CN117946240A - 重组补体因子h多肽及其用途 - Google Patents

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CN117946240A CN202311403982.4A CN202311403982A CN117946240A CN 117946240 A CN117946240 A CN 117946240A CN 202311403982 A CN202311403982 A CN 202311403982A CN 117946240 A CN117946240 A CN 117946240A
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理查德.伍兹
梁帅怡
宁威
曹其来
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Abstract

本公开涉及重组补体因子H多肽及其用途。具体而言，本公开涉及重组补体因子H多肽，所述重组补体因子H多肽具有补体调节活性，尤其涉及补体旁路途径调节活性。

Description

重组补体因子H多肽及其用途
技术领域
本公开涉及重组补体因子H多肽及其用途，具体地，所述重组补体因子H多肽具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性。本公开还涉及编码重组补体因子H多肽的DNA分子、载体、宿主细胞、包含重组补体因子H多肽的药物组合物，以及重组补体因子H多肽、核酸分子、载体、宿主细胞、药物组合物的制药用途、治疗方法。
背景技术
补体是一种存在于人和脊椎动物血清及组织液中，可介导免疫应答和炎症反应的一种血清蛋白质。补体系统是由一系列约40种蛋白质分子组成，有着精密调控机制的蛋白质反应系统。补体系统的主要作用是参与外源病原体的定靶和清除，诱导与病原体相关的和调节的酶级联反应，一旦触发，就会以裂解结束并保护宿主参与免疫复合物和细胞碎片的排除以及增强细胞免疫，在多种自身免疫、炎症等疾病的病理学过程中扮演着十分重要的角色。
补体因子H(Complement Factor H，CFH)是一种含唾液酸的糖蛋白，在血浆中浓度很高(500μg/mL),在旁路途径中起着非常重要的作用。成熟的CFH有1213个氨基酸组成，约155kDa，参与了微生物防御、免疫复合物处理和细胞程序性死亡。CFH参与C3转移酶、C3b的裂解或取代B因子结合C3b，使C3b受到抑制，从而阻断替代途径，同时还作为Ⅰ因子的辅助因子促进Ⅰ因子降解C3b。CFH是一个由20个短同源重复序列(Short consensus repeats，SCR)构成的类似串珠状的结构，这些SCR按从N端到C端的顺序分别命名为SCR1至SCR20，每个SCR由约60个氨基酸组成，在空间结构上高度相似。CFH与固定在细胞表面的C3b结合后，能粘附到细胞表面，抑制C3bBb的形成。
许多疾病的发生与补体功能异常，特别是补体的过度激活有关。其中，年龄相关性黄斑变性(age-related macuLar degeneration，AMD)又称为老年性黄斑变性，不仅是发达国家老年人中心视力损害的主要原因之一，也是我国50岁以上老年人致盲的主要眼病。AMD是视网膜最重要的中心区域黄斑区发生紧张性病变，导致中心视力的下降甚至丧失。AMD临床表现分为干性(非渗出性或萎缩性)和湿性(新生血管性或渗出性):干性AMD以脉络膜下玻璃膜疣沉积和地图状萎缩形成为主要特点，而湿性AMD则以脉络膜新生血管为突出特征。所有的AMD都是从干性开始的。有些人(约10％)继续发展为湿性AMD，大约85％的AMD患者只有干性AMD。更多的研究表明，CFH基因的突变与干性AMD密切相关，例如发生在第402号氨基酸上，即Y402H，这个突变不仅与AMD相关，也与早期黄斑病变有关。研究表明与湿性AMD相比，CFH Y402H多态性与干性AMD有更强的相关性。CFH蛋白上402位酪氨酸变为组氨酸(Y402H)会导致带正电荷组氨酸取代疏水酪氨酸，从而影响CFH与肝素、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)结合，降低CFH对C3b的亲和力，对补体系统激活的抑制减弱，导致补体成分C3b和C5b-9(膜攻击复合体)产生增多，C5b-9沉积于视网膜色素上皮细胞基底层，可导致黄斑区萎缩及血管内皮损伤，进而血管阻塞，进一步发展新生血管形成，AMD发生。(Toomey C.,Rickman C.etc.Complement factor H in AMD:Bridging geneticassociations and pathobiology.Progress in Retinal and Eye Research)
综上所述，由于CFH与补体相关的疾病的发生、发展密切相关，开发活性更强的CFH多肽，从而针对性的治疗与补体相关的疾病，是目前亟需解决的重要问题。
发明内容
本公开提供了重组补体因子H多肽、编码多肽的核酸分子、载体、宿主细胞、包含重组补体因子H多肽的药物组合物、制药用途和治疗方法。
第一方面，本公开提供了重组补体因子H多肽。
在一些实施方案中，本公开提供了一种重组补体因子H多肽，其从N末端向C末端依次包括第二结构域和第三结构域，所述第二结构域与所述第三结构域可操作地连接。
在一些实施方案中，本公开提供了一种重组补体因子H多肽，其从N末端向C末端依次包括第一结构域，与所述第一结构域可操作地连接的第二结构域，以及与所述第二结构域可操作地连接的第三结构域。
构成补体因子H(Complement Factor H，CFH)的短同源重复序列从N末端向C末端的顺序，依次被命名为SCR1～SCR20(SCR1、SCR2、SCR3、SCR4、SCR5、SCR6、SCR7、SCR8、SCR9、SCR10、SCR11、SCR12、SCR13、SCR14、SCR15、SCR16、SCR17、SCR18、SCR19、SCR20，如图1所示)，本公开中的第一结构域、第二结构域、第三结构域分别包括来自于SCR1～SCR20中的任意一个或多个SCR结构域。
在一些实施方案中，所述第一结构域包含来自补体因子H的短同源重复序列SCR1、SCR 2、SCR 3、SCR 4中的一个或任意2个、3个、4个SCR。一些具体实施方案中，所述第一结构域包含一个或多个(例如，2、3、4个)SCR1、和/或一个或多个(例如，2、3、4个)SCR2、和/或一个或多个(例如，2、3、4个)SCR3、和/或一个或多个(例如，2、3、4个)SCR4。
在一些具体实施方案中，所述第一结构域包括：
SCR1、SCR2、SCR3和SCR4中的任意1个；
SCR1和SCR2；
SCR1和SCR3；
SCR1和SCR4；
SCR2和SCR3；
SCR2和SCR4；
SCR3和SCR4；
SCR1、SCR2和SCR3(即，SCR(1-3))；
SCR1、SCR2和SCR4；
SCR1、SCR3和SCR4；
SCR2、SCR3和SCR4；或
SCR1、SCR2、SCR3和SCR4(即，SCR(1-4))。
在一些实施方案中，所述第二结构域包含来自补体因子H的短同源重复序列SCR17、SCR 18、SCR 19、SCR 20中的一个或任意2个、3个、4个SCR。一些具体实施方案中，所述第一结构域包含一个或多个(例如，2、3、4个)SCR17、和/或一个或多个(例如，2、3、4个)SCR18、和/或一个或多个(例如，2、3、4个)SCR19、和/或一个或多个(例如，2、3、4个)SCR20。
在一些具体实施方案中，所述第二结构域包括：
SCR17、SCR18、SCR19和SCR20中的任意1个；
SCR17和SCR18；
SCR17和SCR19；
SCR17和SCR20；
SCR18和SCR19；
SCR18和SCR20；
SCR19和SCR20(即，SCR(19-20))；
SCR17、SCR18和SCR19；
SCR17、SCR18和SCR20；
SCR17、SCR19和SCR20；
SCR18、SCR19和SCR20(即，SCR(18-20))；或
SCR17、SCR18、SCR19和SCR20(即，SCR(17-20))。
在一些实施方案中，所述第三结构域包含来自补体因子H的短同源重复序列SCR6、SCR7、SCR8中的一个或任意2个、3个SCR。一些具体实施方案中，所述第一结构域包含一个或多个(例如，2、3、4个)SCR6、和/或一个或多个(例如，2、3、4个)SCR7、和/或一个或多个(例如，2、3、4个)SCR8。
在一些具体实施方案中，所述第三结构域包括：
SCR6、SCR7、SCR8中的任意1个；
SCR6和SCR7(即，SCR(6-7))；
SCR6和SCR8；
SCR7和SCR8(即，SCR(7-8))；或
SCR6、SCR7和SCR8(即，SCR(6-8))。
在一些实施方案中，第一结构域选自如下1)-2)中的任一项或其任意组合：1)SCR(1-3)，2)SCR(1-4)。在一些具体的实施方案中，第一结构域为SCR(1-4)。
在一些实施方案中，第二结构域选自如下3)-5)中的任一项或其任意组合：3)SCR(17-20)，4)SCR(18-20)，5)SCR(19-20)。在一些具体的实施方案中，第二结构域为SCR(18-20)。
在一些实施方案中，第三结构域选自如下6)-9)中的任意一项或其任意组合：6)SCR7，7)SCR(6-7)，8)SCR(6-8)，9)SCR(7-8)。在一些具体的实施方案中，第三结构域为SCR(6-8)。
在一些具体的实施方案中，提供重组补体因子H多肽，其从N端到C端包括如下任意一种的SCR组合：
(1)SCR(1-4)，SCR(17-20)，和SCR7；
(2)SCR(1-4)，SCR(18-20)，和SCR7；
(3)SCR(1-4)，SCR(19-20)，和SCR7；
(4)SCR(1-4)，SCR(17-20)，和SCR(6-7)；
(5)SCR(1-4)，SCR(18-20)，和SCR(6-7)；
(6)SCR(1-4)，SCR(19-20)，和SCR(6-7)；
(7)SCR(1-4)，SCR(17-20)，和SCR(7-8)；
(8)SCR(1-4)，SCR(18-20)，和SCR(7-8)；
(9)SCR(1-4)，SCR(19-20)，和SCR(7-8)；
(10)SCR(1-4)，SCR(17-20)，和SCR(6-8)；
(11)SCR(1-4)，SCR(19-20)，和SCR(6-8)；
(12)SCR(1-3)，SCR(17-20)，和SCR7；
(13)SCR(1-3)，SCR(18-20)，和SCR7；
(14)SCR(1-3)，SCR(19-20)，和SCR7；
(15)SCR(1-3)，SCR(17-20)，和SCR(6-7)；
(16)SCR(1-3)，SCR(18-20)，和SCR(6-7)；
(17)SCR(1-3)，SCR(19-20)，和SCR(6-7)；
(18)SCR(1-3)，SCR(17-20)，和SCR(7-8)；
(19)SCR(1-3)，SCR(18-20)，和SCR(7-8)；
(20)SCR(1-3)，SCR(19-20)，和SCR(7-8)；
(21)SCR(1-3)，SCR(17-20)，和SCR(6-8)；
(22)SCR(1-3)，SCR(18-20)，和SCR(6-8)；
(23)SCR(1-3)，SCR(19-20)，和SCR(6-8)；
(24)SCR(1-4)，SCR(18-20)，和SCR(6-8)。
在一些具体的实施方案中，前述重组补体因子H多肽从N末端向C末端的方向包括：SCR(1-4)，与SCR(1-4)可操作地连接的SCR(18-20)，以及与SCR(18-20)可操作地连接的SCR(6-8)。
在本公开中，第一结构域、第二结构域和第三结构域选自天然来源的CFH彼此独立地为野生型CFH或其功能变体。相应地，构成第一结构域、第二结构域和第三结构域的每个SCR彼此独立地来自于野生型CFH或其功能变体。示例性地，CFH的功能变体包括但不限于在野生型CFH的基础上进一步突变获得的突变体，修饰物(例如，糖基化修饰、PEG化修饰、生物素化修饰、磷酸化修饰等等)，片段，截短体，缀合物或融合蛋白等等。
在一些实施方案中，每个SCR彼此独立地选自野生型SCR或SCR突变体。
在一些实施方案中，每个SCR彼此独立地选自糖基化的SCR、去除或降低糖基化的SCR。
在一些具体的实施方案中，重组补体因组H多肽包含如下至少一个如下所述位点的氨基酸突变：第439位，第1077位；所述突变的位点为相对于SEQ ID NO:13所示序列的自然计数位点。相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第439位的氨基酸也即相对于SEQ ID NO:35所示序列中按自然计数的第13位的氨基酸，相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第1077位的氨基酸也即相对于SEQ ID NO:36所示序列中按自然计数的第50位的氨基酸。
在一些实施方案中，第439位和/或第1077位的氨基酸突变能够降低或去除重组补体因子H多肽的糖基化。
在一些具体的实施方案中，重组补体因子H多肽包含SCR8，且所述SCR8在相对于SEQ ID NO:13所示序列的自然计数位点的第439位存在突变。也即，SCR8在相对于SEQ IDNO:35所示序列的自然计数位点的第13位存在突变。
在一些具体的实施方案中，相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第439位的氨基酸突变为如下任意一种氨基酸：丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，赖氨酸(K)，天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)。
在一些具体的实施方案中，相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第439位的氨基酸存在如下任意一种突变：N439A，N439V，N439I，N439L，N439M，N439G，N439S，N439T，N439Q，N439R，N439K，N439D，N439E。
在一些具体的实施方案中，重组补体因子H多肽包含SCR18，且所述SCR18在相对于SEQ ID NO:13所示序列的自然计数位点的第1077位存在突变。也即，SCR18在相对于SEQ IDNO:36所示序列的自然计数位点的第50位存在突变。
在一些具体的实施方案中，相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第1077位的氨基酸突变为丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，赖氨酸(K)，天冬氨酸(D)，或谷氨酸(E)。在一些具体的实施方案中，相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第1077位氨基酸存在突变1077Q。
在一些具体的实施方案中，相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第1077位氨基酸存在如下任意一种突变：N1077A，N1077V，N1077I，N1077L，N1077M，N1077G，N1077S，N1077T，N1077Q，N1077R，N1077K，N1077D，N1077E。在一些具体的实施方案中，相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第1077位氨基酸存在突变N1077Q。
示例性地，SCR(18-20)包含如SEQ ID NO:2所示序列，其第50位的氨基酸X选自天冬酰胺(N)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，赖氨酸(K)，天冬氨酸(D)，或谷氨酸(E)。其中，SEQ ID NO:2所示序列的第50位的氨基酸位点对应于SEQ ID NO:13所示序列中第1077位的氨基酸位点。
在一些实施方案中，在糖基化的SCR(18-20)中，对应于SEQ ID NO:2所示序列的第50位的氨基酸为天冬酰胺(N)；在去除/降低糖基化的SCR(18-20)中，对应于SEQ ID NO:2所示序列的第50位的氨基酸为丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，赖氨酸(K)，天冬氨酸(D)，或谷氨酸(E)。
在一些具体的实施方案中，糖基化的SCR(18-20)包含如SEQ ID NO:3所示序列。去除/降低糖基化的SCR(18-20)在相对于SEQ ID NO:3所示序列按自然计数的第50位氨基酸存在突变50Q，50A，50V，50I，50L，50M，50G，50S，50T，50R，50K，50D或50E。
在一些具体的实施方案中，糖基化的SCR18包含如SEQ ID NO:36所示序列。去除/降低糖基化的SCR18在相对于SEQ ID NO:36所示序列按自然计数的第50位氨基酸存在突变50Q，50A，50V，50I，50L，50M，50G，50S，50T，50R，50K，50D或50E。
在一些具体的实施方案中，去除/降低糖基化的SCR(18-20)包含如SEQ ID NO:4所示序列。
相应地，本公开中用于形成第二结构域的SCR(18-20)是包含糖基化位点的野生型SCR(18-20)，也即糖基化的SCR(18-20)；或者SCR(18-20)是包含去除/降低糖基化的氨基酸突变的SCR(18-20)突变体，也即，去除/降低糖基化的SCR(18-20)。
示例性地，SCR(6-8)包含如SEQ ID NO:5所示序列，其第135位的氨基酸X选自天冬酰胺(N)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，赖氨酸(K)，天冬氨酸(D)，或谷氨酸(E)。其中，SEQ ID NO:5所示序列的第135位的氨基酸位点对应于SEQ ID NO:13所示序列中第439位的氨基酸位点。
在一些实施方案中，在糖基化的SCR(6-8)中，对应于SEQ ID NO:5所示序列的第50位的氨基酸为天冬酰胺(N)；在去除/降低糖基化的SCR(18-20)中，对应于SEQ ID NO:5所示序列的第50位的氨基酸为丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，赖氨酸(K)，天冬氨酸(D)，或谷氨酸(E)。
在一些具体的实施方案中，糖基化的SCR(6-8)包含如SEQ ID NO:6所示序列。去除/降低糖基化的SCR(6-8)在相对于SEQ ID NO:6所示序列中按自然计数的第135位氨基酸存在突变135Q，135A，135V，135I，135L，135M，135G，135S，135T，135R，135K，135D或135E。
在一些具体的实施方案中，糖基化的SCR8包含如SEQ ID NO:35所示序列。去除/降低糖基化的SCR8在相对于SEQ ID NO:35所示序列按自然计数的第13位氨基酸存在突变13Q，13A，13V，13I，13L，13M，13G，13S，13T，13R，13K，13D或13E。
相应地，本公开中用于形成第三结构域的SCR(6-8)是包含糖基化位点的野生型SCR(6-8)，也即糖基化的SCR(6-8)；或者SCR(6-8)是包含去除/降低糖基化的氨基酸突变的SCR(6-8)突变体，也即，去除/降低糖基化的SCR(6-8)。
需要说明的是，对于构成重组补体因子H多肽的任意一个SCR而言，选择野生型SCR或SCR突变体、糖基化的SCR或去除/降低糖基化的SCR，由SCR最终构建得到的多肽的CFH活性决定，本公开对各SCR的类型不进行限制性限定。
在本公开中，第一结构域与第二结构域直接连接，或通过第一连接子间接与第二结构域间接连接。
在本公开中，第二结构域与第三结构域直接连接，或通过第二连接子与第三结构域间接连接。
示例性地，前述重组补体因子H多肽从N末端向C末端具有如下任一项所示的结构：
第一结构域-第一连接子-第二结构域-第二连接子-第三结构域；
第一结构域-第一连接子-第二结构域-第三结构域；
第一结构域-第二结构域-第二连接子-第三结构域；或，
第一结构域-第一连接子-第二结构域-第二连接子-第三结构域。
在本公开中，第一连接子与第二连接子可以相同或不同。
在一些实施方案中，第一连接子和第二连接子彼此独立地选自：
(R1)m或(R1)n-(R3)x-(R4)t-(R3)x-(R1)n；
其中，m为1-20的任一整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；n为1-8的任一整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)；
R1为(Z1)r，r选自1-8的任一整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，每一个Z1各自独立地选自Gly(G)、Ala(A)、Ser(S)、Pro(P)、Asn(N)、Tyr(Y)、或Thr(T)；
x为0-4的任一整数(例如，0、1、2、3或4)，若存在，R3为Ala(A)；
t为1-8的任一整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，R4为Glu-Ala-Ala-Ala-Lys(EAAAK)。
示例性地，R1为G，G2，G3，G4，GS，ASGS，GGNGT，YGNGT，S，S2，S3，S4，G2S，G3S，G4S，G2SS，G3SSS，G4SS等等。
示例性地，R3为不存在或A、A2、A3或A4。
示例性地，R4为EAAAK、(EAAAK)2、(EAAAK)3、(EAAAK)4等等。
在一些具体的实施方案中，(R1)m选自(G)m、(GS)m、(G2S)m、(G3S)m、(G4S)m、(GAP)m、(ASGS)m、(GpSq)m、(GGNGT)m或(YGNGT)m；其中，m选自1-20的任一整数；p选自1-7的任一整数(例如1，2，3，4，5，6或7)，q选自1-7的任一整数(例如1，2，3，4，5，6或7)，且p+q≤8(例如2，3，4，5，6，7或8)；
在一些具体的实施方案中，(R1)m选自(G)m，其中，m选自1-8的任一整数(例如，m选自1、2、3、4、5、6、7或8)。
在一些具体的实施方案中，(R1)n选自(G)n、(GAP)n、(ASGS)n、(GpSq)n、(GGNGT)n、(YGNGT)n；其中，n选自1-8的任一整数；p选自1-7的任一整数(例如1，2，3，4，5，6或7)，q选自1-7的任一整数(例如1，2，3，4，5，6或7)，且p+q≤8(例如2，3，4，5，6，7或8)。
在一些具体的实施方案中，(R1)n-(R3)x-(R4)t-(R3)x-(R1)n选自(R1)n-A-(EAAAK)t-A-(R1)n或(R1)n-(EAAAK)t-(R1)n；其中，n选自1-8的任一整数，t为1-6的任一整数(例如，1，2，3，4，5或6)，x选自0-4的任一整数。
在一些具体的实施方案中，(R1)n-(R3)x-(R4)t-(R3)x-(R1)n选自(GpSq)n-A-(EAAAK)t-A-(GpSq)n或(GpSq)n-(EAAAK)t-(GpSq)n，其中，n选自1-8的任一整数，t为1-6的任一整数；p选自1-7的任一整数，q选自1-7的任一整数，且p+q≤8。
示例性地，(R1)n为(G4S)n；其中，n为1-8的任一整数(例如1、2、3、4、5、6、7或8)。进一步地，(R1)n-(R3)x-(R4)t-(R3)x-(R1)n为(G4S)n-A-(EAAAK)t-A-(G4S)n或(G4S)n-(EAAAK)t-(G4S)n；其中，n为1-6中的任一整数(例如1、2、3、4、5或6)，t为1-6的任一整数(例如1、2、3、4、5或6)。
示例性地，第一连接子和第二连接子彼此独立地选自如下所示氨基酸序列的连接子：(G4S)4，(G4S)3，(G4S)2，G4S，(G4)4，(G4)3，(G4)2，G4，G4SA(EAAAK)2AG4S，(G4S)2A(EAAAK)2A(G4S)2，(G4S)3A(EAAAK)2A(G4S)3，G4S(EAAAK)2G4S，(G4S)2(EAAAK)2(G4S)2，(G4S)3(EAAAK)2(G4S)3，GS；GAP；ASGS，GGNGT，(GGNGT)2，(GGNGT)3，(GGNGT)4，YGNGT，(YGNGT)2，(YGNGT)3，(YGNGT)4。
在一些具体的实施方案中，第一连接子为(G4S)3，第二连接子为(G4S)3；或者，第一连接子为G4SA(EAAAK)2AG4S，第二连接子为G4SA(EAAAK)2AG4S；或者，第一连接子为(G4S)3，第二连接子为G4SA(EAAAK)2AG4S；或者，第一连接子为G4SA(EAAAK)2AG4S，第二连接子为(G4S)3。
连接子的氨基酸序列编号如下所示：
序列 SEQ ID NO: 序列 SEQ ID NO:
(G3S)m 38 S4 50
(G4S)m 39 A4 51
(ASGS)m 40 (G4)4 52
(GGNGT)m 41 (G4)3 53
(YGNGT)m 42 (G4)2 54
G2SS 43 G4 55
G3SSS 44 G4SA(EAAAK)2AG4S 56
G4SS 45 (G4S)2A(EAAAK)2A(G4S)2 57
EAAAK 46 (G4S)3A(EAAAK)2A(G4S)3 58
(EAAAK)2 47 G4S(EAAAK)2G4S 59
(EAAAK)3 48 (G4S)2(EAAAK)2(G4S)2 60
(EAAAK)4 49 (G4S)3(EAAAK)2(G4S)3 61
在一些实施方案中，前述重组补体因子H多肽从N末端向C末端具有如下式(I)所示的结构：
第一结构域-第一连接子-第二结构域-第二连接子-第三结构域式(I)，
其中，第一结构域选自SCR(1-3)或SCR(1-4)，第二结构域选自SCR(17-20)、SCR(18-20)或SCR(19-20)，第三结构域选自SCR7、SCR(6-7)、SCR(6-8)或SCR(7-8)；
第一连接子和第二连接子彼此独立地选自如下任意一种：(R1)m或(R1)n-(R3)x-(R4)t-(R3)x-(R1)n
其中，m为1-20的任一整数，n为1-8的任一整数；
R1为(Z1)r，r选自1-8的任一整数，每一个Z1各自独立地选自Gly(G)、Ala(A)、Ser(S)、Pro(P)、Asn(N)、Tyr(Y)、或Thr(T)；
x为0-4的任一整数，若存在，R3为Ala(A)；
t为1-8的任一整数，R4为Glu-Ala-Ala-Ala-Lys(EAAAK)。
在一些具体的实施方案中，前述重组补体因子H多肽从N末端向C末端具有如下任意一种结构：
第一结构域-(G4S)m-第二结构域-(G4S)m-第三结构域式(I-1)；或者，
第一结构域-(G4S)n(EAAAK)t(G4S)n-第二结构域-(G4S)n(EAAAK)t(G4S)n-第三结构域式(I-2)；或者，
第一结构域-(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n-第二结构域-(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n-第三结构域式(I-3)；
其中，第一结构域、第二结构域、第三结构域选自前述(1)-(24)任一项所示的组合，m选自1-20的任一整数，n为1-8的任一整数，t选自1-6的任一整数。
在一些具体的实施方案中，前述重组补体因子H多肽从N末端向C末端具有如下任意一种结构：
SCR(1-4)-(G4S)m-SCR(18-20)-(G4S)m-SCR(6-8)，
或者，
SCR(1-4)-(G4S)n(EAAAK)t(G4S)n-SCR(18-20)-(G4S)n(EAAAK)t(G4S)n-SCR(6-8)；
或者，
SCR(1-4)-(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n-SCR(18-20)-(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n-SCR(6-8)；其中，SCR(18-20)为糖基化的、去除糖基化的或降低糖基化的；
m选自1-20的任一整数，n为1-8的任一整数，t选自1-6的任一整数。
在一些具体的实施方案中，前述重组补体因子H多肽从N末端向C末端具有如下任意一种结构：
SCR(1-4)-(G4S)m-SCR(18-20)-(G4S)m-SCR(6-8)，
或者，
SCR(1-4)-(G4S)n(EAAAK)t(G4S)n-SCR(18-20)-(G4S)n(EAAAK)t(G4S)n-SCR(6-8)，
或者，
SCR(1-4)-(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n-SCR(18-20)-(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n-SCR(6-8)；其中，SCR(18-20)为糖基化的、去除糖基化的或降低糖基化的；
m选自1-8的任一整数，n为1-6的任一整数，t选自1-6的任一整数。
在一些具体的实施方案中，前述重组补体因子H多肽从N末端向C末端具有如下任意一种结构：
SCR(1-4)-(G4S)3-SCR(18-20)-(G4S)3-SCR(6-8)，或者，
SCR(1-4)-G4SA(EAAAK)2AG4S-SCR(18-20)-G4SA(EAAAK)2AG4S-SCR(6-8)。
在一些具体的实施方案中，前述重组补体因子H多肽从N末端向C末端具有如下任意一种结构：
SCR(1-4)-(G4S)3-糖基化的SCR(18-20)-(G4S)3-SCR(6-8)，或者，
SCR(1-4)-G4SA(EAAAK)2AG4S-去除/降低糖基化的SCR(18-20)-G4SA(EAAAK)2AG4S-SCR(6-8)。
在一些具体的实施方案中，去除/降低糖基化的SCR(18-20)包括50Q的氨基酸突变，所述突变的位点为相对于SEQ ID NO:2所示序列的自然计数位点。
在一些实施方案中，各SCR结构域的示例性氨基酸序列如下所示：
>SCR(1-4)
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEE
(SEQ ID NO:1)
>SCR(18-20)
其中，X选自N，Q，A，V，I，L，M，G，S，T，R，K，D，E。
>糖基化的SCR(18-20)
>去除/降低糖基化的SCR(18-20)(N50Q)
>SCR(6-8)
其中，X选自N，Q，A，V，I，L，M，G，S，T，R，K，D，E。
>糖基化的SCR(6-8)
>去除/降低糖基化的SCR(6-8)
>SCR(1-3)
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVE
(SEQ ID NO:7)
>SCR(17-20)
TDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAK
(SEQ ID NO:8)
>SCR(19-20)
STGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAK
(SEQ ID NO:9)
>SCR7
RKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENG WSPTPRCIR
(SEQ ID NO:10)
>SCR(6-7)
KPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIR
(SEQ ID NO:11)
>SCR(7-8)
RKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIK
(SEQ ID NO:12)
>SCR8
>SCR18
在一些具体的实施方案中，前述重组补体因子H多肽包含SEQ ID NO:14-15、19、23、26任一项所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:14-15、19、23、26任一项所示序列具有至少80％序列同一性(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等)，且具有补体因子H活性和/或补体调节活性的氨基酸序列。
其中，SEQ ID NO:13所示序列中第1077位的氨基酸位点在对应SEQ ID NO:15所示序列的氨基酸位点为318位。也即，SEQ ID NO:15所示序列中重组补体因子H多肽包含如下去除糖基化的氨基酸突变:318Q。
在一些实施方案中，重组补体因子H多肽中包含信号肽，或不包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽的添加适用于重组补体因子H多肽的分泌。在一些实施方案中，信号肽的添加适用于重组补体因子H多肽的翻译后修饰(例如，糖基化、硫酸化等等)。在一些实施方案中，信号肽的添加适用于重组补体因子H多肽的定位。在另外的实施方案中，信号肽的添加还可以用于实现其他信号肽功能，本公开对此不进行限制性限定。本领域技术人员应当理解，重组补体因子H多肽中可以不包含信号肽而不改变其期望的补体因子H活性和/或补体调节活性。
在一些具体的实施方案中，重组补体因子H多肽中包含信号肽，所述信号肽位于所述重组补体因子H多肽的N末端。信号肽具有广泛的序列来源，均能实现其功能。作为非限制性示例，信号肽包含来源于如下所示蛋白的氨基酸序列：CD33信号肽、CD8信号肽、CD16信号肽、CFH信号肽等。示例性地，信号肽包含如SEQ ID NO:27或28所示的氨基酸序列。包含信号肽的重组补体因子H多肽包含SEQ ID NO:29-32任一项所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:29-32任一项所示序列具有至少80％序列同一性(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等)，且具有补体因子H活性和/或补体调节活性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，前述重组补体因子H多肽与野生型CFH相比，具有提高的CFH活性。例如，与野生型CFH相比，重组补体因子H多肽具有如下至少一种提高的CFH活性：
(a)与C□反应蛋白(CRP)结合活性，(b)与C3b和/或其片段结合活性，(c)与肝素结合活性，(d)与唾液酸结合活性，(e)与细胞表面补体受体(例如，CR3、CD11b/CD18或integrinαM/integrinβ2等)结合活性，(f)与糖胺聚糖结合活性，(g)与丙二醛(Malondialdehyde，MDA)结合活性，(h)与病原体结合活性，(j)补体因子I切割C3b辅因子活性，(k)C3和C5替代途径转化酶衰变加速活性，(l)补体调节活性，包括补体旁路途径调节活性，更具体为抑制补体激活的活性。
在一些具体的实施方案中，重组补体因子H多肽与野生型CFH相比，具有提高的补体调节活性，更具体为提高的抑制补体激活的活性。
第二方面，本公开提供了一种重组补体因子H多肽，其相对野生型CFH包含第1077位和/或第439位的氨基酸突变，所述突变的位点为相对于SEQ ID NO:13所示序列的自然计数位点。
在一些实施方案中，所述突变去除/降低重组补体因子H多肽的糖基化。
在一些实施方案中，重组补体因子H多肽包含第1077位的氨基酸突变，其中所述突变的位点为相对于SEQ ID NO:13所示序列的自然计数位点。
在一些具体的实施方案中，重组补体因子H多肽在相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第1077位的氨基酸突变为丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，赖氨酸(K)，天冬氨酸(D)，或谷氨酸(E)。在一些具体的实施方案中，重组补体因子H多肽在相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第1077位氨基酸存在如下突变：1077Q。
在一些具体的实施方案中，重组补体因子H多肽在相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第1077位氨基酸存在如下任意一种突变：N1077A，N1077V，N1077I，N1077L，N1077M，N1077G，N1077S，N1077T，N1077Q，N1077R，N1077K，N1077D，N1077E。在一些具体的实施方案中，重组补体因子H多肽在相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第1077位氨基酸存在如下突变：N1077Q。
需要说明的是，相对于SEQ ID NO:13的氨基酸突变(1077Q)对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中按自然计数的第50位的氨基酸残基。
在一些实施方案中，本公开提供包含SCR18的重组补体因子H多肽，其是去除/降低糖基化修饰的；在一些具体实施方案中，在相对于本公开的SEQ ID NO:2的自然计数的第50位氨基酸存在去除/降低糖基化突变；在一些具体实施方案中，在相对于本公开的SEQ IDNO:2的自然计数的第50位氨基酸存在50Q的突变。
在一些实施方案中，重组补体因子H多肽包含第439位的氨基酸突变，其中所述突变的位点为相对于SEQ ID NO:13所示序列的自然计数位点。
在一些具体的实施方案中，重组补体因子H多肽在相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第439位的氨基酸突变为如下任意一种氨基酸：丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，赖氨酸(K)，天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)。
在一些具体的实施方案中，重组补体因子H多肽在相对于SEQ ID NO:13所示序列中按自然计数的第439位的氨基酸存在如下任意一种突变：N439A，N439V，N439I，N439L，N439M，N439G，N439S，N439T，N439Q，N439R，N439K，N439D，N439E。
在一些实施方案中，重组补体因子H多肽同时包含第439位与第1077位的氨基酸突变，其中所述突变的位点为相对于SEQ ID NO:13所示序列的自然计数位点。
在一些具体的实施方案中，前述重组补体因子H多肽包含SEQ ID NO:15、22-26任一项所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:15、22-26任一项所示序列具有至少80％序列同一性(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等)，且具有补体因子H活性和/或补体调节活性的氨基酸序列。
第三方面，本公开提供了一种核酸分子，及包含核酸分子的载体。
在一些实施方案中，本公开提供了一种核酸分子，其编码前述任意一种的重组补体因子H多肽。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子可以为RNA、DNA或cDNA。根据本公开的一些实施方案，本公开的核酸分子是分离的核酸。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒、YAC或病毒载体。载体可尤其为表达载体，即可提供重组补体因子H多肽体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本公开的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。针对在特定宿主中的表达对所述元件及其序列进行选择为本领域技术人员的常识。对本公开的重组补体因子H多肽的表达有用或必需的调控元件及其他元件例如为启动子、增强子、终止子、整合因子、选择标记物、前导序列、报告基因。
本公开的核酸可基于本公开的多肽的氨基酸序列的信息通过已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。
在一些实施方案中，本公开中的核酸分子及载体可用于制备重组补体因子H多肽。在一些实施方案中，本公开中的核酸分子及载体用于在细胞或受试者体内表达重组补体因子H多肽，以调节细胞或受试者体内的补体因子活性。
第四方面，本公开提供了一种宿主细胞，其表达前述任意一种的重组补体因子H多肽，或包含编码前述任意一种的重组补体因子H多肽的核酸分子或载体。
在一些实施方案中，宿主细胞是原核或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括原核微生物(如大肠杆菌)或各种真核生物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚胎肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)、昆虫细胞等)。在一些实施方案中，可以使用表达糖基化多肽的宿主细胞，由多细胞生物体(包括例如无脊椎动物和脊椎动物)衍生，例如植物和昆虫细胞。脊椎动物细胞也可以用作宿主细胞，例如，悬浮生长的哺乳动物细胞系、猴肾CV1系(COS-7)、人胚胎肾系(293或293T细胞)、幼仑鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(HepG2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather等，Annals N.Y.AcadSci383，44-68(1982))、MRC5细胞和FS4细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0，以及在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。第五方面，本公开还提供了一种制备本公开的重组补体因子H多肽的方法，其包括：
-在允许表达本公开的重组补体因子H多肽的条件下培养本公开的宿主细胞；及
-从培养物回收由所述宿主细胞表达的重组补体因子H多肽；及
-任选的，包括进一步纯化和/或修饰本公开的重组补体因子H多肽。
本公开的重组补体因子H多肽可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞质中、在周质中或在包涵体中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。例如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化，洗去非特异性结合的组分，再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测，收集。可选地，用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本公开的重组补体因子H多肽的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。
第六方面，本公开提供了药物组合物，包括前述重组补体因子H多肽、核酸分子、载体、宿主细胞中的至少一种。
在一些实施方案中，药物组合物中还包括一种或多种药学上可接受的辅料。
在一些具体实施方案中，药物组合物单位计量中可含有0.01至99重量％的重组补体因子H多肽，或药物组合物单位剂量中含有的重组补体因子H多肽的量为0.1-2000mg(例如1-1000mg)。
在一些具体实施方案中，药物组合物可以为冻干制剂或液体制剂。
第七方面，本公开提供了前述重组补体因子H多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物的医药用途、预防或治疗疾病的方法。
在一些实施方案中，前述重组补体因子H多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物，其用于如下至少一种：
(i)抑制补体激活，或制备用于抑制补体激活的药物；
(ii)用于预防或治疗与补体相关的疾病，或制备用于预防或治疗与补体相关的疾病的药物；
(iii)用于治疗患有将受益于补体激活被抑制的疾病的受试者，或制备用于治疗患有将受益于补体激活被抑制的疾病的受试者的药物。
在一些实施方案中，与补体相关的疾病选自视网膜病变。例如，黄斑变性、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)变性、脉络膜视网膜变性、光感受器变性等。
在一些具体的实施方案中，视网膜病变选自黄斑变性。
在一些具体的实施方案中，视网膜病变为年龄相关性黄斑变性。示例性地，年龄相关性黄斑变性选自干性AMD或湿性AMD。
在一些实施方案中，本公开提供了一种预防或治疗与补体相关的疾病的方法，包括向受试者施用前述重组补体因子H多肽、核酸分子、载体、重组宿主细胞或药物组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于抑制细胞内补体激活的方法，其包括将所述细胞与前述重组补体因子H多肽、核酸分子、载体、重组宿主细胞或药物组合物相接触。
在一些实施方案中，细胞为体外细胞或体内细胞。在一些实施方案中，细胞在受试者体内。在一些实施方案中，受试者具有如下至少一种特性：
补体活性失调，更具体为补体过度激活；
患有与补体相关的疾病；
患有将受益于补体激活被抑制的疾病。
在一些实施方案中，与补体相关的疾病或将受益于补体激活被抑制的疾病选自视网膜病变。例如，黄斑变性、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)变性、脉络膜视网膜变性、光感受器变性等。
在一些具体的实施方案中，视网膜病变选自黄斑变性。
在一些具体的实施方案中，视网膜病变为年龄相关性黄斑变性。示例性地，年龄相关性黄斑变性选自干性AMD或湿性AMD。
定义
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学。除非在本公开中另有明确定义，本公开使用的所有其它技术和科学都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
除非上下文另外清楚要求，否则在整个说明书和权利要求书中，应将词语“包含”、“具有”、“包括”等理解为具有包含意义，而不是排他性或穷举性意义；也即，“包括但不仅限于”的意义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。
“受试者”、“患者”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。
“约”、“大约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围，例如1％至15％之间、在1％至10％之间、在1％至5％之间、在0.5％至5％之间、在0.5％至1％之间变化，本公开中，数字或数值范围之前有术语“约”的每种情况也包括给定数的实施方案。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
如本公开所使用的，术语“多肽”、“肽”或“蛋白”可互换使用，其指氨基酸残基的聚合物，或多个氨基酸残基聚合物的集合体。这些术语应用于其中的一个或多个氨基酸残基为对应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。多肽序列通常记述为多肽序列的左手端为氨基末端(N末端、N端)；多肽序列的右手端为羧基末端(C末端、C端)。
如本公开所使用的，“补体因子H”(Complement Factor H,CFH)又称“因子H”、“FH”等，其具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性。本公开中的CFH可以是天然来源的野生型CFH或其功能变体。CFH序列可获取于GenBank、UniProt等。示例性地，天然来源指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和其他物种(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、狗、猪、羊等)等。在一些实施方案中，CFH为哺乳动物CFH。在一些实施方案中，CFH为人CFH；示例性地，人CFH在Genbank:NP_000177.2中所示出。
在本公开中，“重组补体因子H多肽”也可称为“重组CFH多肽”、“重组CFH蛋白”、“CFH截短体”、“CFH截短体蛋白”、“具有补体因子H活性的多肽”、“具有CFH活性的多肽”、“具有补体抑制活性的多肽”等等。
如本公开所使用的，“CFH的功能变体”包括野生型CFH的同系物、片段、截短体、突变体、修饰物等，CFH的功能变体与野生型CFH相比，具有提高的、降低的或维持的CFH活性。
如本公开所使用的，术语“修饰”包括但不限于PEG化修饰、糖基化修饰、生物素化修饰、磷酸化修饰等等。
如本公开所使用的，术语“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。其中，取代是指用不同的核苷酸或氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸或氨基酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸或氨基酸之后添加核苷酸或氨基酸。
如本公开所使用的，“SCR”(Short consensus repeats，SCR)是指来自于补体因子H(Complement Factor H，CFH)的短同源重复序列，其也被称为“短共有重复序列”、“补体调节蛋白重复序列结构域”。以“SCR(1-4)”或“SCR1-4”的表述为例，其含义为“SCR1至SCR4的片段”。其它数字的类似表示含义与此相同。
术语“可操作地连接”或“可操作的连接”或“可操作连接”是指两个或更多个生物学序列以使其处于以目的方式作用的方式连接，无论是否存在间隔区(也称接头、连接子、连接序列)。当用于多肽时，该术语表示多肽序列以使所连接的产物具有目的生物学功能的方式连接，两条序列间可以存在或不存在间隔区。例如，可将抗体可变区可操作地连接至恒定区，以形成具有抗原结合活性的稳定产物。所述术语还可用于多核苷酸。例如，当编码多肽的多核苷酸可操作地连接至调控序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)时，该术语表示所述多核苷酸序列以允许所述多肽由所述多核苷酸调控表达的方式连接。
如本公开所使用的，术语“连接子”是指多肽连接子、非肽连接子及其组合。在一些实施方案中，本公开中的“连接子”为多肽连接子，其具有在两个结构域之间起连接作用的氨基酸链。例如，连接子为富含甘氨酸和/或丝氨酸的柔性连接子(Flexible Linker)，刚性α螺旋连接子(例如，(EAAAK)n，n≤6)，或由柔性连接子(Flexible Linker)与刚性连接子(rigid Linker)组成的半刚性连接子(semi-regid Linker)。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。通常，当比对两个序列时进行比较以给出最大百分比同源性。例如，可以通过BLAST算法执行比较，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配。以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS):Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish，W.等人，(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7:649-656。其他如NCBI BLAST提供的常规BLAST算法也为本领域技术人员所熟知。
“载体”、“表达载体”与“表达构建体”同义并指用于导入与其可操作联合的特定基因并指导其在靶细胞中表达的DNA分子，包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到其所导入的宿主细胞的基因组中的载体。本文的表达载体包含表达盒，允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内，就通过细胞转录和/或翻译体系生成基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。
“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有与原始转化细胞中所筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变后代。
“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“施用”、“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
如本公开所使用的，术语“预防”是指在对象中对于本文所提及的疾病或病症保持一定时间段的健康。应理解的是，所述时间段取决于所施用的药物化合物的量以及本说明书中其他地方讨论的对象的个体因素。还应理解，预防可能不在用本公开化合物治疗的所有对象中是有效的。但是，该术语优选地要求有效地预防同生群或群体的统计学显著部分的患有本文所述的疾病或病症或其伴随症状的对象。优选地，在这种情况下，设想了对象的同生群或群体，其通常，即，如果没有根据本公开的预防措施，将发展出本文所指的疾病或病症。本领域技术人员可以使用本说明书中其他地方讨论的各种众所周知的统计评估工具来确定一部分是否在统计上是有意义的。
如本公开所使用的，“治疗”意指给予受试者内用或外用治疗剂，诸如包含本公开的任一种多肽、包含多肽的组合物，所述受试者确诊患有、疑似患有、易感于一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床不可测量的程度。
如本公开所使用的，“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定受试者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
如本公开所使用的，“与补体相关的疾病”没有特别限制，只要它是与补体相关的疾病或病症即可。在一些实施方案中，与补体相关的疾病包括由于补体失调导致的疾病或病症。在一些实施方案中，补体失调为补体过度激活。
如本公开所使用的，术语“补体过度激活”涉及在给定情况下在时间和、或幅度上超过补体激活的正常水平的补体激活。在一些实施方案中，不适当的补体激活是在给定情况下，补体激活超过、优选显著超过健康参照、优选明显健康对象的补体激活程度。在一些实施方案中，不适当的补体激活是引起患者疾病症状的补体激活。
如本公开所使用，术语“药学上可接受的辅料”又称“药物学可接受的载体”是指在药物生产领域中广泛采用的辅助物料。使用辅料的主要目的在于提供一种使用安全、性质稳定和/或具有特定功能性的药物组合物，还在于提供一种方法，以便在为受试者施用药物之后，活性成分能够以所期望的速率溶出，或者促进活性成分在接受给药的受试者体内得到有效吸收。药学上可接受的辅料可以是具有惰性的填充剂，也可以是为药用组合物提供某种功能(例如稳定组合物的整体pH值或防止组合物中活性成分的降解)的功效成分。药学上可接受的辅料的非限制性实例包括但不限于粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂(或填充剂)、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味剂等。
附图说明
图1示出了CFH全长蛋白的结构示意图(引用自Mihály Józsi et al.,TrendsImmunol.2015Jun；36(6):374-84.)，其包括从SCR1至SCR20的20个SCR。
图2示出了部分CFH截短体(CFH-13、CFH-25、CFH-37、CFH-48、CFH-79、CFH-81、CFH-84)的结构示意图。
图3示出了CFH-01(2.5mg/mL)、CFH-79(2.5mg/mL)、CFH-84(2.5mg/mL)给药后，小鼠CNV模型光斑渗透改善结果。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。
本公开实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，Wiley Interscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1.补体因子H(CFH)截短体的构建和制备
补体因子H(CFH)全长蛋白共有20个短同源重复序列(short consensus repeat，SCR)，如图1所示。本公开对CFH全长蛋白进行截短体的设计，包括不同SCR的组合、不同连接子(linker)的使用、糖基化位点的改造。
1、设计具有不同SCR组合的CFH截短体
如图2和表1所示，针对不同的SCR组合进行了设计，CFH截短体中保留了具有C3b结合的功能区，即SCR1-4和SCR19-20，以及AMD疾病相关的突变Y402所在的SCR7。选择了柔性(G4S)3和半刚性G4S-A(EAAAK)2A-G4S作为连接子。
表1.部分CFH截短体蛋白结构
(注：斜体为linker；*表示糖基化)
表1中CFH全长及CFH截短体的序列为如下所示，其中单下划线部分为连接子，部分为CFH截短体上连接的His标签，/>部分为去除/降低糖基化的氨基酸突变位点。
>CFH-01
/>
>CFH-79
>CFH-84
>CFH-13
>CFH-25
>CFH-48
>CFH-49(无his tag)
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEGGGGSGGGGSGGGGSTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKGGGGSGGG GSGGGGSKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIK
(SEQ ID NO:19)
>CFH-49
>CFH-77
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEGGGGSGGGGSGGGGSKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKGG GGSGGGGSGGGGSTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAK(SEQ ID NO:21)
>CFH-78
>CFH-80
>CFH-81
>CFH-82
>CFH-83
>CFH-37.1
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKGGGGSAEAAAKEAAAKAGGGGSIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKGGGGS(SEQ ID NO:33)
>CFH-73
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKGGGGSAEAAAKEAAAKAGGGGSIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAK(SEQ ID NO:34)
上述的CFH截短体蛋白在N末端设计有信号肽。在本实施中，CFH截短体蛋白在N末端直接连接CD33信号肽：MPLLLLLPLLWAGALAM(SEQ ID NO:27)。下述序列中波浪线部分为信号肽。
>连接CD33信号肽的CFH-79
>连接CD33信号肽的CFH-84
在另外的实施方案中，CFH截短体蛋白在N末端还可以连接补体因子H(CFH)信号肽：MRLLAKIICLMLWAICVA(SEQ ID NO:28)。
>连接CFH信号肽的CFH-79
>连接CFH信号肽的CFH-84
2、CFH截短体蛋白的重组表达、制备和检测
在CFH-84的核酸序列的5’端添加EcoRI酶切位点，在3’端添加Hind III酶切位点，克隆到pTT5载体，获得表达质粒。将表达质粒进行抽提，并转染Expi293细胞，分泌的上清通过Heparin肝素亲和柱(购自博格隆，AA0261)纯化，分别用100mM,200mM,300mM,500mM和1M的NaCl进行洗脱，经过SDS-PAGE检测收集200mM NaCl的洗脱产物，经过SEC-HPLC检测，确认为目的蛋白CFH-84。将CFH-84蛋白透析后保存在20mM Tris,500mM NaCl,pH8.0的溶液中。
用同样的方法，分别制备表达CFH-77、CFH-78、CFH-79、CFH-80、CFH-81、CFH-82、CFH-83核酸序列的质粒，转染Expi293细胞，纯化，洗脱，经SEC-HPLC检测检测蛋白浓度。
构建带有His标签克隆：CFH-13、CFH-48、CFH-49，His标签的引入是便于筛选与C3b结合活性较高的克隆(检测用Anti-His抗体)。经SEC-HPLC检测蛋白浓度。
其中，SEC-HPLC检测纯度的方法为：用PBS,pH7.2,10％IPA作为流动相，用Waters的分子筛(XBridge Protein BEH SEC Column,3.5μm,7.8mm X 300mm)，分别取30μL样品，浓度为1mg/mL上样分析。
CFH截短体蛋白产量的检测方法为：将1LHEK293细胞培养液最终表达纯化之后的蛋白，通过NanoDrop(Thermo Scientifics)检测A280吸收，得到蛋白的浓度，乘以蛋白的最终体积，最后得到的蛋白总量毫克数，即为蛋白的产量。
CFH截短体的产量、纯度检测结果如表2所示，CFH-79、CFH-84的蛋白产量、纯度优于其他克隆。
表2.CFH截短体的产量、纯度对比
编号 是否带His标签 产量(mg/L) 纯度
CFH-13 是 1.5 90％
CFH-25 是 7.2 88％
CFH-48 是 10.7 83％
CFH-49 是 11.8 74％
CFH-79 否 10.8 91％
CFH-84 否 17 92％
实施例2.CFH截短体的蛋白产量比较
对CFH-78、CFH-80、CFH-84的蛋白产量进行检测，检测方法：1L HEK293细胞培养液最终表达纯化之后的蛋白，通过NanoDrop(Thermo Scientifics)检测A280吸收，得到蛋白的浓度，乘以蛋白的最终体积，最后得到的蛋白总量毫克数，即为蛋白的产量。
CFH-78、CFH-80、CFH-84号分子的蛋白产量检测结果如表3所示。结果显示，CFH-84的蛋白产量高于CFH-80。实验结果表明，CFH-84分子内的半刚性连接子G4S-A(EAAAK)2A-G4S能够提高CFH截短体的蛋白产量。
表3.CFH截短体的产量对比
编号 是否带His标签 产量(mg/L)
CFH-78 否 5.7
CFH-80 否 5.8
CFH-84 否 17
实施例3.CFH截短体蛋白与C3b的亲和力检测
CFH最重要的作用就是对C3b具有负调控作用，具体来说，与固定在细胞表面的C3b结合后，能粘附到细胞表面，抑制C3bBb的形成。CFH与C3b主要通过两个结合位点相互作用，分别位于SCR1-4(结合完整的C3b)和SCR19-20(结合C3d部分)。使用ELISA实验检测CFH-48、CFH-49与C3b的结合，CFH-48、CFH-49号分子带有His标签，His标签的引入是便于筛选与C3b结合活性较高的克隆(检测用Anti-His抗体)。
1、实验方法
1)包被：用1×Elisa包被液(Solarbio，C1055)稀释包被抗体，C3b(CompTech，A114)浓度为6μg/mL，100μL/孔，4℃孵育过夜；
2)封闭：甩掉板中液体，以1×PBST清板5次后甩干液体，1％BSA(PBST洗液稀释)，100μL/孔，室温封闭1h；
3)上样：甩掉板中液体，以1×PBST清板5次后甩干液体，加入梯度稀释的CFH蛋白，蛋白起始浓度为40nM/20nM,2倍梯度稀释，11个稀释度，以1％BSA稀释，100μL/孔加入，室温孵育2h(22℃)；
4)加入抗His标签抗体(Proteintech,HRP-66005)：甩掉板中液体，以1×PBST清板5次后甩干液体，加入1：5000稀释的CFH抗体，1％BSA稀释，100μL/孔，室温孵育1h小时
5)显影：甩掉板中液体，以1×PBST清板5次后甩干液体，显影液提前平衡到室温，1：1配置完后，100μL/孔加入，置37℃避光放置5-30分钟，观察颜色出现明显梯度。
6)检测：50μL/孔加入终止液，于30min内测定450nm波长。
CFH-48、CFH-49与C3b的结合能力检测结果如表4所示。其中，与CFH-48相比，CFH-49对SCR的顺序进行了颠倒。实验结果显示，对SCR的顺序颠倒后，C3b结合活性提高了10倍，因此选择颠倒SCR顺序的CFH-49分子进行改造。
表4.CFH截短体与C3b的结合能力检测
编号 是否带His标签 C3b结合EC50(nM)
CFH-48 是 2.157
CFH-49 是 0.1998
实施例4.CFH截短体蛋白与C3b的亲和力检测
原理与方法与实施例3相同，唯一区别是使用的抗体不同，本实施例使用抗CFHSCR19的抗体(Biolegend，518503)通过Elisa的方法可以鉴定CFH截短体与CFH全长相比和C3b的结合能力，从而分析CFH-79和CFH-84的体外活性是否可以优于CFH-01全长。其中，CFH-01为不带有His标签的全长CFH蛋白。
实验结果如表5所示，CFH-79、CFH-84与C3b的结合能力分别是CFH全长的1.7倍和1.1倍，说明本公开中的CFH-79、CFH-84具有优异的C3b结合能力。
表5.CFH蛋白与C3b的结合能力检测结果
蛋白编号 是否带His标签 EC50(nM) 相对全长CFH提高倍数
CFH-01 否 60 /
CFH-79 否 35 1.7
CHF-84 否 54 1.1
实施例5.CFH截短体与MAA-BSA的亲和力检测
丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是一种常见的脂质过氧化产物，可在包括AMD在内的许多病理过程中积聚。丙二醛-乙醛-蛋白加合物(Malondialdehyde-acetaldehyde-BSAadduct,MAA-BSA)是MDA在体内的一种常见存在形式；CFH为主要的MDA结合蛋白，SCR7和SCR20是CFH和MDA/MAA的结合位点。CFH是血浆中主要的MDA结合蛋白，CFH与可溶性MAA-BSA的结合具有相似的效率。因此，通过检测CFH截短体蛋白与MAA-BSA的亲和力，能够模拟血浆内与MDA结合的效率，从而比较CFH截短体蛋白相较于全长CFH-01的体外活性。其中，CFH-01为不带有His标签的全长CFH蛋白。
1、实验方法
1)包被：用1×Elisa包被液(Solarbio,C1055)稀释(1：5000)包被抗体(Biolegend，518503，结合CFH蛋白SCR19,适用于所有带SCR19的CFH蛋白)，MAA-BSA浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃孵育过夜；(96孔板，Greiner bio-one，GN650061)
2)封闭：甩掉板中液体，以1×PBST清板5次后甩干液体，1％BSA(PBST洗液稀释)，100μL/孔，室温封闭1h；
3)上样：甩掉板中液体，以1×PBST清板5次后甩干液体，加入梯度稀释的CFH蛋白，蛋白起始浓度为40nM,2倍梯度稀释，11个稀释度，以1％BSA稀释，100μL/孔加入，室温孵育2h(22℃)；
4)加入CFH抗体(Biolegend，518503)：甩掉板中液体，以1×PBST清板5次后甩干液体，加入1：5000稀释的CFH抗体，1％BSA稀释，100μL/孔，室温孵育1h小时
5)显影：甩掉板中液体，以1×PBST清板5次后甩干液体，显影液提前平衡到室温，1：1配置完后，100μL/孔加入，置37℃避光放置5-30分钟，观察颜色出现明显梯度。
6)检测：50μL/孔加入终止液，于30min内测定450nm波长。
2、实验结果
如表6所示，CFH-80蛋白、CFH-83蛋白和CFH-84蛋白与MAA-BSA的结合能力都显著优于CFH-01全长蛋白(WT，不带His标签，由近岸公司合成，方法同CFH-79和CFH-84)。CFH-80、CFH-83与CFH-84均具有颠倒的SCR顺序，以及去除/降低糖基化的第二结构域，实验结果说明CFH分子中的SCR顺序颠倒，及第二结构域去除/降低糖基化后，CFH蛋白可以获得明显提高的与MAA-BSA的结合能力。
与CFH-77蛋白相比，CFH-79蛋白中具有颠倒的SCR排列顺序。实验结果显示，CFH-79与MAA-BSA的结合能力显著优于CFH-77，说明SCR顺序颠倒可以有效提高CFH截短体的体外活性。
CHF-83蛋白中的第一结构域与第二结构域由柔性连接子(G4S)3进行连接，第二结构域与第三结构域由半刚性连接子G4S-A(EAAAK)2A-G4S进行连接。实验结果显示，CHF-83蛋白与MAA-BSA的结合能力显著优于CFH-01全长蛋白，说明CFH截短体中可以选择不同的第一连接子与第二连接子进行连接。
表6.CFH蛋白与MAA-BSA的结合能力检测结果
蛋白编号 是否带His标签 EC50(nM) 相对全长CFH提高倍数
CFH-01 否 8.45 /
CFH-77 否 3.73 2.3
CFH-80 否 0.67 12.6
CHF-83 否 1.70 5.0
CHF-84 否 1.50 5.6
实施例6.CFH截短体与MAA-BSA的亲和力检测
使用实施例5中提供的MAA-BSA的亲和力检测方法，对CFH-77、CFH-79、CFH-82与MAA-BSA的结合能力进行检测。
CFH-77、CFH-79、CFH-82与MAA-BSA的结合能力检测结果如表7所示。实验结果显示，CFH-79与MAA-BSA的结合活性相对CFH-77的提高倍数为8.2，CFH-82与MAA-BSA的结合活性相对CFH-77的提高倍数为4.2。与CFH-77蛋白相比，CFH-79分子中具有颠倒的SCR排列顺序，说明SCR顺序颠倒可以有效提高CFH截短体的体外活性。与CFH-77蛋白相比，CFH-82在第二结构域中均具有突变的糖基化位点(对应SEQ ID NO:2所示序列中第50位的氨基酸突变：N50Q)，说明CFH截短体中第二结构域的去除/降低糖基化能够提高CFH截短体的体外活性。
表7.CFH蛋白与MAA-BSA的结合能力检测结果
蛋白编号 是否带His标签 相对CFH-77提高倍数
CFH-77 否 /
CFH-79 否 8.2
CFH-82 否 4.2
实施例7.CFH截短体抑制酵母多糖诱导的血清旁路补体途径激活能力检测
酵母多糖Zymosan是一种来自酵母细胞壁的碳水化合物，是研究补体活化的必要试剂。CFH可以抑制在Zymosan诱导之下对血清的旁路补体途径激活，而抑制效果可以通过C3b的降解来衡量。本实施例作为CFH蛋白补体作用方面的药效筛选实验，检测CFH截短体蛋白对酵母多糖诱导的血清旁路补体途径激活的抑制作用。具体可以通过对C3b的含量的检测从而反应CFH截短体以及全长分子对Zymosan诱导的血清旁路补体途径的抑制效果。
1、实验方法
1)包被:100μg/mL zymosan(Sigma-Aldrich，Z4250-250MG)包被于384孔板，50μL/孔，ELISA包被液(Solarbio,C1055)稀释，4℃过夜孵育；
2)封闭：甩掉板中液体，PBST洗板5次后甩干，2％BSA封闭，50μL/孔，室温封闭1h；
3)洗板：PBST洗板5次后甩干，后使用VBSMG(Veronal Buffered Saline with Mg++and EGTA，Tiandz，Inc.25-08020)缓冲液洗1次后甩干；
4)上样：加入使用VBSMG缓冲液稀释一定比例的正常人血清(Factor H-depletedhuman serum，Complement Technology，A337)，25μL/孔，室温反应1h；
5)终止：加入EDTA终止反应，终浓度为20mM；
6)加一抗：PBST洗板5次后甩干，分别加入浓度为5μg/mL的生物素-人C3b的一抗(小鼠抗人C3b抗体，ThermoFisher，A39257；Biotin，ThermoFisher，A39257)，15μL/孔，室温孵育1h，抗体使用2％BSA溶液稀释；
7)加二抗：PBST洗板5次后甩干，加入用2％BSA溶液稀释的Streptavidin(HRP)二抗，50μL/孔，室温孵育1h；
8)显影和检测：PBST洗板5次后甩干，加入显影液(显影液A和B液提前平衡到室温，1：1配置)，50μL/孔，室温避光反应，10分钟后加入终止液，50μL/孔，测定450nm波长。
2、实验结果
如表8所示，EC50表示是C3b浓度降低的活性，从而说明了CFH通过Zymosan诱导抑制了对补体旁路途径激活。CFH-79蛋白和CFH-84蛋白抑制酵母多糖诱导的血清旁路补体途径的能力都显著优于CFH全长蛋白，分别是全长活性的5.2倍和5倍，大大提高了对补体旁路途径激活的抑制。
与CFH-77蛋白相比，CFH-79具有颠倒的SCR顺序；与CFH-82相比，CHF-84具有颠倒的SCR顺序。实验结果显示，SCR排列顺序颠倒后，CFH截短体对补体旁路途径激活的抑制能力显著提高。
CFH-82、CFH-84蛋白的第二结构域中均具有糖基化位点的突变(对应SEQ ID NO:2所示序列中第50位的氨基酸突变：N50Q)。实验结果显示，CFH-82、CFH-84蛋白的对补体旁路途径的抑制活性相较CFH全长有显著提高，说明第二结构域的去除/降低糖基化可以明显提升CFH截短体抑制补体旁路途径激活的能力。
表8.CFH蛋白抑制酵母多糖诱导的血清旁路补体途径激活的能力检测结果
实施例8.CFH截短体蛋白在CNV模型小鼠的体内药效实验
本实施例针对CFH-79蛋白、CFH-84蛋白对激光光凝诱导的小鼠脉络膜新生血管药效进行检测，使用CFH-01(CFH全长蛋白，近岸蛋白公司合成)作为阳性对照。激光诱导脉络膜新生血管(Laser-induced choroidal neovascularization，CNV)小鼠模型已广泛应用于渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD)的研究。这个活体实验模型依靠激光损伤穿透Bruch膜，导致视网膜下血管脉络膜募集。给药前和给药后分别对每眼光斑渗透评分，在给药7-10天以后，可以通过三级光斑的比例以及光斑渗透改善率，考察CFH-79、CFH-84分子相对全长CFH-01对于小鼠光斑渗透率的改善效果。
1、实验方法
1)造模和给药：在造模前，对小鼠(购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，种数与品系C57BL/6J小鼠)进行一般眼科检查，将眼前节、眼底无明显异常的小鼠纳入试验。采用双眼眼底激光诱导脉络膜新生血管(Laser-induced choroidal neovascularization，CNV)造模，计划每眼光凝数(每眼重度荧光光斑个数)为3个。具体来说，首先进行散瞳，即动物双眼各滴0.5％复方托吡卡胺滴眼液1～2滴；之后进行麻醉--先肌肉注射舒泰50(50mg/kg，50mg/mL)，再肌肉注射盐酸赛拉嗪注射液(2mg/mL，1mg/kg)对动物进行全身麻醉；最后是激光，即动物实验眼滴卡波姆滴眼液，眼前放置眼底激光镜，看清眼底，距离视盘约1.5-2PD处围绕视乳头进行光凝。激光参数为：波长532nm，功率200mW，光斑直径50μm，曝光时间100ms。激光后动物双眼涂氧氟沙星眼膏，动物苏醒前放保温毯上维持体温，做好人员看护，苏醒后放回笼中。7天以后挑选有中、重度荧光渗漏光斑的小鼠入组，根据光斑渗漏平均分进行分组，分为4组，每组6只。按照表9中的分组进行给药。具体来说，将麻醉后的小鼠侧卧于操作台上，用聚维酮碘棉球消毒眶周皮肤，用生理盐水冲洗结膜囊，充分暴露眼球，选择眼睛颞上或鼻上角巩膜缘后1～2mm为注射进针处。用一次性胰岛素针与巩膜成小角度行巩膜穿刺，形成通道，更换33G微量注射器刺入玻璃体腔给药，停顿10秒后缓慢拔针，用无菌棉球轻压进针口10秒，涂氧氟沙星眼膏(每天2次，连续3天)。动物苏醒前放保温毯上维持体温，做好人员看护，苏醒后放回笼中。
表9.CNV模型小鼠的给药方案
注：所有小鼠在造模后即刻(D0，只进行FP)、D7和D10进行眼底照相(FundusPhotography，FP)和眼底血管荧光造影(Fundus Fluorescein Angiography，FFA)检查。即在激光光凝和给药后，通过视网膜成像显微镜采用FFA来确定光斑渗漏的情况并进行评级。眼底荧光血管造影检测前，小鼠需要静脉注射给予荧光素钠注射液(10％，0.02mL/只)。FFA每2-5分钟采集影响，通过影像进行光斑荧光渗漏评级，从而对比给药前后小鼠光斑渗透是否得到改善。
2)分析指标：对比造影早期(1.5min内)、晚期(大于3min)的FFA图片，根据造影晚期激光光斑有无荧光渗漏判断是否有CNV生成，根据荧光渗漏程度对小鼠CNV程度进行评级，并计算各级渗漏光斑的比率及光斑渗漏平均分。
光斑荧光渗漏评级标准为：0级(无荧光渗漏)，1级(轻度荧光渗漏，渗漏面积为激光光斑大小的1％～50％)，2级(中度荧光渗漏，渗漏面积为激光光斑大小的50％～100％)，3级(重度荧光渗漏，渗漏面积大于激光光斑大小)。
各级光斑比率(％)＝对应级别光斑总数/4种光斑总数(即有效光斑数)×100％；
光斑渗漏平均分＝[(0级光斑数×0)+(1级光斑数×1)+(2级光斑数×2)+(3级光斑数×3)]/4种光斑总数(即有效光斑数)，其中，有效光斑是指其附近无严重视网膜前、下出血且在荧光造影中能完整显示的光斑。
3)数据处理：采用统计学软件SPSS13.0对数据进行处理。所有统计分析采用双尾分析，统计学水平设在p≤0.05。计算不同组别动物的光斑渗漏平均分、各级荧光渗漏光斑比率等指标的均值(Mean)和标准差(SD)。
2、实验结果
如图3所示，CFH-01全长蛋白与本公开的CFH-79蛋白和CFH-84蛋白在给药后第7天和第10天对于小鼠CNV模型光斑渗透改善率都有明显的作用。
给药7天和10天后，实验组CFH-01、CFH-79和CFH-84都相对于对照组PBS有明显的三级光斑数减少的趋势，给药10天后，实验组CFH-84(2.5mg/mL)三级光斑全部消失(表10)。CFH-01和CFH-84都相对于对照组PBS有明显的光斑渗透率有明显改善，并且CFH-84(2.5mg/mL)具有高于CFH-01(2.5mg/mL)的平均改善率(表11)。
表10.第0、7、10天的三级光斑数量及比例
表11.第0、7、10天的光斑渗透平均改善率
蛋白编号(样品浓度) 第7天平均改善率 第10天平均改善率
CFH-01(2.5mg/mL) 39.37 48.79
CHF-84(2.5mg/mL) 50.51 55.47
PBS，pH7.2 10.07 19.81
。

Claims (10)

1.一种重组补体因子H(CFH)多肽，其中，所述重组补体因子H多肽从N末端向C末端依次包括第一结构域，与所述第一结构域可操作地连接的第二结构域，以及与所述第二结构域可操作地连接的第三结构域；
所述第一结构域包含来自补体因子H的短同源重复序列(SCR)1、2、3、4中的一个或多个，
所述第二结构域包含来自补体因子H的短同源重复序列(SCR)17、18、19、20中的一个或多个，
所述第三结构域包含来自补体因子H的短同源重复序列(SCR)6、7、8中的一个或多个；
优选地，所述第一结构域选自如下1)-2)中的任一项或其任意组合：1)SCR(1-3)，2)SCR(1-4)；
所述第二结构域选自如下3)-5)中的任一项或其任意组合：3)SCR(17-20)，4)SCR(18-20)，5)SCR(19-20)；
所述第三结构域选自如下6)-9)中的任意一项或其任意组合：6)SCR7，7)SCR(6-7)，8)SCR(6-8)，9)SCR(7-8)；
更优选地，所述重组补体因子H多肽从N末端向C末端依次包括：SCR(1-4)，与所述SCR(1-4)可操作地连接的SCR(18-20)，与所述SCR(18-20)可操作地连接的SCR(6-8)。
2.根据权利要求1所述的重组补体因子H多肽，其中，所述重组补体因子H多肽是糖基化的、去除糖基化的或降低糖基化的；
优选地，所述重组补体因子H多肽包含降低或去除糖基化的突变；
优选地，所述降低或去除糖基化的突变选自如下至少一个：第439位或第1077位，所述氨基酸突变位点是相对于SEQ ID NO:13所示序列的自然顺序位点；
更优选地，所述降低或去除糖基化的突变为1077Q。
3.根据权利要求1或2所述的重组补体因子H多肽，其中，所述第一结构域通过第一连接子与所述第二结构域可操作地连接，和/或，所述第二结构域通过第二连接子与所述第三结构域可操作地连接，所述第一连接子与所述第二连接子相同或不同；
优选地，其中，所述第一连接子与所述第二连接子彼此独立地选自：
1)(G)m、(GS)m、(G2S)m、(G3S)m、(G4S)m、(GAP)m、(ASGS)m、(GpSq)m、(GGNGT)m、(YGNGT)m、(GpSq)nA(EAAAK)tA(GpSq)n或(GpSq)n(EAAAK)t(GpSq)n；
其中，m选自1-20的任一整数，n为1-8的任一整数；p选自1-7的任一整数，q选自1-7的任一整数，且p+q≤8；t选自1-6的任一整数；
2)所述第一连接子与所述第二连接子彼此独立地选自(G4S)m、
(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n或(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n；
其中，m选自1-8的任一整数，n为1-6的任一整数，t选自1-6的任一整数；或
3)(G4S)3，G4SA(EAAAK)2AG4S或G4S(EAAAK)2G4S；
优选地，所述第一连接子、第二连接子为(G4S)3；或者，所述第一连接子、第二连接子为G4SA(EAAAK)2AG4S；或者，所述第一连接子为(G4S)3，所述第二连接子为G4SA(EAAAK)2AG4S；或者，所述第一连接子为G4SA(EAAAK)2AG4S，所述第二连接子为(G4S)3。
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组补体因子H多肽，其从N末端向C末端具有如下式(I)所示的结构：
第一结构域-第一连接子-第二结构域-第二连接子-第三结构域式(I)，
其中，第一结构域选自SCR(1-3)或SCR(1-4)，第二结构域选自SCR(17-20)、SCR(18-20)或SCR(19-20)，第三结构域选自SCR7、SCR(6-7)、SCR(6-8)或SCR(7-8)；
第一连接子和第二连接子彼此独立地选自如下任意一种：(G)m、(GS)m、(G2S)m、(G3S)m、(G4S)m、(GAP)m、(ASGS)m、(GpSq)m、(GGNGT)m、(YGNGT)m、(GpSq)nA(EAAAK)tA(GpSq)n或(GpSq)n(EAAAK)t(GpSq)n；
其中，m选自1-20的任一整数，n为1-8的任一整数；p选自1-7的任一整数，q选自1-7的任一整数，且p+q≤8；t选自1-6的任一整数；
优选地，所述重组补体因子H多肽从N末端向C末端具有如下任意一种结构：
SCR(1-4)-(G4S)m-SCR(18-20)-(G4S)m-SCR(6-8)，
SCR(1-4)-(G4S)n(EAAAK)t(G4S)n-SCR(18-20)-(G4S)n(EAAAK)t(G4S)n-SCR(6-8)，
SCR(1-4)-(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n-SCR(18-20)-(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n-SC R(6-8)，
SCR(1-4)-(G4S)m-SCR(18-20)-(G4S)nA(EAAAK)tA(G4S)n-SCR(6-8)；
其中m选自1-8的任一整数，n为1-6的任一整数，t选自1-6的任一整数；
更优选具有如下任意一种结构：
SCR(1-4)-(G4S)3-SCR(18-20)-(G4S)3-SCR(6-8)，或者，
SCR(1-4)-G4SA(EAAAK)2AG4S-SCR(18-20)-G4SA(EAAAK)2AG4S-SCR(6-8)；
优选地，所述的重组补体因子H多肽，其包含选自SEQ ID NO:14-15、19、23、26任一项所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:14-15、19、23、26任一项所示序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
优选地，所述重组补体因子H多肽进一步包含信号肽，所述信号肽包含如SEQ ID NO:27或28所示的氨基酸序列；
优选地，包含所述信号肽的重组补体因子H多肽包含选自SEQ ID NO:29-32任一项所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的重组补体因子H多肽，其中，所述重组补体因子H多肽具有补体因子H活性，和/或补体调节活性；
优选地，所述补体调节活性为补体旁路途径调节活性；
优选地，所述补体调节活性为抑制补体激活的活性；
优选地，所述重组补体因子H多肽与野生型补体因子H相比，具有提高的补体因子H活性，和/或提高的补体调节活性。
6.一种DNA分子，其中，所述DNA分子编码如权利要求1-5任一项所述的重组补体因子H多肽。
7.一种载体，其中，所述载体包含如权利要求6所述的DNA分子。
8.一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞表达如权利要求1-5任一项所述的重组补体因子H多肽，或者所述宿主细胞包含如权利要求6所述的DNA分子或如权利要求7所述的载体。
9.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括如下至少一种：如权利要求1-5任一项所述的重组补体因子H多肽，如权利要求6所述的DNA分子，如权利要求7所述的载体；
优选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受地辅料。
10.如权利要求1-5任一项所述的重组补体因子H多肽，如权利要求6所述的DNA分子，或如权利要求7所述的载体在如下(i)-(iii)至少一项中的用途：
(i)抑制补体激活，或制备用于抑制补体激活的药物；
(ii)用于预防或治疗与补体相关的疾病，或制备用于预防或治疗与补体相关的疾病的药物；
(iii)用于治疗患有将受益于补体激活被抑制的疾病的受试者，或制备用于治疗患有将受益于补体激活被抑制的疾病的受试者的药物；
优选地，所述与补体相关的疾病为视网膜病变；
更优选地，所述视网膜病变为黄斑变性；
更优选地，所述视网膜病变为年龄相关性黄斑变性(AMD)。
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