KR20140046781A

KR20140046781A - 보체인자 ｈ를 포함하는 맥락막 신생혈관 생성 예방 또는 치료용 조성물

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Publication number: KR20140046781A
Application number: KR1020120112870A
Authority: KR
Inventors: 김상진; 강희정; 김치화; 김정섭; 진동규; 김기용; 박지윤
Original assignee: 주식회사 메디진바이오
Priority date: 2012-10-11
Filing date: 2012-10-11
Publication date: 2014-04-21

Abstract

레이저 유도 맥락막 신생혈관 형성(CNV) 쥐 모델에서 유리체 내 투여시킨 인간 보체인자 H (CFH)의 억제 효과를 확인하기 위한 것이다. 사람 혈장으로부터 정제한 CFH를 이용한 보체 대체경로 저해 분석은 쥐 혈청의 자이모산 입자에 C3c의 침적을 측정하여 실시되었다. 보다 상세하게는 CNV는 브라운 노르웨이 쥐 눈에 레이저 광 응고를 실시하여 유도하였다(0 일째). 예방 효과를 보는 군은 0일째, 치료 효과를 보는 군은 7일째, 사람 혈장에서 정제한 CFH (50㎍/2 ㎕)와 PBS(대조군)를 유리체 내 주사하였다. 주사 후 7일째, 눈을 적출하고 적출한 눈에서 망막 색소 상피-맥락막-공막 조직 절편을 준비하였다. CNV 영역은 조직 절편을 제작한 후 막 공격 복합체 (MAC)를 염색하여 이미지를 분석하고 정량하였다. 인간 CFH는 농도 의존적으로 보체 대체경로의 활성을 억제했다. 특히 광응고 수술 후 3 일째, CFH를 처리한 눈(P<0.001)은 처리하지 않은 눈과 비교했을 때 MAC 침적이 감소되었음을 확인 하였다. 예방 효과를 보는 군에서는 7 일째, PBS 처리된 대조군 눈 (P = 0.011)에 비해 CFH 처리 군이 27.0 % 감소되었다. 치료 효과를 보는 군에서도 마찬가지로 대조군에 비해 CFH를 처리한 실험군에서 38.3% 의 감소를 확인하였다(p=0.001). 유리체 내로 투여한 인간 보체 H 인자(CFH)는 레이저 유도 맥락막 신생 혈관 생성을 억제하고 퇴화시키는 특징을 보였으며, 인간 보체 H 인자(CFH)가 연령 관련 황반변성(AMD) 및 기타 원인에 관련된 CNV의 치료제로 기능할 수 있다.

Description

보체인자 Ｈ를 포함하는 맥락막 신생혈관 생성 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating of choroidal neovascularization including complement factor H}

본 발명은 보체인자 H를 유효성분으로 포함하는 연령-관련 황반변성(AMD) 또는 다른 원인으로 인한 맥락막 신생혈관 생성 질환(CNV)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

맥락막 신생혈관 생성(choroidal neovascularization, CNV)은 광범위한 망막 질환과 관련이 있다. CNV는 망막 층을 통해 성장하는 맥락막(망막 바로 아래에 혈관이 풍부한 조직 층)으로부터 중기가 형성된 비정상 혈관으로, 매우 쉽게 부서지고 깨지며, 혈액 및 유체를 망막 층 내로 유도한다. 혈관이 누출되면, 섬세한 망막 조직을 교란 시켜 시력을 악화시킨다. 증상의 정도는 CNV의 크기 및 황반(망막의 중심부)에 근접한 정도에 따라 다르다.

황반변성(macular degeneration, MD)은 황반의 손상에 의해 중심 시력이 파괴되는 안과질환이다. 황반변성은 습성(wet) 또는 건성(dry) 황반변성으로 나눌 수 있다. 초기에는 건성 황반변성이 일어나며, 황반 아래에 드루젠(망막에 나이변화에 따라 노폐물이 침적된 것)이 나타나고, 망막-색소-상피(retinal pigment epithelium, RPE)에 색소변화가 일어난다. 습성 황반변성은 맥락막 신생혈관 생성, 색소상피박리, 황반 부종, 망막출혈, 망막삼출 등을 유발하여 망막 신경세포의 사멸로 실명에 이르게 한다. 또한, 황반변성은 50세 이상의 노인에게서 실명을 일으키는 주원인인 연령-관련 황반변성(AMD)(N Engl J Med. 2008; 358: 2606-17, Lancet. 2012; 379: 1728-38), 근시가 원인인 근시성 황반변성, 원인을 알 수 없는 특발성 황반변성과 기타 황반변성 등으로 구분 할 수 있다.

최근 들어 노령화 사회로 접어들면서 노령인구가 급증하여 황반변성 환자의 수가 점차 증가하고 있는 추세이다. 황반변성 관련 치료는 주로 레이저 치료, 항체주사, 수술 등을 시행하고 있으며 부족한 영양소를 포함하고 있는 보조약물의 처방 등이 있다.

한편, 유전학적 연구에서 AMD와 보체인자 H(Complement factor H, CFH) 유전자 사이의 강한 연관 관계가 보고된 바 있다(Science 2005;308:385-9, Science 2005; 308: 421-4, Proc. Natl. Acad. Sci. 2005;102:7227-32). CFH와 같은 보체 구성요소와 조절 단백질은 망막-색소-상피(RPE)와 맥락막(choroid), 그리고 AMD 환자의 드루젠에 편재되어 있음이 알려져 있다. 또한, AMD 환자는 전신에서 보체 활성이 이루어지고 있다고 보고된바 있다 (PLoS One. 2008;3:e2593, Ophthalmology. 2008;115:1904-10).

본 발명에서는 레이저 유도 CNV 동물 모델을 이용하여 CNV 발달에 필수적인 대체경로(alternative pathway) 활성을 CFH가 억제함을 확인하였다. 대체경로 활성은 CNV 발달을 유도하는 성장인자 방출에 필수적이고, siRNA를 이용한 방법으로 눈에서 CFH 유전자를 넉-다운시키면 막-공격-복합체(membrane attack complex, MAC)의 침적을 증가시키고, 레이저-유도 CNV의 악화를 가져왔다. 이러한 결과들로부터 보체인자 H가 보체 대체경로의 항상성 조절에 효과적인 역할을 수행하여 CNV 형성을 완화시킨다는 것을 제안한다.

대한민국 공개특허 2007-0112801호 대한민국 공개특허 2010-008548호

N Engl J Med. 2008; 358: 2606-17 Lancet. 2012; 379: 1728-38 Science 2005;308:385-9 Science 2005; 308: 421-4 Proc. Natl. Acad. Sci. 2005;102:7227-32 PLoS One. 2008;3:2593 Ophthalmology. 2008;115:1904-10

본 발명의 목적은 보체인자 H(CFH)를 유효성분으로 포함하는 맥락막 신생혈관 생성 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 보체인자 H를 유효성분으로 포함하는 맥락막 신생혈관 생성 관련 질환, 특히 황반변성의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 보체인자 H(CFH)를 유효성분으로 포함하는 맥락막신생혈관 생성(CNV) 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 보체인자 H는 인간의 혈액으로부터 추출하거나, 재조합을 통해 획득하는 단백질이며, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재한 아미노산 서열을 갖는 것이 특징이다.

<서열번호 1>

>gi|62739186|ref|NP_000177.2| complement factor H isoform a precursor [Homo sapiens]

MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGE

WVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPI

CEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISC

KSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPL

RIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVG

KYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNHGRKFVQGKSIDVACHPGY

ALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSG

SITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSD

LPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPICKEQVQSC

GPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHG

WAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLKNKKE

FDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQ

ENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEE

NETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSH

PPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVN

PPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDI

TSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLY

SRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR

<서열번호 2>

>gi|62739188|ref|NP_001014975.1| complement factor H isoform b precursor [Homo sapiens]

MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGE

WVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPI

CEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISC

KSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPL

RIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVG

KYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNHGRKFVQGKSIDVACHPGY

ALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVSFTL

상기 보체인자 H의 맥락막신생혈관 생성(CNV) 억제 효과는 레이저 유도된 CNV 쥐 모델을 이용하여 유리체 내 CFH 투여를 통해 확인하였다. 보다 상세하게는 사람혈장으로부터 정제한 CFH를 이용하여 생체 외(in vitro)에서 대체경로(alternative pathway) 저해를 확인하였고, CFH의 유리체 내 투여에 의해 CNV 형성이 감소하는 것을 확인하여 발명을 완성하였다.(도 3 참조)

대체경로의 활성은 AMD 뿐만 아니라 레이저 유도된 CNV의 발달에 중요한 것으로 보고된 바 있으며 (Arch Ophthalmol. 2010;128:349-58, Science. 2005;308:385-9), CFH의 저해는 막 공격 복합체 (MAC)의 침적을 증가시키고, 레이저 유도된 맥락막신생혈관 생성(CNV)의 악화를 야기하게 된다(도 4 내지 도 6 참조). 상기 결과로부터, 인간 환자에서 AMD의 주요병변이 쥐에서 레이저 유도된 CNV의 발달과 유사하며, 유사한 병변인 CNV를 쥐에서 일으키므로 모델 쥐에 투여 약제가 그 병변을 완화시킬 수 있다면 이는 사람에게서도 적용가능하다는 것을 의미한다.

본 발명의 보체인자 H(CFH)는 일례로, 쥐 모델에서 레이저-유도 CNV의 억제 효과를 가지는 것이 특징이다. 상기 모델에서 hCFH의 유리체 내 투여는 CNV 형성의 억제 뿐만 아니라, 부분적으로 CNV를 퇴화시키는 것이 특징이다.

본 발명에서 사용된 쥐(rat)와 인간(human) 종(species) 사이에 CFH 단백질의 구조적 차이는 거의 없다. hCFH cDNA 코딩 서열은 쥐 CFH cDNA와 74% 동일성(identity)이 있으며, hCFH에 대한 아미노산 서열은 쥐 CFH 아미노산 서열과 63% 상동성을 갖는다. 따라서 본 발명은 레이저-유도 CNV 쥐 모델에서 hCFH의 보체 대체경로 저해효과를 입증하였다. 보다 상세하게는 CFH의 농도 변화에 따라 보체의 한 구성물인 C3c 침적이 억제됨을 유세포 분석기를 이용하여 확인하였으며, 분석방법은 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 쥐 모델에서 사용한 보체인자 H의 함량은 60㎍/㎖이며, 이는 상기 쥐 모델에서 맥락막 신생혈관 생성이 40%까지 억제되는 효과를 나타낸다.

쥐 유리체 부피가 12㎕ 내지 56㎕인 것을 고려할 때, 이론상 hCFH 50㎍의 쥐 유리체 내 투여는 900 내지 4,000㎍/㎖ 농도가 유리체 내에 형성되게 되는 것으로써 혈장 내 CFH 농도보다 1.5배 내지 6.7배 높은 수치에 해당한다.

보체인자 H는 혈액으로부터 추출되거나, 재조합으로 합성하여 사용할 수 있다. 또한, 보체인자 H는 '야생-형'인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 '맥락막 신생혈관 생성'은 새로운 맥락막 모세혈관이 생성되는 과정을 의미한다. 맥락막은 안구의 고혈관막으로 이들이 발견되는 주변부에 위치하는 홍채 및 망막에 영양을 공급하는 미세한 모세관의 복잡한 망상구조를 일컫는다.

본 발명에서 '신생혈관 생성'은 새로운 혈관이 세포, 조직 또는 기관내로 발생하는 것을 의미한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 보체인자 H를 유효성분으로 포함하는 맥락막 신생혈관 생성 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 맥락막 신생혈관 생성 관련 질환은 황반변성, 특발성 맥락막 신생혈관 생성, 근시성 맥락막 신생혈관 생성, 외상성 맥락막 신생혈관 생성, 결절성 맥막병증, 고도근시 및 가황색종으로 구성되는 군으로부터 선택하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 더욱 바람직하게는 연령-관련 황반변성 질환이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, CFH 투여군과 대조군에서 맥락막 신생 혈관을 억제하는 효과는 유세포 분석, 형광안저조영술, 황반의 크기 및 부피 등을 통해 확인하는 것이 특징이지만, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 보체인자 H를 유효성분으로 포함하는 맥락막 신생혈관 생성 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 다른 원인에 의한 맥락막 신생혈관(CNV)을 억제함으로써 황반변성 관련 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 것이다.

도 1은 4 종류의 크로마토그래피를 이용하여 용출시킨 hCFH를 SDS-PAGE로 분석한 젤 사진이다. 각각의 밴드들은 코마쉬 블루 염색시약으로 염색되었으며, 젤 사진의 가장 왼쪽에 위치하는 Lane M은 분자량(MW) 마커이고, Lanes 2-5(비 환원 조건)는 각각의 크로마토그래피에 의해 용출된 hCFH이며, Lane 6은 상용화되고 있는 표준 hCFH이다.
Lane 1; I + III 페이스트 용해 후 원심 상층액
Lane 2; DEAE-세파로즈(Sepharose) 칼럼을 이용하여 정제한 후 hCFH
Lane 3; 헤파린-세파로즈 (Heparin-Sepharose) 칼럼을 이용하여 정제한 후 hCFH
Lane 4; Q-세파로즈(Sepharose) 칼럼을 이용하여 정제한 후 hCFH
Lane 5; HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 칼럼을 이용하여 정제한 후 hCFH
Lane 6: 표준 hCFH (Complement technology, Cat: A137)
도 2는 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 hCFH의 순도를 분석한 결과 도면이다. Superdex 200 10/300 GL (GE Health care, Cat; 17-5175-01)칼럼을 통과하여 정제된 후의 hCFH의 순도는 98 %를 나타냈다.
도 3은 정제된 인간 보체인자 H(hCFH)에 의해 보체 대체경로의 활성이 억제됨을 생체 외에서 확인한 도면이다. 정제된 hCFH는 농도 의존적으로 쥐 혈청(전체 부피의 10 %)을 포함하고 있는 자이모산 입자에 C3c의 침적 정도를 42 %까지 억제하였다.
도 4는 레이저 유도된 맥락막 신생 혈관(CNV) 형성에 대한 정제된 인간 보체인자 H (hCFH)의 효과를 확인한 도면이다. hCFH 처리군 및 대조군의 망막 색소 상피-맥락막-공막 조직 절편에서 CNV 영역을 측정하고 비교하였다. 레이저-유도 CNV 동물에 유리체 내 주사(intravitreal injection) 후 7일 째, 평균 CNV 영역은 hCFH 처리 눈(n=10)에서 대조군에 비해 27 % 감소한 작은 영역을 보인다(n=10, t-검정에서의 p=0.011, 눈금 막대는 100 ㎛).
도 5는 레이저 유도 맥락막 신생 혈관 생성(CNV)에 정제된 인간 보체인자 H (hCFH)의 효과를 나타낸 도면으로써, hCFH 처리군 및 대조군의 망막 색소 상피-맥락막-공막 조직 절편에서 CNV 영역을 측정하고 비교하였다. 레이저-유도 CNV 동물에 유리체 내 주사(intravitreal injection) 후 14일 째, 평균 CNV 영역이 대조군의 눈보다 hCFH 처리된 눈 (n=10)에서 38.3 %까지 감소된 영역을 보인다(n = 9, t 검정에서의 p 값 0.001, 눈금 막대는 100 ㎛).
도 6은 국소적으로 보체가 활성화되는 것을 확인하는 방법인 막-공격 복합체(MAC)의 형성여부를 통해 보체 활성을 조사한 도면이다. CNV 복합물의 조직 절편은 MAC의 형성 여부를 확인하기 위해 염색을 하였다. 레이저광 응고술 후 3 일째 결과는 MAC 침적 면적이 대조군의 눈보다 hCFH 처리된 눈 (n=7)에서 유의하게 작아졌다(t-검정에서의 p<0.001, n=7). 7 일째 결과를 비교하면, 두 군 (n=7/각각의 눈) 사이의 MAC 침적의 평균 면적에 있어 유의한 차이는 보이지 않았다(t-검정에서의 p=0.09, 눈금 막대는 100 ㎛).

이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 제한할 수 없다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

동물모델

200 내지 250g의 브라운 노르웨이 쥐 (일본 에스엘시(주), 하마마츠, 일본)를 본 발명에 사용하였다. 안과학적 시력 연구에 사용된 동물은 국제시력안과연구협회(Association for Research in Vision and Ophthalmology, 이하 ARVO라고 한다)의 규정에 따라 사용하였다. 모든 동물 실험은 삼성서울병원의 동물 관리 및 사용위원회에서 승인받은 프로토콜에 따라 실시했다.

인간 보체인자 H(Human complement factor H)

인간 보체인자 H (hCFH)는 인간 혈장으로부터 에탄올 침전법으로 얻은 I + III 페이스트를 출발 원료로 사용하였으며, 4 종류 칼럼을 이용한 크로마토그래피 과정을 거쳐 정제하였다.

I + III 페이스트를 pH 7.5인 20 mM 트리스-HCl 완충용액으로 4 ℃에서 하룻밤 동안 용해시켰다. 상기 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 4000 rpm에서 원심 분리하여 녹지 않는 펠렛(pellet)은 제거하였다. hCFH는 하기와 같이 이온교환 크로마토그래피, 친화성(affinity) 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피를 조합한 방법으로 정제 하였다(Biochem. J. 205, 285-293; Acta Cryst. F63, 480483)

상층액을 여과시킨 후, DEAE-세파로즈(Sepharose) 레진에 로드시키고, 칼럼은 50 mM NaCl을 포함하는 pH 7.5인 20 mM 트리스-HCl 완충용액으로 씻어 낸 후, 200 mM NaCl을 포함하는 pH 7.5인 20 mM 트리스-HCl 완충용액으로 hCFH를 용출하였다.

용출시킨 hCFH는 pH 7.5인 20 mM 트리스-HCl 완충용액으로 5배 희석시켜 헤파린-세파로즈 (Heparin-Sepharose) 레진에 로드시키고, 상기와 동일한 방법으로 용출시켰다. hCFH를 포함한 부분(fraction)을 취합한 후, 이를 Q-세파로즈(Sepharose)에 로드시키고 칼럼은 120 mM NaCl을 포함하는 pH 7.5인 20 mM 트리스-HCl 완충용액으로 씻어 낸 후, 160 mM NaCl을 포함하는 pH 7.5인 20 mM 트리스-HCl 완충용액으로 hCFH를 용출하였다. 마지막으로 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR의 컬럼에 적용하여 정제하였다. 각각의 정제 단계에서 획득된 hCFH는 SDS-PAGE 젤에서 확인 하였고,마지막 칼럼을 통과한 후, 단일 밴드를 확인하였다(도 1 참조).

이후, H 인자를 포함한 부분은 약 25 ㎎/㎖까지 한외여과하여 농축하여 -70℃에 보관하였다. 상기와 같이 정제한 hCFH의 순도는 고속 액체 크로마토그래피에서 98%로 확인하였다(도 2 참조).

N-말단 염기 서열 결정 방법에서 정제한 hCFH는 확인하였으며 자연 형태(native form)로 확인하였다.

실시예 1. 생체 외에서 hCFH에 의해 대체경로(AP)활성의 억제 효과에 대한 분석 실시.

보체 대체경로 활성은 상기한 바와 같이 자이모산 입자에 C3c 침적되는 정도를 유세포 분석법을 사용하여 측정 하였다. 5 mM MgCl₂와10mM EDTA를 포함하는 젤라틴 벨 나르 완충용액(GVB)에 브라운 노르웨이 쥐 혈청(부피의 10%)과 다양한 농도의 hCFH를 포함한 반응 튜브, 양성대조군(상기 동일한 조건의 완충용액 내에 동일 량의 쥐 혈청만 포함)튜브 및 음성대조군(10 mM의 EDTA를 포함하는 GVB에 동일 량의 쥐 혈청)튜브 각각에 활성화시킨 1×10⁷자이모산(zymosan) 입자를 첨가하였다.

각 반응 혼합물의 최종 용량은 100 ㎕으로 하였다. 각 시료는 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰고, 이후 자이모산 입자를 소 태아 혈청(부피의 1 %)이 포함된 차가운 PBS로 3 회 세척하고, FITC(fluoroisothyocyanate)를 표지시킨 토끼 유래 쥐 C3c 특이 항체(Abcam 사)로 처리하고, 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 상기 자이모산(zymosan) 입자는 3회 세척하고 파라포름알데히드(부피의 1 %)를 포함한 PBS에 다시 현탁했다. 자이모산(zymosan) 입자의 C3c 침적 량은 유세포분석기로 측정했다. 각 시료의 보체 대체경로 활성은 각각 100 %와 0 %로 할당된 양성 및 음성 대조군과 비교하여 C3c 침적 정도를 백분율로 나타냈다. 정제된 hCFH는 농도 의존적으로 자이모산 입자에 쥐 혈청유래 C3c 침적을 억제하였다. hCFH 60㎍/㎖이 쥐 혈청(부피의 10 %)을 포함하는 자이모산 반응 혼합물에 첨가되었을 때 C3c 침적이 40.2 % 억제 효과가 있음을 보였다(도 3 참조).

실시예 2. CNV에서 hCHF의 효과 분석 실시.

레이저-유도 CNV 모델

브라운 노르웨이 쥐에 레이저광 응고에 의해 CNV를 유도하였고, 유도한 날을 0일째로 하였다. 쥐는 졸레틸(Zoletil ㄾ (졸라지판과 틸레타민))과 실라진(xylazine) 염산염으로 마취하였다. 5 ㎎/㎖ 염산페닐레프린과 5 ㎎/㎖ 산동제(tropicamide) 점안약으로 동공확대 후, 프로파라카인 염산염 안약을 떨어뜨려 국소 마취하고, 레이저 광응고를 실시하였다(아르곤 그린 레이저, 파장: 532nm, 소비 전력130 mW, 시간: 100 ms, 스팟크기:75㎛). 6 레이저 스팟은 콘텍트 렌즈처럼 커버 슬립을 사용하여 슬릿램프 전달 시스템을 이용해 시신경 주위에 도포하였다. 브루크막 파열을 알 수 있는 수포 생성 부위만 본 발명에 포함시켰고, 출혈이 있거나 수포가 생성된 자리는 분석에서 제외하였다.

hCFH의 유리체 내 투여

예방 효과를 보는 군에서 CNV 형성에 hCFH 효과를 조사하기 위하여 눈은 무작위로 실험군과 대조군에 할당했다.

0 일째, 레이저광 응고 직후, hCFH (50㎍/2㎕ PBS) 또는 동일한 양의 PBS를 33-게이지 바늘(해밀턴)을 사용하여 유리체 내에 주입했다. 치료효과를 보는 군에서는 이미 형성된 CNV에 hCFH의 치료효과를 조사하기 위해 응고술 후 7일째 hCFH (50㎍/2㎕ PBS) 또는 같은 부피의 PBS를 같은 방법으로 치료군과 대조군의 눈에 주사하여 효과를 조사하였다.

hCFH 처리군 및 대조군의 망막 색소 상피-맥락막-공막 조직 절편의 CNV 영역을 비교한 결과, 예방효과를 보는 군에서는 7 일째 hCFH 처리된 눈(n=10)의 평균 CNV 영역이 대조군과 비교하여 의미있게 작아졌고(n=10, t-검정의 p값 0.011, 도 2참조), 평균 CNV 영역 27 % 감소를 보였다. 치료효과를 보는 군에서는 14 일째, 평균 CNV 영역이 대조군의 눈보다 hCFH 처리된 눈(n=10)에서 유의하게 작아졌다(n=10, t-검정 p값 0.001, 도 5참조). 14 일째에 PBS 처리 대조 눈에 비교하여 hCFH 처리 눈의 평균 CNV 영역은 38.3 % 감소를 보였다.

실시예 3. CNV 및 MAC 침적(deposition)의 조직학적 분석(Histologic analysis)

예방 효과를 보는 군에서는 7 일째, 치료 효과를 보는 군에서는 14 일째, 각각 망막 색소 상피-맥락막-공막 조직 절편을 제작하였다. 간단히 요약하면, 쥐를 안락사 시킨 후 눈을 적출하고 4% 파라포름알데히드로 2시간 동안 고정 후, 전측(anterior) 세그먼트와 망막을 제거하였다. 망막 색소 상피-맥락막-공막 안배 시료를 블러킹 용액(소 혈청 알부민 5%를 포함하는 PBS)에서 1 시간동안 반응 시켰다. TRITC-결합된 반데이라이아 심플리씨폴리아(Bandeiraea simplicifolia) 이소렉틴 B4 (0.2 ㎎/㎖에서 시그마-알드리치사, 세인트 루이스, MO) 및 마우스 유래 단일 클론 쥐-특이 막 공격 복합체 (MAC; C5b-9) 항체 (1:50, Hycult 바이오텍)를 소 혈청 알부민(부피의 0.2 %)이 포함된 PBS에 안배시료와 함께 넣고 하룻밤동안 반응 시켰다. PBS로 세척한 후, 이차 항체 (FITC 결합된 마우스-특이 IgG, 1:400)를 실온에서 1 시간동안 처리하였다. 여러 차례 세척한 후, 망막 색소 상피-맥락막-공막 안배 시료를 평평하게 자르고, 조직 절편용 봉입용액으로 봉입하였다. 만들어진 조직 절편은 레이저 공초점 현미경(LSM700 자이스)하에서 레이저 스팟 이미지를 획득하였다. 적색 형광 (CNV 크기) 및 녹색 형광 (MAC 침적) 영역은 이미지제이(Image J) 프로그램 (국립 위생 연구소, 베데스다, MD)을 이용하여 측정했다. CNV 및 MAC 침적 영역은 t-검정에 의해 hCFH 처리군 및 대조군을 비교했으며, p 값은 0.05 이하로 통계적 유의성을 보였다.

MAC 구조체가 형성되는지 여부는 국소 보체 활성을 측정함으로써 확인하였고, MAC의 형성 여부 확인을 위해 CNV 복합물의 조직 절편을 염색하였다. 레이저광 응고 술 후 3일째, MAC의 침적 평균영역이 대조군의 눈보다 hCFH 처리시킨 눈 (n=7)에서 유의하게 작아졌다(n=7, t-검정에서의 p<0.001, 도 6 참조). 유도 후 7 일째, MAC 침적의 평균 면적은 두 그룹 모두에서 감소했고, 그룹간의 차이가 없었다(t-검정에서의 p=0.09).

<110> GCBio Corp. <120> Composition for preventing or treating of choroidal neovascularization including complement factor H <130> 12P_1011 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala 35 40 45 Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met 50 55 60 Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys 65 70 75 80 Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr 100 105 110 Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu 115 120 125 Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val 130 135 140 Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser 145 150 155 160 Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe 165 170 175 Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys 180 185 190 Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile 195 200 205 Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys 210 215 220 Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly 225 230 235 240 Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp 245 250 255 Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile 260 265 270 Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp 275 280 285 Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly 290 295 300 Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys 305 310 315 320 Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr 325 330 335 His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr 340 345 350 Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr 355 360 365 Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro 370 375 380 Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln 385 390 395 400 Asn His Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys 405 410 415 His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met 420 425 430 Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys 435 440 445 Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln 450 455 460 Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly 465 470 475 480 Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys 485 490 495 Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro 500 505 510 Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu 515 520 525 Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr 530 535 540 Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp 545 550 555 560 Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val 565 570 575 His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val 580 585 590 Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser 595 600 605 Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys 610 615 620 Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn 625 630 635 640 Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu 645 650 655 Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln 660 665 670 Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu 675 680 685 Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu 690 695 700 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser 705 710 715 720 Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly 725 730 735 Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys 740 745 750 Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys 755 760 765 Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys 770 775 780 Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu 785 790 795 800 Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln 805 810 815 Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly 820 825 830 Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly 835 840 845 Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys 850 855 860 Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr 865 870 875 880 Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys 885 890 895 Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu 900 905 910 Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly 915 920 925 Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His 930 935 940 Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe 945 950 955 960 Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu 965 970 975 Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu 980 985 990 Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr 995 1000 1005 Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys Met 1010 1015 1020 Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr Gly Arg 1025 1030 1035 1040 Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn 1045 1050 1055 Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg 1060 1065 1070 Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu 1075 1080 1085 Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp 1090 1095 1100 Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile 1105 1110 1115 1120 Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr 1125 1130 1135 Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys 1140 1145 1150 Arg Asn Gly Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val 1155 1160 1165 Ile Ser Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr 1170 1175 1180 Ala Lys Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val 1185 1190 1195 1200 Cys Lys Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr 1205 1210 1215 Thr Cys Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg 1220 1225 1230 <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala 35 40 45 Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met 50 55 60 Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys 65 70 75 80 Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr 100 105 110 Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu 115 120 125 Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val 130 135 140 Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser 145 150 155 160 Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr 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Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro 370 375 380 Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln 385 390 395 400 Asn His Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys 405 410 415 His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met 420 425 430 Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Ser Phe Thr 435 440 445 Leu

Claims

보체인자 H를 유효성분으로 포함하는 맥락막 신생혈관 생성으로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 보체인자 H는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재한 아미노산으로 이루어진 단백질인 것을 특징으로 하는 맥락막 신생혈관 생성으로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 단백질은 혈장에서 분리 정제된 단백질인 것을 특징으로 하는 맥락막 혈관 신생으로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,
황반변성, 특발성 맥락막 신생혈관 생성, 근시성 맥락막 신생혈관 생성, 외상성 맥락막신생혈관 생성, 결절성 맥막병증, 고도 근시 및 가황색종 중에서 선택된 맥락막 신생혈관 생성으로부터 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 황반변성은 습성 황반변성 또는 연령관련 황반변성인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 약제학적 제제.
제 7항에 있어서,
상기 약제학적 제제는 담체, 부형제 또는 희석제 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 약제학적 제제.