KR102166545B1

KR102166545B1 - 호르몬 분비 조절제, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 사용한 호르몬 분비 조절 방법

Info

Publication number: KR102166545B1
Application number: KR1020197005889A
Authority: KR
Inventors: 김상재
Original assignee: 주식회사 젬백스앤카엘; 김상재
Priority date: 2013-06-21
Filing date: 2014-06-23
Publication date: 2020-10-16
Also published as: CN105324123B; TW201505648A; EP3011967A1; ES2808076T3; JP6495899B2; KR20160039152A; EP3011967A4; WO2014204281A1; JP2016523248A; US20160137695A1; US10561703B2; CN105324123A; EP3011967B1; TWI539960B; KR20190025744A; WO2014204281A9

Abstract

본 발명은 텔로머레이즈로부터 유래한 펩티드, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 펩티드를 포함하는 호르몬 분비 조절제에 관한 것이며, 또한 상기 호르몬 분비 조절제를 포함하는 약학적 조성물 및 약학적 조성물을 호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위해 사용하는 용도에 관한 것이다.

Description

호르몬 분비 조절제, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 사용한 호르몬 분비 조절 방법{HORMONE SECRETION REGULATOR, COMPOSITION CONTAINING SAME, AND METHOD FOR CONTROLLING HORMONE SECRETION USING SAME}

본 명세서는 텔로머레이즈로부터 유래한 펩티드, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 펩티드를 포함하는 호르몬 분비 조절제에 관한 것이며, 또한 상기 호르몬 분비 조절제를 포함하는 약학적 조성물 및 약학적 조성물을 호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위해 사용하는 용도에 관한 것이다.

사람의 생식 기관의 발생과 발달 및 노화와 관련된 호르몬을 성호르몬이라하며, 여기에는 대표적으로 테스토스테론 (testosterone), 에스트로겐, 여포자극 호르몬 (follicle-stimulating hormone, FSH), 황체 형성 호르몬 (luteinizing hormone,LH), 및 성선자극호르몬 방출호르몬 (gonadotrophin-releasing hormone, GnRH)이 있다.

테스토스테론은 남성과 여성 모두에게서 발생되며 체내에서 생성되는 주요한 성호르몬 중에 하나이다. 남성에게서는 주로 고환의 간질 조직 세포 (Leydig cells)에서 생성되며, 여성에게서는 난소와 태반에서 생성된다. 또한 남녀공통으로는 부신 피질에서 생성된다. 테스토스테론은, 잘 알려진 주요한 역할로 2차 성징, 예를 들어 남성에게 근육과 뼈의 질량 및 체모의 질량을 늘리는 속성을 가지고 있다.

황체 형성 호르몬은 2개의 서브유닛으로 이루어진 글리코프로테인 호르몬이다. 알파 서브유닛들은 여포자극 호르몬, 인간 융모성 성선 자극호르몬 (human chorionic gonadotropin, hCG), 및 갑상선 자극 호르몬 (thyroid-stimulating hormone, TSH)의 것들과 유사하다. 베타 서브유닛은 다른 글리코프로테인 호르몬들의 것과 다르며 생화학적 특이성을 부여한다. 황체 형성 호르몬은 뇌하수체 전엽에서, 남성의 경우 시상하부에서 분비된 성선자극호르몬 방출호르몬에 반응하여 분비된다. 황체 형성 호르몬은 간질 세포 자극 호르몬 (interstitial-cell-stimulating hormone, ICSH)이라고도 불리며, 황체 형성 호르몬 분비는 시상하부-뇌하수체 축 (hypohthalamic-pituitary axis), 생식기관, 뇌하수체 및 성 스테로이드 호르몬을 포함하는 양성 및 음성 피드백 작용기전의 균형에 의해 조절된다. 황체 형성 호르몬과 다른 뇌하수체 성선 자극호르몬 및 여포자극 호르몬은 남성과 여성의 생식 시스템의 정상적인 기능 유지에 매우 중요한 역할을 한다.

여포자극 호르몬은 2개의 서브유닛으로 이루어진 글리코프로테인 호르몬이다. 알파 서브유닛은 황체 형성 호르몬, hCG, TSH의 것들과 유사하다. 베타 서브유닛은 다른 글리코프로테인들과 다르며, 생화학적 특이성을 부여한다. 여포자극 호르몬은 뇌하수체 전엽에서, 시상하부에서 분비된 성선자극호르몬 방출호르몬에 반응하여 분비된다. 남성과 여성 모두에게서, 여포자극 호르몬의 분비는 시상하부-뇌하수체 축 (hypohthalamic-pituitary axis), 생식기관, 뇌하수체 및 성 스테로이드 호르몬을 포함하는 양성 및 음성 피드백 작용기전의 균형에 의해 조절된다. 여포자극 호르몬과 황체 형성 호르몬, 다른 뇌하수체 성선 자극호르몬, 및 여포자극 호르몬은 남성과 여성의 생식 시스템의 정상적인 기능 유지에 매우 중요한 역할을 한다.

에스트로겐은 여성 스테로이드 호르몬으로 대부분은 난소에서 생성되며, 적은 양이 부신피질, 태반, 남성 고환에서 생성된다. 에스트로겐은 사춘기와 관련된 신체변화를 포함하여 성적 성숙을 제어하고 안내하는 것을 돕는다. 또한 월경에서 배란 주기, 임신 후 수유기간, 감정의 방향 및 노화과정에 영향을 준다. 에스트로겐 생산은 자연스럽게 여성의 수명주기를 전환시키는데, 사춘기를 시작으로 (초경) 성인 수준으로 도달하여, 폐경 시작 직전까지 중년으로 갈수록 감소하게 된다. 에스트로겐 결핍은 월경의 감소 (월경 불순), 폐경기 관련 지속적인 장애 (예를 들어, 조울증 및 질마름), 및 노년의 골다공증을 일으킬 수 있다. 에스트로겐 결핍의 경우 천연 또는 합성된 에스트로겐의 제재가 처방될 수 있다. 에스트로겐은 또한 많은 경구 피임약들의 성분 중 하나이다. 남성에게 에스트로겐의 과잉은 유방조직의 확대와 같은 여성 2차 성징 (여성화)을 일으킨다.

성선자극호르몬 방출호르몬 (gonadoliberin)은 생식에서 중심적인 역할을 하는 펩티드 패밀리 중의 하나이다. 성선자극호르몬 방출호르몬의 주기능은 뇌하수체에 작용하여 황체 형성 및 여포자극 호르몬을 합성 및 분비하는 것을 자극하는 것이나, 성선자극호르몬 방출호르몬은 뇌, 망막, 교감신경계, 성선, 및 특정 종의 태반에서도 작용한다. 성선자극호르몬 방출호르몬은 최소 3가지 이상의 다양한 형태를 가지는 것으로 보인다. 두 번째 형태는 중뇌에서 발현되며, 널리 퍼지는 것으로 보인다. 세 번째 형태는 드물게 나타나며, 어류에서만 관찰된다. 성선자극호르몬 방출호르몬은 보다 큰 전구체 단백질에서 유래된 C-말단 아미드화 데카펩티드다. 10 개중 4 개의 잔기가 성선자극호르몬 방출호르몬을 서열화한 모든 종에서 완벽하게 보존되어 있다.

US 20020042401 A1 US 20120277290 A1

Christoph Eisenegger et al., Trends in Cognitive Sciences June 2011, Vol. 15, No. 6.

[발명의 요약]

본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편를 포함하는 펩티드를 포함하는 호르몬 분비 조절제를 제공한다.

본 발명의 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 호르몬 분비 조절제를 포함하는 호르몬 분비 조절용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 호르몬 분비 조절용 의약을 제조하기 위한 상기 본 발명에 따른 호르몬 분비 조절제의 사용을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 약학 조성물; 및

설명서를 포함하는 호르몬 분비 조절용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 호르몬 분비 조절제를, 호르몬 조절 치료를 필요로 하는 대상에게 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 호르몬 레벨 조절 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 호르몬 분비 조절용 약학 조성물을, 호르몬 조절 치료를 필요로 하는 대상에게 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 호르몬 레벨 조절 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 펩티드를 포함하는 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH) 아날로그를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그의 유효한 양을 호르몬 조절 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그를 포함하는 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절용 의약을 제조하기 위한 상기 본 발명에 따른 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그의 사용을 제공한다.

본 발명에 따른 호르몬 분비의 조절제는 부작용이 없거나 미미한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명은 의약분야에서 성선자극 호르몬 방출호르몬 아날로그로서, 1) 전립선암 또는 유방암 같은 호르몬 민감성 암의 항암치료, 2) 월경과다, 자궁내막증, 자궁근종, 자궁 섬유낭종 등 여성의 에스트로겐 생산 교란의 치료, 3) 여성 및 남성의 불임 치료, 4) 어린이 성조숙증의 치료, 및 5) 전립선 비대증의 치료 및 개선에 사용 가능하다.

도 1 은 남성과 여성의 생식기관에서 테스토스테론, 에스트로겐, 여포자극 호르몬, 황체 형성 호르몬 및 성선자극호르몬 방출호르몬을 포함한 호르몬의 조절 루프를 나타내는 그래프이다.
도 2 는 시간에 따라 PEP-1를 반복적으로 투여한 수컷 쥐의 혈액에서 테스토스테론의 농도변화를 나타낸 그래프이다.
도 3 은 시간에 따라 PEP-1를 반복적으로 투여한 암컷 쥐의 혈액에서 테스토스테론의 농도변화를 나타낸 그래프이다.
도 4 는 시간에 따라 PEP-1를 반복적으로 투여한 수컷 쥐의 혈액에서 에스트라디올 E2의 농도변화를 나타낸 그래프이다.
도 5 는 시간에 따라 PEP-1를 반복적으로 투여한 암컷 쥐의 혈액에서 에스트라디올 E2의 농도변화를 나타낸 그래프이다.
도 6 은 시간에 따라 PEP-1를 반복적으로 투여한 수컷 쥐의 혈액에서 여포자극 호르몬의 농도변화를 나타낸 그래프이다.
도 7 은 시간에 따라 PEP-1를 반복적으로 투여한 암컷 쥐의 혈액에서 여포자극 호르몬의 농도변화를 나타낸 그래프이다.
도 8 은 시간에 따라 PEP-1를 반복적으로 투여한 수컷 쥐의 혈액에서 황체 형성 호르몬의 농도변화를 나타낸 그래프이다.
도 9 는 시간에 따라 PEP-1를 반복적으로 투여한 암컷 쥐의 혈액에서 황체 형성 호르몬의 농도변화를 나타낸 그래프이다.
도 10 과 11은 PEP-1를 투여한 후 수컷 및 암컷 쥐에서 상대적인 성선자극호르몬 방출호르몬의 mRNA 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 12 는 PEP-1 (GV1001)을 처리한 전립선 비대증 동물모델의 실질세포주 (WPMY-1)에서 세포 증식의 정도를 나타낸 그래프이다.
도 13 은 PEP-1 (GV1001)을 처리한 전립선 비대증 동물모델의 상피세포주 (RWPE-1)에서 세포 증식의 정도를 나타낸 그래프이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 실시 예를 기초로 하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이러한 실시 예는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것은 아니며, 본 발명은 특허청구범위에 기재된 바를 기초로 하여 다양한 실시예 및 응용이 가능하며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명은 일 측면에 있어서,

호르몬 분비 조절을 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편를 포함하는 펩티드를 제공한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 상동성 (homology)및 서열 상동성 (sequence identity)라 함은 상호변환가능하게 사용되었으며, 이는 2개의 아미노산 (또는 비슷한 것으로 핵산) 사이에서 서열의 오버랩 정도를 나타낸다.

본 명세서에서 펩티드나 핵산에 대하여 서열 상동성의 다른 용어를 사용하지 않는다면, 서열의 상동성은 (nref-ndif)*100/nref 를 사용하여 계산되며, 상기 계산식에서, 두 서열을 정렬하여 가장 많은 일치의 수가 나오게 하였을 때, ndif는 두 서열 사이에서 비 일치 잔기들의 총 개수를, nref는 두 서열 중 짧은 서열의 잔기들의 총 개수를 뜻한다. 예를 들어, DNA 서열 agtcagtc는 aatcaatc의 서열과 서열 상동성을 상기 식으로 구하면 75% 이다 (nref=8, ndif=2).

본 명세서의 일 측면에서, 서열의 상동성은 종래에 알려진 하기의 방법들로 결정되었다. Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, by the search for similarity method of Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, using the CLUSTAL W algorithm of Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res 22:467380, by computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group). The BLAST algorithm (Altschul et al., 1990, Mol. Biol. 215:403-10) for which software may be obtained through the National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/) may also be used. When using any of the aforementioned algorithms, the default parameters for "Window" length, gap penalty, etc.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열 안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편를 포함하는 펩티드는 세포 내 독성이 낮아 생체 내 안전성이 높다는 장점을 가진다.

서열번호 1 : EARPALLTSRLRFIPK

본 발명의 다른 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편를 포함하는 펩티드를 포함하는 호르몬 분비 조절제를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 호르몬은 성호르몬이며, 상기 성호르몬은 테스토스테론 (testosterone), 에스트로겐(estrogen), 여포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone), 황체형성호르몬(LH, luteinizing hormone), 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH, Gonadotropin-releasing hormone), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 호르몬은 테스토스테론이다.

테스토스테론 (4 안드로스텐 17β-ol-3-one)은 C19 스테로이드 호르몬이고, 남성에게 중요한 안드로겐이다. 뇌하수체 호르몬인, 황체 형성 호르몬에 의해 조절된다. 황체 형성 호르몬은, 테스토스테론의 생산을 제어하기 위해, 뇌하수체 전엽 샘에서 분비되며 고환의 간질 조직의 세포에 직접적으로 작용한다. 테스토스테론은 외부 생식기의 성숙 및 2차 성징, 이에 더하여 얼굴, 겨드랑이, 생식기 주위 (사타구니) 털의 성장 등을 자극하는 역할을 한다.

순환계에서 황체 형성 호르몬과 테스토스테론의 레벨 측정은 성선 기능감퇴를 밝혀내는데 유용하다. 낮은 농도의 테스토스테론은 성선 기능 감퇴, 고환 기능 부전, 높은 프롤락틴 (prolactin) 레벨, 뇌하수체 기능 저하, 신장 또는 간질환 등의 이유에서 비롯된다. 여성에게서 테스토스테론은 남성보다 매우 낮은 레벨을 보이는데, 여성에게서의 높은 테스토스테론 농도는 다낭성 난소 증후군과 부신 과형성을 발생시킬 수 있다. 과잉 테스토스테론은 불임, 다모증, 무월경증 또는 비만을 발생시키기도 한다.

테스토스테론은 성호르몬-결합 글로불린 (sex hormone-binding globulin, SHBG) 또는 테스토스테론- 에스트라디올- 결합 글로불린 (TeBG)등의 플라스마 단백질들과 매우 강하게 결합하고, CBG(cortisol-binding globulins)와 알부민과는 약한 결합력을 가진다. 2.5% 미만의 테스토스테론 만이 비 결합된 형태 (free form)로 체내에서 순환된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 호르몬은 에스트로겐이며, 상기 에스트로겐은 에스트론 (estrone, E1), 에스트라디올 (estradiol, E2), 또는 에스트리올 (estriol, E3)일 수 있다.

여성에게서 자연적으로 생성되는 세가지 주요 에스트로겐은 에스트론 (estrone, E1), 에스트라디올 (estradiol, E2), 및 에스트리올 (estriol, E3)이다. 에스트라디올은 절대적 세럼 레벨에서나, 에스트로겐 활성도에서나 생식활동기간에서 가장 우세한 에스트로겐이다.에스트라디올 (E2)의 측정은 난소 기능을 평가하는데 사용되고, 체외 수정 등의 의학적 도움을 받는 생식 프로토콜에서 여포 (여포) 성숙을 관찰하는데 중요하게 사용된다. E2는 여성 생식기의 성장을 촉진하며, 2차 성징을 활성화 시키고, 월경 주기에 필수적인 역할을 한다. 보통 불임 여성에게서, 에스트라디올은 여포와 과립 세포들의 상호작용에 의해 여포와 황체의 발달기간 동안 대부분 분비된다. 임신 기간 동안, 태반은 에스트라디올의 가장 주요한 분비처가 된다. 에스트라디올이 혈액으로 분비되고 있는 동안, 1~3%가 어떠한 단백질과도 결합하지 않은 형태로 존재하고, 약 40%가 SHBG에 결합한 형태로 존재하며, 나머지는 알부민에 결합한 형태로 존재한다. 에스트라디올의 일차적인 기능은 여성 생식기의 성장과 2차 성징의 촉진이다.

에스트라디올은 여성의 월경주기에 필수적인 역할을 한다. 항체의 생성 시작 주기에, 에스트라디올은 낮은 레벨로 유지된다. 약 7일이 지난 후, 여포의 성숙이 에스트라디올의 레벨에 의해 조절되며 레벨은 증가한다. 에스트라디올 레벨의 증가는 황체 형성 호르몬 레벨의 급등과 여포자극 호르몬의 억제를 유발한다. 정상 배란은 황체 형성 호르몬(레벨)의 최고점에서 10~12시간 정도 후, 에스트라디올 (레벨)의 최고점에서 24~36시간 정도 후에 일어난다. 황체기 동안에는, 에스트라디올 레벨이 증가하고 배란 후 8 일차에 피크 (최고점)을 찍게 된다. 이러한 에스트라디올 레벨의 상승은 황체의 퇴행을 나타낸다. 만약 수정된 난자의 착상이 일어나지 않을 경우, 에스트라디올은 감소하고 다음 주기를 시작하라는 신호가 된다.

에스트라디올-6 테스트는 E2의 6번째 결합자리에서 일어나는 항원 항체반응에서 그 이름이 유래되었고, 테스트의 특이성이 좋으며, 테스트에 의한 결과는 다양한 방법으로 사용 될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 호르몬은 여포자극호르몬이다.

여포자극 호르몬은 글리코프로테인 호르몬으로 황체 형성 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 인간 융모성 성선 자극호르몬과 유사한 알파 서브유닛과, 여포자극 호르몬의 생화학적 특성을 나타내는 베타 서브유닛으로 구성되며, 황체 형성 호르몬과 함께, 남성과 여성 모두에서 정상적인 생식계의 기능을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 여포자극 호르몬은 뇌하수체 전엽 에서 방출되고, 시상하부에서 분비된 성선자극호르몬 방출호르몬에 의해 촉진된다. 남녀 모두에게서, 여포자극 호르몬은, 항상성을 유지하는데, 이는 시상하부-뇌하수체 경로(hypohthalamic-pituitary pathway), 생식기관, 뇌하수체 및 성호르몬을 포함하는 피드백 작용기전에 의해 조절된다.

여포자극 호르몬의 작용 부위와 작용은 남녀 각각에게 아래와 같이 나타난다.

[표 1]

여포자극 호르몬 레벨의 증대는 여성에게서 폐경기와 일차적인 성선 기능 감퇴증을 나타내며, 남성에게서도 일차적인 성선 기능 감퇴증에 관련한다. 여포자극 호르몬 레벨의 감소는 일차적인 성선 기능 감퇴증과 관련이 있다. 다낭성 여포증후군을 앓고 있는 여성의 경우, 여포자극 호르몬 레벨이 정상 또는 감소한다.

본 발명의 일 구체예서 상기 호르몬은 황체 형성 호르몬(LH)이다.

황체 형성 호르몬은 2개의 서브유닛으로 이루어진 글리코프로테인 호르몬이다. 여포자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 인간 융모성 성선 자극호르몬과 유사한 알파 서브유닛과, 황체 형성 호르몬의 생화학적 특성을 나타내며, 다른 글리코프로테인 호르몬과 다른, 베타 서브유닛으로 구성되어 있다. 황체 형성 호르몬은 뇌하수체 전엽에서 분비되며, 시상하부에서 분비되는 성선자극호르몬 방출호르몬의 분비에 의해 촉진된다. 남성의 경우, 황체 형성 호르몬은 종종 ICSH로 불린다. 남녀 모두에게서, 황체 형성 호르몬 레벨은 시상하부-뇌하수체 경로(hypohthalamic-pituitary pathway), 생식기관, 뇌하수체 및 성호르몬 등을 포함하는 피드백 작용기전에 의해 조절된다. 황체 형성 호르몬은 뇌하수체 성선, 여포자극 호르몬 등과 마찬가지로 남성과 여성의 생식계에서 중요한 역할을 맡는다.

LH의 남성과 여성에서의 각각 대상과 그 작용은 아래 표로 나타내었다.

[표 2]

황체형성 호르몬의 비정상적인 레벨은 여포자극 호르몬, 에스트로겐, 프로게스테론 레벨의 증가와 관련이 있다. 황체 형성 호르몬 농도의 증가는 여성의 폐경기, 다낭성 난소 증후군, 및 일차적인 성선 기능감퇴를, 남성의 일차적인 성선 기능감퇴를 나타낸다. 반대로, 황체 형성 호르몬의 감소된 농도는 일차적인 성선 기능 항진증을 나타낸다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 호르몬은 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH)이다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 펩티드는 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그로서 작용할 수 있으며, 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그는 성선자극호르몬 방출호르몬 아고니스트 (agonist) 또는 안타고니스트 (antagonist)로서 효과를 가질 수 있다.

상기 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그는 스테로이드 관련 질병 (예: 전립선암, 유방암, 및 난소암 등), 성선 내분비계의 기능저하와 관련한 질병 (예: 불규칙적인 월경, 무월경, 성조숙증, 및 성선 기능 감퇴), 인공 수정 시 배란 주기의 조절 (예: 성선자극호르몬 방출호르몬 아고니스트 혹은 안타고니스트의 투여에 의해 선택적으로 조절될 수 있는 배란 주기), 피임 (예: 배아의 성장과 착상률이 성교 후 성선자극호르몬 방출호르몬 안타고니스트의 투여에 의해 저해 및 감소될 수 있음), 어류와 가축의 생산 증가 등에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 의약분야에서 잠재적 사용은 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그로서 이루어질 수 있어, 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절에 사용될 수 있으며, 이러한 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절은 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과의 증진 또는 감소를 포함하며, 예를 들어 이러한 효과 조절에 의해 1) 전립선암 또는 유방암 같은 호르몬 민감성 암의 항암 치료; 2) 월경과다, 자궁내막증, 자궁근종, 자궁 섬유낭종 등 여성의 에스트로겐 생산 교란의 치료; 3) 여성 및 남성의 불임 및 4) 어린이 성조숙증의 치료, 및 5) 전립선 비대증의 치료 및 개선이 이루어질 수 있다

따라서, 본 발명의 또 다른 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 펩티드를 포함하는 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH) 아날로그를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 호르몬 분비 조절제를 포함하는 호르몬 분비 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 호르몬 분비 조절제 및약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는 호르몬 분비 조절용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH) 아날로그를 포함하는 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 0.1 ㎍/mg에서 1 mg/mg, 구체적으로는 1 ㎍/mg에서 0.5 mg/mg, 더욱 구체적으로는 10 ㎍/mg 에서 0.1 mg/mg 의, 서열번호 1의 아미노산으로 구성된, 또는 상기 서열번호 1과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산으로 구성된, 또는 앞서 말한 것들의 단편들인 펩티드를 포함한다. 펩티드가 상기 범위에 포함될 때, 조성물의 모든 안전성과 안정성은 비용-효율적 면에서 적절하고 충족된다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 투여될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의약학적 조성물은, 유효성분으로서 서열번호 1의 아미노산으로 구성된 펩티드, 서열번호 1의 펩티드와 80% 이상의 상동성을 지닌 펩티드 또는 서열번호 1의 단편 펩티드를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 호르몬 분비 조절제는 상기 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그와 같은 작용을 할 수 있으며, 이를 포함하는 약학적 조성물은, 본 발명에서 개시한, 병적 증상을 유발하는 호르몬 레벨 또는 병이나 상태의 진행에 영향을 준 호르몬 레벨에 관련된 병이나 증상을 가진 대상 (인간 또는 다른)의 치료에 특히 유용하다. 따라서, 상기 본 발명에 따른 약학 조성물은 호르몬, 특히 성호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환의 치료, 개선 또는 예방에 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환은 전립선암, 유방암, 난소암월경과다증(menorrhagia), 자궁내막증(endometriosis), 자궁선근종증(adenomyosis), 자궁섬유양(uterine fibroids), 여성 또는 남성 불임(female or male infertility), 소아 성조숙증(precocious puberty in children), 전립선 비대증, 및 이들의 조합에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 의약품은 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 투여제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체에에서, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 약학적 조성물의 유효성분은 환자의 나이, 성별, 몸무게, 병증 및 상태, 투여 방법, 처방자의 판단등에 의해 매우 다양할 수 있다. 구체적인 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 0.1 ㎍/kg/일 내지 1 g/kg/일, 더 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일이 될 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따르면, 약학적 조성물의 투여는, 이에 제한되지 않으며, 1일에 1 내지 3회일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 호르몬 조절을 위한 식품 조성물을 제공한다. 식품 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 아미노산으로 구성된, 또는 상기 서열번호 1과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산으로 구성된, 또는 앞서 말한 것들의 단편들인 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 식품 조성물은 형태에 국한되지 않고, 예를 들어 과립, 파우더, 액체, 및 고체일 수 있다. 각각의 형태는 통상적으로 당업자에 의해 적절히 선택되는 성분들과 혼합될 수 있으며, 또한 유효 성분에 더 추가할 수 있고, 다른 성분들과의 혼합으로 효과가 증대될 수 있다.

상기 식품 조성물의 구체적인 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 0.1 ㎍/kg/일 내지 1 g/kg/일, 더 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일이 될수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 펩티드는 어쥬번트와 조합되어 투여될 수 있다. 따라서, 상기 본 발명에 따른 조성물, 약학 조성물, 및 식품조성물은 어쥬반트를 포함할 수 있다. 이러한 어쥬반트는 당해 기술분야에 공지된 임의의 면역학적 어쥬반트를 포함할 수 있으며, 예를 들어 알루미늄 염과 같은 무기 어쥬번트와, 오일계, 바이로좀(virosome), 스쿠알란과 같은 유기 어쥬번트를 포함한다. 유기 어쥬번트는 에멀젼, 미생물-유래, 합성 어쥬번트, 사이토킨 등이 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 사이토킨 어쥬번트는 9종이 알려져 있다. 예컨대, 성숙한 그래뉼로사이트 및 마크로파지를 활성화시키는 그래뉼로사이트-마크로파지 콜로니-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)를 들 수 있는데, 이는 B형 간염, HIV, 암 백신에 주로 사용된다[J Biomed Biotechnol. 2012; 2012: 831486. Published online Mar 13, 2012].

본 명세서에서 언급된 어쥬번트의 적절한 투여량은 이미 당업계에 널리 알려져 있으므로, 각 환자의 상태에 따라 당업계에 알려진 기준에 의해 투여할 수 있다. 구체적인 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10 g/kg/일, 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 100 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, GM-CSF 의 경우 본 명세서에 개시된 펩티드 투여 전, 예컨대 1분 내지 150분 전의 시점, 5 내지 80분 전의 시점, 또는 10 내지 15분 전의 시점에 성인 기준 7 내지 700 mg의 투여량으로 피내 투여될 수 있다. 투여시간은 펩티드 투여 전 1분 이상 전, 3분 이상 전, 5분 이상 전, 7분 이상 전, 8분 이상 전, 9분 이상 전 또는 10분 이상 전에 투여될 수 있다. 또한, 150분 이하 전, 130분 이하 전, 110분 이하 전, 100분 이하 전, 90분 이하 전, 80분 이하 전, 70분 이하 전, 60분 이하 전, 50분 이하 전, 40분 이하 전, 30분 이하 전, 20분 이하 전 또는 15분 이하 전의 시점에 투여될 수 있다. 투여량은 7 mg 이상, 10 mg 이상, 20mg 이상, 30mg 이상, 40mg 이상, 50mg 이상, 60mg 이상 또는 70mg 이상일 수 있다. 또한, 투여량은 700mg 이하, 600mg 이하, 500mg 이하, 400mg 이하, 300mg 이하, 200mg 이하, 100mg 이하, 90mg 이하 또는 80mg 이하일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기 본 발명에 따른 약학 조성물; 및 설명서를 포함하는 호르몬 분비 조절용 키트를 제공한다.

상기 설명서는 상기 본 발명에 따른 약학 조성물의 활성성분, 함량, 성상, 효능효과, 용법용량, 저장방법, 사용기간, 판매자, 제조자, 제조연월일, 부작용, 및/또는 금기사항을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은, 호르몬 분비 조절용 의약을 제조하기 위한 상기 본 발명에 따른 호르몬 분비 조절제의 사용을 제공한다.

상기 호르몬 분비 조절용 의약의 상세는 상기 본 발명에 따른 호르몬 분비 조절용 약학 조성물에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기 본 발명에 따른 호르몬 분비 조절제를 호르몬 조절 치료를 필요로 하는 대상에게 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 호르몬 레벨 조절 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기 본 발명에 따른 호르몬 분비 조절용 약학 조성물을, 호르몬 조절 치료를 필요로 하는 대상에게 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 호르몬 레벨 조절 방법을 제공한다.

상기 호르몬 레벨 조절 방법의 상세는 상기 본 발명에 따른 호르본 분비 조절제 및 약학 조성물에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.

상기 호르몬 레벨 조절 방법은 정상상태에 도달하기 위한, 또는 호르몬에 의해 유발된 질병의 치료, 개선, 또는 예방을 위한 호르몬 레벨의 증가 또는 감소를 포함하며, 이는 호르몬에 의해 유발된 질병의 종류에 따라 달라질 수 있다. 상기 호르몬 레벨 조절 방법의 대상 호르몬은 테스토스테론 (testosterone), 에스트로겐(estrogen), 난포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone), 황체형성호르몬(LH, luteinizing hormone), 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH, Gonadotropin-releasing hormone), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 호르몬 레벨 조절 방법은 당업자가 적절히 결정할 수 있으며, 일 구체에서는 상기 약학 조성물의 투여방법이 적용될 수 있다.

상기 레벨 조절 방법의 일 구체예는, 상기 호르몬 분비 조절제 또는 호르몬 분비 조절용 약학 조성물을 1일 1회 투여할 수 있다.

상기 레벨 조절 방법은 호르몬, 특히 성호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환의 치료, 개선 또는 예방할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환은 전립선암, 유방암, 난소암월경과다증(menorrhagia), 자궁내막증(endometriosis), 자궁선근종증(adenomyosis), 자궁섬유양(uterine fibroids), 여성 또는 남성 불임(female or male infertility), 소아 성조숙증(precocious puberty in children), 전립선 비대증, 및 이들의 조합에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 측면은, 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절용 의약을 제조하기 위한 상기 본 발명에 따른 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그의 사용을 제공한다.

상기 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절용 의약의 상세는 상기 본 발명에 따른 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절용 약학 조성물에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기 본 발명에 따른 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그의 유효한 양을 호르몬 조절 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절 방법을 제공한다.

상기 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절 방법은 정상상태에 도달하기 위한, 또는 호르몬에 의해 유발된 질병의 치료, 개선, 또는 예방을 위한 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과의 증진 또는 감소를 포함하며, 이는 호르몬에 의해 유발된 질병의 종류에 따라 달라질 수 있다.

상기 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절 방법의 일 구체예는, 상기 성선자극호르몬 방출호르몬 아날로그 또는 그 아날로그를 포함하는 약학 조성물을 1일 1회 투여할 수 있다.

상기 성선자극호르몬 방출 호르몬 효과 조절 방법은 성호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환의 치료, 개선 또는 예방할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환은 전립선암, 유방암, 난소암월경과다증(menorrhagia), 자궁내막증(endometriosis), 자궁선근종증(adenomyosis), 자궁섬유양(uterine fibroids), 여성 또는 남성 불임(female or male infertility), 소아 성조숙증(precocious puberty in children), 전립선 비대증, 및 이들의 조합에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).

수치를 범위로서 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하기 용이하기 때문이며, 다른 언급이 없는 한, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.

본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명이 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 사상 및 보호 범위 내에서 않고서도 형태 및 디테일에 있어서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다.

I. 펩티드 합성 및 분석 방법

실시예 1: 펩티드의 합성

서열번호 1을 포함하는 펩티드, 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 그것의 단편인 펩티드를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫 번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin

NH2-Ala-2-chloro-Trityl Resin

NH2-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin

펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.

커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H2O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.

아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.

서열번호 1로 구성된 Pep 1 (EARPALLTSRLRFIPK) 을 예로 들어 구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.

1) 커플링

NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

2) Fmoc 탈보호

20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.

4) 절단(Cleavagge): 합성이 완료된 펩티드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 Resin에서 분리하였다.

5) 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸 에테르를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시켰다.

6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 분말 형태로 제조하였다.

실시예 2: 재료의 준비 및 분석 방법

(1) 테스트 약물, PEP-1의 준비

PEP-1 (서열번호 1의 펩티드)는, PEP-1의 보정계수를 고려하여 (순도: 94.13%, 함량: 92.36%, 보정계수: 1.15), 상기 실시예 1 에서 언급된 방법에 따라 동결건조 화이트 파우더 상태로 얻은 것을 0.9% 살린에 녹였다. 50 mg/mL 저장 용액은 또한 각각 20 mg/mL, 2 mg/mL, 및 1 mg/mL 로 0.9% 살린을 포함하여 희석되었고, 4 ℃에서 사용되기 전까지 일주일간 보관되었다.

(2) 재료의 준비

이 실시예의 목적은 혈중 성호르몬의 변화를 확인하기 위함이며, 서열번호 1의 펩티드, PEP-1을 7일간 매일 반복적으로 투여된 SD 쥐에서 수행되었다. 이 실험은 KAMSI Inc. (Korea Animal Medical Science Institue)에서 지정한 동물 실험 규정을 따랐다. 또한, 이 실험은 Non-GLP 실험으로, MFDS (Ministry of Food and Drug Safety) 지시; Agent 2013-40 (2013년 4월 5일), Principles of Good Laboratory Practice (1997)을 참고하였다.

SPF 쥐 (Crlj:CD(SD))는 ORIENTBio Inc. (대한민국 경기도 가평군 북면 목동리 소재)에서 구매하였다. 75개체의 수컷 (생후 6.5주, 190~210g) 및 75개체의 암컷 (생후 6.5주, 160~180g) 쥐가 4일간 관찰되었으며, 암수 각각 64개체가 실험대상으로 선정되었다. 생육 조건은 다음과 같다: 23±3℃의 온도, 5±15%의 상대습도, 10-20 회/시간 의 공기 교환, 12시간 (오전 8시~오후 8시)의 조도 150~300 럭스 강도의 명시간.

동물 시설의 환경, 예를 들어 온도-습도, 공기 교환 횟수, 및 빛의 강도가 정기적으로 측정되었다. 동물의 먹이는 (Cargill Agri Purina. Inc.에서 생산됨) DreamBios Co., Ltd (507, 대한민국 서울특별시 광진구 광나루로 507 소재)에서 구입 하였으며, 쥐들이 자유롭게 먹도록 한 먹이 공급 시스템을 사용하였다. 정수된 물은 폴리카보네이트 물병을 사용하여 주어졌고, 쥐 사육장의 침구는 SaeronBio Inc. (대한민국 경기도 의왕시 청계동 800-17 소재)에서 구입하였다. 최대 5마리의 쥐는 적응기간, 검사기간, 투여 절차의 기간 동안 각각 폴리카보네이트 사육장 (W 170 x L 235 x H 125 mm 크기)에서 사육되었다. 물, 침구, 및 사육장은 주 1회 이상 교체되었다.

(3) 동물 그룹과 투여 경로

64 개체의 암수 쥐 (상기) 는 8개의 그룹으로 나뉘었다. 투여 요법은 예를 들어 약물, 경로, 투여량, 부피 등은 아래와 같다:

[표 3]

상세한 투여 요법은 아래와 같다: 1일 1회, 1일 2회 그리고 1주 2회는 각각의 실험 그룹이다. 투여는 매일 오전 10시에 시작하였으며, 각각의 쥐는 각각 1분의 간격으로 투여되었다. 그룹 9, 10, 13, 14의 쥐는 1주일에 2번 투여되었다. 고용량의 투여는 저용량의 투여보다 선행되었다. 투여의 볼륨은 가장 최근에 측정된 쥐의 무게를 사용하여 계산하였으며, 이는 5mL/kg이다. 피하 투여는 다음과 같이 시행되었다 : 보조자가 쥐의 등을 위로 향하게 잡으면, 실험자가 쥐의 등을 70% 알코올로 소독하고, 테스트 약물을 26G 주사기를 사용하여 피하 투여하였다.

(4) 채혈

1.4 mL의 혈액 샘플 (0.7 mL의 혈청) 이 몸무게 측정 (Day 0) 후 수집되었다. 다음날 (Day 1), 1.4 mL의 혈액 샘플 (0.7 mL의 혈청) 이 테스트 약물의 투여 후 (각각 테스트 약물 투여 4 시간 및 8시간 후) 2회 수집되었다. 이후 6일간 (Day 2 ~ Day 7), 1.4 mL 의 혈액이 매일 1회 (테스트 약물 투여 4시간 후) 수집되었다. 테스트 약물의 투여량과 볼륨은 각각 표 3에서 제시된 바와 같으며, 투여 시간대도 매일 같은 시간에 행하였다. 혈액은 경정맥에서 추출되었으며, 30분간 실온에서 보관되었다. 혈청은 원심분리기 (5 분당 10,000 rpm)로 분리하였으며, -70±5℃의 딥프리져에서 사용직전까지 보관되었다. 채혈은 각각의 대상에게서 매일 같은 시간대에 행해졌다.

(5) 호르몬 분석 방법

CLIA (Chemi-Luminescence Immune Assay) 키트가 테스토스테론, 에스트라디올 E2, 여포자극 호르몬, 및 황체 형성 호르몬을 분석하는데 사용되었다. 분석은 채혈 후 48시간 이내에 완료 되었고 (중앙대학교 병원 내 실험 의약 부서), 상세한 방법은 아래와 같다: PEP-1과 비히클(vehicle) 간의 비교 분별 및 PEP-1 투여량 간의 분별은 One-way ANOVA 를 사용하였고, Duncan 테스트는 파라미터 테스트 용으로 사용되었으며, Dunnett's 테스트는 비파라미터 테스트 용으로 사용되었다. p < 0.05 는 통계학적 유의성을 나타내며, 모든 통계 분석은 SPSS 10.1을 통하여 도출하였다.

II. 호르몬에 대한 분석

실시예 3: 테스토스테론 분석

테스토스테론은 실시예 2에서 준비된 샘플을 사용하여 분석되었다. 15μL 의 혈청이 분석에 사용되었다. 분석의 기초는 경쟁적인 면역분석법이며, 직접적인 화학-형광법을 기본으로 하였다. 실시예 2에서 언급했듯이, 테스토스테론 분석에는 CLIA 키트가 사용되었으며, 제조사의 규약을 따랐다. 결과는 다음과 같다: PEP-1 혹은 비히클을 주입하기 전 모든 그룹의 테스토스테론 레벨은 1-3 ng/dL였다. 첫째 날, 테스토스테론 레벨은 6-10 ng/dL 까지 비히클을 주입한 그룹을 제외한 모든 그룹에서 증가하였다. 둘째 날, 테스토스테론 레벨은 G3, G5, G11 및 G15 그룹에서 가장 높게 나타났으며, 이들 그룹은 1일 1회 주입 요법이 시행된 그룹이었다. 3일 후 테스토스테론 레벨은 감소하였으며, PEP-1 및 비히클을 주입한 그룹간의 뚜렷한 차이가 없었으며, 정상 레벨로 돌아갔다. 암컷 그룹에서, 테스토스테론의 베이스라인은 특이한 점을 찾을 수 없을 정도로 낮았다. 게다가, 수컷 그룹과 달리, 암컷 그룹은 테스토스테론 레벨이 PEP-1 혹은 비히클 주입 전 0.2 ng/dL 이하였고, PEP-1의 주입 이후 0.05ng/dL 까지 계속 떨어졌으며, 3일 째에 정상 레벨로 돌아왔다. 이에 따르면 PEP-1은 암컷 쥐의 테스토스테론 레벨에는 뚜렷한 효과가 없는 것으로 여겨진다 (표 4 및 도 2 와 3 참조).

[표 4]

실시예 4: 에스트라디올 E2 의 분석

에스트라디올 E2는 실시예 2 에서 준비된 샘플을 이용하여 분석되었다. 75 μL의 혈청이 분석에 사용되었다. 분석의 기초는 경쟁적인 면역분석법이며, 직접적인 화학-형광법을 기본으로 하였다. 실시예 2 에서 언급했듯이, 분석에는 CLIA 키트가 사용되었으며, 제조사의 규약을 따랐다. 수컷 그룹에서 에스트라디올 E2의 혈중 평균 레벨은 암컷보다 낮았으며, 에스트라디올 E2의 초기레벨 (PEP-1의 주입 전)은 15-20 pg/mL로 7일차 까지 유지되고, PEP-1은 에스트라디올 E2의 레벨에 영향을 끼치지 않음을 보였다. 그러나, 첫째 날 암컷 그룹에서, 에스트라디올 E2가 20-50 pg/mL (베이스라인)에서 16-30 pg/mL로 모든 PEP1을 맞은 그룹에서 감소하였다. 이러한 레벨은 3일차 까지 일정하게 유지되었으며, 4일차부터 에스트라디올 E2의 레벨이 G4, G10 및 비히클 그룹에서 40-50 pg/mL까지 증가했다가, 정상 레벨로 돌아감을 보였다 (표 5 및 도 4, 5 참조). 결론적으로, PEP-1은 암컷 그룹의 에스트라디올 E2 레벨을 초기에 저해하나, 3-4일차부터 그 레벨이 회복되며, 특히 주입의 횟수와 테스트 약물의 투여량이 에스트라디올 E2 레벨의 저해에 관련된 것처럼 보였다.

[표 5]

실시예 5: 여포자극 호르몬 (FSH) 분석

여포자극 호르몬은 실시예 2에서 준비된 샘플을 이용하여 분석되었다. 100 μL의 혈청이 분석에 사용되었다. 분석의 기초는 2-사이트 샌드위치 면역분석법이며, 직접적인 화학-형광법을 기본으로 하였다. 실시예 2에서 언급했듯이, 분석에는 CLIA 키트가 사용되었으며, 제조사의 규약을 따랐다.

분석 결과에서, PEP-1이 투여된 암컷 및 수컷 둘 다에게서, 베이스라인 (주입 전)과 비교하여 볼 때, 특히 고용량이 투여되면 (G11 부터 G16 그룹), 소폭 증가 (1 일 차, 투여 4시간 및 8시간 후) 함을 보였다 (표 6, 도 6, 7 참조). 1일 째, G6 와 G14 그룹의 여포자극 호르몬 레벨이 비히클그룹과 비교하여 볼 때 증가함을 볼 수 있었다.

[표 6]

실시예 6:황체 형성 호르몬 (LH) 분석

LH는 실시예 2에서 준비된 샘플을 이용하여 분석되었다. 50 μL의 혈청이 분석에 사용되었다. 분석의 기초는 2-사이트 샌드위치 면역분석법이며, 직접적인 화학-형광법을 기본으로 하였다. 실시예 2 에서 언급했듯이, 분석에는 CLIA 키트가 사용되었으며, 제조사의 규약을 따랐다.

분석 결과에서, PEP-1은 수컷과 암컷 모두에게서 황체 형성 호르몬 분비를 촉진하는 것으로 보였고, 특히 높은 투여량과 잦은 주입의 경우에서 황체 형성 호르몬의 레벨이 증가하는 것으로 보였다. 수컷 쥐의 황체 형성 호르몬 레벨은 PEP-1 투여 전 0.1 mIU/mL 이었고, 비히클을 제외한 모든 그룹에서 4시간 후 0.5-1.5 mIU/mL 까지 증가하였다. 황체 형성 호르몬의 레벨은 매일 투여 요법을 실시한 G5, G11, 및 G15에서 가장 높았다. 8시간 후 황체 형성 호르몬의 레벨은 급격히 감소하였으며, 종료 시까지 정상 레벨로 유지 되었다. 암컷 쥐에서, 황체 형성 호르몬 레벨은 또한 4시간 후 증가하였으나, 높은 투여량 요법의 G12, G14, 및 G16 그룹으로부터 증가 폭이 많이 떨어져 있지 않았다. 또한, 8시간 후 황체 형성 호르몬 레벨은 정상 레벨로 돌아 왔다 (표 7 및 도 8, 9 참조).

[표 7]

실시예 7: 성선자극호르몬 방출호르몬 (GnRH) 분석

(1) 쥐에게 PEP-1을 주입

Orient Bio (대한민국 경기도 소재)에서 얻은 SD(Spargue-Dawley) 쥐 중 생후 7 주의 쥐가 연구에 사용되었다. 쥐는 4 개의 그룹 (G1-G4)으로 나뉘었으며 표 8에 나타나 있다. 쥐는 7 일의 연구기간 동안 PEP-1 (100mg/kg)을 피하투여로 2 회 (1 일차 및 7 일차) 주입 받는다. 혈액 샘플 (1.4 mL)은 0 일차 (PEP-1 투여 전), 1일차 (주입 4 시간 후 및 8 시간 후), 그리고 7 일차 (주입 4 시간 후)에 수집되었다. 혈청 샘플은 피로부터 얻어서 실험에 사용되었다. 혈청 샘플은 1 일차 (주입 4시간 후)에 수집된 혈액으로부터 수집되어 실험에 사용되었다. 동물의 처치와 진행과정은 KAMSI의 IACUC의 규정에 따라서 승인되었다.

[표 8]

(2) Real-Time qPCR

RNA 분리 및 cDNA 합성은 혈청 샘플로부터 실시하였다. 외부 컨트롤로, miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control이 각 혈청 샘플에 RNA 추출 시행 전 추가되었고, 총합 RNA 가 혈청 샘플로부터 추출 및 정제되었으며, 여기에 miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하였고, 제조사의 지시를 따랐다. cDNA 샘플의 첫 번째-가닥은 총합 RNA들로부터 합성되었으며, Reverse Transcription System (Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하였다.

(3) Real-Time qPCR 실험

Real-Time qPCRdms RT2 SYBR Green qPCR Mastermix kit (Qiagen)과 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)가 사용 되었다. 데이터는 CFX Manager Software V3.0이 △△Ct방법을 사용한 것을 이용하여 분석되었다.

[표 9]

(4) 성선자극호르몬 방출호르몬의 혈청 레벨

실험 1 일차 PEP-1 (100 mg/kg)의 주입 4시간 후 혈액 샘플에서 얻은 쥐 혈청 샘플이 성선자극호르몬 방출호르몬의 mRNA 발현의 분석에 이용되었다. 도 10 및 11 에서 보듯이, 수컷 및 암컷 쥐 모두에게서, PEP-1 의 투여에 의한 상대적인 성선자극호르몬 방출호르몬 mRNA 발현 증가가 나타났다. 성선자극호르몬 방출호르몬 레벨의 증가는 혈청 샘플에서 관찰되며, 이는, 도 6 부터 9 에서 보이는 1 일차 주입 4 시간 후, 처음 초기의 황체 형성 호르몬 및 여포자극 호르몬의 급증과 관련이 있다. 결과는 PEP-1의 성선자극호르몬 방출호르몬 mRNA 레벨의 상향-조절 (up-regulate)을 보여주며, 이는 PEP-1이 성선자극호르몬 방출호르몬 아고니스트 혹은 아날로그로서의 약제학적 적용의 가능성을 지지해 준다.

이러한 호르몬에 대한 분석을 통하여, 본 발명의 성호르몬 조절제는 테스토스테론, 에스트로겐, 여포자극 호르몬, 황체 형성 호르몬 및 성선자극 방출호르몬을 포함한 성호르몬들을 조절하는데 효과가 있음을 알 수 있다.

III. 호르몬 조절제에 의한 치료 효과

실시예 8 : 테스토스테론의 전립선 세포주내에서의 분석

테스토스테론은 체내에 주입되면 5α-reductase로 인해 DHT (dehydrotestosterone)의 형태가 되어 전립선 세포 증식을 촉진하고 이로 인해 전립선 비대증 (BPH)을 유발한다. 이 사실에 기초하여 다음과 같이 전립선 세포주의 세포 증식 억제효과에 대한 PEP-1 (GV1001) 투여 실험이 진행 되었다. 세포주는 전립선 비대 동물모델에서 얻은 전립선의 실질 세포주 (WPMY-1)와 상피 세포주 (RWPE-1)를 사용하였다. 실험방법은 WPMY-1 (2.5103 cells)와 RWPE-1 (1104 cells)를 96 well에 시딩 (seeding) 하고, 표 10 과 같은 실험군을 대상으로 증식 변화를 확인하였다. 증식 변화 확인은 배양액 흡입 (suction) 후, CCK-8 solution을 각 well에 10 L씩 넣어준 후, 1-4 hr동안 450 nm로 광학 밀도 (optical density)를 측정하는 방식으로 진행하였다.

DHT를 처리하지 않은 그룹들 (1-3 그룹) 사이에는 PEP-1 (GV1001)을 투여하지 않은 그룹 (1 그룹)과 투여한 (2 및 3 그룹) 그룹에서 눈에 띄는 차이가 실질 세포주 (WPMY-1)와 상피 세포주 (RWPE-1) 모두에게서 보이지 않음을 알 수 있었다. DHT를 처리한 그룹들 (4-6 그룹) 사이에는 PEP-1 (GV1001)을 투여하지 않은 그룹 (4 그룹)과 투여한 (5 및 6 그룹) 그룹에서 유의한 차이를 보였으며, PEP-1 (GV1001)을 처리한 그룹에서 확연한 증식 억제 효과가 있음을 보였다 (표 10 및 도 12, 13 참조). 따라서, DHT에 의한 전립선 비대증에 영향을 주는 전립선 세포 증식 억제에 PEP-1이 효과가 있을 것으로 여겨진다.

[표 10]

이러한 호르몬 조절제의 세포 실험을 통하여, 본 발명의 성호르몬 조절제는 전립선 비대증과 같은 호르몬 과다 또는 결핍에 의한 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 사용에 효과가 있음을 알 수 있다.

<110> KAEL-GEMVAX CO., Ltd. KIM, SANG JAE <120> A modulator of hormone secretion, composition comprising the same, and a method for modulating hormone using the same <130> px047156 <150> EP 13173219.0 <151> 2013-06-21 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 유효성분으로 포함하는 성 호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환의 치료, 개선, 또는 예방을 위한 약학 조성물로,
상기 성 호르몬은 테스토스테론 (testosterone), 여포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone), 황체형성호르몬(LH, luteinizing hormone), 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH, Gonadotropin-releasing hormone), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것이고,
상기 성 호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환은 월경과다증(menorrhagia), 자궁내막증(endometriosis), 자궁선근종증(adenomyosis), 자궁섬유양(uterine fibroids), 여성 또는 남성 불임(female or male infertility), 소아 성조숙증(precocious puberty in children), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 펩티드는 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH) 아날로그로 작용하는 것인 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH) 아날로그는 GnRH 아고니스트(agonist) 또는 안타고니스트(antagonist)인 것인 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 조성물은 어쥬번트(adjuvant)를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 어쥬번트는 그래뉼로사이트-마크로파지 콜로니-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)인 약학 조성물.
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제1항 내지 제3항, 제 7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물; 및
설명서를 포함하는 성 호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환의 치료, 개선, 또는 예방을 위한 키트.
제1항 내지 제3항, 제 7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을, 성 호르몬 조절 치료를 필요로 하는 인간을 제외한 포유 동물에게 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하는 성 호르몬 레벨 조절 방법.
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제15항에 있어서, 1일 1회 투여하는 것인 성 호르몬 레벨 조절 방법.
제15항에 있어서, 상기 성 호르몬이 테스토스테론 (testosterone), 여포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone), 황체형성호르몬(LH, luteinizing hormone), 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH, Gonadotropin-releasing hormone)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 성 호르몬 레벨 조절 방법.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 유효성분으로 포함하는 성 호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환의 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물로,
상기 성 호르몬은 테스토스테론 (testosterone), 여포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone), 황체형성호르몬(LH, luteinizing hormone), 성선자극호르몬 방출호르몬(GnRH, Gonadotropin-releasing hormone), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것이고,
상기 성 호르몬의 과다 또는 결핍에 의한 질환은 월경과다증(menorrhagia), 자궁내막증(endometriosis), 자궁선근종증(adenomyosis), 자궁섬유양(uterine fibroids), 여성 또는 남성 불임(female or male infertility), 소아 성조숙증(precocious puberty in children), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 식품 조성물.
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