CN116966272A - 一种sgp130蛋白在制备治疗角膜炎症及角膜炎适应症产品中的应用 - Google Patents
一种sgp130蛋白在制备治疗角膜炎症及角膜炎适应症产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种sgp130蛋白在制备治疗角膜炎症及角膜炎适应症产品中的应用，提出了人sgp130蛋白新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。碱烧伤造成的角膜炎症，在滴入或者涂入sgp130蛋白后，能有效抑制角膜炎症反应、修复受损的角膜上皮层、减轻角膜水肿、减少炎症细胞浸润、促进炎症病变组织恢复，抑制角膜新生血管生成等作用。具有刺激性小、疗程短等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉一种sgp130蛋白在制备治疗角膜炎症及角膜炎适应症产品中的应用。
背景技术
角膜盲是全球排名第4的致盲性原因。角膜炎症是角膜盲常见的病因。角膜炎症所带来角膜新生血管会导致角膜透明度下降，引起永久性视力下降或丧失，对患者的视觉质量甚至生活质量带来严重的影响。
关于角膜炎症以及角膜血管新生发生机制、病理过程以及治疗手段等问题尚未完全阐明，目前治疗药物和手段的作用局限也是一个关键问题。因此，如何治疗角膜炎症、预防角膜新生血管、保护视功能是当前眼科界攻关的重点课题。
角膜是屈光介质的重要组成部分，角膜的透明性在光线折射过程中发挥了重要作用。角膜炎引起角膜新生血管生成是免疫性角膜病变、微生物性角膜炎、角膜化学性烧伤等疾病共有病理改变。研究表明，角膜发生炎症后会引起角膜新生血管形成，造成角膜透明度降低；炎症组织招募炎症细胞造成大量炎症细胞浸润，造成角膜水肿，使角膜混浊，透明度进一步降低，，严重的患者有高致盲的风险。目前，市面上尚无理想的抗炎、抗血管新生的滴眼液，临床上应用的抗炎药物多数含有激素，长期使用会破坏眼表微环境的平衡，并且部分药物存在相关并发症，如糖皮质激素眼药水可能加重角膜溃疡或增加角膜溶解风险、氯霉素滴眼液长期大剂量使用可导致角膜水肿、眼球运动受到限制等。虽然，大量研究发现，中药提取物具有一定的抗血管新生，但其成分复杂、药效有待进一步肯定。这些对角膜炎症及其并发症的治疗带来一定的困扰。
角膜炎症中存在复杂的免疫炎症反应，控制炎症及其衍生的角膜新生血管化是治疗角膜炎症、促进患者视力恢复的关键所在。白介素-6(Interleukin 6,IL-6)是重要的前炎性因子，IL-6反式信号传导途径具有促炎作用。研究表明IL-6通路相关炎性因子在角膜炎病理及修复过程中具有重要的地位。在碱烧伤、微生物感染等造成的角膜炎患者和动物模型中，角膜组织IL-6表达显著升高，而拮抗IL-6受体阻止IL-6信号的传递能够减轻角膜炎症反应，并抑制介导血管新生的血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)。
本发明首次将sgp130蛋白用于治疗角膜炎症及其角膜炎适应症并取得了良好的治疗性研究，为角膜炎症及其角膜炎适应症临床治疗提供了新的思路。
发明内容
为了满足上述实验需求，本发明提供了sgp130蛋白在制备治疗角膜炎症及其角膜炎适应症产品中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种功能域包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蛋白在制备治疗角膜炎症及角膜炎适应症产品中的应用。
一种sgp130蛋白在制备治疗角膜炎症及角膜炎适应症产品中的应用。
作为一种可能的实施方式，进一步，所述产品为眼用制剂；所述眼用制剂包括：滴眼液、眼用凝胶、眼膏、注射液。
本发明还提供了一种用于治疗角膜炎症及其角膜炎适应症的药物组合，包含药学上可接受的载体以及功能域包含SEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白。
作为一种可能的实施方式，进一步，所述功能域包含SEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白选用sgp130蛋白。
作为一种可能的实施方式，进一步，所述药学上可接受的载体选用生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、泊洛沙姆、透明质酸钠中的任意一种或多种组合。
作为一种可能的实施方式，进一步，所述sgp130蛋白为重组人sgp130蛋白。
作为一种较优的选择实施方式，优选的，所述药物组合为眼用制剂；所述眼用制剂包括滴眼液、眼用凝胶、眼膏、注射液。
在治疗角膜炎症及其角膜炎适应症时，对需要治疗的对象(其中，治疗对象包括哺乳动物，包括人)，将功能域包含SEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白(例如：sgp130蛋白)或上述药物组合物滴入或者涂入结膜囊内。其能够起到抑制角膜炎症反应、修复受损的角膜上皮层、减轻角膜水肿、减少炎症细胞浸润、促进炎症病变组织恢复、抑制角膜新生血管生成等作用。
发明的有益效果在于：
1)本发明提出了人sgp130蛋白新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。碱烧伤造成的角膜炎症，在滴入或者涂入sgp130蛋白后，能有效抑制角膜炎症反应、修复受损的角膜上皮层、减轻角膜水肿、减少炎症细胞浸润、促进炎症病变组织恢复，抑制角膜新生血管生成等作用。具有刺激性小、疗程短等优点。
2)sgp130蛋白是人源蛋白，使用具有安全无毒副作用，有很好的药用前景。
3)人sgp130蛋白做成滴眼液、眼用凝胶、眼膏或注射液等，使用方便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为sgp130蛋白基因PCR扩增电泳图。图中为sgp130基因PCR扩增产物；M：marker；1：对照(模板为ddH2O)；2-6：sgp130。
图2为sgp130蛋白纯化色谱图。峰1：sgp130蛋白；峰2/3：杂蛋白；
图3为sgp130蛋白纯化后电泳图。1号洗脱峰洗脱液SDS-PAGE结果；M：marker；1：1号洗脱峰洗脱液样品
图4为用裂隙灯显微镜观察重组sgp130蛋白治疗小鼠角膜血管新生的结果；
图5为用苏木精-伊红染色(HE)观察重组sgp130蛋白治疗小鼠角膜损伤和炎症的结果。
图6为sgp130蛋白对碱烧伤的角膜组织VEGF-A/IL-6蛋白表达的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
经过广泛而深入的研究，首次发现sgp130蛋白具有抑制碱烧伤造成的及其角膜炎适应症的作用。在此基础上完成了本发明。
具体的，本发明的重组人sgp130蛋白可直接滴入结膜囊内，能够有效、抑制角膜炎症反应、修复受损的角膜上皮层、减轻角膜水肿、减少炎症细胞浸润、促进炎症病变组织恢复、抑制角膜新生血管生成等作用。具有刺激性小、有效控制感染和疗程短等优点。
sgp130蛋白
如本文所用，术语“本发明蛋白”、“sgp130蛋白”等可互换使用，都指具有人sgp130氨基酸序列的蛋白或多肽。应理解为，这些术语既包括人(源)的蛋白，也包括其他哺乳动物(中的具有同种功能的同系物或同源蛋白。此外，该术语包括野生型和突变型sgp130蛋白。
人sgp130基因的cDNA序列GenBank登录号：NM_002184，如SEQ ID NO：1所示。
人sgp130的氨基酸序列的登录号为NP_002175，如SEQ ID NO：2所示。
人sgp130蛋白与IL-6和IL-6R结合的功能域氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白功能域与IL-6和IL-6R相结合，能够拮抗IL-6受体，阻止IL-6信号的传递，减轻角膜炎症反应，并抑制介导血管新生的血管内皮生长因子。
应理解为，由于人等哺乳动物的sgp130蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本领域常规的DNA重组技术而获得其蛋白。
一类特别优选的蛋白是sgp130类似物，即在其他哺乳动物(如猴、羊、狗、鼠等)中sgp130的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据sgp130的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。
药物组合物和施用方法
本发明还提供了药物组合物，含有安全有效量的本发明sgp130蛋白和药物上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、泊洛沙姆、透明质酸钠及其组合。
例如，可将本发明蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH值通常为6-8，较佳pH为6.8-7.6，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症面有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但不局限于)：局部给药、结膜下注射等。一种优先的方式为直接滴入或涂入结膜囊内。
药物制剂应该和给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制备成滴眼液、眼用凝胶或眼膏等形式，均在无菌环境下制备。活性成分的给药量是治疗有效剂量，例如每天10微克/公斤-5毫克/公斤，具体剂量需要考虑给药方式、病人情况等因素。
此外，本发明的蛋白可以与治疗角膜炎症及其角膜炎适应症的其他药物一起使用。
在优先例中，可将本发明蛋白按照0.01-5毫克/每次滴入或者涂入结膜囊内。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。分子克隆：实验室手册(New York:cold spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1pLVX-IRES-ZsGreen1/sgp130表达载体构建
根据编码sgp130成熟蛋白的基因序列设计并合成一对特异引物(上游：5'-CCGCTCAGGCCACC ATGCTGACTCTGCAGACCTGGCTG-3')，下游引物：5'-CGCGGATCCTCATTCGATCTCCCCCTGAGCAA-3')，酶切位点分别为XhoⅠ和BamHⅠ，以实验室制备的人cDNA文库为模板，进行PCR扩增。结果见图1，检测到和理论值相符的bp的扩增片段。
用胶回收试剂盒回收琼脂糖凝胶中目的片段，用XhoⅠ和BamHⅠ对sgp130基因以及pLVX-IRES-ZsGreenl质粒进行酶切，转化到感受态大肠杆菌(DH5α)。通过挑选菌落单克隆筛选阳性克隆，并测序进一步筛选和验证基因序列的正确性，得到重组表达质粒pLVX-IRES-ZsGreen1/sgp130。
实施例2sgp130蛋白的表达
将重组质粒pLVX-IRES-ZsGreen1/sgp130转化到CHO细胞，采用有限稀释法进行单克隆筛选。对筛选到的单克隆细胞进行扩大培养，收集上清进行Dot-blot检测，筛选表达量较高的单克隆细胞株进一步WB检测表达量，筛选表达量最高的单克隆细胞株。将筛选到的CHO单克隆细胞株进行大量培养，收集培养上清。
实施例3sgp130蛋白的纯化
选取表达量最高的CHO单克隆细胞株进行大量培养，收集培养上清，利用超滤管进行浓缩。利用分子筛对浓缩过的细胞培养上清进行分离纯化(峰1，见附图2所示)，可得到较纯的sgp130蛋白。
经SDS-PAGE检测(如附图3所示)，其中sgpl30蛋白含量由BandScan软件分析后，含量大于90％。
实施例4sgp130蛋白对角膜炎症及其角膜炎适应症的作用
4.1动物来源
清洁级4-6周龄雄性C57BL6小鼠购于吴氏实验动物贸易有限公司。
4.2药品
实验组：实施例3中制备的sgp130蛋白；
对照组：1×PBS。
4.3角膜炎症模型制备
采用3％水合氯醛溶液麻醉。麻醉后，使用盐酸爱尔卡因表面麻醉滴眼液进行局部麻醉60s，并用无菌棉签吸取多余液体。成功后，将小鼠左侧卧位于消毒铺巾上。使用无菌打孔器将事先灭菌的定性滤纸制成2mm的圆形滤纸片，并将其用用无菌镊子浸泡在1mol/L氢氧化钠溶液中15s。然后将滤纸片取出，吸除表面多余溶液，将圆形滤纸片覆盖在小鼠右眼角膜中央40s后，取下滤纸。用20mL生理盐水缓慢冲洗角膜表面及结膜囊，无菌棉签吸去液体。左眼不做处理。用裂隙灯显微镜进行观察。
4.4治疗方法
实验包括：对照组(滴1×PBS)、sgp130蛋白治疗组滴(滴1.5mg/mL sgp130蛋白)。角膜碱烧伤后第二天开始用药，每天用药4次，每次将1滴(约50μL)药品滴入小鼠眼内。采用裂隙灯显微镜定期观察角膜的损伤及修复情况。取给药14d后角膜，HE染色技术观察角膜病理情况，Western blot技术检测VEGF-A和IL-6蛋白表达情况。
4.5实验结果(如附图4所示)
小鼠角膜碱烧伤后，角膜出现水肿混浊，透明度降低，呈灰白色。
治疗第3天，对照组呈现显著的角膜水肿混浊，角膜缘血管网显著扩张；sgp130蛋白治疗组存在中度角膜水肿及混浊，角膜缘血管网明显扩张，较对照组轻。
治疗第7天，对照组角膜水肿减轻，混浊减轻，角膜缘血管网仍显著扩张并出现新生血管芽；sgp130蛋白治疗组角膜水肿减轻，混浊减轻，角膜缘血管网扩张仍存，无加重趋势。
治疗第14天，对照组角膜轻度水肿，新生血管广泛侵入角膜，并累及中央区，角膜新生血管相关混浊明显；sgp130蛋白治疗组角膜水肿减轻，残留中央区轻度混浊，未见明显新生血管侵入。
治疗第21天，对照组角膜水肿仍然存在，角膜大量新生血管，部分新生血管萎缩，角膜新生血管相关混浊显著，透明度低。sgp130蛋白治疗组残留中央区上皮轻微水肿混浊，透明度基本恢复。
建模干预14天后，通过HE染色和Western blot检测角膜损伤和炎症情况。
如附图5所示，HE染色表明，治疗14天后，对照组角膜亚结构紊乱、排列不规整，基质层出现大量的炎症细胞浸润(红色箭头)，而sgp130蛋白治疗组角膜亚结构排列基本规整，基质层仅有少量细胞浸润(红色箭头)。
如附图6所示，Western blot结果显示，与对照组比较，sgp130蛋白组VEGF-A和IL-6蛋白表达明显下调，两组差异有统计学意义(P＜0.005)。
4.6实验结论
人sgp130蛋白在治疗角膜炎症过程中具有抑制角膜炎症、修复受损的角膜上皮层、减轻角膜水肿、减少炎症细胞浸润、促进炎症病变组织恢复、抑制角膜新生血管生成；等作用。
实施例5用于治疗角膜炎症及其角膜炎适应症
将重组人sgp130蛋白制备成滴眼液剂，其成分含量如下：sgp130蛋白0.5-1g，尼泊金甲酯0.023g，尼泊金丙酯0.011g，加入1×PBS(pH7.4)至100g。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种功能域包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蛋白在制备治疗角膜炎症及角膜炎适应症产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为眼用制剂；所述眼用制剂包括：滴眼液、眼用凝胶、眼膏、注射液。
3.一种sgp130蛋白在制备治疗角膜炎症及角膜炎适应症产品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为眼用制剂；所述眼用制剂包括：滴眼液、眼用凝胶、眼膏、注射液。
5.一种用于治疗角膜炎症及角膜炎适应症的药物组合，其特征在于，包含药学上可接受的载体以及功能域包含SEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白。
6.根据权利要求5所述的用于治疗角膜炎症及角膜炎适应症的药物组合，其特征在于，所述功能域包含SEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白选用sgp130蛋白。
7.根据权利要求5所述的用于治疗角膜炎症及角膜炎适应症的药物组合，其特征在于，所述药学上可接受的载体选用生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、泊洛沙姆、透明质酸钠中的任意一种或多种组合。
8.根据权利要求6所述的用于治疗角膜炎症及其角膜炎适应症的药物组合，其特征在于，所述sgp130蛋白为重组人sgp130蛋白。
9.根据权利要求6所述的用于治疗角膜炎症及其角膜炎适应症的药物组合，其特征在于，所述药物组合为眼用制剂；所述眼用制剂包括滴眼液、眼用凝胶、眼膏、注射液。
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