（峰 1)， 用含 300mM咪唑的缓 冲液 A将目的蛋白洗脱下来 (峰 2)(见图 2)。
最后用 G-25脱盐柱将洗脱的蛋白置换于缓冲液 A中以去除咪唑， SDS-PAGE电泳检测。 经分析， 获得了纯度在 95%以上 Prx-6蛋白， 分子量 约 26.1kD。 （见图 3)。 实施例 4. 蛋白的抗氧化活性 (HEF细胞氧化损伤实验）
HEF细胞为常用的人胚胎成纤维细胞 (Zavada et al.， Nature New Biology, 240: 124-125 (1972)； 或 US 7，811,817)。 用培养基（高糖 DMEM+5%FBS)复 苏细胞， 培养 48h， 待细胞长至 90%汇合后， 按照下面实验方法先将实施例 3中获得的 Prx-6蛋白 (Prdx-6-His融合蛋白）加入培养体系中， 再加入 H2O2， 作用 30min后， MTT方法检测细胞存活率。 实验设计： 正交试验
因素 1 : H2O2水平（lmM、 0.5 mM、 0.25 mM、 0.125 mM、 0 mM) 因素 2: Prdx-6-His水平（0.5mg/ml、 0.25 mg/mK 0.125 mg/mK 0 mg/ml)
各实验组的 H2O2和 Prdx-6-His浓度如表 1所示。
表 1
Figure imgf000011_0001
结果如表 1和图 4所示。
¾02对细胞有很强的毒性作用， 当其浓度为 0.125mM时， 细胞存活率 .47%。 随着 H2O2浓度上升， 造成的损伤也越大。
当体系中同时有 Prx-6-His蛋白存在时细胞存活率显著增加。如果只有缓 冲液存在时， 细胞活率与 Prx-6-His蛋白组相比显著降低。 以 H2O2浓度为 0.125mM的各组为例， 添加了 0.25mg/ml、 0.5 mg/ml Prx-6蛋白， 可使得存 活率从约 2.5%大幅上升到 65%。
另外， 仅用表达标签 6His不能起到保护作用。
上述结果表明： Prx-6-His蛋白对 ¾02的过氧化损伤有抵抗作用。
0.25mg/ml的蛋白能使 HEF细胞在一定程度上抵御 0.125mM浓度的 H2O2 损伤。 实施例 5. Prx-6蛋白的抗氧化活性 (H9C2细胞氧化损伤实验） 试验方法：
H9C2细胞为常用的大鼠心肌细胞 (US 7，482，320)。 用培养基 (高糖 DMEM+10%FBS)复苏细胞， 培养 48h， 待细胞长至 90%汇合后， 按照下面 实验方法先将实施例 3中获得的 Prx-6蛋白 (Prdx-6-His融合蛋白）加入培养 体系中， 再加入 ¾02， 作用 30min后， MTT方法检测细胞存活率。 实验设计： 正交实验
因素 1 : H2O2水平（0.5mM、 0.25 mM、 0.125 mM、 0.0625 mM、 0 mM) 因素 2: Prx-6-His水平（0.5mg/ml、 0.25 mg/mK 0.125 mg/mK 0 mg/ml)
各实验组的 H2O2和 Prdx-6-His浓度如表 2所示。
表 2
Figure imgf000013_0001
结果如表 2和图 5所示。
¾02对细胞有很强的毒性作用， 当体系中同时有 Prx-6-His蛋白存在时 细胞存活率显著增加，且随着 Prx-6蛋白的浓度增加，存活率也相应增加。例 如在 H2O2浓度为 0.0625mM的条件下， 随着 Prx-6浓度的增加（从 0〜 0.5mg/ml), 细胞的存活率增 1 ·4%〜97·38%) 这表明 Prx-6-His蛋白对 Η2Ο2的过氧化损伤有抵抗作用。 0.5mg/ml的 Prx-6蛋白能使 H9C2细胞在一定程度上抵御 0.0625 mM浓度的 H2O2损伤。 实施例 6 Prx-6蛋白对烧烫伤的治疗作用
6.1 动物来源
小鼠 24〜30g， 烟台毓璜顶医院实验动物中心。 6.2 药物
实验组： 实施例 3中制备的 Prx-6蛋白；
对照组： 美宝湿润烧伤膏， 批号 Z20000004(常用的治疗烧伤药物， 作为 阳性对照药物)。
6.3 烧伤模型制备
2.5%戊巴比妥钠 (35mg/kg体重)腹腔内注射， 麻醉后剪除背部长毛， 涂 硫化钡脱毛剂， 3-5分钟后轻轻刮除， 温水清洗干净后正常饲养。 24h后同 样方法麻醉， 麻醉后将小鼠仰卧固定于带有正方形孔烫伤板上， 置于 95度 热水中 15s， 立即取出用干纱布吸除残余热水， 松绑。 同时行体液复苏， 腹 腔内注射乳酸钠林格氏液 10ml， 小鼠背部造成约占体表面积 10%的三度烫 伤模型。
6.4 治疗方法
烫伤后 lh用药， 每天换药 3次。
实验包括： 对照组 (涂不含蛋白的缓冲液)、 Prx-6蛋白治疗组 (涂 lmg/ml Prx-6蛋白）、 美宝 +Prx-6蛋白阳性对照组 (先涂 lmg/ml Prx-6蛋白， 再涂美 宝湿润烧伤膏)、 美宝阳性对照组 (涂美宝湿润烧伤膏)，烫伤后 lh用药， 每天 换药 3次。 将 lmg/ml Prx-6蛋白溶液涂小鼠烧伤创面，用量是 400ul，折合到 O. lmg/cm2 , 将美宝湿润烧伤膏均匀涂于创面， 厚度约 lmm。 6.5 实验结果
在烫伤后的第 2天 (2d)、 第 3天 (3d)和第 5天 (5d)时， 对照组小鼠发生了 较为严重的炎症反应， 而 Prx-6蛋白治疗组小鼠和美宝阳性对照组小鼠炎症 反应显著减轻。 在烫伤后 5d时， 对照组小鼠伤口没有结痂， 仍处于溃疡状 态， 而 Prx-6蛋白治疗组小鼠和美宝阳性对照组小鼠伤口已经结痂 (图 6)。 (注： 图中从左至右依次为： 对照组 (2只）； Prx-6组 (2只）； Prx-6+美宝组 (2 只)； 美宝组 (2只))。 实施例 7
用于治疗烫伤的药物组合物
将重组人 Prx-6蛋白制备成膏剂， 各成分含量如下： Prx-6蛋白冻干粉 0.1%, 磷酸盐缓冲液 20mM(pH 7.0)85%， 20%丙三醇， 卡波树脂 1%， 香精 0.3%。 实施例 8 Prx-6蛋白对角膜损伤的治疗作用
8.1 动物来源
6周龄 SD大鼠， 烟台毓璜顶医院实验动物中心。 8.2 药物
实验组： 实施例 3中制备的 Prx-6蛋白；
对照组： 生理盐水。
8.3 角膜损伤模型制备
5%水合氯醛（7ml/kg体重）腹腔内注射， 麻醉后选择双星明和新福林眼 液作为散瞳剂， 每 2min l次， 1滴 /次， 20min后， 瞳孔散大后用棉签小心 吸除角结膜的散瞳剂， 置于 300nm紫外线灯下， 固定大鼠与紫外线灯的相 对位置高度， 并用紫外照射计测定辐射照度， 控制在 l x l03 Uw/cm2， 每天 累计辐射剂量 9KJ/m2， 连续 3天， 造成大鼠角膜损伤模型， 用裂隙灯显微 镜观察。 8.4 治疗方法
实验包括： 对照组 (滴生理盐水）、 Prx-6蛋白治疗组 (滴 2mg/ml Prx-6蛋 白）。 角膜损伤后 2天开始用药， 每天用药 4次， 每次将 2滴 （约 30μ1) 药 品滴入大鼠眼内。
8.5 实验结果
紫外线照射后 2天， 大鼠角膜发生水肿， 透明度明显降低。 治疗第 4天， 对照组的角膜有较多新生血管生成， 炎症反应严重， 而 Prx-6蛋白治疗组仅 有少量新生血管生成， 并且水肿明显减轻； 治疗第 8天， 对照组角膜的水肿 稍减轻， 透明度部分恢复， Prx-6蛋白治疗组角膜透明度大部分恢复； 治疗 第 12天，对照组角膜透明度仍未完全恢复， Prx-6蛋白治疗组大鼠角膜基本 恢复， 水肿消除 (图 7)。 （注： 图中从左至右依次为： 对照组 (2只）； Prx-6治 疗组 (2只 ))。 实施例 9 用于治疗角膜损伤的药物组合物
将重组人 Prx-6蛋白制备成凝胶剂， 各成分含量如下： Prx-6蛋白 l-4g， 6g卡波姆 941，尼泊金甲酯 0.5g，加 20mM磷酸盐缓冲液（pH7.0)至 1000g。 实施例 10 活性片段的治疗作用
重复实施例 6和 8， 不同点在于： 用 SEQ ID NO.: 2中第 5-169位所示的 Prx-6活性片段替代 SEQ ID NO.: 2所示的全长 Prx-6蛋白。
结果表明， 该活性片段具有治疗烧烫伤和角膜损伤的作用， 其治疗效果 与全长 Prx-6相当。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文 献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容 之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样 落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权 利 要 求
1. 一种 Prx-6蛋白在制备治疗烧烫伤和 /或角膜损伤的药物中的用途。
2. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的 Prx-6蛋白是人 Prx-6 蛋白或其活性片段或其衍生产物。
3. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的 Prx-6蛋白是重组蛋 白。
4. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的 Prx-6蛋白包括氨基 酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白或 SEQ ID NO: 2中第 5-169位所示的活 性片段， 或其与表达标签形成的融合蛋白。
5. 一种用于治疗烧烫伤和 /或角膜损伤的药物组合物， 其特征在于， 所 述的药物组合物含有 Prx-6蛋白以及药学上可接受的载体， 并且所述的药物 组合物为外用制剂或眼用制剂。
6. 如权利要求 5所述的药物组合物， 其特征在于， 所述的 Pn -6蛋白是人 Prx-6蛋白或其活性片段或其衍生产物。
7. 如权利要求 5所述的药物组合物， 其特征在于， 所述的 Prx-6蛋白是 重组蛋白。
8. 如权利要求 5所述的药物组合物， 其特征在于，
所述的外用制剂是膏剂、 喷雾剂、 或滴剂；
所述的眼用制剂是滴眼液、 眼用凝胶或眼膏。
9. 一种治疗烧烫伤和 /或角膜损伤的方法， 其特征在于， 包括步骤： 对需要治疗的对象， 在烧烫伤的创面上施用 Prx-6蛋白或权利要求 5所 述的药物组合物， 和 /或，
对需要治疗的对象， 将 Prx-6蛋白或权利要求 5所述的药物组合物滴入 或涂入结膜囊内。
10. 如权利要求 9所述的方法， 其特征在于， 所述的烧烫伤的治疗包括： 促进伤口愈合和减少创面的炎症反应； 或，
所述的角膜损伤的治疗包括： 抑制角膜新生血管的生成； 修复受损的 角膜上皮细胞；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力；清除自由基抗氧化， 促进炎症病变组织恢复。
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