CN1834255A - 加快并提高腺相关病毒介导的基因在视网膜细胞内表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种腺相关病毒介导的基因在视网膜细胞内表达的方法。本发明通过联合使用一定剂量范围的不同类型的腺病毒，能显著提高了腺相关病毒对视网膜细胞的转导效率和基因表达水平，且没有明显的毒、副作用。本方法经实验证实，条件复制型和复制缺陷型腺病毒在一定的剂量时可明显促进AAV₂介导的基因表达，同时未观察到细胞病变。本发明可用于指导眼底病的基因治疗，包括视网膜变性、黄斑变性、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎、脉络膜新生血管、视神经变性、损伤等。

Description

加快并提高腺相关病毒介导的基因在视网膜细胞内表达的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种腺相关病毒介导的基因在视网膜细胞内表达的方法。

背景技术

视网膜由神经视网膜和视网膜色素上皮(简称RPE)共同组成，神经视网膜位于眼球壁的最内侧，RPE位于神经视网膜的外侧。二者在组织发生、结构和功能方面具有密切的关系。在胚胎发育早期前脑前端的神经外胚层向两侧突出形成眼泡，不久眼泡顶部凹陷形成眼杯，其内层发育为神经视网膜，其外层发育为RPE，二层间紧密相邻，但存在一潜在的腔隙，称视网膜下腔。神经视网膜主要由三种不同类型的细胞组成，在视觉的感知和传导过程中起重要作用。RPE细胞呈立方状，紧密排列成单层。此外，RPE细胞有极性。紧邻感光细胞一侧发出许多细小的突起，称微绒毛，感光细胞的外节插在RPE细胞的微绒毛间。RPE参与构成血-眼屏障，并具有营养、支持感光细胞的功能。当RPE细胞异常时，如：发生变性不能吞噬感光细胞脱落的外节，或不能产生营养物质等，可导致感光细胞变性、凋亡。总之，神经视网膜和RPE都是视网膜的重要组成成分，在维持视网膜的正常功能方面均发挥十分重要的作用。

视网膜的许多疾病，如视网膜色素变性、老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等，是致盲的最重要原因，目前均无有效的治疗方法。

视网膜变性包括多种眼底退行性病变，最常见的是原发性视网膜色素变性。视网膜色素变性是一组以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性视网膜变性疾病。以青壮年发病多见，世界各国发病率为1/3000-1/5000，据估计目前全世界已有患者约150万人。是眼底病致盲重要的原因之一。视网膜色素变性有多种遗传方式，可为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、性连锁隐性遗传，约1/3为散发病例。视网膜色素变性表现为光感受器功能异常，而大多数病例视杆细胞受累最严重，使得患者暗视力受损严重。ERG病变早期即显著异常，甚至无波形。

另外一种常见的视网膜疾病为老年性黄斑变性，是西方国家老年人致盲最主要的原因。随着我国人口日趋老龄化，我国老年性黄斑变性患者日益增多，已成为眼科防盲研究的重点课题之一。患者眼底可有不同表现形态，根据临床表现和病理改变的不同分为两型：干性型和湿性型。老年性黄斑变性累及视网膜色素上皮、感光细胞层和脉络膜多层组织。确切的病因尚不明。可能的发病机制顺序为：RPE功能障碍、RPE细胞内物质积聚、细胞外基质异常聚集基底膜、Bruch膜结构改变、Bruch膜对营养物质的通透能力改变、RPE对代谢障碍的反应等，最终导致老年性黄斑变性。

脉络膜毛细血管萎缩者称为干性型；脉络膜毛细血管通过Bruch膜的裂隙进入色素上皮下，形成新生血管者称为湿性型。干性老年性黄斑变性的特点为视网膜外层、色素上皮层、Bruch膜、脉络膜毛细血管不同程度的萎缩变性，可见色素上皮下大小不一的黄白色类圆形的玻璃膜疣，有时可以融合，色素上皮增生和萎缩，使后极部色素紊乱，视功能不同程度受损。湿性老年性黄斑变性的特点为视网膜外层、色素上皮层、Bruch膜、脉络膜毛细血管不同程度的萎缩变性，可见色素上皮大小不一的黄白色类圆形的玻璃膜疣，有时可以融合，色素上皮增生和(或)萎缩，使后极部色素紊乱，视功能不同程度受损。

湿性老年性黄斑变性临床表现为老年人突然视力下降、视物变形或出现中央暗点。眼底后极部视网膜下出血、渗出，其中有时可见灰黄色病灶，可能有新生血管膜存在。位于神经上皮下或色素上皮下的出血颜色暗红，甚至呈黑色，边缘略红，同时可有浅层鲜红色出血，附近有时仍可见玻璃膜疣，病变区可隆起。荧光血管造影视网膜下典型的新生血管，在造影早期出现边界清楚的血管形态，迅速出现荧光素渗漏而边界不清，造影晚期仍呈相对的高荧光。如大量浅层出血可进入玻璃体，致使玻璃体积血眼底不能窥入。日久后，出血机化，病变区形成盘状瘢痕，中心视功能完全丧失。

此外，随着社会经济条件的改善，人的寿命显著延长，我国及世界范围内糖尿病患者日渐增多。糖尿病可致眼部各种组织发生病变，视网膜新生血管及所致出血是糖尿病眼病不可逆盲的严重并发症。针对糖尿病视网膜病变新生血管目前除了激光光凝外，没有其他有效方法，但激光光凝不能用于黄斑新生血管。

基因治疗可望延缓这类疾病的进展并最终起到治疗的作用。通过基因转移延缓视网膜神经细胞变性凋亡、抑制视网膜新生血管形成可望解决这类疾病的治疗问题。基因转移需要载体来介导，目前有许多不同类型的基因传递载体，但腺相关病毒(简称AAV)是视网膜疾病基因治疗最常选用的。由于AAV的宿主范围广，能够感染包括神经细胞在内的多种类型的细胞，并能够介导治疗基因较长时间表达，因此，一般认为比较适合作为视网膜疾病的基因传递载体。但在实际应用AAV作为基因传递载体时发现，无论是将AAV注射到视网膜下间隙还是玻璃体腔内，单独使用AAV时视网膜神经细胞或RPE细胞被感染的效率和治疗基因的表达水平均较低，通常要等一、二周后才能检测到治疗基因表达，虽然其表达水平可逐渐增加，一、二月后到高峰，但即使达到高峰其表达水平仍然较低，很难达到基因治疗的效果。

提高AAV介导的基因转导效率和基因表达水平，是促进基因治疗在视网膜疾病临床应用前迫切需要解决的关键问题。尽管目前在AAV的生产和纯化工艺方面做了大量改进，但仅仅依靠提高病毒滴度和用量已没有太多空间和余地。此外，由于眼球和视网膜的结构特殊，不可能无限加大AAV的用量。鉴于野生型腺病毒是AAV复制的辅助病毒，但野生型腺病毒感染有致病或使视网膜细胞发生变性的潜在危险。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种加快并提高腺相关病毒(简称AAV)介导的基因在视网膜细胞内表达的方法。

本发明的进一步目的是通过本方法提高腺相关病毒对视网膜细胞的转导效率和所介导的外源基因的表达水平，从而改善眼底病的治疗效果。

本发明通过联合使用条件复制或复制缺陷型腺病毒，并调整条件复制或复制缺陷型腺病毒的用量及与AAV的比例，实现简便、有效的加快并提高AAV介导的基因在视网膜RPE细胞及神经细胞内表达的方法。

从AAV被发现的过程和随后揭示的AAV生活周期看，AAV是作为腺病毒的伴随病毒被发现的，是一种单链DNA病毒，感染细胞后常常以潜伏形式存在。腺病毒和单纯疱疹病毒是AAV的辅助病毒，当AAV与腺病毒或单纯疱疹病毒一起感染时，腺病毒和单纯疱疹病毒可帮助AAV复制，产生子代AAV；或处于潜伏状态的AAV，在腺病毒或单纯疱疹病毒超感染时，腺病毒或单纯疱疹病毒可帮助AAV从潜伏状态拯救出来，产生子代AAV。腺病毒或单纯疱疹病毒的某些基因担负这样的辅助功能，现在已经明确腺病毒的E1A、E1B、E2A和E4ORF6等基因有此功能。因此，在生产AAV时必须加入腺病毒或单纯疱疹病毒。

用于基因治疗的AAV载体称重组AAV(rAAV)，由于AAV的基因组容量较小，仅5kb，其中ITR是AAV包装必须的。故在基因治疗用rAAV载体中只保留了ITR，给外源基因4.7kb的容量。AAV的其它基因如rep、cap等只是在AAV包装时必须，故只在生产rAAV时由其他载体反式提供。

重组AAV(rAAV)介导的基因在靶细胞内的表达与以下因素有关：一是细胞膜表面的受体，现在已经发现与AAV结合和内吞有关的细胞膜表面受体有：硫酸乙酰肝素糖蛋白、αv β5整合素、成纤维细胞生长因子受体1、肝细胞生长因子受体2及c-Met等。由于硫酸乙酰肝素糖蛋白在不同的种属及不同类型的细胞表面广泛表达，因此，AAV的宿主范围较广；二是被内吞后转移到细胞核的过程，包括转运和脱衣壳；三是在核内AAV携带的基因的去向。AAV进入细胞核后的去向受许多因素影响，简单地讲，有两条路。当有辅助病毒存在时，单链DNA迅速复制形成双链DNA，同时AAV的基因也大量表达。当有rep及cap蛋白产生时，新合成的双链DNA解链，仍以单链形式被包装成新的子代病毒颗粒。若没有辅助病毒存在时，AAV的基因表达程序自动被抑制，倾向潜伏起来，野生型AAV在rep蛋白的帮助下可定点整合到人类19号染色体q13.3-qter区。rAAV因缺乏rep，若发生整合，整合为随机的。值得一提的是，对于处于潜伏状态的AAV，当发生辅助病毒超感染时，在辅助病毒的帮助下，AAV的基因表达程序可被激活，引起AAV rep介导的拯救，重新合成DNA及表达病毒蛋白，包装新的子带病毒颗粒。辅助病毒也可帮助rAAV从重组质粒骨架中拯救出来，合成并重新包装成新的病毒颗粒。还要提到的是，在某些特殊情况下，即使没有辅助病毒存在，AAV也可以复制并产生新的子代病毒，已经确定的这类特殊情况有：DNA受到损伤时，如UV照射后、离子辐射后，或使用基因毒性化学药品等如使用丁酸钠等；或代谢受到抑制时。

实际上，AAV进入细胞后的情况远比前面讲的复杂，特别是rAAV，由于完全缺乏病毒蛋白，其命运完全依赖宿主细胞。但有一点特别要强调，即进入细胞内的单链AAV或rAAV是不能表达的，其携带的基因要表达必须转变成双链，只有双链DNA才具有转录能力。最近的研究结果表明，AAV进入靶细胞后，游离的单链状态的AAV基因组只能存在很短时间，其中大部分被靶细胞的酶识为损伤DNA而被降解。在某些情况下，AAV脱衣壳后其单链DNA可转变成双链DNA。单链DNA转变成双链DNA可能有以下二条途径：一条是以AAV DNA为模版合成另一条链，有研究报告腺病毒的E4ORF6基因、UV照射以及基因毒性化学药品等可增强这个过程；另一条是来自两个AAV病毒颗粒、极性相反的单链退火形成双链。因为AAV是单链DNA病毒，末端的ITR折叠形成发夹样的结构，复制是从AAV基因组折叠的3’端以AAV基因组作为模版合成双链DNA，双链DNA再解链，正、负链以同等的效率被包装成新的病毒颗粒。故感染细胞后正、负链可通过退火形成双链。此后，双链AAV DNA基因组在ITR处可通过分子内或分子间的重组形成环形或链状的串联体，这种环形或链状的串联体可以核外染色体形式长期存在。有报道AAV感染小鼠肝脏后，形成的双链DNA中，90％是以环形或链状的核外染色体形式存在，仅10％为整合到宿主细胞基因组染色体的双链分子。

在基因治疗中，所采用的都是缺乏病毒基因组的rAAV，rAAV进入细胞后的命运及是否能有效表达完全取决于宿主细胞。但有一点是肯定的，由于缺乏辅助病毒的帮助，rAAV的转导效率是低的。

rAAV所携带的治疗基因要在靶细胞中迅速、长期、稳定、高水平表达的前提是rAAV复制，而不涉及将rAAV包装成新的病毒颗粒。

根据野生型腺病毒是AAV复制的辅助病毒，可帮助rAAV复制和基因表达，在同时有rep、cap编码基因存在时，可帮助包装成新的病毒颗粒；在没有rep、cap编码基因存在时，虽然不能包装成新的病毒颗粒，但仍然可帮助rAAV复制和基因表达。但是，由于野生型腺病毒感染后，其复制不受控制，故有致病或使视网膜细胞发生变性的潜在危险。因此，本发明不采用野生型腺病毒。

根据野生型腺病毒帮助AAV复制的基因主要是E1A、E1B、E2A及E4ORF6。故本发明中，采用条件复制型腺病毒给rAAV提供E1A、E1B、E2A及E4ORF6等基因。本发明采用端粒酶逆转录酶基因启动子及热休克蛋白基因启动子调控E1A、E1B基因表达。由于端粒酶逆转录酶基因及热休克蛋白基因在正常视网膜细胞内活性较低，因此，条件复制型腺病毒其E1A、E1B基因在视网膜细胞内的产生是严格受到调控的，其在视网膜细胞内的复制也是严格受到调控的。本发明采用条件复制型腺病毒不仅可帮助AAV复制，提高AAV携带的外源基因的表达水平，同时也显著降低了腺病毒的致病性和副作用，提高了基因治疗的安全性。考虑到复制缺陷型腺病毒也是一种较安全的载体系统，尽管复制缺陷型腺病毒不能提供E1A、E1B基因，但可提供rAAV复制有关的E2A和E4ORF6等基因。在本发明中，也探讨了能提供E2A和E4ORF6基因的复制缺陷型腺病毒在促进rAAV复制和外源基因表达水平方面的作用和价值。

除了联合使用条件复制或复制缺陷型腺病毒外，在使用条件复制或复制缺陷型腺病毒时，为了达到既提高rAAV的转导效率，又避免使用腺病毒可能带来的毒、副作用，确定了视网膜局部使用条件复制或复制缺陷型腺病毒的有效和安全剂量，以及rAAV与条件复制或复制缺陷型腺病毒联合应用的比例。本发明通过体内和体外实验证实了所提出的方案是有效的。

本发明所涉及的各种病毒的来源与制备方法如下：

①野生型腺病毒为DL309(美国杜克大学放射肿瘤系李川源教授提供)，有完整的E1A、E1B和部分E3基因。DL309的使用剂量分别为1×10³、1×10⁴和1×10⁵空斑形成单位(pfu)。

②带GFP报告基因的2型及1型腺相关病毒AAV₂-GFP及AAV_1/2-GFP，用于延缓视网膜变性的AAV₂-CNTF(购自本元正阳基因技术有限公司)。

③所述的二种条件复制型腺病毒，即Ad-TERT-E1A/E1B和Ad-HSP-E1A/E1B，携带E1A、E1B、E2A及E4ORF6编码基因，其构建方法如下：

A.Ad-TERT-E1A/E1B构建方法

分离克隆人端粒酶逆转录酶基因(TERT)的启动子：采用引物5’-tcatggcccctccctcgg-3’及5’-cgcgggggtggccggg-3’，以人胚胎肾细胞HEK293为模板，PCR扩增人端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序，反应条件为：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共30个周期。PCR产物长453bp，测序结果如序列1。

检测人端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序的活性与特异性：将人端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序插入真核表达质粒pEGFP-1的多克隆位点处，构建受人端粒酶逆转录酶基因调控的EGFP表达质粒pTERT-EGFP-1。转化大肠杆菌DH5α后，挑选转化子，进一步经限制性内切酶鉴定有插入片段。分别转染人胚肾293细胞、肿瘤细胞及正常成纤维细胞，观察GFP表达情况，确定人端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序具有在端粒酶逆转录酶活性较高的细胞内选择性表达的能力。

构建受人端粒酶逆转录酶基因调控的条件复制型腺病毒载体：用限制性内切酶自E1A、E1B表达载体中切下E1A、E1B编码基因，然后插入到pTERT-EGFP-1，取代其中的EGFP的cDNA，构建受人端粒酶逆转录酶基因调控的E1A、E1B表达质粒pTERT-E1A/E1B。进一步用限制性内切酶从表达质粒pTERT-E1A/E1B中切下含TERT启动子、E1A、E1B编码基因及PolyA尾的表达盒，插入穿梭质粒pENTR1A的多克隆位点处，再与带有腺病毒完整基因的大质粒在LR clones酶的作用下重组。重组子转染大肠杆菌BJ5183。从转化子中抽提DNA，酶切鉴定筛选含腺病毒基因组的质粒DNA，大量扩增后Pac I消化使其线性化。转染293细胞，包装腺病毒。再经三轮空斑筛选，选出稳定的毒株，大量扩增、纯化，用于细胞和动物实验。

B.Ad-HSP-E1A/E1B构建方法

分离克隆人热休克蛋白基因70B(HSP70B)的启动子：以HEK-293细胞DNA为模板，采用引物5’-GGTCGAGGCGCGTCCTCAGAGCCA-3’及5’-AGGTCGACTAGAAGCTTCTTGTCG-3’，PCR扩增HSP70B基因5’端调控顺序。PCR扩增条件为94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1分钟，25个周期。PCR产物长420bp，经测序结果如序列2。

产物先插入TA cloning载体pCR-Blunt内，再经限制性内切酶EcoRI消化后，连接到载体pEGFP-1(Clontech，Carlbad，CA)多克隆位点内的EcoRI位点处，构建受加热调控的EGFP表达质粒pHSP-EGFP-1。转化大肠杆菌DH5α后，挑选转化子，进一步经限制性内切酶鉴定有插入片段。转染人胚肾293细胞，24小时后置42℃水浴中加热30分钟，再培养24小时。对照不加热。荧光显微镜观察GFP表达情况，确认人热休克蛋白基因5’端调控顺序在加热后能诱导GFP高水平表达。

构建受人热休克蛋白基因调控的条件复制型腺病毒载体：用限制性内切酶自E1A/E1B表达载体中切下E1A、E1B编码基因，然后插入pHSP-EGFP-1，取代其中的EGFP的cDNA，构建受人端粒酶逆转录酶基因调控的E1A/E1B表达质粒pHSP-E1A/E1B。进一步用限制性内切酶从表达质粒pHSP-E1A/E1B中切下含HSP启动子、E1A、E1B编码基因及PolyA尾的表达盒，插入穿梭质粒pENTR1A的多克隆位点处，再与带有腺病毒完整基因的大质粒在LR clonase酶的作用下重组。重组子转染大肠杆菌BJ5183。从转化子中抽提DNA，酶切鉴定筛选含腺病毒基因组的质粒DNA，大量扩增后Pac I消化使其线性化。转染293细胞，包装腺病毒。再经三轮空斑筛选，选出稳定的毒株，大量扩增、纯化，用于细胞和动物实验。

④本发明所涉及的一种复制缺陷型腺病毒Ad-Luc，其与DL309或条件复制型腺病毒的不同之处在于缺乏E1A、E1B编码基因，但携带E2A及E4ORF6编码基因。可以感染人类细胞，但不能复制。其构建方法如下：

用限制性内切酶自含有Luc编码基因的表达质粒中切下Luc编码基因，插入穿梭质粒pENTR1A的多克隆位点处，再与带有腺病毒完整基因的大质粒在LR clonase酶的作用下重组。重组子转染大肠杆菌BJ5183。从转化子中抽提DNA，酶切鉴定筛选含腺病毒基因组的质粒DNA，大量扩增后Pac I消化使其线性化。转染293细胞，包装腺病毒。再经三轮空斑筛选，选出稳定的毒株，大量扩增、纯化，用于细胞和动物实验。

本发明所涉及的各种细胞其来源和培养方法如下述：

成人RPE细胞(APRE-19)为ATCC产品，原代培养的成人RPE细胞、原代培养的成人视网膜神经细胞、原代培养的新生SD大鼠视网膜神经细胞按消化培养方法进行。具体方法为：取出大鼠眼球后，75％酒精消毒。沿角膜缘将眼球剪成两部分。取含有视网膜的部分，放入盛有PBS的培养皿中用吸管吹打，分离得到视网膜，剪碎，离心1000转/5分钟，弃上清，加入一倍体积的0.25％Try-EDTA 37℃消化20分钟，吸出0.25％Try-EDTA后加入含有15％FBS的DMEM/F12培养基(Invitrogen Inc)吹打细胞成细胞悬液。显微镜下计数，以每孔2×10⁵的细胞数量分至6孔板中，置37℃、CO2体积分数为5％的培养箱内培养，7天换液。

细胞培养采用6孔细胞培养板，每孔接种2×10⁵RPE细胞(APRE-19，ATCC或原代培养的RPE)，或2×10⁶胰蛋白酶消化的成人RPE细胞、成人视网膜神经细胞、新生SD大鼠视网膜神经细胞。

本发明通过下述步骤实现：

在6孔细胞培养板中联合加入腺病毒和rAAV。腺相关病毒的用量为每一个细胞大约5×10²-5×10³病毒颗粒。所述rAAV病毒有二种，一种是血清型2型，另一种是血清型1型但基因型2型的1/2型嵌合型，二者均带有GFP报告基因。所述腺病毒有三种，其中条件复制型腺病毒又有二种：一种是端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序调控E1A、E1B表达的复制型腺病毒，另一种是热休克蛋白基因5’端调控顺序调控E1A、E1B表达的复制型腺病毒，病毒的用量为0.005-5pfu；其中复制缺陷型腺病毒一种：携带Luc报告基因，病毒的用量为0.005-5pfu；野生型腺病毒为DL309，其用量为0.005-0.5pfu。

由于仅rAAV携带GFP报告基因，GFP的表达反映rAAV转导和表达效率。荧光显微镜观察及流式细胞依检测结果表明，单独应用5×10²-5×10³AAV₂-GFP，感染后第5天(120小时)起才能观察到GFP表达，总体上讲GFP阳性表达细胞数量少、亮度弱。应用5×10²AAV₂-GFP感染人RPE细胞后7天流式细胞仪检测，GFP阳性率仅6.29％，平均亮度1.62；当AAV₂-GFP的用量为5×10³，感染后7天流式细胞仪检测，GFP阳性率为13.5％，GFP的平均亮度为2.75。

本发明实验结果表明：

在使用AAV₂-GFP感染人RPE细胞时，同时加入野生型腺病毒(DL309)，GFP的表达明显提前、表达量也明显增加。当AAV₂-GFP的用量为5×10²，同时加入0.005-0.5pfu的DL309，第2天(48小时)便可观察到GFP表达，GFP阳性细胞数明显增加，GFP的平均亮度也增高，但同时出现明显的细胞病变，表现为细胞变圆，最后漂浮脱落。例如同时加入0.5pfuDL309，感染后7天做流式分析，其孔中的细胞全部脱落，不能分析；同时加入0.05pfu DL309，感染后7天做流式分析，孔中大部分细胞脱落，多数为死细胞，GFP阳性细胞反而下跌至6.54％，平均亮度为1.71。另一组AAV₂-GFP的用量为5×10³，同时加入0.05-0.5pfuDL309，GFP表达明显提前，于感染后第1天(24小时)即可见GFP表达，感染后第5天流式细胞仪检测，GFP阳性细胞分别占71.2％和36.1％，GFP的平均亮度分别为7.32和4.43，其中DL309使用量为0.5组RPE细胞有明显病变，而DL309使用量为0.05组RPE细胞形态较好，无明显细胞病变发生，但7天后也出现明显细胞病变。

在使用AAV₂-GFP感染人RPE细胞时，同时加入条件复制型腺病毒，也可使GFP表达时间明显提前，第2天(48小时)即可观察到GFP表达，GFP阳性细胞数明显增加，GFP的平均亮度也增高。当AAV₂-GFP用量为5×10²，同时加入0.05pfu Ad-TERT-E1A/E1B，感染后7天流式细胞仪检测，GFP阳性表达细胞达55.1％，平均亮度2.74，GFP阳性表达细胞形态好，未见任何细胞病变现象；加入0.5pfu Ad-TERT-E1A/E1B，GFP阳性表达细胞达40.5％，平均亮度5.05，但少数GFP阳性细胞出现变圆脱落的病变现象。当AAV₂-GFP用量为5×10³时，同时加入0.05pfu Ad-TERT-E1A/E1B，7天后流式细胞仪检测，GFP阳性表达率52％，平均亮度4.59，GFP阳性表达细胞形态好，未见任何细胞病变现象；加入0.5pfu Ad-TERT-E1A/E1B，GFP阳性表达率60.7％，平均亮度6.12，少数GFP阳性细胞出现变圆脱落的病变现象。

在使用AAV₂-GFP感染人RPE细胞时，若同时加入复制缺陷型腺病毒，也可使GFP表达的时间明显提前，第2天(48小时)即可观察到GFP表达，GFP阳性细胞数明显增加，GFP的平均亮度也增高。当AAV₂-GFP用量为5×10²时，同时加入0.5pfu Ad-Luc，感染后7天流式细胞仪检测，GFP阳性细胞达26.8％，平均亮度2.23；加入5pfu Ad-Luc，GFP阳性细胞达52.7％，平均亮度6.87。当AAV₂-GFP用量为5×10³时，加入0.5pfu Ad-Luc，感染后7天流式细胞仪检测，GFP阳性表达率为40.4％，平均亮度3.71。加入5pfu Ad-Luc，GFP阳性表达率为63.3％，平均亮度6.9。加入复制缺陷型腺病毒的各组均未发现细胞出现明显变圆、脱落等细胞病变现象。

Western blot分析以上各组GFP蛋白表达量，单独应用AAV₂-GFP感染人RPE细胞时，GFP阳性信号很弱，同时加入条件复制型腺病毒或复制缺陷型腺病毒，GFP表达明显增加，比较不同类型及不同剂量腺病毒对GFP表达的影响。感染后5天收集细胞，比较0.5pfuAd-TERT-E1A/E1B与5pfu Ad-Luc，或0.05pfuAd-TERT-E1A/E1B与0.5pfu Ad-Luc，前者(Ad-TERT-E1A/E1B)GFP表达均比后者明显；比较0.05pfuAd-TERT-E1A/E1B与0.5pfu Ad-TERT-E1A/E1B，或0.5pfuAd-Luc与5pfuAd-Luc，高剂量组GFP表达比低剂量组明显。

必须强调的是，加入0.005-0.05pfu Ad-TERT-E1A/E1B或0.005-0.5pfuAd-HSP-E1A/E1B，未见被感染细胞有明显病变，未出现加入DL309时细胞变圆脱落现象；Ad-TERT-E1A/E1B用量为0.5pfu时，较多细胞明显变圆、脱落，出现明显的病变，而Ad-TERT-E1A/E1B用量为0.005pfu时，表达GFP的阳性细胞数明显降低。

除了上述建株的RPE细胞外，本发明单独使用AAV₂-GFP或联合使用野生型腺病毒与AAV₂-GFP感染原代培养的成人RPE细胞、人视网膜神经细胞及大鼠视网膜神经细胞均获得了与建株的RPE细胞相同的结果。

本发明还采取同样的方法对1/2嵌合型腺相关病毒AAV_1/2-GFP对RPE细胞及神经细胞的转导效率和外源基因表达水平进行检测分析，获得了与2型AAV₂-GFP腺相关病毒一致的结果。

结果显示：

AAV₂单独感染视网膜细胞时，如感染RPE细胞时，所携带的外源基因GFP表达出现的时间较晚，阳性率较低，表达量亦低；加入一定量的腺病毒后，能促使AAV介导的基因开始表达的时间明显提前、表达量也明显增加。

不同类型的腺病毒对AAV表达的影响存在明显差异，其中野生型腺病毒在促使AAV介导的基因表达提前和增加的作用最明显，但存在较明显的细胞毒性，可导致RPE细胞变性、死亡；条件复制型腺病毒moi在0.05-0.5pfu时，相对比较安全，既能诱导AAV介导的基因表达时间提前，阳性率明显增加，表达量也明显增加，同时又没有明显的细胞病变；复制缺陷型腺病毒moi在0.5-5pfu时，促使AAV₂-GFP介导的基因表达提前和表达量增加的作用稍微逊于条件复制型腺病毒，但更加安全，感染后期GFP表达的效率和表达量也较高。

通过AAV₂-GFP观察2型腺相关病毒对视网膜细胞转导的细胞特异性，2型腺相关病毒能转导RPE细胞、部分外核层的细胞(即光感受器)、少量节细胞；联合使用腺病毒后，2型腺相关病毒能转导RPE细胞、部分外核层的细胞(即光感受器)、少量节细胞；并可见内核层的部分细胞及视网膜内、外网状层呈现阳性着色。阳性着色较单独应用腺相关病毒明显。

本方法经实验证实，条件复制型和复制缺陷型腺病毒在一定的剂量时可明显促进AAV₂介导的基因表达，同时未观察到细胞病变。本发明可用于指导眼底病的基因治疗，包括视网膜变性、黄斑变性、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎、脉络膜新生血管、视神经变性、损伤等。

附图说明

图1-4是荧光显微镜照相观察分别被AAV₂-GFP或AAV₂-GFP联合各种腺病毒感染的RPE细胞GFP表达情况。

其中，图1：单独应用AAV₂-GFP 1×10e9感染RPE细胞后第5天，细胞生长良好，荧光显微镜下可见表达GFP的细胞数量少，散在分布，GFP荧光强度弱，A和B为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，×100；C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，×400。

图2：AAV2-GFP 1×10e9联合野生型腺病毒1×10e3感染RPE细胞后第5天，大部分细胞变圆，漂浮，可见部分细胞表达GFP，但有些荧光为细胞凋亡后的自发荧光，A和B为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，×100；C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，×400。

图3：AAV2-GFP 1×10e9联合Ad-TERT-E1A/E1B腺病毒1×10e5感染RPE细胞后第5天，细胞生长良好，未见明显死亡及漂浮的细胞，表达GFP荧光的RPE细胞数量多，荧光强度明显增强，A和B为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，×100；C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，×400。

图4：AAV2-GFP 1×10e9联合复制缺陷型腺病毒Ad-Luc 1×10e5感染RPE细胞后第5天，细胞生长良好，未见明显死亡及漂浮的细胞，表达GFP荧光的RPE细胞数量多，荧光强度明显增强，A和B为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，×100；C和D为同一视野下RPE细胞的荧光照片和黑白照片，×400。

图5是流式细胞仪观察分别被AAV₂-GFP或AAV₂-GFP联合各种腺病毒感染的RPE细胞GFP表达情况。

其中A：AAV2-GFP 1×10e9感染RPE细胞后第7天，流式细胞仪检测RPE细胞GFP表达阳性率(13.5％)的二维图，

B：AAV2-GFP 1×10e9联合Ad-TERT-E1A/E1B腺病毒1×10e5感染RPE细胞后第7天，流式细胞仪检测RPE细胞GFP表达阳性率(60.7％)的二维图，

C：AAV2-GFP 1×10e9联合复制缺陷型腺病毒Ad-Luc 1×10e6感染RPE细胞后第7天，流式细胞仪检测RPE细胞GFP表达阳性率(52％)的二维图。

图6是Western blot检测分别被AAV₂-GFP或AAV₂-GFP联合各种腺病毒感染的RPE细胞GFP表达情况。

其中，AAV2-GFP 1×10e9联合1×10e5和1×10e4条件复制型腺病毒Ad-TERT-E1A/E1B或1×10e6和1×10e5复制缺陷型腺病毒Ad-Luc感染RPE细胞后第5天，Westernblot检测细胞内GFP表达量，从高到低的顺序为：AAV2-GFP联合1×10e5Ad-TERT-E1A/E1B、AAV2-GFP联合1×10e6Ad-Luc、AAV2-GFP联合1×10e4Ad-TERT-E1A/E1B、AAV2-GFP联合1×10e5Ad-Luc、单独使用AAV2-GFP，单独使用AAV2-GFP时条带很弱，以至于无法看到。

图7是单独应用AAV₂-CNTF或联合应用AAV₂-CNTF与腺病毒对RCS大鼠视网膜光感受器的保护作用。其中：单独应用AAV2-CNTF 1×10e^-10或联合应用AAV2-CNTF 1×10e¹⁰与条件复制型腺病毒Ad-TERT-E1A/E1B 1×10e5和1×10e4，经内路法注射入3周龄RCS大鼠视网膜下间隙后第5周，HE切片观察联合应用AAV2-CNTF 1×10e10与条件复制型腺病毒时视网膜内外核层存留的细胞数目较单独应用AAV2-CNTF 1×10e10时多，A：未经治疗时RCS大鼠视网膜外核层细胞几乎全部发生凋亡，丧失；×400B：单独应用AAV2-CNTF 1×10e10时RCS大鼠视网膜内可见有3-4层外核层细胞存留，×400；C：联合应用AAV2-CNTF 1×10e10与条件复制型腺病毒Ad-TERT-E1A/E1B 1×10e4时RCS大鼠视网膜内可见有5-6层外核层细胞存留，×400；D：联合应用AAV2-CNTF 1×10e10与条件复制型腺病毒Ad-TERT-E1A/E1B 1×10e5时RCS大鼠视网膜内可见有5-6层外核层细胞存留，×400。

具体实施方式

实施例1

野生型腺病毒加快和提高AAV对视网膜细胞的转导效率和基因表达水平，但同时导致视网膜细胞病变

按每孔2×10⁵将RPE(APRE-19，ATCC)细胞接种在6孔细胞培养板中，24小时后细胞贴壁，分别将1×10⁸或1×10⁹AAV₂-GFP与1×10³、1×10⁴或1×10⁵DL309加入培养的细胞中，然后每天用荧光显微镜观察并照相记录被感染的细胞GFP荧光的亮度、细胞形态与病变状态。5-7天后胰蛋白酶消化，流式细胞仪检测GFP阳性细胞数及GFP荧光强度、PCR及Western blot检测GFP基因拷贝数与GFP表达量。

上述检测结果显示，当AAV₂-GFP病毒用量为1×10⁸时，不加DL309的细胞，第5天(120小时)起才能观察到GFP表达，总体上讲GFP阳性表达细胞数量少、亮度弱，7天时流式细胞仪检测GFP阳性率为6.29％，平均亮度1.62。见图1、5、6。若加入1×10⁴或1×10⁵DL309，GFP表达时间明显提前，第2天(48小时)便可观察到GFP表达，GFP阳性细胞数明显增加，GFP的平均亮度也增高，但出现明显的细胞病变，表现为细胞变圆，最后漂浮脱落。7天时做流式分析，加入1×10⁵DL309，其孔中的细胞全部脱落，不能分析；加入1×10⁴DL309，其孔中的细胞也大部分脱落，多数为死细胞，GFP阳性细胞反而下跌至6.54％，平均亮度为1.71。在另一组实验中，当AAV₂-GFP的用量为1×10⁹，不加DL309的RPE细胞，第5天起开始观察到GFP表达，总体上讲GFP阳性表达细胞数量少、亮度弱，但比AAV₂-GFP使用量为1×10⁸组明显多、明显亮，7天时流式细胞仪检测GFP阳性率为13.5％，GFP的平均亮度为2.75；加入1×10³或1×10⁴DL309，GFP表达明显提前，于感染后第1天(24小时)即可见GFP表达，感染后第5天流式细胞仪检测GFP阳性细胞分别占71.2％和36.1％，GFP的平均亮度分别为7.32和4.43，其中DL309使用量为1×10⁴组RPE细胞有明显病变，而DL309使用量为1×10³组RPE细胞形态较好，无明显细胞病变发生。见图2、5、6。

上述结果表明，单独使用腺相关病毒时，腺相关病毒对视网膜细胞的转导和表达效率较低，其转导和表达效率与病毒用量有一定关系；联合应用野生型腺病毒可明显提前并提高腺相关病毒介导的基因的转导和表达效率，但野生型腺病毒的用量十分关键，即使用量为0.005个pfu，对RPE细胞仍有明显的毒性，会引起细胞变性、死亡。

实施例2

条件复制型腺病毒加快和提高AAV对视网膜细胞的转导效率和基因表达水平

条件复制型腺病毒与野生型腺病毒DL309不同，虽带有E1A、E1B基因，但其表达分别受TERT基因启动子或HSP基因启动子调控。因此，其复制在一定程度上受到调控，安全性较好、毒副作用较小。体外实验中Ad-TERT-E1A/E1B、Ad-HSP-E1A/E1B的用量分别是1×10³-1×10⁶pfu。AAV₂-GFP的用量分别是1×10⁸和1×10⁹病毒颗粒；针对每个RPE细胞，腺相关病毒的用量大约为5×10²-5×10³个病毒颗粒，条件复制型腺病毒的用量约为0.005-5个pfu。条件复制型腺病毒与腺相关病毒用量的比例分别为1∶1×10²-1∶1×10⁵；每个神经细胞的用量大致为10⁴-10⁵个病毒颗粒，条件复制型腺病毒的用量大约为0.1-100pfu。条件复制型腺病毒与腺相关病毒用量的比例分别为1∶1×10²-1∶1×10⁵。

按每孔2×10⁵将RPE(APRE-19，ATCC)细胞接种在6孔细胞培养板中，24小时后细胞贴壁，分别将1×10⁸或1×10⁹AAV₂-GFP与1×10³、1×10⁴、1×10⁵或1×10⁶Ad-TERT-E1A/E1B或Ad-HSP-E1A/E1B加入培养的细胞中，然后每天用荧光显微镜观察并照相记录被感染的细胞GFP荧光的亮度、细胞形态与病变状态。7天后胰蛋白酶消化，流式细胞仪检测GFP阳性细胞数及GFP荧光强度、PCR及Western blot检测GFP基因拷贝数与GFP表达量。

当AAV₂-GFP用量为1×10⁸时，单独使用AAV₂-GFP，第7天时流式细胞仪检测GFP阳性表达细胞仅占6.29％，平均亮度1.62；加入1×10⁴Ad-TERT-E1A/E1B，GFP阳性表达细胞达55.1％，平均亮度2.74；加入1×10⁵Ad-TERT-E1A/E1B，GFP阳性表达细胞达40.5％，平均亮度5.05。

当AAV₂-GFP病毒用量为1×10⁹时，不加条件复制型腺病毒的细胞，第5天(120小时)起才能观察到GFP表达，总体上讲GFP阳性表达细胞数量少、亮度弱，7天时流式细胞仪检测GFP阳性率为13.5％，GFP的平均亮度为2.75。加入条件复制型腺病毒，GFP表达时间明显提前，第2天(48小时)便可观察到GFP表达，GFP阳性细胞数明显增加，GFP的平均亮度也增高。7天时流式细胞仪检测加入1×10⁴Ad-TERT-E1A/E1B，GFP阳性表达率52％，平均亮度4.59；加入1×10⁵Ad-TERT-E1A/E1B，GFP阳性表达率60.7％，平均亮度6.12；加入1×10⁴Ad-HSP-E1A/E1B，GFP阳性表达率39.7％，平均亮度3.37；加入1×10⁵Ad-HSP-E1A/E1B，GFP阳性表达率46.5％，平均亮度3.64。见图3、5、6。

必须强调的是，加入1×10⁴和1×10⁵Ad-TERT-E1A/E1B或Ad-HSP-E1A/E1B，除加入1×10⁵Ad-TERT-E1A/E1B可见少量细胞变圆，未见被感染细胞有明显病变，未出现加入DL309时细胞变圆脱落现象。但Ad-TERT-E1A/E1B用量为1×10⁶时，较多细胞明显变圆、脱落，出现明显的病变。而d-TERT-E1A/E1B用量为1×10³表达GFP的阳性细胞数量明显减少。提示条件复制型腺病毒的用量在0.05-0.5pfu时是安全的。

单独使用AAV₂-GFP病毒或联合使用条件复制型腺病毒与AAV₂-GFP病毒感染原代培养的人RPE细胞、人视网膜神经细胞及大鼠视网膜神经细胞也获得了与建株的RPE细胞相同的结果。

采取同样的方法对1/2嵌合型腺相关病毒(AAV_1/2-GFP)对RPE及神经细胞的转导效率和外源基因表达水平进行检测分析，获得了与2型腺相关病毒(AAV₂-GFP)一致的结果。

实施例3

复制缺陷型腺病毒加快和提高AAV对视网膜细胞的转导效率和基因表达水平

体外实验中Ad-Luc的使用量是1×10³、1×10⁴、1×10⁵和1×10⁶pfu，AAV₂的用量为1×10⁸或1×10⁹个病毒颗粒。与条件复制型腺病毒实验设计相同，针对每个RPE细胞，腺相关病毒的用量约为5×10²-5×10³个病毒颗粒，复制缺陷型腺病毒Ad-Luc的用量大约为0.005-5pfu；Ad-Luc与腺相关病毒用量的比例分别为1∶10²-1∶10⁶；每个神经细胞的用量大致为10⁴-10⁵个病毒颗粒，Ad-Luc的用量大约为0.05-5pfu。Ad-Luc与腺相关病毒用量的比例分别为1∶10²-1∶10⁵。

按每孔2×10⁵将RPE(APRE-19，ATCC)细胞接种在6孔细胞培养板中，24小时后细胞贴壁，分别将1×10⁸或1×10⁹AAV₂-GFP与1×10³、1×10⁴、1×10⁵Ad-Luc加入培养的细胞中，然后每天用荧光显微镜观察并照相记录被感染的细胞GFP荧光的亮度、细胞形态与病变状态。7天后胰蛋白酶消化，流式细胞仪检测GFP阳性细胞数及GFP荧光强度、PCR及Western blot检测GFP基因拷贝数与GFP表达量。

单独使用1×10⁸AAV₂-GFP时，GFP阳性细胞仅占6.29％，平均亮度1.62；加入1×10⁴Ad-Luc，GFP阳性细胞达26.8％，平均亮度2.23；加入1×10⁵Ad-Luc，GFP阳性细胞达52.7％，平均亮度6.87。

当AAV₂-GFP病毒用量为1×10⁹时，不加复制缺陷型腺病毒的细胞，第5天(120小时)起才能观察到GFP表达，总体上讲GFP阳性表达细胞数量少、亮度弱，7天时流式细胞仪检测GFP阳性率为13.5％，GFP的平均亮度为2.75。加入1×10⁴Ad-Luc，GFP阳性表达率为40.4％，平均亮度3.71；加入1×10⁵Ad-Luc，GFP阳性表达率为63.3％，平均亮度6.9。见图4、5、6。

还必须说明的是，加入1×10³、1×10⁴、1×10⁵和1×10⁶Ad-Luc均未见细胞出现明显的病变，表明这些剂量均是安全的。

实施例4

条件复制型腺病毒及复制缺陷型腺病毒加快和提高AAV对活体视网膜细胞的转导效率和基因表达水平，提高治疗效果

A.腺病毒提高AAV介导的基因在视网膜细胞内的表达水平

4周龄SD大鼠，麻醉后分别在视网膜下腔注射AAV₂-GFP和AAV₂-GFP+Ad-TERT-E1A/E1B。具体剂量：左眼AAV₂-GFP 2×10⁹(2ul)个病毒颗粒，右眼AAV₂-GFP 2×10⁹个病毒颗粒联合Ad-TERT-E1A/E1B 2×10⁴或2×10⁵个pfu。视网膜下注射1周和2周后多聚甲醛灌注后取眼球，5％冰醋酸后固定24小时，石蜡包埋后连续切片，切片厚度约6μm，行GFP免疫组织化学染色。单独使用AAV₂-GFP后1周，可见在注射局部视网膜内有个别RPE细胞GFP染色，呈弱阳性，2周时注射局部视网膜可见极少数RPE细胞和外核层的细胞GFP染色，呈弱阳性。AAV₂-GFP+Ad-TERT-E1A/E1B注射后1周，可见注射局部视网膜部分RPE细胞和外核层细胞GFP染色，不仅阳性细胞数且着色也较单独注射AAV-2-GFP组明显，呈中等程度阳性。2周后，视网膜内GFP阳性着色细胞数量进一步增多，着色强度进一步增强。其中加入2×10⁴或2×10⁵Ad-TERT-E1A/E1B，视网膜内GFP阳性细胞的数量和染色强度未见明显区别。视网膜内细胞未见明显坏死、凋亡及炎症反应。

B.腺病毒提高AAV介导的基因转移的治疗效果

取3周龄RCS大鼠，雌雄不限，随机分成3组，分别在视网膜下注射生理盐水(2ul)、AAV₂-CNTF 1×10¹⁰(2ul)个病毒颗粒、AAV₂-CNTF 1×10¹⁰个病毒颗粒+Ad-TERT-E1A/E1B 1×10⁴或1×10⁵个pfu(共2ul)。注射后5周多聚甲醛灌注后取眼球，5％冰醋酸后固定，石蜡包埋，HE染色后观察切片。OLYMPAS显微镜下观察计数RCS大鼠外核层细胞数量。视网膜下注射生理盐水组外核层细胞数量(每微米)为X＝1.40±0.23，单纯注射AAV₂-CNTF组外核层细胞数量(每微米)为X＝4.98±0.16，联合应用AAV₂-CNTF和Ad-TERT-E1A/E1B时外核层细胞数量(每微米)为X＝8.95±0.21，三组之间p值均小于0.05，差异有统计学意义。见图7。

                         序列.txt

             SEQUENCE LISTING

<110>上海交通大学附属第一人民医院

<120>加快并提高腺相关病毒介导的基因在视网膜细胞内表达的方法

<130>11

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>453

<212>DNA

<213>人类

<400>1

tcatggcccc tccctcgggt taccccacag cctaggccga ttcgacctct ctccgctggg     60

gccctcgctg gcgtccctgc accctgggag cgtgagcggt gcgcgggcgg ggaaacgcgg    120

cccagaaccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg gccaggccgg gctcccagtg    180

gattcgcggg cacagacgcc caggaccgcg cttccacgtg gcggaggact gggacccggg    240

caccgtcctg cccccttcac cttccagttc cgcttcttcc gcgcggaccc cgccccgtcc    300

cgacccttcc cgggtccccg gcccagcccc ttccgggccc tcccagccct tccccttcct    360

ttccgcggcc ccgccctctc ctcgcggcgc gagtttcagg cagcgctgcg tcctgctgcg    420

cacgtgggaa gccctggccc cggccacccc gcg                                 453

<210>2

                         序列.txt

<211>420

<212>DNA

<213>人类

<400>2

ggtcgaggcg cgtcctcaga gccagccggg aggagctaga accttccccg cgtttctttc     60

agcagccctg agtcagaggc gggctggcct ggcatagccg cccagcctct cggctcacgg    120

cccgatccgc ccgaaccttc tcccggggtc agcgccgcgc tgcgccgccc ggctgactca    180

gcccgggcgg gcgggcggga ggctctcgac tgggcgggaa ggtgcgggaa ggttcgcggc    240

ggcggggtcg gggaggtgca aaaggatgaa aagcccgtgg aagcggagct gagcagatcc    300

gagccgggct ggcggcagag aaaccgcagg gagagcctca ctgctgagcg cccctcgacg    360

gcggagcggc agcagcctcc gtggcctcca gcatccgaca agaagctctc tagtcgacct    420

Claims (9)

1、一种加快并提高腺相关病毒介导的基因在视网膜细胞内表达的方法，其特征是通过联合使用一定比例的条件复制型腺病毒或复制缺陷型腺病毒提高腺相关病毒对视网膜细胞的转导效率和基因表达水平。

2、根据权利要求1的方法，其中所述腺相关病毒是带有GFP报告基因的血清型2型或血清型1型但基因型2型的1/2型嵌合型。

3、根据权利要求1的方法，其中所述的条件复制型腺病毒是端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序调控E1A、E1B表达的复制型腺病毒或热休克蛋白基因5’端调控顺序调控E1A、E1B表达的复制型腺病毒，所述的复制缺陷型腺病毒是携带Luc报告基因的复制缺陷型腺病毒。

4、根据权利要求1或2或3的方法，其中所述的腺相关病毒的用量为每一个细胞5×10²-5×10³个病毒颗粒，所述的条件复制型腺病毒的用量为每一个细胞0.05-0.5pfu，条件复制型腺病毒与腺相关病毒的比例为1∶1×10^3-5。

5、根据权利要求1或2或3的方法，其中所述的腺相关病毒的用量为每一个细胞5×10²-5×10³个病毒颗粒，所述的复制缺陷型腺病毒的用量为每一个细胞0.5-5pfu，复制缺陷型腺病毒与腺相关病毒的比例为1∶1×10^2-4。

6、根据权利要求3的方法，其中所述的端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序调控E1A、E1B表达的复制型腺病毒通过下述方法构建：

(1)分离克隆人端粒酶逆转录酶基因的启动子：

采用引物5’-tcatggcc cctccctcgg-3’及5’-cgcgggggtggccggg-3’，以人胚胎肾细胞HEK293为模板，PCR扩增序列1的人端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序，反应条件为：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共30个周期，PCR产物长453bp；

(2)检测人端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序的活性与特异性：将人端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序插入真核表达质粒pEGFP-1的多克隆位点处，构建受人端粒酶逆转录酶基因调控的EGFP表达质粒pTERT-EGFP-1，转化大肠杆菌DH5α，挑选转化子，限制性内切酶鉴定插入片段，分别转染人胚肾293细胞、肿瘤细胞及正常成纤维细胞，观察GFP表达情况，确定人端粒酶逆转录酶基因5’端调控顺序具有在端粒酶逆转录酶活性较高的细胞内选择性表达的能力；

(3)构建受人端粒酶逆转录酶基因调控的条件复制型腺病毒载体：用限制性内切酶表达载体中切下E1A、E1B编码基因，插入pTERT-EGFP-1，取代其中的EGFP的cDNA，构建受人端粒酶逆转录酶基因调控的E1A、E1B表达质粒pTERT-E1A/E1B，进一步用限制性内切酶从表达质粒pTERT-E1A/E1B中切下含TERT启动子、E1A、E1B编码基因及PolyA尾的表达盒，插入穿梭质粒pENTR1A的多克隆位点处，再与带有腺病毒完整基因的大质粒在LR clones酶的作用下重组，重组子转染大肠杆菌BJ5183，从转化子中抽提DNA，酶切鉴定筛选含腺病毒基因组的质粒DNA，大量扩增后Pac I消化使其线性化，转染293细胞，包装腺病毒，再经空斑筛选出稳定毒株，扩增、纯化。

7、根据权利要求3的方法，其中所述的热休克蛋白基因5’端调控顺序调控E1A、E1B表达的复制型腺病毒通过下述方法构建：

(1)分离克隆人热休克蛋白基因70B的启动子：以HEK-293细胞DNA为模板，采用引物5’-GGTCGAGGCGCGTCCTCAGAGCCA-3’及5’-AGGTCGACTAGAAGCTTCTTGTCG-3’，PCR扩增序列2的人热休克蛋白70B基因5’端调控顺序，PCR扩增条件为94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1分钟，25个周期，PCR产物长420bp；

(2)检测上述调控顺序的活性与表达特异性：将PCR产物插入TA cloning载体pCR-Blunt内，再经限制性内切酶EcoRI消化，连接到载体pEGFP-1多克隆位点内的EcoRI位点处，构建受加热调控的EGFP表达质粒pHSP-EGFP-1，转化大肠杆菌DH5α后，挑选转化子，经限制性内切酶鉴定有插入片段，转染人胚肾293细胞，24小时后置42℃水浴中加热30分钟，培养24小时，观察GFP表达情况，确认所述调控顺序在加热后能诱导GFP高水平表达；

(3)构建受上述人热休克蛋白基因调控的条件复制型腺病毒载体：用限制性内切酶自表达载体中切下E1A、E1B编码基因，插入pHSP-EGFP-1，取代其中的EGFP的cDNA，构建受人端粒酶逆转录酶基因调控的E1A/E1B表达质粒pHSP-E1A/E1B，用限制性内切酶从表达质粒pHSP-E1A/E1B中切下含HSP启动子、E1A、E1B编码基因及PolyA尾的表达盒，插入穿梭质粒pENTR1A的多克隆位点处，与大质粒在LR clonase酶的作用下重组，重组子转染大肠杆菌BJ5183，从转化子中抽提DNA，酶切鉴定筛选含腺病毒基因组的质粒DNA，扩增后Pac I消化使其线性化，转染293细胞，包装腺病毒，经空斑筛选出稳定毒株，扩增、纯化。

8、权利要求1的方法在制备治疗眼底病药物中的用途。

9、权利要求8的用途，其中所述的眼底病包括视网膜变性、黄斑变性、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎、脉络膜新生血管、视神经变性或损伤。

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