CN106377764A

CN106377764A - 重组人Prx‑6蛋白在治疗烧烫伤方面的用途

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Publication number: CN106377764A
Application number: CN201610833326.1A
Authority: CN
Inventors: 李建远
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-12-06
Filing date: 2010-12-06
Publication date: 2017-02-08
Also published as: CN102485272A

Abstract

本发明提供了重组人Prx‑6蛋白在治疗烧烫伤方面的用途。具体地，本发明提供了人Prx‑6蛋白在制备治疗烧烫伤的药物中的用途。本发明的实验表明，Prx‑6蛋白在治疗烧烫伤过程中有重要的促进伤口愈合作用。

Description

重组人Prx-6蛋白在治疗烧烫伤方面的用途

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体地说，涉及重组人Prx-6蛋白在治疗烧烫伤方面的用途。

背景技术

烧烫伤是常见病，多发病，也是致残率较高的创伤性疾病。轻者也给伤者带来很大痛苦，重者常常损害器官功能，给患者的工作和生活造成很大的不便，同时因为烧烫伤较多发生在人的暴露部位，愈合后的疤痕毁坏伤者的容貌，还会给患者的心理造成不良影响，因此，对中轻度的烧/烫伤则要尽量缩短愈合期，减少病人痛苦，并尽量减少疤痕形成。对严重烧烫伤者应尽量减少再灌注引起的各种脏器损伤及继发感染等并发症。

目前临床治疗烧伤常采用的方法，一般是在进行创面早期处理后，采用包扎疗法或采用暴露疗法进行治疗。无论采用哪种方法，在早期清创时，都要进行创面抗感染处理，清创所选用的抗感染药物主要有三类：一是中草药制剂，如四季青、毛冬青、黄连、黄柏等；二是化学药物制剂，如双氧水、新洁尔灭、甲磺灭脓；三是抗生素制剂如青霉素、庆大霉素。由于大多数药物均可从创面吸收，大面积使用这些药物，尤其浓度过大或使用粉剂时常常可引起中毒或内脏损害。再者这些药物一般都有一定的刺激性，在使用时常常会给患者增加痛苦。

Peroxiredoxins(Prxs)是新近发现的一类非硒依赖过氧化物酶家族蛋白，广泛存在于各种生物体内。根据Prxs蛋白保守cys个数的不同(1个或2个)，可分为1-Cys或2-Cys亚类。迄今，已在哺乳动物组织中发现了6种Prxs蛋白。其中Prx 1-5为2-Cys酶，以硫氧还蛋白作为电子供体；Prx-6蛋白是哺乳动物中唯一的1-Cys酶，以谷胱苷肽(GSH)为电子供体(还原剂)。

Prx-6蛋白首先是在牛眼睫状体中被分离获得的，又名LTW4、抗氧化蛋白2、Clara细胞蛋白26、p67吞噬细胞氧化酶(phox)结合蛋白、角质化细胞生长因子(KGF)调节基因1等，由224个氨基酸组成，分子量为25.1KDa。分析该蛋白的晶体结构，发现了一个由80个氨基酸组成的硫氧还蛋白折叠，其中包含四个β折叠和两个α螺旋。

大量研究表明，硫氧还蛋白折叠结构在一些参与氧化还原反应的蛋白(如硫氧还蛋白、谷氧还蛋白、GPx1蛋白、谷胱甘肽S-转移酶等)中普遍存在。另外，尽管Prx-6和GPx1蛋白的一级结构只有17％的同源性，但是它们的三级结构具有极高的同源性。这种结构上的相似性，预示着这两种蛋白在功能上的相关。

从初期细胞实验到近年来动物体内实验，越来越多的研究证明了Prx-6蛋白具有抗氧化损伤功能。细胞水平的研究表明，过表达Prx-6蛋白能明显减少脂质过氧化作用，降低细胞质膜损伤；抑制Prx-6蛋白的表达，可观察到明显的脂质过氧化、脂膜损伤及细胞凋亡。活体水平研究表明，Prx-6转基因小鼠对高氧损伤有显著的保护作用；Prx-6敲除小鼠的抗氧化损伤能力明显降低。但是，这些研究主要是关于Prx-6蛋白在心脏、肺或皮肤组织中的抗氧化损伤作用，并未涉及到Prx-6蛋白在治疗烧烫伤方面的用途。

综上所述，目前尚缺乏令人满意的治疗烧烫伤的药物，因此本领域迫切需要开发新的能够用于治疗烧烫伤的药物。

发明内容

本发明的目的是提供重组人Prx-6蛋白在治疗烧伤和烫伤方面的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种Prx-6蛋白在制备治疗烧烫伤的药物中的用途。

在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。

在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。

在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白或其与表达标签(如6-His)形成的融合蛋白。

在本发明的第二方面，提供了一种用于治疗烧烫伤的药物组合物，所述的药物组合物含有Prx-6蛋白以及药学上可接受的载体，并且所述的药物组合物为外用制剂。

在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。

在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。

在另一优选例中，所述的外用制剂是膏剂、喷雾剂、或滴剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有其他治疗烧烫伤的药物。

在本发明的第三方面，提供了一种治疗烧烫伤的方法，包括步骤：对需要治疗的对象，在烧烫伤的创面上施用Prx-6蛋白蛋白或本发明第二方面中所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的治疗包括：促进伤口愈合和减少创面的炎症反应。

在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。

在另一优选例中，所述的施用包括施涂或喷涂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了Prx-6基因PCR扩增结果。泳道1：空白对照；泳道2：Prx-6；M：分子量标准品。

图2显示了Prx-6蛋白亲和纯化色谱图。峰1：杂蛋白；峰2：Prx-6目的蛋白。

图3显示了Prx-6蛋白纯化电泳图(12％SDS-PAGE)。泳道1：蛋白分子量标准品(Fermentas)；泳道2：亲和层析纯化并脱盐后的Prx-6蛋白；泳道3：峰1；泳道4：上样穿出蛋白；泳道5：破菌上清(上样的样品)。

图4显示了重组Prx-6蛋白对HEF细胞的抗氧化保护作用(P<0.05)。

图5显示了重组Prx-6蛋白对H9C2细胞的抗氧化保护作用(P<0.05)。

图6显示了重组Prx-6蛋白治疗小鼠烫伤的结果。图中，各图片(2-9d)从左至右依次为：对照组(2只)；Prx-6组(2只)；Prx-6+美宝组(2只)；美宝组(2只)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，除了发现Prx-6蛋白具有抗氧化作用可保护HEF等细胞之外，还首次发现Prx-6蛋白居然具有促进烧伤和烫伤愈合的作用，因此可用于治疗烧烫伤。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明的重组人Prx-6蛋白可直接涂覆于伤口表面，对于烧/烫伤创面可立即收敛，抑制渗出。涂后即刻成膜，杜绝内外感染，能加快新生肉芽组织生长，促进烧烫伤组织愈合，同时具有刺激性小、可有效控制感染、疗程短等优点。

Prx-6蛋白

如本文所用，术语“本发明蛋白”、“Peroxiredoxins蛋白”“prdx6蛋白”、“Prx-6蛋白”“过氧化氧化还原蛋白”等可互换使用，都指具有人Prx-6氨基酸序列的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始的甲硫氨酸。应理解，这些术语既包括人(源)的蛋白，也包括在其他哺乳动物(如狗、牛、羊、猴、啮齿动物(如小鼠))中的具有同种功能的同系物或同源蛋白。此外，该术语包括野生型和突变型Prx-6蛋白。

人prx-6基因的cDNA序列GenBank登录号：NM_004905.2，如SEQ ID NO:1所示。人Prx-6的氨基酸序列的登录号为NP_004896，如SEQ ID NO:2所示。

应理解，由于人等哺乳动物的prdx6蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本领域常规的DNA重组技术而获得其蛋白。

一类特别优选的蛋白是prx-6类似物，即在其他哺乳动物(如牛、羊、兔、狗、猴、鼠等)中prx-6的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据prdx6的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。

药物组合物和施用方法

本发明还提供了药物组合物，它含有安全有效量的本发明prx-6蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

例如，可将本发明蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：局部给药、口服、肌内、静脉内。一种优选的方式是直接施涂在烧烫伤的创面和周围。

药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如膏剂、滴剂、喷雾剂、片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

此外，本发明的蛋白还可与治疗烧烫伤的其他治疗剂一起使用。

在优选例中，可将本发明蛋白按0.1-0.5mg/cm²创面的用量直接施涂或喷涂在烧烫伤的创面。

本发明的主要优点包括：

(1)开发了人Prx-6蛋白新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。烧烫伤创面涂覆Prx-6蛋白后可立即收敛，抑制渗出，杜绝内外感染，能加快新生肉芽组织生长，促进烫伤组织愈合，同时具有刺激性小、可有效控制感染。

(2)Prx-6蛋白是源自人的蛋白，使用安全安全无毒副作用，有很好的药用前景。

(3)人Prx-6蛋白做成注射剂型、喷雾剂、滴剂、膏剂等，使用方便。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。

实施例1.pET32b(+)/Prx-6表达载体构建

根据编码Prx-6成熟蛋白的基因序列设计并合成了一对特异引物(上游引物：5’-tatccatatgcccggaggtctgcttc–3’(SEQ ID NO:3)，下游引物：5’-ttactcgagaggctggggtgtgtagcg–3’(SEQ ID NO:4))，酶切位点分别为NdeI及XhoI，

以常规方法抽提的人附睾mRNA为模板，进行RT-PCR扩增。结果见图1，检测到与理论值相符的688bp的扩增片段。

分离扩增片段，用NdeI及XhoI进行双酶切。然后，将经过双酶切的片段连接到已用NdeI和XhoI切成线性的pET32b(+)表达载体(购自Novagen)中，转化常规的大肠杆菌TOP10F’(购自Invitrogen)。通过菌落PCR的方法筛选阳性克隆，并测序进一步证实序列及表达阅读框的正确性，得到重组表达质粒pET32b(+)/Prx-6。该表达载体所表达的Prx-6蛋白在C端附加8个氨基酸LEHHHHHH，以便于分离纯化。

实施例2.Prx-6蛋白的表达

将质粒pET32b(+)/Prx-6转化大肠杆菌Origami B(DE3)(购自Novagen)，将阳性克隆接种于含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37度摇床培养过夜。次日按1：100转接于含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37度摇床培养至菌密度OD600＝0.6～0.8后，加入IPTG至终浓度0.4mM以诱导目的蛋白Prx-6的表达，3-4h后离心收集菌体。

实施例3.Prx-6蛋白的纯化

将离心收集的菌体重悬于缓冲液A中(20mM磷酸盐缓冲液，150mM氯化钠，pH7.2)，冰浴中超声破碎，20000g低温(4度)离心15min取上清为待纯化的样品。使用缓冲液A平衡镍亲和层析柱后，将样品上柱，然后用含50mM咪唑的缓冲液A冲洗柱子去除杂蛋白(峰1)，用含300mM咪唑的缓冲液A将目的蛋白洗脱下来(峰2)(见图2)。

最后用G-25脱盐柱将洗脱的蛋白置换于缓冲液A中以去除咪唑，SDS-PAGE电泳检测。经分析，获得了纯度在95％以上Prx-6蛋白，分子量约26.1kD。(见图3)。

实施例4.蛋白的抗氧化活性(HEF细胞氧化损伤实验)

HEF细胞为常用的人胚胎成纤维细胞(Zavada et al.,Nature New Biology,240:124-125(1972)；或US 7,811,817)。用培养基(高糖DMEM+5％FBS)复苏细胞，培养48h，待细胞长至90％汇合后，按照下面实验方法先将实施例3中获得的Prx-6蛋白(Prdx-6-His融合蛋白)加入培养体系中，再加入H₂O₂，作用30min后，MTT方法检测细胞存活率。

实验设计：正交试验

因素1：H₂O₂水平(1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM、0mM)

因素2：Prdx-6-His水平(0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0mg/ml)各实验组的H₂O₂和Prdx-6-His浓度如表1所示。

表1

结果如表1和图4所示。

H₂O₂对细胞有很强的毒性作用，当其浓度为0.125mM时，细胞存活率仅2.47％。随着H₂O₂浓度上升，造成的损伤也越大。

当体系中同时有Prx-6-His蛋白存在时细胞存活率显著增加。如果只有缓冲液存在时，细胞活率与Prx-6-His蛋白组相比显著降低。以H₂O₂浓度为0.125mM的各组为例，添加了0.25mg/ml、0.5mg/ml Prx-6蛋白，可使得存活率从约2.5％大幅上升到65％。

另外，仅用表达标签6His不能起到保护作用。

上述结果表明：Prx-6-His蛋白对H₂O₂的过氧化损伤有抵抗作用。0.25mg/ml的蛋白能使HEF细胞在一定程度上抵御0.125mM浓度的H₂O₂损伤。

实施例5.Prx-6蛋白的抗氧化活性(H9C2细胞氧化损伤实验)

试验方法：

H9C2细胞为常用的大鼠心肌细胞(US 7,482,320)。用培养基(高糖DMEM+10％FBS)复苏细胞，培养48h，待细胞长至90％汇合后，按照下面实验方法先将实施例3中获得的Prx-6蛋白(Prdx-6-His融合蛋白)加入培养体系中，再加入H₂O₂，作用30min后，MTT方法检测细胞存活率。

实验设计：正交实验

因素1：H₂O₂水平(0.5mM、0.25mM、0.125mM、0.0625mM、0mM)

因素2：Prx-6-His水平(0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0mg/ml)

各实验组的H₂O₂和Prdx-6-His浓度如表1所示。

表2

结果如表2和图5所示。

H₂O₂对细胞有很强的毒性作用，当体系中同时有Prx-6-His蛋白存在时细胞存活率显著增加,且随着Prx-6蛋白的浓度增加，存活率也相应增加。例如在H₂O₂浓度为0.0625mM的条件下，随着Prx-6浓度的增加(从0～0.5mg/ml)，细胞的存活率增加(从1.4％～97.38％)。

这表明Prx-6-His蛋白对H₂O₂的过氧化损伤有抵抗作用。0.5mg/ml的Prx-6蛋白能使H9C2细胞在一定程度上抵御0.0625mM浓度的H₂O₂损伤。

实施例6 Prx-6蛋白对烧烫伤的治疗作用

6.1 动物来源

小鼠24～30g，烟台毓璜顶医院实验动物中心。

6.2 药物

实验组：实施例3中制备的Prx-6蛋白；

对照组：美宝湿润烧伤膏，批号Z20000004(常用的治疗烧伤药物，作为阳性对照药物)。

6.3 烧伤模型制备

2.5％戊巴比妥钠(35mg/kg体重)腹腔内注射，麻醉后剪除背部长毛，涂硫化钡脱毛剂，3-5分钟后轻轻刮除，温水清洗干净后正常饲养。24h后同样方法麻醉，麻醉后将小鼠仰卧固定于带有正方形孔烫伤板上，置于95度热水中15s，立即取出用干纱布吸除残余热水，松绑。同时行体液复苏，腹腔内注射乳酸钠林格氏液10ml，小鼠背部造成约占体表面积10％的三度烫伤模型。

6.4 治疗方法

烫伤后1h用药，每天换药3次。

实验包括：对照组(涂不含蛋白的缓冲液)、Prx-6蛋白治疗组(涂1mg/ml Prx-6蛋白)、美宝+Prx-6蛋白阳性对照组(先涂1mg/ml Prx-6蛋白，再涂美宝湿润烧伤膏)、美宝阳性对照组(涂美宝湿润烧伤膏),烫伤后1h用药，每天换药3次。将1mg/ml Prx-6蛋白溶液涂小鼠烧伤创面,用量是400ul,折合到0.1mg/cm²，将美宝湿润烧伤膏均匀涂于创面，厚度约1mm。

6.5 实验结果

在烫伤后的第2天(2d)、第3天(3d)和第5天(5d)时，对照组小鼠发生了较为严重的炎症反应，而Prx-6蛋白治疗组小鼠和美宝阳性对照组小鼠炎症反应显著减轻。在烫伤后5d时，对照组小鼠伤口没有结痂，仍处于溃疡状态，而Prx-6蛋白治疗组小鼠和美宝阳性对照组小鼠伤口已经结痂(图6)。(注：图中从左至右依次为：对照组(2只)；Prx-6组(2只)；Prx-6+美宝组(2只)；美宝组(2只))。

实施例7

用于治疗烫伤的药物组合物

将重组人Prx-6蛋白制备成膏剂，各成分含量如下：Prx-6蛋白冻干粉0.1％，磷酸盐缓冲液20mM(PH7.0)85％，20％丙三醇，卡波树脂1％，香精0.3％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种Prx-6蛋白在制备治疗烧烫伤的药物中的用途，其中所述的治疗烧烫伤药物为外用制剂，并且所述外用制剂为膏剂、喷雾剂、或滴剂；且所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示的蛋白或其与表达标签形成的融合蛋白。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的外用制剂的用量为0.1-0.5mg/cm²创面。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治疗烧烫伤药物用于使烧烫伤创面立即收敛，抑制渗出，和杜绝内外感染。

5.一种用于治疗烧烫伤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有Prx-6蛋白以及药学上可接受的载体，并且所述的药物组合物为外用制剂，所述的外用制剂是膏剂、喷雾剂、或滴剂。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。

7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的外用制剂的用量为0.1-0.5mg/cm²创面。

8.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有其他治疗烧烫伤的药物。