JP6585720B2

JP6585720B2 - 眼疾患治療のペプチド及びこれを含む眼疾患治療用組成物

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Publication number: JP6585720B2
Application number: JP2017534267A
Authority: JP
Inventors: サンチェキム
Original assignee: ジェムバックスアンドカエルカンパニー，リミティド
Priority date: 2014-12-23
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2019-10-02
Anticipated expiration: 2035-12-22
Also published as: EP3238736A1; WO2016105086A1; JP2018502095A; CN107106651B; US20200016230A1; CN107106651A; US10463708B2; KR20160076911A; US20170360870A1; KR102413243B1; EP3238736A4; US11077163B2

Description

本明細書は、眼疾患の治療効能を有するペプチド及びこれを含む薬学的組成物に関する。より詳しくは、テロメラーゼに由来のペプチドであって、眼疾患の治療効能を有するペプチド及びこれを含む眼球疾患治療用薬学的組成物に関する。

加齢黄斑変性（Age-related macular degeneration）は、西欧において６５才以上の老人で失明を引き起こす重大な原因の疾患であって、アジア諸国においても老齢化に従い、黄斑変性が視力の低下と共に失明の重要な原因として報告されている。最近、韓国においても人口の老齢化と共に、加齢黄斑変性の発生が増えつつあり、社会的治療費用の負担がかなり高まっている疾患の一つである。

脈絡膜血管新生（ＣＮＶ、choroidal neovascularization）は、ブルッフ膜（Bruchs membrane）の破裂により網膜下や網膜細胞上皮下の空間に発生する脈絡膜起因性血管新生で、湿性加齢黄斑変性の特徴的な所見である。

加齢黄斑変性の病態生理は、まだ完全に明らかとなっているわけではないが、様々な臨床実験及び研究に基づき、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor, ＶＥＧＦ）が、脈絡膜血管新生の発生に主要な役割を果たすことが知られている。これにより、過去のレーザー治療、光線力学治療などが、主になった加齢黄斑変性の治療において、現在では、抗−血管内皮細胞増殖因子抗体（anti-VEGF antibody）注射は、一次的な治療としての位置を占めており、ラニビズマブ（Ranibizumab）、ベバシズマブ（Bevacizumab）、アフリバーセプト（Aflibercept）などの抗−血管内皮細胞増殖因子抗体の薬物が、湿性加齢黄斑変性の治療剤として全世界的に多く使用されている。

現在の湿性加齢黄斑変性の一次治療剤が、殆どの患者に効果的であることが明らかになっているが、これらは硝子体内に直接投与する注射治療で、多くの限界があることは否認できない。眼内での薬効の持続時間に限界があり、短くは一ヶ月の間隔で反復的な注射治療をするしかなく、臨床的な好転を見せても、持続的に再発する脈略膜血管新生の特性のため、見込みのない注射治療を続けなければならないという負担感が、医者と患者の両方に強く迫ってくる。

反復的に抗−血管内皮細胞増殖因子抗体を注射で投与した場合、地図状萎縮（geographic atrophy）の発生が増加することもまた一つの問題となる。さらに、反復された硝子体内の注射治療は、結膜下の出血などの微々たる副作用から眼内炎や網膜剥離、眼圧上昇などの深刻な合併症まで、様々な眼科的有害事象（ocular adverse events)の危険性があることにその限界があると言える。

高価の抗体注射と、注射治療と関連した社会的費用、頻繁な訪問による患者のＱＯＬ低下、過渡に増えた医者の業務量もまた問題になる。

しかし、なによりも抗−血管内皮細胞増殖因子抗体の注射に反応しない患者群があることが、別の大きな問題になる。一部の患者は、反復的な抗−血管内皮細胞増殖因子抗体の注射にも関わらず、最初から脈絡膜血管新生の活性度がまったく減らず、視力の改善もない患者群があり、また他の一部の患者は、初期には、抗−血管内皮細胞増殖因子抗体の注射に反応するが、だんだんその効力が落ちるタキフィラキシー（tachyphylaxis）を現すこともある。これは、脈絡膜血管新生の病態生理に、血管内皮細胞増殖因子以外の他の要素が関与することを間接的に示しているが、実際に活性酸素（reactive oxygen species, ＲＯＳ）により誘発する酸化ストレス（oxidative stress）や組織の炎症反応（inflammatory reaction）などが、脈絡膜血管新生の発生と成長に関与することが報告されている。さらに、抗酸化剤（antioxidant）やフリーラジカルスカベンジャー（free radical scavenger）、ステロイド（steroid）などが、湿性加齢黄斑変性の治療剤として開発されているが、まだ抗−血管内皮細胞増殖因子抗体の注射の補助的な役割のみを担っている。

したがって、本研究では、組織の炎症反応が重要な病態生理の一部分であることが明らかとなっている脈略膜血管新生の動物モデルにおいて、テロメラーゼ由来のペプチドの有効性と安全性とを評価した。実験を通じて、テロメラーゼ由来のペプチドの脈絡膜血管新生抑制の効果を立証し、これは、既存の抗−血管内皮細胞増殖因子抗体の注射とは異なるメカニズムによる薬剤であるので、追って湿性加齢黄斑変性のさらなる治療手段となり、眼科的疾患以外の様々な炎症性疾患にも適用されて、副作用のない効果的な炎症の治療にかなり役になると期待できる。

前記の目的を達成するために、本発明の一態様によると、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドを含む、眼疾患の治療及び予防用組成物が提供される。

本発明の一態様による組成物において、前記フラグメントは、３個以上のアミノ酸から構成されたフラグメントであってもよい。

本発明の一態様による組成物において、前記眼疾患は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、血管新生緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬及び黄斑変性（macular degeneration）からなる群より選ばれる一つ以上であってもよい。

本発明の一態様による組成物において、前記眼疾患は、加齢（age-related）眼疾患であってもよい。

本発明の一態様による組成物において、前記ペプチドは、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor, ＶＥＧＦ）の活性を低下させることを特徴とする。

本発明の一態様による組成物において、前記ペプチドは、脈絡膜血管新生を抑制することを特徴とする。

本発明の他の一態様によると、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドを含む、脈絡膜血管新生の抑制用組成物が提供される。

本発明の他の一態様による組成物において、前記組成物は、薬学組成物であり、製薬学的に許容可能な賦形剤及び添加剤をさらに含んでもよい。

本発明のまた他の一態様によると、前記組成物は、食品組成物であってもよい。

本発明のまた他の一態様によると、前記眼疾患の治療及び予防用組成物を、対象に投与するステップを含む、眼疾患の治療及び予防方法が提供される。

本発明のまた他の一態様によると、眼疾患の治療及び予防用組成物、及び説明書を含む、眼疾患の治療及び予防用キットが提供される。

本発明のまた他の一態様によるキットにおいて、前記説明書は、前記眼疾患の治療及び予防用組成物を投与することに関する内容を含んでもよい。

本発明のまた他の一態様によると、眼疾患において、前記眼疾患の治療及び予防用組成物を製造するための、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドの使用が提供される。

本発明の一態様によると、効果的に眼疾患の治療が可能な組成物が提供できる。従って、本発明の一態様による組成物は、眼疾患の治療及び予防に適用でき、特に脈略膜血管新生による眼科疾患の治療のために使用できる。

また、本発明の一態様による配列番号の配列を有するペプチド、又は前記配列と８０％の相同性を有する配列を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドは、眼疾患の治療及び予防の効能を有する。

レーザー誘導ＣＮＶ（脈絡膜血管新生、choroidal neovascularization）の動物モデルにおいて、ｐｅｐ１を濃度別の実験群に分けて投与し、実験群別にＣＮＶの厚さを比較して示している写真である。レーザー誘導ＣＮＶの動物モデルにおいて、ｐｅｐ１を濃度別の実験群に分けて投与し、ＣＮＶの厚さを測定して実験群別に示しているグラフである。レーザー誘導ＣＮＶの動物モデルにおいて、ｐｅｐ１を濃度別の実験群に分けて投与し、実験群別にＣＮＶの面積を比較して示している写真である。レーザー誘導ＣＮＶの動物モデルにおいて、ｐｅｐ１を濃度別の実験群に分けて投与し、ＣＮＶの面積を測定して実験群別に示しているグラフである。レーザー誘導ＣＮＶの動物モデルにおいて、ｐｅｐ１を濃度別の実験群に分けて投与し、蛍光眼底血管造影術を用いて、血管新生の漏出程度を撮影したものを、実験群別に比較して示している写真である。レーザー誘導ＣＮＶの動物モデルにおいて、ｐｅｐ１を濃度別の実験群に分けて投与し、血管新生の漏出程度を表す等級で評価された病変（lesion）の比率を、実験群別に示しているグラフである。

本発明は、多様な変換を加えてもよく、様々な実施例を有してもよい。以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の実施形態に限定することではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むことを理解すべきである。本発明を説明するにあたって、関連の公知技術に関する具体的な説明が、本発明の要旨を曖昧にする恐れがあると判断する場合、その詳細な説明を省略する。

テロメア（telomere）は、染色体の末端に繰り返して存在する遺伝物質であって、当該染色体の損傷や他の染色体との結合を防止すると知られている。テロメアの長さは、細胞が分裂する度に、少しずつ短くなって、一定の回数以上の細胞分裂があれば、テロメアは非常に短くなり、その細胞は、分裂を止めて死になる。その反面、テロメアを長くすると、細胞の寿命が延長されると知られており、その例として、癌細胞では、テロメラーゼ（telomerase）という酵素が分泌され、テロメアが短くなることを防ぐため、癌細胞が死ぬことなく、増殖し続けることができると知られている。本発明者らは、テロメラーゼに由来のペプチドが、血管新生の抑制に効果的であることを確認し、本発明を完成するに至った。

本明細書に開示されたペプチドは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を有するペプチドを含んでもよい。また、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１を含むペプチド又はそのフラグメントと、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸又は７個以上のアミノ酸が変化されたペプチドとを含んでもよい。

本発明の一態様において、アミノ酸の変化は、ペプチドの物理化学的特性を変更させる性質に属する。例えば、ペプチドの熱安定性を向上し、気質特異性を変更させ、最適のｐＨを変化させるなどのアミノ酸の変化が行われてもよい。

本明細書において、「アミノ酸」というのは、自然にペプチドに統合される２２個の標準アミノ酸のみならず、Ｄ−異性体及び変形されたアミノ酸を含む。これにより、本発明の一態様において、ペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドであってもよい。一方、本発明の別の態様において、ペプチドは、翻訳後修飾（post-translational modification）の非標準アミノ酸などを含んでもよい。翻訳後修飾の例には、リン酸化（phosphorylation）、グリコシル化（glycosylation）、アシル化（acylation）（例えば、アセチル化（acetylation）、ミリストイル化（myristoylation）及びパルミトイル化（palmitoylation）を含む）、アルキル化（alkylation）、カルボキシル化（carboxylation）、ヒドロキシル化（hydroxylation）、糖化反応（glycation）、ビオチニル化（biotinylation）、ユビキチニル化（ubiquitinylation）、化学的性質の変化（例えば、ベータ除去脱アミド化、脱アミド化）、及び構造的変化（例えば、二黄化物ブリッジの形成）が含まれる。また、ペプチドコンジュゲートを形成するための架橋剤（crosslinker）との結合過程で起こる化学反応により生じるアミノ酸の変化、例えば、アミノ基、カルボキシ基、又は側鎖における変化のようなアミノ酸の変化が含まれる。

本明細書に開示されたペプチドは、自然そのままの供給源から、同定及び分離された野生型ペプチドであってもよい。一方、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１のフラグメントであるペプチドと比較して、一つ以上のアミノ酸が、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む、人工変異体であってもよい。人工変異体のみならず、野生型ポリペプチドにおけるアミノ酸の変化は、タンパク質のフォールディング（folding）及び／又は活性に有意義な影響を及ばさないアミノ酸の保存性置換を含む。保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）の群の範囲内にある。一般に、特異的活性を変更させないアミノ酸の置換が、本分野に公知されている。最も頻繁に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、そしてこれらと逆のものである。保存的置換の他の例は、以下の表に示している。

ペプチドの生物学的特性における実在的な変形は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シート又は螺旋立体構造の保持におけるこれらの効果、（ｂ）標的部位での前記分子の電荷又は疎水性の保持におけるこれらの効果、又は（ｃ）側鎖のバルクの保持におけるこれらの効果が、相当に異なる置換部を選択することにより行われる。天然の残基は、通常の側鎖の特性に基づいて、次のグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存的置換は、これらの類型のうちの一つの構成員を、また他の類型に交換することにより行われる。ペプチドの適当な立体構造の保持と関連のないいかなるシステイン残基も、一般にセリンに置換されて、前記分子の酸化的安定性を向上し、異常な架橋結合を防ぐことができる。逆に言えば、システイン結合（複数の結合）を前記ペプチドに加え、その安定性を向上することができる。

ペプチドの他の類型のアミノ酸変異体は、抗体のグリコシル化パターンが変化されたものである。変化とは、ペプチドで見付けられた一つ以上の炭水化物残基の欠失及び／又はペプチド内に存在しない一つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。

ペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ−結合されるか、Ｏ−結合されるものである。Ｎ−結合されるとは、炭水化物残基が、アスパラギン残基の側鎖に付着したものを言う。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸である）は、炭水化物残基を、アスパラギン側鎖に酵素的付着するための認識配列である。従って、これらのトリペプチド配列のうちの一つが、ポリペプチドに存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ−結合されたグリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース及びキシロースのうちの一つを、ヒドロキシアミノ酸、最も通常的には、セリン又はトレオニンに付着することを意味するが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンを用いてもよい。

ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、前に挙げられたトリペプチド配列の一つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変化することで、便宜に行われる（Ｎ−結合されたグリコシル化部位の場合）。このような変化は、一つ以上のセリン又はトレオニン残基を、最初の抗体の配列に付加するか、これらの残基で置換することにより行われてもよい（Ｏ−結合されたグリコシル化部位の場合）。

また、本発明の一態様による配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列のフラグメントであるペプチド又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、細胞内毒性が低く、生体内安定性が高いという長所を有する。本発明における配列番号１は、テロメラーゼに由来のペプチドとして、以下のように１６個のアミノ酸からなるペプチドである。

配列番号１に記載されたペプチドは、以下の表２の通りである。以下の表２における「名称」は、ペプチドを区別するために命名したものである。本発明の一態様において、配列番号１に記載されたペプチドは、ヒトのテロメラーゼの全ペプチドを示す。本発明の他の態様において、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列のフラグメントであるペプチド、又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼに含まれたペプチドのうち、当該位置のペプチドを選別して合成した「合成ペプチド」を含む。配列番号２は、全テロメラーゼのアミノ酸配列を示したものである。

本発明細書の実験において用いられたレーザー誘導実験脈絡膜血管新生モデル（Laser-induced experimental CNV model）は、ラットでヒトの湿性加齢黄斑変性を実現するために最も多く使われている動物モデルである。ブルッフ膜の破裂をレーザーで誘発し、脈絡膜から血管新生が成長するようにして、ヒトの脈絡膜血管新生と似た環境を造成することができる。慢性で遺伝的及び環境的な複合的要因により発生するヒトの湿性加齢黄斑変性と、レーザーの急性損傷を与えて生じさせた動物モデルにおける脈絡膜血管新生とを同様に評価することはできないが、このような動物モデルは、すべての加齢黄斑変性の治療剤の一次的な評価方法として中枢的な役割を担っている。

本明細書では、テロメラーゼ由来のペプチドであるｐｅｐ１を、レーザー誘導ＣＮＶモデルに投薬し、脈絡膜血管新生の厚さ、面積、漏出程度などで評価される活性度が、ビークル（vehicle）のみを投薬した対照群に比べて、減少するか否かを確認する実験を行った。

本発明の一態様では、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントである、脈絡膜血管新生の活性度を低くして、眼疾患の治療効能を有するペプチドを、有効成分として含む薬学的組成物を提供する。

本発明の一態様による眼疾患の治療効能の組成物は、一側面では、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドを、０．０１ｇ／Ｌ〜１ｋｇ／Ｌ、具体的には、０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ、より具体的には、１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの含量で含んでもよいが、容量による効果の差を示す場合、これを適切に調整することができる。前記範囲又はそれ以下の範囲で含む場合、本発明の意図した効果を奏するのに適切であるだけではなく、組成物の安定性及び安全性の両方を満たすことができ、費用対比効果の観点からも、前記範囲で含むことが適切であり得る。

本発明の一態様による組成物は、ヒト、イヌ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ギニアピグ又はサルを含む全ての動物に適用できる。

本発明の一態様において、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントである、血管新生抑制の効能を有するペプチドを含む薬学組成物を提供する。本発明の一態様による薬学組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内又は皮下内に投与できる。

経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質又は硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、又は乳濁剤であってもよいが、これに限定されない。非経口投与のための剤形は、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチ、又は噴霧剤であってもよいが、これに限定されない。

本発明の一態様による薬学組成物は、必要に応じて、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩解剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料、又は甘味剤などの添加剤を含んでもよい。本発明の一態様による薬学組成物は、当業界の通常的な方法により製造できる。

本発明の一態様による薬学組成物の有効成分は、投与される対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその重症度、投与経路又は処方者の判断によって異なる。このような因子に基づいた適用量の決定は、当業者のレベル内にあり、この一日投与量は、例えば、１０ｎｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、具体的には、０．１μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には、１μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日、さらにより具体的には、２μｇ／ｋｇ／日〜５０μｇ／ｋｇ／日となってもよいが、容量による効果の差を示す場合、これを適切に調整してもよい。本発明の一態様による薬学組成物は、１日１回〜３回投与してもよいが、これに限定されない。

本発明の一態様において、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドを、有効成分として含む血管新生抑制用食品組成物を提供する。

本発明の一態様による食品組成物の剤形は、特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、固形製剤などに剤形化することができる。各剤形は、有効成分の他に、当該分野において通常用いられる成分を、剤形又は使用目的に応じて、当業者が容易に適宜選択して配合でき、他の原料と同時に適用する場合、上昇効果を奏することができる。

本明細書において用いられた用語は、特定の具体例を説明するための目的のみで意図されたものであり、本発明を限定しようとする意図ではない。名詞の前に個数が省略された用語は、数量を制限するものではなく、言及された名詞の物品が、一つ以上存在することを示すものである。用語「含む」、「有する」、及び「含有する」とは、包括的意味と解釈される（即ち、「含まれるが、これに限定されない」という意味）。

数値の範囲を言及するのは、単にその範囲内に属するそれぞれの別個の数値を、個別的に言及することに代わる容易な方法であるためであり、それではないと明示されていない限り、各数値は、個別的に明細書に言及されているように本明細書に適用される。全ての範囲の限界値は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。

本明細書に述べられる全ての方法は、特に明示されているか、文脈により明白に矛盾しない限り、適切な順序で行われ得る。いずれか一つの実施例及び全ての実施例又は例示的言語（例えば、「〜のような」）を使用するのは、特許請求の範囲に含まれていない限り、単に本発明の記載を容易にするためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書のいかなる言語も、請求されていない構成要素を、本発明の実施に必須的なものであると解釈してはいけない。特に定めのない限り、本明細書に用いられる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者により通常理解されるような意味を有する。

本発明の好適な具体例は、本発明を実行するために、発明者に知られた最適のモードを含む。好適な具体例の変形は、先行する記載に触れれば、当業者に明白になるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に利用することを期待し、発明者らは、本明細書の記載とは異なる方式で、本発明が実施されることを期待する。従って、本発明は、特許法により許容されているように、添付の特許請求の範囲に述べられた発明の要旨の均等物及び全ての変形を含む。さらに、全ての可能な変形内で、前述の構成要素のいかなる組み合わせも、ここで異なって明示するか、文脈上、明白に矛盾しない限り、本発明に含まれる。本発明は、例示的な具体例を参照して、具体的に開示し、記述されたが、当業者は、添付の特許請求の範囲により定められる発明の思想及び範囲を逸脱することなく、形態及びディテールにおいて多様な変化が可能であることがよく分かる。

以下、実施例及び実験例をもって、本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。しかし、以下の実施例及び実験例は、本発明の理解を助けるために例示の目的にのみ提供されたものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲を限定するものではない。

実施例１：ペプチドの合成
配列番号１のペプチド（以下、「ＰＥＰ１」という）を、従来知られている固相ペプチド合成法（solid phase peptide synthesis, ＳＰＰＳ）に従って製造した。具体的に、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Peptron, Inc., 大韓民国・大田）を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成法でＣ−末端からアミノ酸を一つずつカップリングすることにより合成した。次のように、ペプチドのＣ−末端の一番目のアミノ酸が、レジンに付着されたものを用いた。例えば、以下の通りである。

ＮＨ_２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジン
ＮＨ_２−Ａｌａ−２−クロロ−トリチルレジン
ＮＨ_２−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−２−クロロ−トリチルレジン
ペプチドの合成に用いた全てのアミノ酸原料は、Ｎ−末端がＦｍｏｃで保護（protection）され、残基は全て酸で除去される、Ｔｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕ（t-ブチルエステル）、Ｐｂｆ（２、２、４、６、７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルフォニル）などで保護されたものを用いた。例えば、次の通りである。

Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ、Ｔｒｔ−メルカプト酢酸。

カップリング試薬（Coupling reagent）としては、ＨＢＴＵ[２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１、１、３、３−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロホスファート]／ＨＯＢｔ[Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾル]／ＮＭＭ［４−メチルモルホリン]を用いた。Ｆｍｏｃの除去は、２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in DMF）を用いた。合成されたペプチドを、レジンから分離及び残基の保護基の除去には、切断カクテル（Cleavage Cocktail）［ＴＦＡ (トリフルオロ酢酸)／ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）／ＥＤＴ（エタンジチオール）／Ｈ_２Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を用いた。

アミノ酸の保護基が結合された出発アミノ酸が、固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸を各々反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護の過程を繰り返すことにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを、レジンから切り取った後、ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで合成の可否を確認した後、凍結乾燥した。

本実施例に用いられたペプチドへの高速液体クロマトグラフィーの結果、全てのペプチドの純度は、９５％以上であった。

ペプチドＰＥＰ１の製造についての具体的な過程は、以下の通りである。

１）カップリング
ＮＨ_２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジンに、保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解して加えた後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。

２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in DMF）を加えて、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。

３）前記１）と２）の反応を繰り返して行い、ペプチドの基本骨格ＮＨ_２−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジンを作製した。

４）切断（Cleavage）：合成が完了されたペプチドレジンに、切断カクテル（Cleavage Cocktail）を加えて、レジンからペプチドを分離した。

５）得られた混合物に、冷却ジエチルエーテルを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈殿した。

６）Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認し、凍結してパウダーとして製造した。

実施例２：ＣＮＶ動物モデルの定立及び統計処理方法
レーザー誘導ＣＮＶ（choroidal neovascularization, 脈絡膜血管新生）ラットモデルの定立
ＢＮラット（Brown Norway rat）を麻酔し、０．５％フェニルエプリン（phenylephrine）を用いて散瞳（瞳孔を拡大させる）して用意した。散瞳された対象のラットに、５７７ｎｍレーザー（５７７ｎｍ、diode、１０μｍ、０．０５ｓ）で一眼当り６〜８回照射して、脈絡膜に血管新生を生じさせた。レーザー照射の際、眼にカバーグラスを付け、スリットランプデリバリーシステム（slit lamp delivery system）を用いて、レーザー照射の途中でバブル（bubble）が発生することで、ブルッフ膜（Bruchs membrane）の破裂を確認した。

ｐｅｐ１の投与濃度による実験群の分類
レーザー誘導脈絡膜血管新生のラットモデルにおいて、実施例１に述べられた方法で製造されたペプチドｐｅｐ１を、三つの用量（０．１、１、１０ｎＭ）で投与した実験群と、ｐｅｐ１を投与していない対照群（vehicle）とで、ラットを無作為化（randomization）した後、レーザー照射の三日前から、レーザー照射の２週後まで、薬物を皮下注射（subcutaneous）で１日１回投与した。

統計処理
多グループ間のＣＮＶ活性を比較するためには、クラスカル−ウォリス検定（Kruskal-Wallis test）を用い、二つのグループ間の比較には、マンホイットニーのＵ検定（Mann-Whitney U test）を使用した。Ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意であると評価した。

実施例３：ｐｅｐ１の投与によるＣＮＶ厚さの測定
ＣＮＶの減少効果を確認するために、ＣＮＶ厚さの測定実験を行った。

レーザーでＣＮＶを誘導した後、２週が過ぎた時点で、ｐｅｐ１を投与した群と、対照群とのラットを麻酔し、ＯＣＴ（optical coherence tomography, 光干渉断層撮影）を行い、in vivoでＣＮＶ厚さを測定した。

Ｐｅｐ１を投与した群及び対照群は、実施例２に述べられた実験群に従い、各群の全ての病変（lesion）の厚さを測定して、ＣＮＶ厚さに差があるかを確認した。

実験の結果、ＣＮＶが誘導された後、ｐｅｐ１を投与していない対照群の厚さと比較したとき、ｐｅｐ１を投与した群において、全てが厚さの減少を示したことが確認できた（図１を参照）。

実施例２に述べられた統計処理に基づいて、実験の結果をグラフで示したとき、ｐｅｐ１の全ての濃度（０．１、１、１０ｎＭ）の投与群において、ＣＮＶ厚さが対照群より統計的に有意に減少し、特にｐｅｐ１を１ｎＭの濃度で投与した群において、ＣＮＶ厚さが最も大きく減少したことが確認できた（図２を参照）。

実施例４：ｐｅｐ１の投与によるＣＮＶ面積の測定
ＣＮＶの減少効果を確認するために、ＣＮＶ面積測定実験を行った。

レーザーでＣＮＶを誘導した後、２週が過ぎた時点で、ｐｅｐ１を投与した群と、対照群とのラットの眼球を摘出して、水晶体と硝子体を除去し、網膜色素上皮−脈絡膜−強膜（retinal pigment epithelium-choroid-sclera）の組織を獲得した。血管内皮細胞に特異的なイソレクチン（isolectin）で染色された面積を測定し、対照群とｐｅｐ１投与群とにおけるＣＮＶ面積を比較した。

Ｐｅｐ１を投与した群及び対照群は、実施例２に述べられた実験群に従い、各群の全ての病変の面積を測定して、グループ別にＣＮＶ面積に差があるかを確認した。

実験の結果、ＣＮＶが誘導された後、ｐｅｐ１を投与していない対照群の面積と比較したとき、ｐｅｐ１を投与した群において、全てが面積の減少を示したことが確認できた（図３を参照）。

実施例２に述べられた統計処理に基づいて、実験の結果をグラフで示したとき、ｐｅｐ１の全ての濃度（０．１、１、１０ｎＭ）の投与群において、ＣＮＶ面積が、対照群より統計的に有意に減少し、特にｐｅｐ１を１ｎＭの濃度で投与した群において、ＣＮＶ面積がもっとも大きく減少したことが確認できた（図４を参照）。

実施例５：ｐｅｐ１の投与による血管新生漏出の測定
ＣＮＶの減少効果を確認するために、脈絡膜で血管新生漏出（angiographic leakage）の測定実験を実施した。

レーザーでＣＮＶを誘導した後、２週が過ぎた時点で、ｐｅｐ１を投与した群と、対照群とのラットを麻酔し、造影剤を０．１ｍｌ腹腔内に注射した（１０％フルオレセインナトリウム、fluorescein disodium salt）。ＦＡＧ（fluorescein angiography、蛍光眼底血管造影術）を利用して、対照群とｐｅｐ１投与群とにおいて、脈絡膜血管新生の漏出程度を比較した。

Ｐｅｐ１を投与した群及び対照群は、実施例２に述べられた実験群に従い、各群の全ての病変の漏出程度を測定し、グループ別に脈絡膜に差があるかを確認した。

実験の結果、ＣＮＶが誘導された後、ｐｅｐ１を投与していない対照群の面積と比較したとき、ｐｅｐ１の全ての濃度（０．１、１、１０ｎＭ）の投与群において、漏出程度が減少することが確認できた（図５を参照）。

各群の全ての病変を、漏出程度に応じてグレード化（grade）し、各群別にグレードによる病変の比率をグラフで示した（図６を参照）。グレードは、１等級（臨床的に深刻しない漏出程度）、２Ａ等級（臨床的に並みの漏出程度）、２Ｂ等級（臨床的に深刻な漏出程度）で表した。対照群の比率と比較した場合、ｐｅｐ１の全ての濃度の投与群において、漏出程度が深刻な２Ｂ等級の病変の比率が減少することを確認した。特に、ｐｅｐ１を１、１０ｎＭの濃度で投与したとき、２Ｂ等級の病変の比率が明確に減少することが分かる。

前記実施例の結果をまとめると、ＣＮＶ活性度を、ＣＮＶ厚さ、ＣＮＶ面積、血管新生の漏出程度による病変の比率を含んだ３種類で測定した結果、ｐｅｐ１の投与の際にＣＮＶ活性度が減少する結果が出た。即ち、ｐｅｐ１が、ＣＮＶの活性度を減少することにより、ＣＮＶ関連の眼球疾患の治療及び予防に効果があることが立証された。従って、ｐｅｐ１を含んだ組成物は、眼球疾患の治療及び予防用薬学組成物として、眼球疾患の治療及び予防における使用可能性があることが分かる。
発明の開示の概要
〔項１〕
配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、該アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドを含む、眼疾患の治療及び予防用組成物。
〔項２〕
前記フラグメントは、３個以上のアミノ酸から構成されたフラグメントである、項１に記載の眼疾患の治療及び予防用組成物。
〔項３〕
前記眼疾患は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、血管新生緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬及び黄斑変性（macular degeneration）からなる群より選ばれる一つ以上である、項１に記載の眼疾患の治療及び予防用組成物。
〔項４〕
前記眼疾患は、加齢（age-related）眼疾患である、項１に記載の眼疾患の治療及び予防用組成物。
〔項５〕
前記ペプチドは、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor, ＶＥＧＦ）の活性を低下させることを特徴とする、項１に記載の眼疾患の治療及び予防用組成物。
〔項６〕
前記ペプチドは、脈絡膜血管新生を抑制することを特徴とする、項１に記載の眼疾患の治療及び予防用組成物。
〔項７〕
配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、該アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドを含む、脈絡膜血管新生の抑制用組成物。
〔項８〕
前記組成物は、薬学組成物であり、製薬学的に許容可能な賦形剤及び添加剤をさらに含む、項１から７のうちいずれか一つに記載の組成物。
〔項９〕
前記組成物は、食品組成物である、項１から７のうちいずれか一つに記載の組成物。
〔項１０〕
配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、該アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントの有効量を、眼疾患の治療又は予防の必要がある対象に投与するステップを含む、眼疾患の治療又は予防方法。
〔項１１〕
項１から７のうちいずれか一つに記載の組成物、及び説明書を含む、眼疾患の治療及び予防用キット。
〔項１２〕
前記説明書は、前記組成物を投与することに関する内容を含む、項１１に記載の眼疾患の治療及び予防用キット。
〔項１３〕
眼疾患において、項１から７のうちいずれか一つに記載の組成物を製造するための、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、該アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドの使用。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む、脈絡膜血管新生に起因する眼疾患の治療及び予防用組成物。
前記眼疾患は、黄斑変性（macular degeneration）である、請求項１に記載の眼疾患の治療及び予防用組成物。
前記眼疾患は、加齢（age-related）眼疾患である、請求項１に記載の眼疾患の治療及び予防用組成物。
前記ペプチドは、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor, ＶＥＧＦ）の活性を低下させることを特徴とする、請求項１に記載の眼疾患の治療及び予防用組成物。
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む、脈絡膜血管新生の抑制用組成物。
前記組成物は、薬学組成物であり、製薬学的に許容可能な賦形剤及び添加剤をさらに含む、請求項１から５のうちいずれか一つに記載の組成物。
前記組成物は、食品組成物である、請求項１から５のうちいずれか一つに記載の組成物。
請求項１から５のうちいずれか一つに記載の組成物、及び説明書を含む、脈絡膜血管新生に起因する眼疾患の治療及び予防用キット。
前記説明書は、前記組成物を投与することに関する内容を含む、請求項８に記載の眼疾患の治療及び予防用キット。
請求項１から５のうちいずれか一つに記載の眼疾患の治療及び予防用組成物の製造における、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの使用。
脈絡膜血管新生の抑制用組成物の製造における、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの使用。