JP2023523771A - Ｐｄ－１に対する改善された親和性を有するｐｄ－ｌ１変異体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むPD-L1ポリペプチドに関し、ここで、ポリペプチドは、少なくともアミノ酸位置Y56およびP76でのアミノ酸置換を担持し、アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく。本発明はまた、上記のPD-L1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれに関連する宿主細胞、方法、および使用にも関する。【選択図】なし
Description
本発明は、配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むPD-L1ポリペプチドに関し、ここで、ポリペプチドは、少なくともアミノ酸位置Y56およびP76でのアミノ酸置換を担持し、ここで、アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく。本発明はまた、上記PD-L1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれに関連する宿主細胞、方法、および使用にも関する。
敗血症は、全身が感染に対して反応する際に生じ得る、生命を脅かす病気である。徹底的な研究にもかかわらず、敗血症は、集中治療室での死亡率の第3の主な原因であり続けている。病態生理学的には、敗血症の進行中に、最初の過剰炎症（hyper-inflammatory）期があり、これが、部分的には並行して起こる低炎症（hypo-inflammatory）段階の発症を引き起こす（Vincent, et al. (2013) Lancet 381:774-775）。
近年の療法アプローチは、炎症性メディエーターの放出を制限するか、それらの機能を遮断するか、または循環からそれらを除去するための、過剰炎症性応答の治療に主に焦点が当てている。1つの最も有望な候補である、その阻害がげっ歯類モデルでの敗血症生存率を顕著に改善することが示されたものは、TNFαであった。中和抗体を用いて、このアプローチは、対ヒトに転換されたが、敗血症生存率を改善することはできなかった（Reinhart et al. (2001) Crit Care Med 29:765-769）。免疫刺激を遮断することにより、過剰炎症を制限し、大多数の患者はこの期間を生き延びるが；しかしながら、前炎症性免疫応答を遮断することにより、一次および二次感染と闘いかつこれを制御する宿主の能力が低減されるので、この療法アプローチは、敗血症生存率を顕著に改善することに最終的に失敗したが、低炎症期を引き起こすかまたは促進した。この免疫抑制は、多くの場合、多臓器障害症候群（MODS）および患者の死亡を引き起こす（Otto et al. (2011) Crit Care 15:R183）。異なるアプローチでは、ヒトPD-L1ポリペプチドの細胞外部分のFc-融合タンパク質が、敗血症の間の臓器不全の治療および予防のために提供された（国際公開第2017/029389号A1）。
免疫まひの患者を救出するための治療アプローチもまた適用されてきた。単球が不活性化されることを考慮して、GM-CSF治療は、敗血症の間の単球機能を回復させた（Meisel et al. (2009) Am J Respir Crit Care Med 180:640-648）。それにもかかわらず、敗血症の複数の原因を有する由来、様々な既存の合併症、または患者の遺伝的前提条件に起因して、適切な患者特異的治療は、未だ達成することが困難である（Hotchkiss and Opal (2010) N Engl J Med 363:87-89）。
一般的に、疾患重症度は、患者で敗血症が診断されるときには既にはるかに進行しており、敗血症進行中の比較的後期の事象である肝臓損傷が既に起こっている。敗血症の間には、多くの場合に多臓器障害症候群（MODS）が後続する臓器不全は、しばしば、患者の死亡をもたらす。したがって、臓器損傷につながるメカニズムの理解が、既に存在する治療選択肢を改善するかまたは新規療法アプローチを提示するために必須である。
敗血症で臓器損傷をもたらすプロセスは、宿主細胞に対する攻撃を開始する細胞傷害性T細胞（CTL）の望ましくない自己免疫活性化である。細胞傷害性T細胞の活性化は、緊密に調節されるプロセスであり、複数のシグナル伝達事象が同時に起こることを必要とする。健康な状況では、主要組織適合性複合体1（MHC-1）に結合するT細胞受容体（TCR）または上皮細胞上でPD-1リガンド1（PD-L1）に結合するプログラムされた細胞死-1（PD-1）などの免疫シナプスでの結合事象が、CTLの活性化を調節する。しかしながら、CTLによる炎症性応答を引き起こす感染の間に、上皮細胞は、数種類の変化を受ける。例えば、感染細胞上でのMHC-Iタンパク質に対する非自己ペプチドの提示がCTLを活性化し、これが、感染組織の迅速な破壊を引き起こす。CTLの活性化に対する別の例は、宿主細胞の表面上でのPD-L1の不在であり、これは、それらの環境での細菌性毒素の存在により、他の因子の間で引き起こされる。Toll様受容体の認識を介して、これらの細菌性毒素が食細胞NADPHオキシダーゼ（NOX2）の発現を誘導し、これにより、細胞質中での反応性酸素分子種（ROS）レベルの増加および細胞表面からのPD-L1の除去がもたらされる（von Knethen et al. (2019), Theranostics 9(7):2003）。これらのプロセスの両方が、正常な感染中に罹患細胞を除去するために必須である一方で、特にPD-L1の欠損は、大型臓器の大量感染、または身体組織の大きな部分の細菌感染中には問題になる。続いて、臓器が、感染することなく患者自身の免疫応答により攻撃され、これが永続的な傷害または、最悪のケースでは臓器不全および死亡を引き起こす。
Vincent, et al. (2013) Lancet 381:774-775
Reinhart et al. (2001) Crit Care Med 29:765-769
Otto et al. (2011) Crit Care 15:R183
Meisel et al. (2009) Am J Respir Crit Care Med 180:640-648
Hotchkiss and Opal (2010) N Engl J Med 363:87-89
von Knethen et al. (2019), Theranostics 9(7):2003
したがって、例えば、特に敗血症の間の臓器不全の治療および/または予防のための、特にCTLの表面上での、PD-1シグナル伝達の調節のための改善された手段および方法に対する強いニーズがある。
本発明の基礎となる技術的課題は、上述の必要性に応じるための手段および方法の提供として見ることができる。技術的課題は、本明細書中の以下で特許請求の範囲および実施形態に特徴付けられる実施形態により解決される。
したがって、本発明は、配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むPD-L1ポリペプチドに関し、ここで、
(I) ポリペプチドは、以下の位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76、I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所でのアミノ酸置換を担持し、ポリペプチドが位置Y56、C113またはI115でのアミノ酸置換を含む場合、ポリペプチドは、上記置換のうちの少なくとも1つをさらに担持し；ここで、アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づき；
(II) ポリペプチドは、少なくともアミノ酸位置Y56およびP76でのアミノ酸置換を担持し、ここで、アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づき；かつ/または
(III) ポリペプチドは、第1のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換；ならびに第2のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換を担持し、ここで、アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく。
(I) ポリペプチドは、以下の位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76、I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所でのアミノ酸置換を担持し、ポリペプチドが位置Y56、C113またはI115でのアミノ酸置換を含む場合、ポリペプチドは、上記置換のうちの少なくとも1つをさらに担持し；ここで、アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づき；
(II) ポリペプチドは、少なくともアミノ酸位置Y56およびP76でのアミノ酸置換を担持し、ここで、アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づき；かつ/または
(III) ポリペプチドは、第1のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換；ならびに第2のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換を担持し、ここで、アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく。
一般的に、本明細書中で用いられる用語は、当業者にとって通常かつ慣用のそれらの意味を与えられ、かつ、別途示されない限り、特殊または専用の意味に限定されない。以下で用いられる場合、用語「有する(have)」、「含む(comprise)」もしくは「挙げられる(include)」またはそのいずれかの任意の文法的変形は、非排他的な様式で用いられる。つまり、これらの用語は、これらの用語により導入される特徴の他に、さらなる特徴がこの文脈で記載される実体の中に存在しない状況および1種以上のさらなる特徴が存在する状況の両方を意味し得る。例として、表現「AはBを有する」、「AはBを含む」および「AとしてはBが挙げられる」は、Bの他に、他の要素がAの中に存在しない状況（すなわち、Aが唯一かつ排他的にBからなる状況）および、Bの他に、要素C、要素CおよびDまたはまたさらなる要素などの1種以上のさらなる要素が実体Aの中に存在する状況の両方を意味し得る。また、当業者により理解される通り、表現「1つの～を含むこと」（「comprising a」および「comprising an」）は、好ましくは、「1つ以上の～を含むこと」を意味し、すなわち、「少なくとも1つの～を含むこと」と等価である。
さらに、以下で用いられる場合、用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「特に」、「より詳細には」、「具体的には」、「より具体的には」または類似の用語は、さらなる可能性を制限することなく、任意選択的な特徴と併せて用いられる。つまり、これらの用語により導入される特徴は、任意選択的な特徴であり、かつどのようにも特許請求の範囲を制限することは意図されない。本発明は、当業者が認識するであろう通り、代替的な特徴を用いることにより実行することができる。同様に、「一実施形態では」または類似の表現により導入される特徴は、本発明のさらなる実施形態に関するいかなる制限も伴わずに、本発明の範囲に関するいかなる制限も伴わずに、かつそのようにして導入される特徴を本発明の他の任意選択的または非任意選択的特徴と組み合わせる可能性に関するいかなる制限も伴わずに、任意選択的な特徴であることが意図される。
本明細書中で用いる場合、用語「標準条件」は、別途記載されない場合、IUPAC標準環境温度と圧力（SATP）条件、すなわち、好ましくは、25℃の温度および100kPaの絶対圧力に関し；また好ましくは、標準条件は、7のpHを含む。さらに、別途示されない場合、用語「約」は、関連する分野での通常許容される技術的精度を伴う示される値に関し、好ましくは、示される値±20％、より好ましくは±10％、最も好ましくは±5％に関する。さらに、用語「本質的に」は、示される結果または使用に対する影響を有する逸脱が存在せず、すなわち、考えられる逸脱が、示される結果が±20％、より好ましくは±10％、最も好ましくは±5％超まで逸脱することを引き起こさないことを示す。つまり、「本質的に～からなる」とは、明記される構成要素を含むが、不純物として存在する物質、構成要素を提供するために用いられるプロセスの結果として存在する不可避物質、および本発明の技術的効果を達成する以外の目的のために添加される構成要素を除いて、他の構成要素を除外することを意味する。例えば、語句「本質的に～からなる」を用いて規定される組成物は、いずれかの公知の許容可能な添加剤、賦形剤、希釈剤、担体などを包含する。好ましくは、本質的に構成要素の組からなる組成物は、5重量％未満、より好ましくは3重量％未満、さらにより好ましくは1重量％未満、最も好ましくは0.1重量％未満の明記されない構成要素を含むであろう。
2つの生物学的配列、好ましくは、DNA、RNA、またはアミノ酸配列間での同一性の程度（例えば、「％同一性」として表わされる）は、当技術分野で周知のアルゴリズムにより決定することができる。好ましくは、同一性の程度は、比較ウインドウにわたる2つの最適にアライメントされた配列を比較することにより決定され、ここで、比較ウインドウ中の配列の断片は、最適アライメントのために比較される配列と比較した場合に、付加または欠失（例えば、ギャップまたはオーバーハング）を含むことができる。パーセンテージは、好ましくは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長にわたって、同一残基が両方の配列中に存在する位置の個数を決定し、それにより一致する位置の個数を得て、比較ウインドウ中の位置の総数により一致した位置の個数を除算し、かつ結果に100を乗算して、配列同一性のパーセンテージを得ることにより、算出される。比較のための配列の最適アライメントは、Smith and Waterman（1981）の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch（1970）の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman（1988）の類似性に対する検索法により、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI中のGAP、BESTFIT、BLAST、PASTA、およびTFASTA）のコンピューター実装により、または目視検査により、行うことができる。2つの配列が比較のために特定されていると仮定すると、GAPおよびBESTFITが、好ましくは、それらの最適アライメントおよび、したがって、同一性の程度を決定するために用いられる。好ましくは、ギャップ重みに対して5.00およびギャップ重み長に対して0.30のデフォルト値が用いられる。本明細書中で参照される生物学的配列の文脈では、用語「本質的に同一な」は、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の％同一性値を示す。理解されるであろう通り、用語「本質的に同一な」は、100％同一性を含む。上記は、用語「本質的に相補的な」に準用される。
生物学的巨大分子の、好ましくはポリヌクレオチドまたはポリペプチドの用語「断片」は、示される配列、構造および/または機能を含むそれぞれの生物学的巨大分子の、いずれかの下位部分、好ましくは下位ドメインに関連する広い意味で、本明細書中で用いられる。つまり、この用語は、生物学的巨大分子の実際の断片化により生成される下位部分を含むが、抽象的な様式で、例えば、in silicoで、それぞれの生物学的巨大分子から誘導される下位部分も含む。つまり、本明細書中で用いる場合、FcまたはFab断片、例えば、単鎖抗体、二重特異的抗体、およびナノボディもまた、免疫グロブリンの断片として参照することができる。
本明細書中で別途具体的に示されない限り、特定される化合物、特にPD-L1ポリペプチドは、より大きな構造中に含めることができ、例えば、担体分子、遅延剤、および他の賦形剤に共有的または非共有的に連結することができる。特に、特定されるポリペプチドは、例えば、精製および/または検出のためのタグとして、リンカーとして機能し得るか、または化合物のin vivo半減期を延長するための、さらなるペプチドを含む融合ポリペプチド中に含めることができる。用語「検出可能タグ」とは、融合ポリペプチドに付加または導入されるアミノ酸の伸長部を意味し；好ましくは、タグは、本発明の融合ポリペプチドに対してC末端またはN末端に付加される。そのようなアミノ酸の伸長部は、好ましくは、タグを特異的に認識する抗体による融合ポリペプチドの検出を可能にするか；または好ましくは、キレーターなどの機能的コンホメーションの形成を可能にするか；または好ましくは、例えば、蛍光タグの場合、可視化を可能にする。好ましい検出可能タグは、Mycタグ、FLAGタグ、6-Hisタグ、HAタグ、GSTタグまたは蛍光タンパク質タグ、例えば、GFPタグである。これらのタグは、すべて当技術分野で周知である。好ましくは融合ポリペプチド中に含められる他のさらなるペプチドは、分泌の媒介因子として、血液脳関門通過の媒介因子として、細胞浸透性ペプチドとして、および/または免疫刺激剤として機能し得る、さらなるアミノ酸または他の修飾を含む。それに対してポリペプチドを融合することができるさらなるポリペプチドまたはペプチドは、シグナルおよび/または輸送配列、例えば、IL-2シグナル配列、リンカー配列、例えば、GSRS（配列番号25）ペプチドリンカーである。
用語「ポリペプチド」は、本明細書中で用いる場合、ペプチド結合により互いに共有結合している数個、典型的には少なくとも20個のアミノ酸からなる分子を意味する。ペプチド結合により共有結合した20個未満のアミノ酸からなる分子は、通常、「ペプチド」であると考えられる。好ましくは、ポリペプチドは、50～1000個、より好ましくは75～1000個、さらにより好ましくは100～500個、最も好ましくは110～400個のアミノ酸を含む。好ましくは、ポリペプチドは、融合ポリペプチドおよび/またはポリペプチド複合体中に含められる。
本説明に従う「融合ポリペプチド」とは、ペプチド結合の連続的な鎖に含められる、少なくとも2種のポリペプチドまたはペプチドから構成されるポリペプチドを意味する。つまり、融合ポリペプチドは、好ましくは、単一の発現構築物から、より好ましくは単一のオープンリーディングフレームから、in vivoで発現可能である。好ましくは、融合タンパク質は、少なくとも、PD-L1ポリペプチドおよび少なくとも1種のさらなるペプチドまたはポリペプチド、好ましくはそれが含められる融合ポリペプチドのin vivo半減期を延長するポリペプチドを含み；好適なポリペプチドは、本明細書中の他の箇所に記載される。しかしながら、融合ポリペプチドは、2種、3種、4種、5種もしくはさらに多くの追加的ポリペプチドまたはペプチド部分、例えば、シグナル配列、リンカー、ヒンジ領域、および/またはin vivo半減期を延長するポリペプチドを含むことができる。融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからin vivoで発現させることができ、ポリヌクレオチドは、例えば、化学的にまたは組み換えDNA技術により合成することができ、かつ適切な発現系で発現させることができる。その後、発現された融合ポリペプチドを、発現系から精製することができる。
用語「ポリペプチド複合体」は、本明細書中で用いる場合、ペプチド結合を介して連結されていない、少なくとも2種のポリペプチドおよび/またはペプチドを含むいずれかの化合物に関する。つまり、融合ポリペプチド中のポリペプチドおよび/またはペプチドは、共有結合、特にジスルフィド結合を介して、または非共有的に、特に、イオン結合、水素結合および/もしくはファンデルワールス力を介して、例えば、親和性結合で、連結することができる。リガンドおよび受容体部分を含む様々な親和性結合システムが当業者に公知であり、さらなる面倒なしに、可逆的に互いに結合した異なるペプチドまたはポリペプチド部分を含むポリペプチドの親和性ペアの構築を可能にする。そのような親和性結合システムの典型的な例は、抗体/抗原、ストレプトアビジン/ビオチン、アビジン/ビオチン、および当技術分野で周知のその他に基づくものである。好ましくは、ポリペプチド複合体は、少なくともPD-L1ポリペプチドおよび少なくとも1種のさらなるペプチドまたはポリペプチド、好ましくはそれが含められる融合ポリペプチドのin vivo半減期を延長するポリペプチドを含み；好適なポリペプチドは、本明細書中の他の箇所に記載される。
用語「PD-L1ポリペプチド」は、本明細書中で用いる場合、配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むポリペプチドに関し；さらに、PD-L1ポリペプチドは、上記で示される配列番号6の配列と比較したアミノ酸置換のうちの少なくとも1つまたはアミノ酸置換の組み合わせを含む。当業者が理解する通り、アミノ酸配列の文脈での用語「置換」は、非同一アミノ酸によるアミノ酸の置き換えに関する。当業者が理解するであろう通り、本明細書中で参照されるPD-L1ポリペプチドの基礎となる構造は、好ましくは、PD-L1タンパク質の公知の構造、好ましくはヒトPD-L1タンパク質（Genbank登録番号NP_054862.1、配列番号26）および/またはマウスPD-L1タンパク質（Genbank登録番号ADK70950.1、配列番号6、好ましくは配列番号3の配列によりコードされる）から誘導される。したがって、PD-L1ポリペプチド内のアミノ酸位置のすべての指示は、上記で特定されるマウスPD-L1（配列番号6）のアミノ酸配列に対して提供される。これもまた当業者が理解するであろう通り、より多いかまたは少ないアミノ酸を有するPD-L1ポリペプチド中の対応する位置は、好ましくは本明細書中の上記で特定される配列番号6を有するPD-L1ポリペプチドをアライメントすることにより、好ましくは決定される。PD-L1ポリペプチドは、PD-1、好ましくはヒトPD-1（Genbank登録番号NP_005009.2）および/またはマウスPD-1（Genbank登録番号NP_032824.1）に結合する生物学的活性を有する。好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、完全タンパク質のアミノ酸31～150を含むマウスPD-1の組み換え断片に結合する生物学的活性を有する。好ましくは、PD-L1ポリペプチドとPD-1との間、好ましくはマウスPD-L1の上記の組み換え断片の結合性のKdは、最大50nM、より好ましくは最大20nM、さらにより好ましくは最大10nM、またさらに好ましくは最大7.5nM、またさらに好ましくは最大5nM、最も好ましくは最大2.5nMである。実施例で本明細書中により詳細に開示される通り、例えば、融合ポリペプチド中の、さらなるポリペプチドの存在が、PD-L1ポリペプチドの親和性に影響する場合があり；つまり、上記のKd値は、好ましくは、野生型PD-L1のアミノ酸18～132、好ましくは配列番号4に対応するペプチドに関して決定される。好ましくは、PD-L1ポリペプチドはさらに、敗血症により誘導される細胞傷害性T細胞を阻害する活性を有し；また好ましくは、PD-L1ポリペプチドはさらに、敗血症により引き起こされる活性化に対する被験体体内の細胞傷害性T細胞での長期的な寛容を誘導する活性を有する。好ましい実施形態では、PD-L1ポリペプチドは、白血球、好ましくはT細胞によるIFN-γおよび/またはTNF-α分泌を低減させ、より好ましくは妨げる活性を有する。好ましい実施形態では、PD-L1ポリペプチドは、T細胞、好ましくはCD4+および/もしくはCD8+T細胞によるIFN-γ分泌；および/またはマクロファージによるTNF-α分泌を低減させ、より好ましくは妨げる活性を有する。さらなる好ましい実施形態では、PD-L1ポリペプチドは、PD-1アゴニスト、好ましくは、野生型PD-L1と比較してPD-1に対する増大した親和性を有するPD-1アゴニストである。
PD-L1ポリペプチドは、上記で特定される第1のアミノ酸配列および第2のアミノ酸配列を少なくとも含む。好ましくは、第1のアミノ酸配列は、配列番号8に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％同一であり、かつ/または第2のアミノ酸配列は、配列番号10に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％同一である。最も好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、本明細書中で特定されるアミノ酸置換（1箇所または複数）を含む、配列番号7および配列番号8から選択される第1のアミノ酸配列、および配列番号9および配列番号10から選択される第2の配列を少なくとも含む。理解されるであろう通り、上記の第1および第2のアミノ酸配列は、ヒトおよび/またはマウスPD-L1タンパク質から誘導可能である。つまり、PD-L1ポリペプチドは、好ましくは、当該PD-L1タンパク質から誘導可能なさらなる配列、特に、ヒトおよび/またはマウスPD-L1タンパク質中の上記の第1および第2のアミノ酸配列を連結する配列に対して少なくとも70％同一な配列、すなわち、ヒトPD-L1タンパク質のアミノ酸77～112に対して少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含む。しかしながら、第1および第2のアミノ酸配列が、PD-L1タンパク質から誘導可能でない配列、例えば、適切なリンカーペプチドを介して連結されることもまた想定される。それにもかかわらず、好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、ヒトPD-L1のアミノ酸18～132、すなわち、配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。より好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、本明細書中の他の箇所で特定される置換を含む、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。理解されるであろう通り、表現「PD-L1ポリペプチドが、本明細書中の他の箇所で特定される置換を含む、アミノ酸配列Xを含む」は、PD-L1ポリペプチドが、本質的にアミノ酸配列Xを含むが、示される置換を含むこと、すなわち、好ましくは、PD-L1ポリペプチドが、示された位置のアミノ酸が置換性アミノ酸により置き換えられていること以外は、アミノ酸配列Xを含むという事実に関する。
本明細書中で特定されるPD-L1ポリペプチドは、以下の位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76、I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所でのアミノ酸置換を担持し、ここで、ポリペプチドが位置Y56、C113、またはI115でのアミノ酸置換を含む場合、ポリペプチドは、上記の置換のうちの、すなわち、V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76、I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125からなるリストからの置換から選択される少なくとも1箇所をさらに担持する。より好ましくは、ポリペプチドが位置Y56、Q63、A69、P76、C113、またはI115でのアミノ酸置換を含む場合、ポリペプチドは、上記の置換のうちの少なくとも1箇所をさらに担持する。より好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、位置Y56および/またはP76での、より好ましくは位置Y56およびP76での少なくとも1箇所のアミノ酸置換を含む。また好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、アミノ酸位置V54、Q66、V68、A69および/またはI115のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのさらなる置換を担持する。より好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、第1のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1箇所のアミノ酸置換；ならびに第2のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換を担持する。好ましくは、Q63置換はQ63N置換ではなく、A69置換はA69H置換ではなく、P76置換はP76V置換ではなく、かつ/またはI115置換はI115M置換ではない。より好ましくは、V54置換はV54L置換であり、Y56置換はY56G、Y56A、Y56D、もしくはY56S置換であり、Q63置換はQ63H置換であり、Q66置換はQ66R置換であり、V68置換はV68E置換であり、A69置換はA69TもしくはA69S置換であり、P76置換はP76FもしくはP76H置換であり、かつ/またはI115置換はI115Lである。好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、アミノ酸位置C113でのさらなる置換を少なくとも担持する。また好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、アミノ酸位置V54、Q66、V68、A69および/またはI115のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのさらなる置換を担持する。
好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、置換(i) Y56S、P76F、およびI115L；(ii) V54L、Y56D、Q66R、V68E、A69S、およびP76H；(iii) Y56G、Q63H、P76F、およびI15L；(iv) Y56A、Q63H、A69T、およびP76F；または(v) Y56A、Q63H、およびP76Hを含む。最も好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、置換Y56S、P76F、およびI115L；またはV54L、Y56D、Q66R、V68E、A69S、およびP76Hを含む。つまり、好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、配列番号16～配列番号20に示されるアミノ酸配列のうちのいずれかを含み、好ましくはそれからなり；好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、配列番号16または配列番号17に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。
好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、本明細書中の上記でこれもまた特定される融合ポリペプチドおよび/またはポリペプチド複合体中に含められる。好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、精製および/もしくは検出のためのタグ、リンカー、および/または化合物のin vivo半減期を延長するポリペプチドをさらに含む融合ポリペプチド中に含められる。化合物のin vivo半減期を延長するポリペプチドは、当技術分野で公知であり、特に、抗体断片、例えば、免疫グロブリンのFc断片、およびオボアルブミンまたはその断片が挙げられる。また好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、ポリペプチド複合体中に含められ；例えば、精製および/もしくは検出のための上記のタグ、リンカー、および/または化合物のin vivo半減期を延長するポリペプチドを、ジスルフィド結合を介して、または本明細書中の他の箇所で特定される親和性結合を介して、PD-L1ポリペプチドに連結することができる。また、融合ポリペプチドは、マルチマー、例えば、二量体を形成することができ、この場合、PD-L1ポリペプチドは、二量体Fc融合ポリペプチド中などの、融合ポリペプチド中およびポリペプチド複合体中に含めることができる。つまり、好ましくは、PD-L1ポリペプチドは、好ましくは配列番号23または24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号21または22に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。
用語「免疫グロブリンの断片結晶化可能（Fc）部分」とは、抗体のCH2およびCH3ドメインを含み、かつ、例えば、パパインを用いる、抗体のタンパク質分解切断により取得することができる、抗体断片を意味する。様々な生物種由来の様々な免疫グロブリンが、当技術分野で公知である。これらの免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgWまたはIgYを包含する。免疫グロブリンのうちで本発明に従って好ましいのは、しかしながら、哺乳動物、特にヒトで見られるもの、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、IgMである。抗体のFc部分は、クラス効果を決定する。重鎖の定常ドメインのみが抗体のFc部分を形成するので、重鎖のクラスがクラス効果を決定する。抗体中の重鎖の考えられるクラスは、α、γ、δ、ε、およびμを包含する。これらの重鎖クラスが、アイソタイプを規定する。抗体の異なるアイソタイプは、それらのそれぞれのFc部分に起因して、異なるクラス効果を有する。そのようなFc媒介クラス効果としては、エフェクター細胞またはエフェクター分子に影響するもの、例えば、オプソニン化、凝集、溶血、補体活性化、およびマスト細胞脱顆粒が挙げられる。Fc部分を形成するCH2およびCH3ドメインに対するアミノ酸配列が、異なる抗体アイソタイプに関して当技術分野で周知であり、かつさらなる面倒なしに当業者により提供されることができる。本発明に従って参照される場合のFc部分は、好ましくは、翻訳後修飾され、より好ましくは、グリコシル化されることができる。好ましくは、本発明に従う当該免疫グロブリンは、IgGであり、より好ましくは、ヒトIgGである。ヒトIgGをコードするアミノ酸配列、ならびにそれをコードする核酸配列は、当技術分野で周知である。さらに、どのアミノ酸が当該アミノ酸配列中のFc部分に対応するかもまた周知である。
好ましくは、当該融合ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、標的化のための第3の部分、特に、細胞傷害性T細胞に特異的に結合することが可能なポリペプチドである第3の部分を含む。より好ましくは、細胞傷害性T細胞に特異的に結合することが可能である当該ポリペプチドは、CD8に結合することが可能であるMHC-I複合体の一部分を含むポリペプチド、CD28に結合することが可能であるCD80の一部分、CD8に特異的に結合することが可能である抗体またはその断片であるポリペプチド、CD28に特異的に結合することが可能である抗体またはその断片であるポリペプチド、およびリンパ球機能関連抗原-3（LFA-3）のCD2結合性部分からなる群より選択される。そのような一部分がそれぞれのタンパク質からどのように誘導できるかは、当業者に周知である。
有利なことに、記載されるPD-L1誘導体が、リガンドPD-1に対する増大した親和性を有することが、本発明の基礎となる研究で見出されている。さらに、顕著により小さな分子を用いることができることが見出された。つまり、特に、敗血症関連臓器不全の治療での治療効果を、より低い濃度で達成することができ、それにより、必要とされる用量が低減される。つまり、PD-L1の変異体は、好ましくは、宿主細胞からの失われたシグナルを置き換え、かつそれによりCTLの自己免疫活性化を妨げる。PD-L1変異体は、好ましくは、PD-1に対する親和性を強化する突然変異を保持するが、PD-L1wtと同じ結合様式を維持する。結果として、遺伝子操作されたPD-L1変異体は、好ましくは、敗血症により引き起こされる患者での臓器/組織損傷を予防するために投与することができる薬物として機能する潜在能力を有する。
上記で行われた定義を、以下に対して準用する。以下でさらに行われる追加的な定義および説明を、本明細書中に記載されるすべての実施形態に対しても準用する。
本発明はまた、本発明に従うPD-L1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。
用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中で用いる場合、一本鎖もしくは二本鎖DNAまたはRNA分子を意味する。ゲノムDNA、cDNA、hnRNA、mRNAならびにそれらの断片をはじめとするそのような分子種のすべての天然に存在するかまたは人工的な誘導体が、当該用語により包含される。ポリヌクレオチドは、好ましくは、直鎖または環状分子であり得る。さらに、上述のPD-L1ポリペプチドをコードする核酸配列に加えて、本発明に従うポリヌクレオチドは、5'-または3'-UTR配列などの適正な転写および/もしくは翻訳のために必要とされる追加的配列またはスプライシングもしくはRNA安定性のために必要とされる配列を含むことができる。本発明に従うPD-L1ポリペプチドをコードする好ましいポリヌクレオチドはまた、本明細書中の他の箇所にも記載される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号1または配列番号2に示される配列に対して少なくとも60％同一な配列を含み、好ましくはそれからなり；好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号11～15のうちのいずれか1種、より好ましくは配列番号11または12に示される配列を含み、好ましくはそれからなる。
好ましくは、ポリヌクレオチドは、当該被験体での当該ポリヌクレオチドの発現を可能にする発現構築物中に含められる。用語「発現構築物」とは、本明細書中で用いる場合、PD-L1ポリペプチドをコードする上述のポリヌクレオチドならびに融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために必要とされる核酸を含む異種ポリヌクレオチドを意味する。典型的には、好ましくはPD-L1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して異種である、そのような追加的核酸は、プロモーター配列、エンハンサー配列および/またはターミネーターなどの転写終結配列であり得る。さらに、発現構築物は、宿主へと発現構築物を導入するために必要とされるさらなる核酸も含むことができる。例えば、宿主細胞での発現が望ましい場合、発現構築物は、形質転換またはトランスフェクションのために、かつ宿主細胞での導入された発現構築物の増殖のために必要とされるさらなる核酸を含むことができる。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。
本明細書中で意味される場合のベクターは、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターならびに細菌または酵母人工染色体などの人工染色体を包含する。PD-L1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含するベクターは、好ましくは、宿主での増殖および/または選択のための選択可能マーカーをさらに含む。ベクターは、当技術分野で周知の様々な技術により、宿主細胞に組み込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿もしくは塩化ルビジウム沈殿などの沈殿物中、または荷電脂質を含む複合体中もしくはフラーレン（fulleren）などの炭素に基づくクラスター中で導入することができる。あるいは、プラスミドベクターは、熱ショックまたはエレクトロポレーション技術により、導入することができる。ベクターがウイルスであるべき場合、宿主細胞への適用に先立って、適切なパッケージング細胞株を用いてin vitroでパッケージングすることができる。レトロウイルスベクターは、複製能を有するかまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的に、補完性宿主/細胞でのみ起こるであろう。さらに、ポリヌクレオチドは、通常、当該ベクターでの、原核もしくは真核宿主細胞またはその単離された画分中での発現を可能にする発現制御配列に機能的に連結される。ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能mRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。宿主細胞での発現を確実にする調節エレメントは、当技術分野で周知であり、かつ本明細書中の上記で例示に基づいて記載される。原核宿主細胞での発現を許容する考えられる調節エレメントは、例えば、大腸菌でのlac、trpまたはtacプロモーターを含み、真核宿主細胞での発現を許容する調節エレメントに関する例は、酵母でのAOX1もしくはGAL1プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞でのCMV、SV40、RSVプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMVエンハンサー、SV40エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。ポリヘドリンプロモーターに基づく系などの本発明により想定される他の発現系は、昆虫細胞での発現を許容するであろう。さらに、誘導可能な発現制御配列を、本発明により包含されるベクター中で用いることができる。そのような誘導可能ベクターは、tetもしくはlacオペレーター配列または熱ショックもしくは他の環境要因により誘導可能な配列を含むことができる。適切な発現制御配列は、当技術分野で周知である。転写の開始に対して応答可能であるエレメントとは別に、そのような調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流の、SV40-ポリA部位またはtk-ポリA部位などの転写終結シグナルも含むことができる。この文脈では、適切な発現ベクターは、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia社）、pBluescript（Stratagene社）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（Invitrogen社）もしくはpSPORT1（Invitrogen社）またはバキュロウイルス由来ベクターなど、当技術分野で公知である。好ましくは、ベクターは、発現ベクターおよび遺伝子移入または標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスから誘導される発現ベクターを、標的化された細胞集団への本発明に従う発現構築物の送達のために、例えば、遺伝子療法アプローチでも、用いることができる。当業者に周知である方法を、組み換えウイルスベクターを構築するために用いることができ；例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載される技術を参照されたい。
さらに、宿主のゲノムへと発現構築物を導入することが想定される。そのような場合、発現構築物はまた、当該発現構築物の異種または同種インテグレーションのいずれかを可能にする核酸もまた含むことができる。つまり、本明細書中で参照される発現構築物はまた、ゲノムDNAへの標的化構築物の無作為または部位特異的インテグレーションを可能にする標的化構築物でもあり得る。そのような標的構築物は、好ましくは、PD-L1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現カセットに隣接する同種または異種組み換えのいずれかのための十分な長さのDNAを含む。さらに、発現構築物はまた、Cre/LoxPまたはCRISPR/CASなどのインテグレーションシステムを用いて導入することもできる。そのような場合、発現構築物は、そのようなインテグレーションシステムの使用を可能にするさらなる核酸を含むことができる。適切な改変/付加は想定されるインテグレーションシステムに依存し、かつ当業者に対して周知である。
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明に従うPD-L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドにも関する。本発明はさらに、敗血症に罹患している被験体での臓器不全の治療および/もしくは予防での使用のための、免疫障害、好ましくは紅斑性狼瘡の治療での使用のための、かつ/または免疫腫瘍学的治療での使用のための、本発明に従うPD-L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する。
用語「治療すること(treating)」とは、本明細書中で用いる場合、疾患もしくはそれに伴う少なくとも1種の症状を改善または治癒することを意味する。つまり、疾患もしくはそれに伴う少なくとも1種の症状の改善または治癒が見られる場合、治療は、有効であると見なされるであろう。治療は、すべての被験体では有効でない場合があることが理解されるであろう。しかしながら、本発明に従えば、治療は、好ましくは、治療対象である被験体のうちの少なくとも統計学的に有意な部分では有効であることが想定される。有効に治療されることができる被験体の統計学的に有意な部分をどのように決定するかは、当業者に周知である。部分が統計学的に有意であるか否かは、様々な周知の統計学的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値決定、スチューデントt検定、マン・ホイットニー検定などを用いて、当業者により、さらなる面倒なしに決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、または0.0001である。好ましくは、本発明により想定される確率は、有効な治療の知見が、所与のコホートまたは集団の被験体のうちの少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％に対して正しいことを可能にする。
用語「予防すること(preventing)」とは、本明細書中で用いる場合、疾患もしくはそれに伴う少なくとも1種の症状の発症を回避することまたは疾患もしくは当該少なくとも1種の症状の悪化を予防することを意味する。本明細書中で参照される場合の予防は、薬物が投与される期間の間、典型的に達成することができる。しかしながら、薬物の投与が停止される場合、予防は、無制限の時間にわたっては持続しないが、薬物の投与後の特定の予防的時間ウインドウにわたって存在し続ける場合がある。典型的には、本発明に従う予防的時間ウインドウは、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、または少なくとも7日間であり得る。しかしながら、予防的時間ウインドウはまた、薬物の投与量ならびに投与様式または製剤の種類にも依存し得る。例えば、高投与量が投与される場合、通常は比較的長い予防的時間ウインドウを達成できる。薬物の徐放製剤が投与されるか、または薬物が、被験体での薬物の即時代謝をもたらさない経路を介して投与される場合、同じことがいえる。そのような場合、予防的時間ウインドウは、数週間、数ヵ月間または数年間までさえ、増大させることができる。予防は、すべての被験体では有効でない場合があることが理解されるであろう。しかしながら、本発明に従えば、予防は、好ましくは、被験体のうちの少なくとも統計学的に有意な部分では有効であることが想定される。有効に予防されることができる被験体の統計学的に有意な部分をどのように決定するかは、当業者に周知である。部分が統計学的に有意であるか否かは、上述の様々な周知の統計学的評価ツールを用いて、当業者によりさらなる面倒なしに決定することができる。
本発明に従うPD-L1ポリペプチドは、医学的治療のために用いられるであろうから、好ましくは、医薬として製剤化されるであろう。本発明の意味での医薬とは、好ましくは、生物学的に活性なPD-L1ポリペプチドまたは製薬上活性な化合物として本発明に従うPD-L1ポリペプチドをコードする発現構築物および1種以上の製薬上許容される担体などの1種以上の他の成分を含有する医薬組成物を意味する。製薬上活性な化合物は、液体または凍結乾燥形態で存在することができる。例えば、製薬上活性な化合物は、グリセロールおよび/またはタンパク質安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン）と共に存在することができる。医薬は、典型的には、全身的に、かつ、好ましくは、静脈内的または筋内的に投与される。しかしながら、製剤の性質および所望の治療的用途に応じて、医薬は、他の経路により同様に投与することができる。製薬上活性な化合物は、医薬の有効成分または薬物であり、かつ好ましくは、慣用の手順に従って標準的な製薬用担体と薬物を併せることにより調製される、慣用の剤型で投与される。これらの手順は、適切な場合に所望の調製物へと、成分を混合、造粒、および圧縮、または溶解させることを含み得る。製薬上許容される担体または希釈剤の形態および特性が、併せる対象である有効成分の量、投与経路、および他の周知の変数により決定付けられることが理解されるであろう。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、かつそのレシピエントに対して有害でないという意味で、許容可能でなければならない。利用される製薬用担体としては、固体、ゲル、または液体が挙げられる。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体担体の例は、リン酸緩衝生理食塩溶液、シロップ、油、水、エマルジョン、様々な種類の湿潤化剤などである。同様に、担体または希釈剤としては、単独またはワックスと併せたモノステアリン酸グリセロールまたはジステアリン酸グリセロールなどの、当技術分野で周知の時間遅延材料が挙げられる。当該適切な担体は、上記で言及されたものおよび当技術分野で周知の他のものを含み、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照されたい。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩液、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤はまた、他の担体、アジュバント、または無毒非治療的非免疫原性安定化剤なども含むことができる。本明細書中で参照される医薬は、好ましくは、例えば、ボーラスとして、少なくとも1回投与される。しかしながら、当該医薬は、2回以上、好ましくは、少なくとも2回、例えば、永続的または所定の時間ウインドウ後に定期的に、投与することができる。
治療上有効用量とは、本明細書中で参照される疾患または状態に伴う症状を予防、改善または治癒する、医薬中で用いられる対象であるPD-L1ポリペプチドまたはPD-L1ポリペプチドをコードする発現構築物の量を意味する。薬物の治療効果および毒性は、細胞培養物または実験動物中で標準的な製薬手順、例えば、ED50（集団のうちの50％で治療上有効な用量）およびLD50（集団のうちの50％に対して致死的である用量）により決定することができる。治療作用と毒性作用との間の用量比が治療指数であり、比LD50/ED50として表わすことができる。投与レジメンは、担当医により、かつ臨床的因子により、決定されるであろう。医学分野では周知である通り、いずれか1人の患者に対する投与量は、患者のサイズ、年齢、投与対象である医薬の特定の製剤化、性別、投与時間および経路、全身健康状態、および同時に投与される他の薬物をはじめとする多数の因子に依存する。定期的評価により進行をモニタリングすることができる。推奨投与量は、考慮されるレシピエントに応じた用量調整を見込むために、処方者または使用者指示書中に示されるであろう。
本発明に従う医薬は、本発明のさらなる態様では、その製剤化中に添加される上述の化合物に加えて、薬物を含むことができる。好ましくは、本発明に従う製薬上活性な化合物は、少なくとも1種のさらなる薬物と共に適用される対象であり、つまり、医薬としてこれらの他の薬物と共に製剤化することができる。より好ましくは、当該少なくとも1種のさらなる薬物は、抗生物質、昇圧剤、ステロイド、抗凝固剤、抗血栓剤、炎症性サイトカインおよびDAMP阻害剤からなる群より選択される。また、医薬組成物の製剤化は、好ましくは、医薬の品質、製薬上の安全性、および有効性を確実にするために、GMP標準化条件などの下で行われる。
用語「臓器不全」とは、本明細書中で用いる場合、正常なホメオスタシスが維持できずかつ内因的に補償できない程度まで、臓器の生理学的に期待される機能に影響する、臓器のいずれかの機能不全を意味する。臓器不全は、急性または慢性であり得る。臓器不全に伴う症状は、罹患臓器に依存し、通常、例えば、臨床的または生化学的パラメーターにより決定することができる、被験体での病態生理学により明らかになる。臓器不全の症状はまた、当技術分野で周知でもあり、かつ医薬の教科書中に記載されている。好ましくは、本明細書中で参照される場合の臓器不全は、多臓器不全である。多臓器不全は、同時または短い期間内で連続的な2つ以上の臓器の不全により特徴付けられる。多くの場合に、全身性炎症反応症候群（SIRS）もしくは敗血症などの重症感染症または炎症性反応の結果として観察することができる。SIRSまたは敗血症の間に不全となる典型的な臓器は、肺、腎臓、心臓および/または全身循環系、特に肝臓をはじめとする消化器系、ならびに神経系である。好ましくは、本明細書中で参照される多臓器不全は、自己反応性細胞傷害性細胞により引き起こされ、より好ましくは、CD8細胞傷害性T細胞依存的な多臓器不全である。また好ましくは、本明細書中で参照される場合の臓器不全は、肝不全、特に、敗血症被験体での肝不全である。
用語「被験体」とは、本明細書中で用いる場合、例えば、哺乳動物、鳥類、魚類または爬虫類を包含するいずれかの種類の動物を意味する。しかしながら、典型的には、動物は、ペットとして用いられる哺乳動物（イヌ、ネコ、ウマ、またはげっ歯類をはじめとする）、実験動物（例えば、ラット、マウスまたは類人猿）、または畜産動物（ブタ、ウシ、ヤギ、またはヒツジなど）などの哺乳動物である。より好ましくは、哺乳動物は霊長類であり、最も好ましくはヒトである。本発明に従う被験体は、好ましくは、敗血症に罹患していることが既知もしくは疑われるか、または敗血症を発症することが予期され；つまり、被験体は、好ましくは、臨床的に明らかな症状または敗血症に典型的に伴う生理学的もしくは分子的パラメーターの変化などの、少なくとも1種以上の病理学的変化を示す。好ましくは、被験体は、免疫障害、好ましくは紅斑性狼瘡に罹患していることが既知であるかまたは疑われる。また好ましくは、被験体は、免疫腫瘍学的治療の必要性があることが既知であるかまたは疑われる。
用語「敗血症」とは、本明細書中で用いる場合、生物全体を侵す炎症性応答を意味する。敗血症に伴う典型的症状は、当技術分野で周知であり、かつ医学の標準的な教科書中に記載される。それらとしては、顕著に変化した体温（低温または発熱）、呼吸促迫、頻拍、低下した末梢血管抵抗に起因する低血圧、精神錯乱および浮腫形成が挙げられる。凝固機能異常または代謝性アシドーシスなどの生化学的パラメーターもまた、敗血症の典型的な徴候である。好ましくは、敗血症は、細菌、ウイルス、寄生生物または真菌による重症感染症により引き起こされる。さらに、糖尿病または癌などの敗血症の発症または転帰に影響を及ぼす交絡因子（cofounding factor）がある。好ましくは、本明細書中で参照される場合の敗血症は、感染に応答した以下の症状のうちの2種以上の存在により特徴付けられる：異常体温（好ましくは、36℃未満または38℃超）、異常心拍（好ましくは、90回/分超）、異常呼吸数（好ましくは、20回/分超）または血液ガス組成（好ましくは、4.3kPa未満のCO2）、および異常白血球数（好ましくは、4×109/L未満もしくは12×109/L超または桿状核好中球の組織学的存在）。
用語「免疫障害」は、免疫反応が生じる被験体の細胞タイプ、組織および/または臓器を攻撃する免疫反応を含むいずれかの障害に関連することが当業者により理解される。免疫障害は、好ましくは、同種免疫応答により引き起こされるかまたは悪化し；つまり、免疫障害は、好ましくは、外来性組織もしくは臓器に対する宿主免疫系の免疫反応を含み、特に、臓器移植拒絶であり、かつ/または宿主組織もしくは臓器に対する外来性免疫系の免疫反応を含み、特に、移植片対宿主病である。好ましくは、免疫障害は、自己免疫応答により引き起こされるかまたは悪化し、すなわち、免疫障害であり；つまり、免疫障害は、好ましくは、T細胞、好ましくはCD8 T細胞が、被験体の自家細胞を溶解させ、かつ/または外因性刺激の非存在下で炎症性反応を引き起こす、障害である。好ましくは、自己免疫障害は、紅斑性狼瘡（lupus）である。
用語「免疫腫瘍学的治療」もまた、当業者により理解される。この用語は、好ましくは、被験体の免疫応答を変化させることによる癌の治療に関する。当該変化は、当該免疫応答の誘導、促進、または抑制であり得る。
本発明はまた、本発明に従うPD-L1ポリペプチド、本発明に従うポリヌクレオチド、および/または本発明に従うベクターを含む宿主細胞にも関する。
本明細書中で用いる場合、用語「宿主細胞」は、本発明のPD-L1ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび/またはベクターを受け入れ、かつ好ましくは、維持および/または発現することが可能ないずれかの細胞に関する。より好ましくは、宿主細胞は、当該ポリヌクレオチドおよび/またはベクター上にコードされる、本明細書中に特定されるPD-L1ポリペプチドを発現することが可能である。好ましくは、細胞は、細菌細胞、より好ましくは、当技術分野で公知の一般的な研究用細菌株の細胞、最も好ましくは、エシェリキア属菌株、特に大腸菌菌株である。また好ましくは、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、酵母細胞、例えば、パン酵母の菌株の細胞であるか、または動物細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、昆虫細胞または哺乳動物細胞、好ましくは、本明細書中の上記で特定される哺乳動物被験体由来の、特にマウスまたはラット細胞である。最も好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。しかしながら、宿主細胞が植物細胞であることも想定される。
本発明はまた、本発明の宿主細胞、本発明に従うPD-L1ポリペプチド、本発明に従うポリヌクレオチド、および/または本発明に従うベクターを含む非ヒトトランスジェニック生物にも関する。
用語「非ヒトトランスジェニック生物」は、用いる場合、ヒトを除く、特に植物および動物をはじめとする、いずれかの多細胞生物に関する。好ましくは、非ヒトトランスジェニック生物は、被験体、好ましくは、本明細書中の上記で特定される哺乳動物被験体であるが、ヒト被験体ではない。また好ましくは、被験体は、植物、好ましくは単子葉または双子葉植物である。
本発明はまた、以下のステップ：
(i) 宿主細胞中で本発明に従うポリヌクレオチドを発現させるステップ；および
(ii) PD-L1ポリペプチドを取得するステップ
を含む、請求項のうちのいずれか1つに従うPD-L1ポリペプチドを製造するための方法にも関する。
本発明はまた、以下のステップ：
(i) 宿主細胞中で本発明に従うポリヌクレオチドを発現させるステップ；および
(ii) PD-L1ポリペプチドを取得するステップ
を含む、請求項のうちのいずれか1つに従うPD-L1ポリペプチドを製造するための方法にも関する。
本発明はさらに、上記の方法により取得可能なPD-L1ポリペプチドに関する。
PD-L1ポリペプチドを製造するための方法は、好ましくは、in vitro法である。好ましくは、方法は、GMPおよび/またはGLP条件下で行われる。さらに、方法は、さらなるステップ、例えば、ステップ(i)の前に適切な発現構築物を含む宿主細胞を提供するステップ、および/またはPD-L1ポリペプチドを精製するための1つ以上の精製ステップを含むことができる。さらに、1つ以上のステップを、自動化装置により補助または実行することができる。
本発明はまた、被験体での臓器不全を治療および/または予防する方法、特に、敗血症に罹患している被験体での臓器不全を治療する方法も提供し、該方法は、(a) 治療上有効量のPD-L1ポリペプチドを前記被験体に投与するステップまたは(b) 前記PD-L1ポリペプチドをコードする治療上有効量のポリヌクレオチドを投与するステップを含む。
臓器不全の種類、治療対象の被験体、敗血症、および融合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する本発明の典型的な態様は、上記に記載され、被験体での臓器不全を治療および/または予防する本発明の方法に対して適用される。好ましくは、方法は、融合ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドの投与に先立って、敗血症の存在を決定することによる、治療対象の被験体の特定を包含する。
また好ましくは、方法は、融合ポリペプチドの投与後に臓器不全の徴候に関して被験体をモニタリングするステップ、および、必要な場合、融合ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを、再度または異なる投与量で投与するステップを含む。
上記に鑑みて、以下の実施形態が特に想定される：
1. 配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むPD-L1ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、以下の位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76、I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所でのアミノ酸置換を担持し、該ポリペプチドが位置Y56、C113またはI115でのアミノ酸置換を含む場合、該ポリペプチドは、上記置換のうちの少なくとも1種をさらに担持し；該アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく、PD-L1ポリペプチド。
2. 配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むPD-L1ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくともアミノ酸位置Y56およびP76でのアミノ酸置換を担持し、該アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく、PD-L1ポリペプチド。
3. 配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むPD-L1ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、該第1のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換；ならびに該第2のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換を担持し、該アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく、PD-L1ポリペプチド。
4. 前記第1のアミノ酸配列が、配列番号8に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％同一であり、かつ/または前記第2のアミノ酸配列が、配列番号10に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％同一である、実施形態1～3のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
5. 前記ポリペプチドが、前記アミノ酸置換（1箇所または複数）を含む、配列番号7および配列番号8から選択される第1のアミノ酸配列、ならびに配列番号9および配列番号10から選択される第2の配列を少なくとも含む、実施形態1～4のうちのいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
6. 前記ポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～5のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
7. 前記ポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～6のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
8. 前記ポリペプチドが、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～7のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
9. 前記ポリペプチドが、位置P76での少なくとも1箇所のアミノ酸置換を含む、実施形態1～8のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
10. 前記ポリペプチドが、該第1のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換；ならびに該第2のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換を担持する、実施形態1～9のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
11. 前記ポリペプチドが、少なくともアミノ酸位置Y56およびP76でのアミノ酸置換を担持する、実施形態1～10のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
12. 前記PD-L1ポリペプチドが、PD-L1の変異体である、実施形態1～11のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
13. 前記PD-L1ポリペプチドが、アミノ酸位置C113でのさらなる置換を少なくとも担持する、実施形態1～12のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
14. 前記PD-L1ポリペプチドが、アミノ酸位置V54、Q66、V68、A69および/またはI115の少なくとも1箇所での少なくとも1つのさらなる置換を担持する、実施形態1～13のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
15. (i) 前記Q63置換がQ63N置換ではなく、(ii) 前記A69置換がA69H置換ではなく、(iii) 前記P76置換がP76V置換ではなく、かつ/または(iv) 前記I115置換がI115M置換ではない、実施形態1～14のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
16. (i) 前記V54置換がV54L置換であり、(ii) 前記Y56置換がY56G、Y56A、Y56D、もしくはY56S置換であり、(iii) 前記Q63置換がQ63H置換であり、(iv) 前記Q66置換がQ66R置換であり、(v) 前記V68置換がV68E置換であり、(vi) 前記A69置換がA69TもしくはA69S置換であり、(vii) 前記P76置換がP76FもしくはP76H置換であり、かつ/または(viii) 前記I115置換がI115L置換である、実施形態1～16のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
17. 前記ポリペプチドが、置換(i) Y56S、P76F、およびI115L；(ii) V54L、Y56D、Q66R、V68E、A69S、およびP76H；(iii) Y56G、Q63H、P76F、およびI15L；(iv) Y56A、Q63H、A69T、およびP76F；または(v) Y56A、Q63H、およびP76Hを含む、実施形態1～16のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
18. 前記PD-L1ポリペプチドが、配列番号16～配列番号20に示されるアミノ酸配列のうちのいずれかを含み、好ましくはそれからなり；好ましくは、該PD-L1ポリペプチドが、配列番号16または配列番号17に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～17のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
19. 前記PD-L1ポリペプチドが、融合ポリペプチドおよび/またはポリペプチド複合体中に含められる、実施形態1～18のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
20. 前記融合ポリペプチドが、該融合ポリペプチドのin vivo半減期を延長する少なくとも1種のポリペプチドをさらに含む、実施形態1～19のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
21. 前記融合ポリペプチドが、少なくとも1種の抗体断片および/またはオボアルブミンもしくはその断片をさらに含み；好ましくは、該融合ポリペプチドが、免疫グロブリンのFc断片をさらに含む、実施形態1～20のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
22. 前記ポリペプチドが、好ましくは、配列番号23または24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号21または22に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～21のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
23. 前記PD-L1ポリペプチドが、細胞傷害性T細胞に特異的に結合することが可能である一部分、好ましくは、免疫グロブリンまたはその断片を追加的に含む、実施形態1～22のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
24. 前記免疫グロブリンがヒトIgGである、実施形態23のPD-L1ポリペプチド。
25. 前記細胞傷害性T細胞に特異的に結合することが可能である一部分が、CD8に結合することが可能であるMHC-I複合体の一部分を含むポリペプチド、CD28に結合することが可能であるCD80の一部分、CD8に特異的に結合することが可能である抗体またはその断片であるポリペプチド、CD28に特異的に結合することが可能である抗体またはその断片であるポリペプチドからなる群より選択される、実施形態1～24のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
26. 実施形態1～25のいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
27. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1または配列番号2に示される配列に対して少なくとも60％同一である配列を含み、好ましくはそれからなり；好ましくは、該ポリヌクレオチドが、配列番号11または配列番号12に示される配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態26のポリヌクレオチド。
28. 医薬としての使用のための、実施形態1～25のいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチドまたは実施形態26もしくは27に記載のポリヌクレオチド。
29. 敗血症に罹患している被験体での臓器不全の治療および/もしくは予防での使用のための、免疫障害、好ましくは紅斑性狼瘡の治療での使用のための、かつ/または免疫腫瘍学的治療での使用のための、実施形態1～25のいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチドまたは実施形態26もしくは27に記載のポリヌクレオチド。
30. 前記臓器不全が、CD8細胞傷害性T細胞依存的多臓器不全であり、かつ/または炎症性反応により、好ましくは、全身性炎症反応症候群（SIRS）もしくは敗血症により引き起こされる、実施形態29に記載の使用のためのPD-L1ポリペプチドまたは使用のためのポリヌクレオチド。
31. 前記被験体が、哺乳動物、好ましくはヒトである、実施形態29もしくは30に記載の使用のためのPD-L1ポリペプチドまたは使用のためのポリヌクレオチド。
32. 前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、投与時に、被験体での敗血症により誘導される細胞傷害性T細胞を阻害する、実施形態29～31のいずれか1つに記載の使用のためのPD-L1ポリペプチドまたは使用のためのポリヌクレオチド。
33. 前記PD-L1ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドが、投与時に、敗血症により引き起こされる活性化に対して被験体体内の細胞傷害性T細胞での長期的な寛容を誘導する、実施形態29～32のいずれか1つに記載の使用のためのPD-L1ポリペプチドまたは使用のためのポリヌクレオチド。
34. 実施形態26または27に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
35. 実施形態1～26のいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチド、実施形態26もしくは27に記載のポリヌクレオチド、および/または実施形態34に記載のベクターを含む宿主細胞。
36. 実施形態35に記載の宿主細胞、実施形態1～26のいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチド、実施形態26もしくは27に記載のポリヌクレオチド、および/または実施形態34に記載のベクターを含む非ヒトトランスジェニック生物。
37. 以下のステップ：
(i) 宿主細胞中で実施形態26または27に記載のポリヌクレオチドを発現させるステップ；および
(ii) PD-L1ポリペプチドを取得するステップ
を含む、実施形態のうちのいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチドを製造するための方法。
38. 実施形態37の方法により取得可能なPD-L1ポリペプチド。
1. 配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むPD-L1ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、以下の位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76、I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所でのアミノ酸置換を担持し、該ポリペプチドが位置Y56、C113またはI115でのアミノ酸置換を含む場合、該ポリペプチドは、上記置換のうちの少なくとも1種をさらに担持し；該アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく、PD-L1ポリペプチド。
2. 配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むPD-L1ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくともアミノ酸位置Y56およびP76でのアミノ酸置換を担持し、該アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく、PD-L1ポリペプチド。
3. 配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むPD-L1ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、該第1のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換；ならびに該第2のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換を担持し、該アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく、PD-L1ポリペプチド。
4. 前記第1のアミノ酸配列が、配列番号8に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％同一であり、かつ/または前記第2のアミノ酸配列が、配列番号10に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％同一である、実施形態1～3のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
5. 前記ポリペプチドが、前記アミノ酸置換（1箇所または複数）を含む、配列番号7および配列番号8から選択される第1のアミノ酸配列、ならびに配列番号9および配列番号10から選択される第2の配列を少なくとも含む、実施形態1～4のうちのいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
6. 前記ポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～5のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
7. 前記ポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～6のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
8. 前記ポリペプチドが、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～7のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
9. 前記ポリペプチドが、位置P76での少なくとも1箇所のアミノ酸置換を含む、実施形態1～8のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
10. 前記ポリペプチドが、該第1のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：V54、Y56、Q63、Q66、V68、A69、P76のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換；ならびに該第2のアミノ酸配列内の以下のアミノ酸位置：I115、A121、D122、Y123、K124、およびR125のうちの少なくとも1箇所での少なくとも1つのアミノ酸置換を担持する、実施形態1～9のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
11. 前記ポリペプチドが、少なくともアミノ酸位置Y56およびP76でのアミノ酸置換を担持する、実施形態1～10のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
12. 前記PD-L1ポリペプチドが、PD-L1の変異体である、実施形態1～11のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
13. 前記PD-L1ポリペプチドが、アミノ酸位置C113でのさらなる置換を少なくとも担持する、実施形態1～12のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
14. 前記PD-L1ポリペプチドが、アミノ酸位置V54、Q66、V68、A69および/またはI115の少なくとも1箇所での少なくとも1つのさらなる置換を担持する、実施形態1～13のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
15. (i) 前記Q63置換がQ63N置換ではなく、(ii) 前記A69置換がA69H置換ではなく、(iii) 前記P76置換がP76V置換ではなく、かつ/または(iv) 前記I115置換がI115M置換ではない、実施形態1～14のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
16. (i) 前記V54置換がV54L置換であり、(ii) 前記Y56置換がY56G、Y56A、Y56D、もしくはY56S置換であり、(iii) 前記Q63置換がQ63H置換であり、(iv) 前記Q66置換がQ66R置換であり、(v) 前記V68置換がV68E置換であり、(vi) 前記A69置換がA69TもしくはA69S置換であり、(vii) 前記P76置換がP76FもしくはP76H置換であり、かつ/または(viii) 前記I115置換がI115L置換である、実施形態1～16のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
17. 前記ポリペプチドが、置換(i) Y56S、P76F、およびI115L；(ii) V54L、Y56D、Q66R、V68E、A69S、およびP76H；(iii) Y56G、Q63H、P76F、およびI15L；(iv) Y56A、Q63H、A69T、およびP76F；または(v) Y56A、Q63H、およびP76Hを含む、実施形態1～16のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
18. 前記PD-L1ポリペプチドが、配列番号16～配列番号20に示されるアミノ酸配列のうちのいずれかを含み、好ましくはそれからなり；好ましくは、該PD-L1ポリペプチドが、配列番号16または配列番号17に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～17のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
19. 前記PD-L1ポリペプチドが、融合ポリペプチドおよび/またはポリペプチド複合体中に含められる、実施形態1～18のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
20. 前記融合ポリペプチドが、該融合ポリペプチドのin vivo半減期を延長する少なくとも1種のポリペプチドをさらに含む、実施形態1～19のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
21. 前記融合ポリペプチドが、少なくとも1種の抗体断片および/またはオボアルブミンもしくはその断片をさらに含み；好ましくは、該融合ポリペプチドが、免疫グロブリンのFc断片をさらに含む、実施形態1～20のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
22. 前記ポリペプチドが、好ましくは、配列番号23または24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号21または22に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～21のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
23. 前記PD-L1ポリペプチドが、細胞傷害性T細胞に特異的に結合することが可能である一部分、好ましくは、免疫グロブリンまたはその断片を追加的に含む、実施形態1～22のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
24. 前記免疫グロブリンがヒトIgGである、実施形態23のPD-L1ポリペプチド。
25. 前記細胞傷害性T細胞に特異的に結合することが可能である一部分が、CD8に結合することが可能であるMHC-I複合体の一部分を含むポリペプチド、CD28に結合することが可能であるCD80の一部分、CD8に特異的に結合することが可能である抗体またはその断片であるポリペプチド、CD28に特異的に結合することが可能である抗体またはその断片であるポリペプチドからなる群より選択される、実施形態1～24のいずれか1つのPD-L1ポリペプチド。
26. 実施形態1～25のいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
27. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1または配列番号2に示される配列に対して少なくとも60％同一である配列を含み、好ましくはそれからなり；好ましくは、該ポリヌクレオチドが、配列番号11または配列番号12に示される配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態26のポリヌクレオチド。
28. 医薬としての使用のための、実施形態1～25のいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチドまたは実施形態26もしくは27に記載のポリヌクレオチド。
29. 敗血症に罹患している被験体での臓器不全の治療および/もしくは予防での使用のための、免疫障害、好ましくは紅斑性狼瘡の治療での使用のための、かつ/または免疫腫瘍学的治療での使用のための、実施形態1～25のいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチドまたは実施形態26もしくは27に記載のポリヌクレオチド。
30. 前記臓器不全が、CD8細胞傷害性T細胞依存的多臓器不全であり、かつ/または炎症性反応により、好ましくは、全身性炎症反応症候群（SIRS）もしくは敗血症により引き起こされる、実施形態29に記載の使用のためのPD-L1ポリペプチドまたは使用のためのポリヌクレオチド。
31. 前記被験体が、哺乳動物、好ましくはヒトである、実施形態29もしくは30に記載の使用のためのPD-L1ポリペプチドまたは使用のためのポリヌクレオチド。
32. 前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、投与時に、被験体での敗血症により誘導される細胞傷害性T細胞を阻害する、実施形態29～31のいずれか1つに記載の使用のためのPD-L1ポリペプチドまたは使用のためのポリヌクレオチド。
33. 前記PD-L1ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドが、投与時に、敗血症により引き起こされる活性化に対して被験体体内の細胞傷害性T細胞での長期的な寛容を誘導する、実施形態29～32のいずれか1つに記載の使用のためのPD-L1ポリペプチドまたは使用のためのポリヌクレオチド。
34. 実施形態26または27に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
35. 実施形態1～26のいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチド、実施形態26もしくは27に記載のポリヌクレオチド、および/または実施形態34に記載のベクターを含む宿主細胞。
36. 実施形態35に記載の宿主細胞、実施形態1～26のいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチド、実施形態26もしくは27に記載のポリヌクレオチド、および/または実施形態34に記載のベクターを含む非ヒトトランスジェニック生物。
37. 以下のステップ：
(i) 宿主細胞中で実施形態26または27に記載のポリヌクレオチドを発現させるステップ；および
(ii) PD-L1ポリペプチドを取得するステップ
を含む、実施形態のうちのいずれか1つに記載のPD-L1ポリペプチドを製造するための方法。
38. 実施形態37の方法により取得可能なPD-L1ポリペプチド。
本明細書中で引用されるすべての参考文献は、それらの開示内容全体および本明細書中で具体的に言及される開示内容に関して、参照により本明細書中に組み入れられる。
本発明は、以下の実施例により単に例示される。当該実施例は、何であれ、本発明の範囲を限定する様式で解釈されないであろう。
実施例1
繊維状ファージM13の表面上に提示されるPD-L1の2×109種の突然変異体のライブラリーを構築した。ガイドとして野生型PD-1およびPD-L1の結晶複合体の公開された構造を用いて、本発明者らは、PD-L1の遠位Ig様ドメイン（マウスPD-L1上のアミノ酸18～132）のみを遺伝子操作し、提示レベルを改善するために、本発明者らは、ライブラリー構築に先立って、マウスPD-L1部分にC113R突然変異を追加的に導入した。結晶構造に基づいて、本発明者らは、界面中に埋め込まれ、かつ側鎖をPD-1と接触させる、PD-L1の14個のアミノ酸残基を無作為化のために選択した。
繊維状ファージM13の表面上に提示されるPD-L1の2×109種の突然変異体のライブラリーを構築した。ガイドとして野生型PD-1およびPD-L1の結晶複合体の公開された構造を用いて、本発明者らは、PD-L1の遠位Ig様ドメイン（マウスPD-L1上のアミノ酸18～132）のみを遺伝子操作し、提示レベルを改善するために、本発明者らは、ライブラリー構築に先立って、マウスPD-L1部分にC113R突然変異を追加的に導入した。結晶構造に基づいて、本発明者らは、界面中に埋め込まれ、かつ側鎖をPD-1と接触させる、PD-L1の14個のアミノ酸残基を無作為化のために選択した。
AviTagペプチドに融合され、in vivoでビオチン化され、かつ大腸菌から精製された、C83S置換を有する組み換えマウスPD-1タンパク質（アミノ酸31～150）を抗原として用いて、ファージ選択を行った。1組の選択ラウンド後、富化されたファージクローンの結合性をELISAにより分析し、選択されたPD-L1変異体を配列決定した。競合的ファージIC50 ELISAでは、5種類のPD-L1変異体を、溶液中での500nMまたは50nMを用いてPD-1-Fcと競合させることにより、それらの結合特性に関して調べた（図1）。全5種類のクローンを、さらなる特性決定のために選択し、Hisタグ融合体として大腸菌で発現させた。選択した変異体の配列およびPD-1-Fcに対するそれらの親和性（バイオレイヤー干渉法BLIにより、Octetデバイス上で測定される）は、変異体214および258が、同じ形式で発現されたPD-L1 wtと比較して、表面固相化マウスPD-1-Fcに対する結合性での最大30倍の優位性を有したことを示した。
表1および2は、選択されたPD-L1変異体のアミノ酸配列および親和性を示す。アミノ酸位置54、56、63、66、68、69、76、113、115、および121～125を無作為化した。選択された変異体に関して、ダッシュ記号は野生型配列と比較してアミノ酸変化がないことを表す。変異体とマウスPD-1の相互作用についてのKd値を、バイオレイヤー干渉法により取得した；n/a：利用不可。マウス配列の元来のC113が、上記で示される通りにライブラリー構築に先立って既に置換されたので、表2はR113を示す。
クローン0258（以下ではPHI258とも称される）および0214をさらに分析した。これらの2種類の変異体に関する代表的なBLIセンソグラムを、図2に示す。PD-L1 Ig様可変ドメインとのクローン0258の構造オーバーレイの0.762Å2の低いRMSD値は、突然変異が生来型コンホメーションを変化させないことを示す。この結果は、親和性の増大が、分子間接触の最適化に起因し、未改変型PD-L1 Ig様可変ドメインと比較したPD-1に対するクローン0258の結合性トポロジーでの変化に起因しないことを示す（図2A、B、C）。さらに、マウスPD-1-EGFP融合構築物を安定的に発現するJurkat細胞の溶解物を用いて、本発明者らは、wt PD-L1ならびに変異体0214および0258を用いるプルダウンアッセイを行った。両方の遺伝子操作型変異体は、野生型構築物またはGST対照よりもはるかに強くPD-1-EGFPと相互作用する（図3）。
一方で、本発明者らは、哺乳動物細胞での発現のために、ヒトFcを含む融合タンパク質としてPD-L1変異体をクローニングし、かつ発現させた。Fc融合タンパク質としてのPD-L1wtおよびPD-L1変異体の確立は、後続のin vivo実験で高いバイオアベイラビリティーを改善する。加えて、哺乳動物発現系は、細菌よりも良好な収量での分子間ジスルフィド結合の最適な形成を可能にする。
Fc融合タンパク質の発現および精製後、本発明者らは、プロテインAカラム上でのワンステップ精製を用いて、良好な純度および200mg/L Expi293F培養物の平均収量を得た（図4）。精製されたタンパク質がそれでもPD-1に結合するか否かを確認するために、本発明者らは、上記の通りにPD-1/PD-L1親和性を決定した。Fc融合体の二量体化により生じる結合アビディティに起因して、変異体の親和性は、それぞれ、2.54および2.14nMから88および77pMへの結合性の増大を示した。類似の実験では、本発明者らは、wtタンパク質に関して約600pMの親和性を観察し、このことは、PD-L1変異体が、in vitroでPD-1に対する最大約8倍の改善された親和性を有することを示した。
本発明者らは、変異体およびwt対照の存在下でのT細胞の細胞傷害性を試験することにより、PD-L1 Fc融合タンパク質の免疫抑制作用を確認した。細胞傷害性T細胞はOT-1マウスから誘導され、表面マウス細胞上のMHCによるオボアルブミン由来ペプチドの提示に対して感受性である。T細胞活性を誘導するために、マウス由来肝細胞株Hepa1にオボアルブミンをパルス添加し、FACSにより細胞死をモニタリングすることにより、細胞傷害性を測定した（図5）。
実施例2
ヒト条件での同種リンパ球活性化に対するPHI258（すなわち、上述のPD-L1変異体258）の影響を分析するために、本発明者らは、健康匿名ヒト血液ドナーのバフィーコート由来のPBMCを用いる混合リンパ球反応（MLR）アッセイを行った。各2名のドナーのPBMCを混合し、様々な濃度（50ng/mL～50μg/mL）でのPHI258の添加を伴うかまたは伴わずに、最大6日間にわたってT細胞増殖培地中で維持した。
ヒト条件での同種リンパ球活性化に対するPHI258（すなわち、上述のPD-L1変異体258）の影響を分析するために、本発明者らは、健康匿名ヒト血液ドナーのバフィーコート由来のPBMCを用いる混合リンパ球反応（MLR）アッセイを行った。各2名のドナーのPBMCを混合し、様々な濃度（50ng/mL～50μg/mL）でのPHI258の添加を伴うかまたは伴わずに、最大6日間にわたってT細胞増殖培地中で維持した。
最初に、細胞を6日目にフローサイトメトリーにより分析し、CD4+およびCD8+T細胞上でのPD-1発現を決定した。非常に低用量でのPHI258とのインキュベーションでさえ、両方のT細胞サブセットの表面上でのPD-1の検出に強く干渉し（図6A、B）、このことは、FACS抗体とのPD-1の結合性の競合またはPD-1内在化のいずれかを示した。次に、MLRの関数として生存細胞の割合を決定した。PHI258は、5μg/mL超の濃度で生存細胞数を顕著に増大させた（図6C）。つまり、PHI258は、MLR中の細胞殺傷を妨げるようである。調節T細胞に関して図6Dに例示的に示される通り、相対的細胞組成は変化しなかった。
次に、MLR中の白血球活性化を示すサイトカイン産生を、Cytometric Bead Arrayにより決定した。PHI258は、5μg/mL超の濃度で炎症性サイトカインIFN-γおよびTNF-αの分泌を顕著に抑制したが、比較的低濃度での作用はより不均一であった（図7）。重要なことに、PHI258は、抗炎症性サイトカインIL-10の産生を抑制しなかった（図7）。
PD-1は、T細胞活性化に際してアップレギュレーションされ、これはT細胞活性化後の約3日間で起こる。PHI258が作用するためにPD-1発現が必要とされるかを分析するために、MLR中の3日目および6日目でのIFN-γレベルを比較した。さらに、未改変型PD-L1（PHI200）を対照として用いた。PHI258またはPHI200のいずれも、3日目でのIFN-γレベルに影響しなかった。しかしながら、PHI258は6日目でのIFN-γレベルを強く抑制したが、PHI200は抑制しなかった（図8A）。炎症性サイトカイン産生の限定でのこの有効性の欠如に対応して、PHI200はまた、PHI258と比較して、MLR培養中で細胞生存率に影響しなかった（図8B）。
結論として、PHI258は、MLR培養中で高い有効性を伴ってヒトT細胞上でPD-1に結合し、かつ炎症性サイトカインレベルおよび細胞殺傷を抑制したが、IL-10発現および調節T細胞レベルなどの抗炎症性特徴を抑制しなかった。
引用文献
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von Knethen et al. (2019), Theranostics 9(7):2003
国際公開第2017/029389号A1
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von Knethen et al. (2019), Theranostics 9(7):2003
国際公開第2017/029389号A1
Claims (15)
- 配列番号8に対して少なくとも70％同一な第1のアミノ酸配列、および配列番号10に対して少なくとも70％同一な第2の配列を少なくとも含むPD-L1ポリペプチドであって、少なくともアミノ酸位置Y56およびP76でのアミノ酸置換を担持し、該アミノ酸位置は、マウスPD-L1アミノ酸配列（配列番号6）に基づく、上記PD-L1ポリペプチド。
- 前記アミノ酸置換（1箇所または複数）を含む、配列番号7および配列番号8から選択される第1のアミノ酸配列、ならびに配列番号9および配列番号10から選択される第2の配列を少なくとも含む、請求項1に記載のPD-L1ポリペプチド。
- 配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載のPD-L1ポリペプチド。
- アミノ酸位置C113でのさらなる置換を少なくとも担持する、請求項1～3のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチド。
- (i) 前記V54置換がV54L置換であり、(ii) 前記Y56置換がY56G、Y56A、Y56D、もしくはY56S置換であり、(iii) 前記Q63置換がQ63H置換であり、(iv) 前記Q66置換がQ66R置換であり、(v) 前記V68置換がV68E置換であり、(vi) 前記A69置換がA69TもしくはA69S置換であり、(vii) 前記P76置換がP76FもしくはP76H置換であり、かつ/または(viii) 前記I115置換がI115L置換である、請求項1～4のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチド。
- 置換
(i) Y56S、P76F、およびI115L；
(ii) V54L、Y56D、Q66R、V68E、A69S、およびP76H；
(iii) Y56G、Q63H、P76F、およびI15L；
(iv) Y56A、Q63H、A69T、およびP76F；または
(v) Y56A、Q63H、およびP76H
を含む、請求項1～5のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチド。 - 配列番号16～配列番号20に示されるアミノ酸配列のうちのいずれかを含み、好ましくはそれからなり；好ましくは、配列番号16または配列番号17に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、請求項1～6のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチド。
- 融合ポリペプチドおよび/またはポリペプチド複合体中に含められ、好ましくは、該融合ポリペプチドが、少なくとも1種の抗体断片および/またはオボアルブミンもしくはその断片をさらに含み；好ましくは、該融合ポリペプチドが、免疫グロブリンのFc断片をさらに含む、請求項1～7のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチド。
- 好ましくは、配列番号23または24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号21または22に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、請求項1～8のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチド。
- 請求項1～9のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 医薬としての使用のための、請求項1～9のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチドまたは請求項10に記載のポリヌクレオチド。
- 敗血症に罹患している被験体での臓器不全の治療および/もしくは予防での使用のための、免疫障害、好ましくは紅斑性狼瘡(lupus)の治療での使用のための、かつ/または免疫腫瘍学的治療での使用のための、請求項1～9のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチドまたは請求項10に記載のポリヌクレオチド。
- 前記臓器不全が、炎症性反応により、好ましくは全身性炎症反応症候群（SIRS）または敗血症により引き起こされる、請求項12に記載の使用のためのPD-L1ポリペプチドまたは使用のためのポリヌクレオチド。
- 請求項1～9のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチド、および/または請求項10に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- (i) 宿主細胞中で請求項10に記載のポリヌクレオチドを発現させるステップ；および
(ii) PD-L1ポリペプチドを取得するステップ
を含む、請求項1～9のいずれか1項に記載のPD-L1ポリペプチドを製造するための方法。
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