KR20230066318A - 재조합 변형된 섬유모세포 성장 인자 및 이의 치료적 용도 - Google Patents

재조합 변형된 섬유모세포 성장 인자 및 이의 치료적 용도 Download PDF

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KR20230066318A
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Abstract

본원에는 눈에 전달하기 위한 변형된 섬유모세포 성장 인자(FGF)의 적합한 제제, 이의 제조 방법, 폴리펩타이드, 그러한 변형된 FGF 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물 및 의약, 및 FGF의 투여로부터 이익을 얻는 병태를 치료 또는 예방하기 위하여 그러한 변형된 FGF 폴리펩타이드를 사용하는 방법이 기술된다.

Description

재조합 변형된 섬유모세포 성장 인자 및 이의 치료적 용도
상호 참조
본 출원은 2020년 6월 26일에 출원된 미국 가출원 제 63/044,980호의 이익을 주장하며; 이 출원은 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본원에는 변형된 섬유모세포 성장 인자(FGF) 폴리펩타이드, 그러한 변형된 FGF 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물 및 의약, 및 FGF의 투여로부터 이익을 얻는 병태를 치료 또는 예방하기 위하여 그러한 변형된 FGF 폴리펩타이드를 제조 및 사용하는 방법이 기술된다.
FGF는 발달 및 성인 조직에서 광범위하게 발현되는 큰 폴리펩타이드이며(Baird et al., Cancer Cells, 3:239-243, 1991) 다수의 생리적 기능에서 역할을 한다(McKeehan et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59:135-176, 1998; Burgess, W. H. et al., Annu Rev. Biochem. 58:575-606 (1989)). FGF 패밀리에는 적어도 22개의 구성원이 포함된다(Reuss et al., Cell Tissue Res. 313:139-157 (2003)).
한 구현예는
변형된 FGF-1 폴리펩타이드,
약 1 mM 내지 약 20 mM의 농도의 시트레이트 또는 히스티딘,
약 0.01% 내지 약 10%(중량/부피)의 농도의 계면활성제, 및
약 1% 내지 약 10%(중량/부피) 또는 약 50 mM 내지 약 200 mM의 농도의 긴장성 조절제
를 포함하는 약학 제제를 제공하며,
변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 하기 아미노산 잔기: 위치 16에서 Ser, 위치 66에서 Cys, 및 위치 117에서 Val을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학 제제는 약 1 mM 또는 약 10 mM의 농도로 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제의 농도는 약 0.1%(중량/부피)이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 PS-20 또는 PS-80이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 PS-80이다. 일부 구현예에서, 긴장성 조절제는 소르비톨이며 약학 제제는 약 5%(중량/부피)의 농도의 소르비톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학 제제는 약 4.5 내지 약 6.5의 pH를 가진다. 일부 구현예에서, 약학 제제는 약 5.8의 pH를 가진다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 농도는 약 0.0005 μg/mL 내지 약 200 μg/mL이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 농도는 약 100 μg/mL이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 실온에서 보관될 때, (i) 육안 검사에 의한 가시적인 미립자의 결여 및 (ii) SE-HPLC(크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피) 검정에서 고분자량 종에 대한 5% 미만의 피크 면적 중 어느 하나에 의해 측정되는 바, 적어도 28일 동안 안정적이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 실온에서 보관될 때 적어도 50일 동안 안정적이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 실온에서 보관될 때 적어도 59일 동안 안정적이다. 일부 구현예에서, 제제는 국소 적용, 점안제, 안구내 주사, 또는 안구 주위 주사로서의 적용에 적합하다. 일부 구현예에서, 제제는 안내 전달을 위한 주사용 제제이다. 일부 구현예에서, 제제는 유리체내 전달을 위한 주사용 제제이다.
한 구현예는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드; 적어도 약 200 mM 내지 약 1000 mM의 농도의 염화나트륨; 약 50 mM 내지 약 500 mM의 농도의 황산암모늄; 약 1 mM 내지 약 50 mM의 농도의 인산수소이나트륨을 포함하는 벌크 의약 물질 제제를 제공하며, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 하기 아미노산 잔기: 위치 16에서 Ser, 위치 66에서 Cys, 및 위치 117에서 Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 농도는 적어도 약 0.1 g/mL 내지 약 10 g/mL이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 농도는 약 3 g/mL이다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 800 mM의 농도의 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 320 mM의 농도의 황산암모늄을 포함한다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 20 mM의 농도의 인산수소이나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 7 내지 약 9의 pH를 가진다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 7.4의 pH를 가진다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제 중의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 -60℃ ± 10℃의 온도에서 보관될 때 안정적이다.
한 구현예는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질감염된 박테리아 세포의 배양에서 봉입체(봉입체)로부터 단리된 다시 접힌(refolded) 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 정제를 포함하는 제조 방법을 제공하며, 정제는 리간드로서 덱스트란 설페이트에 커플링된 고도로 가교결합된 아가로스 염기 매트릭스에 다시 접힌 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포획하는 단계, 이어서 부틸 세파로스 수지로 패킹된 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 연마하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 연마 단계로부터의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 회수는, 헤파린 수지로 패킹된 크로마토그래피 칼럼을 사용하며 다른 것은 동일한 제조 방법에서 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 연마하는 단계 후 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 회수보다 약 10% 내지 약 40% 더 크다.
한 구현예는 치료적으로 효과적인 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 확장 가능한 제조 방법을 제공하며, 방법은:
a. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 구성물을 이.콜라이(E.Coli) 세포에 도입하는 단계로서, 구성물은 번역된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 세포의 주변 세포질 공간 내로 표적화하도록 구성되는 것인 단계,
b. 세포를 적합한 항생물질을 포함하는 합성 성장 배지에서 약 20시간 동안 성장시키는 단계; 및
c. 세포로부터 치료적으로 효과적인 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 단계
를 포함하며,
회수된 변형된 FGF-1의 수율은 1 L 이상의 규모에서 적어도 3 g/L이다.
확장 가능한 방법의 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 하기 아미노산 잔기: 위치 16에서 Ser, 위치 66에서 Cys, 및 위치 117에서 Val을 포함한다. 확장 가능한 방법의 일부 구현예에서, 이. 콜라이(E.Coli) 세포는 균주 BL21, K12 HMS174, 및 W3110으로부터 선택된다. 확장 가능한 방법의 일부 구현예에서, 재조합 핵산 구성물은 T7 또는 tac 프로모터를 포함하는 pMKet_TTHX1114이다. 확장 가능한 방법의 일부 구현예에서, 합성 성장 배지는 탄소원으로서의 글리세롤, 펩톤 및 효모를 포함한다. 확장 가능한 방법의 일부 구현예에서, 이. 콜라이 세포는 BL21 세포이고 pMKet_TTHX1114를 발현하는 BL21 세포는 카나마이신의 존재 하에 약 20시간 동안 37℃에서 성장한다. 확장 가능한 방법의 일부 구현예에서, 재조합 핵산 구성물은 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율을 증가시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다. 확장 가능한 방법의 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 세포에서 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 증가된 발현을 위한 핵산 서열 코돈 최적화를 포함한다.
한 구현예는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하기 위한 핵산 서열을 제공하며, 핵산은 서열 번호: 207의 서열을 포함한다. 한 구현예는 Tac 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 서열 번호: 207을 포함하는 박테리아 발현 벡터를 제공한다.
본원에는 한 구현예에서 하나 이상의 돌연변이가 있는 서열 번호: 1로서 제시된 서열을 포함하는 재조합 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 제공되며, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 위치한 N-말단 메티오닌 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한 연장 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 연장 펩타이드는 서열 번호: 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 연장 펩타이드는 서열 번호: 4-8에 제시된 서열 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 14-18로부터 선택된 서열을 포함한다.
본원에는 (a) 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호: 1에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는 재조합 FGF-1 폴리펩타이드; 및 (b) L-메티오닌을 포함하는 제제가 제공된다. 일부 구현예에서, 제제는 안내 전달을 위한 주사용 제제이다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한 연장 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 연장 펩타이드는 서열 번호: 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 연장 펩타이드는 서열 번호: 4-8에 제시된 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 14-18로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 24-28로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 93-117로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 연장 펩타이드에 대해 N-말단인 메티오닌 잔기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 118-141로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 136개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 이의 성숙한 형태의 적어도 141개 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 67에서 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 146-149로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 연장 펩타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 서열 번호: 174-204로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 재조합 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2, 또는 서열 번호: 205에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 Lys12Val, Cys16Ser, Ala66Cys, Cys117Val, 및 Pro134Val로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 펩타이드 ALTEK의 적어도 하나의 잔기를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 다음의 돌연변이: Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val을 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 제1 잔기에 대해 상류에 위치한 메티오닌 잔기를 포함하며, 펩타이드 ALTEK의 적어도 하나의 잔기는 N-말단 메티오닌과 서열 번호:1의 위치 1 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 제제는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 L-메티오닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 L-메티오닌 및 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는:
- 적어도 약 50 mM 이염기성 인산나트륨 이수화물;
- 적어도 약 100 mM 염화나트륨;
- 적어도 약 10 mM 황산암모늄;
- 적어도 약 5 mM L-메티오닌, 및
- 적어도 약 0.01% 폴리소르베이트 80(중량/부피)
중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는
- 적어도 약 50 mM 이염기성 인산나트륨 이수화물;
- 적어도 약 100 mM 염화나트륨;
- 적어도 약 10 mM 황산암모늄;
- 적어도 약 0.1 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA);
- 적어도 약 5 mM L-메티오닌, 및
- 적어도 약 0.01% 폴리소르베이트 80(중량/부피)
중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 적어도 약 0.01 mM 내지 약 10 mM의 EDTA의 농도로 EDTA를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 황산암모늄을 포함하며, 황산암모늄의 농도는 적어도 약 0.01 mM 내지 약 100 mM이다.
일부 구현예에서, 제제는 적어도 약 0.01 mM 내지 약 100 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 FGF-1은 다음으로 이루어지는 목록으로부터 선택된 하나 이상의 질환, 장애, 또는 병태를 치료하기에 적합한 농도로 존재한다: 푹스 이영양증(Fuch's dystrophy), 수포성 각막병증(bullous keratopathy), 헤르페스 각막병증(herpetic keratopathy), 선천성 유전성 내피 이영양증(congenital hereditary endothelial dystrophy) 1, 선천성 유전성 내피 이영양증 2, 후방 다형 각막 이영양증(posterior polymorphous corneal dystrophy), 안구 건조증(dry eye syndrome), 원추 각막(keratoconus), 격자 각막 이영양증(lattice corneal dystrophy), 과립형 각막 이영양증(granular corneal dystrophy), 황반 각막 이영양증(macular corneal dystrophy), 슈나이더 결정 각막 이영양증(Schnyder crystalline corneal dystrophy), 선천성 간질 각막 이영양증(congenital stromal corneal dystrophy), 반점 각막 이영양증(fleck corneal dystrophy), 각막 손상(corneal injury), 안구 손상(ocular injury), 화학적 손상, 발포제 손상(vesicant injury), 간질 손상(stromal injury) 및 머스터드 가스 각막병증(mustard gas keratopathy).
일부 구현예에서, 본원에는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 유기체에의 투여를 용이하게 하는 약학 조성물 또는 제제가 제공된다. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여하는 다수의 기법이 기술분야에 존재하는데, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 국소적, 안과, 안내, 안구 주위, 정맥내, 경구, 에어로졸, 비경구 투여를 들 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 액체 안과용 제제이다. 일부 구현예에서, 약학 제제는 국소적으로, 또는 각막으로의 미세바늘 주사에 의해, 또는 전방내로(intracamerally) 투여된다. 국소 투여의 방식에는, 예를 들어, 국소 적용, 점안제, 안내 주사 또는 안구 주위 주사가 포함될 수 있다. 안구 주위 주사는 전형적으로 결막 아래로 또는 테논강(Tennon's space)(눈 위에 있는 섬유 조직 아래)으로의 화합물의 주사를 포함한다. 안내 주사는 전형적으로 변형된 FGF 또는 약학 조성물의 유리질로의 주사를 포함한다. 특정 구현예에서, 투여는 예컨대 국소 적용 또는 점안제에 의한 것과 같이 비침습적이다. 일부 구현예에서, 투여는 국소 및 전방내 방법의 조합을 통해 이루어진다.
일부 구현예에서, 제제는 전방내로 투여된다.
일부 구현예에서, 제제는 유리체내로 투여된다.
일부 구현예에서, 제제는 약 -20℃의 온도에서 적어도 약 2주 내지 약 4주 동안 안정적이다.
본원에는 치료적으로 효과적인 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 확장 가능한 제조 방법이 제공되며, 방법은 (a) 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 핵산 구성물을 세포에 도입하는 단계로서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 세포에 의해 생성되는 것인 단계; 및 (b) 세포로부터 치료적으로 효과적인 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 확장 가능한 방법은 (a) 재조합 핵산 구성물을 적합한 이. 콜라이 세포에 도입하는 단계로서, 재조합 핵산 구성물은 pBR322 유도 ori 서열을 포함하는 벡터에 삽입된, 세포질 발현을 위한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 것인 단계, b. 세포를 적합한 항생물질을 포함하는 합성 성장 배지에서 약 20시간 동안 성장시키는 단계; 및 c. 세포로부터 치료적으로 효과적인 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하며, 단계 c에서 회수된 변형된 FGF-1의 수율은 pBR322 유도 ori 서열을 포함하는 벡터, 합성 성장 배지, 또는 이들의 조합을 사용하는 것을 포함하지 않는 방법보다 적어도 2배 더 높다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 Ala66Cys 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 Cys16Ser 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 Cys117Ser 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 위치한 N-말단 메티오닌 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한 연장 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 연장 펩타이드는 서열 번호: 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 연장 펩타이드는 서열 번호: 4-8에 제시된 서열 중 어느 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 14-18로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 24-28로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 93-117로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 연장 펩타이드에 대해 N-말단인 메티오닌 잔기를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 118-141로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 136개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 이의 성숙한 형태의 적어도 141개 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 146-149로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 연장 펩타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 174-204로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2 서열 번호: 205에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 배치당 1 g의 변형된 FGF-1폴리펩타이드를 생성하도록 확장 가능하다.
일부 구현예에서, 방법은 배치당 10 g의 변형된 FGF-1폴리펩타이드를 생성하도록 확장 가능하다.
일부 구현예에서, 방법은 배치당 100 g의 변형된 FGF-1폴리펩타이드를 생성하도록 확장 가능하다.
일부 구현예에서, 방법은 배치당 1 Kg의 변형된 FGF-1폴리펩타이드를 생성하도록 확장 가능하다.
일부 구현예에서, 방법은 배치당 10 Kg의 변형된 FGF-1폴리펩타이드를 생성하도록 확장 가능하다.
일부 구현예에서, 방법은 배치당 100 Kg의 변형된 FGF-1폴리펩타이드를 생성하도록 확장 가능하다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 100 L 세포 스톡의 배치 제제를 생성하도록 확장 가능하다.
일부 구현예에서, 세포는 효모 세포 또는 박테리아이다.
일부 구현예에서, 세포는 박테리아이고, 박테리아는 이. 콜라이이다.
일부 구현예에서, 세포는 이. 콜라이 세포, 균주 BLA21A1이다.
일부 구현예에서, 세포는 이. 콜라이 세포, 균주 K12 HMS174, 또는 W3110이다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산 구성물은 플라스미드의 형태이다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산 구성물은 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율 증가를 위한 하나 이상의 변형을 포함한다.
구현예 69의 방법에서, 하나 이상의 변형은 세포에서 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 증가된 발현을 위한 서열 최적화를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 플라스미드에서의 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율 증가를 위해 적합한 프로모터를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 세포 증식을 최대화하기 위해 적당한 영양 배지에서 세포를 성장시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 적당한 영양 배지는 탄소원을 포함한다.
일부 구현예에서, 탄소원은 글루코스 또는 글리세롤이다.
일부 구현예에서, 플라스미드는 pMKet, 또는 이의 유도체 또는 변형물이다.
일부 구현예에서, 방법은 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율을 최대화하기 위한 하나 이상의 변형 과정을 추가로 포함하며, 하나 이상의 변형 과정은:
i. 돌연변이 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산 내에서의 변형;
ii. 프로모터, 인핸서, 5'-미번역 영역, 3'-미번역 영역, 폴리 A 꼬리, 전사체 안정화 요소로부터 선택된, 돌연변이 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산에 회합된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 재조합 핵산 내에서의 변형;
iii. 재조합 핵산을 포함하는 플라스미드의 변형;
iv. 세포 증식을 최대화하기 위한 세포 균주의 변형 또는 세포 균주의 선택;
v. 세포 성장 배지의 변형; 및
vi. 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 과정의 변형
으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산을 도입하는 단계는 세포에서 재조합 핵산을 전기천공하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 단계는 세포의 세포질 주위 봉입체로부터 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 회수 단계는 변성 완충액에서 봉입체를 가용화하는 단계, 및 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 변성 완충액은 우레아 또는 구아니딘을 포함한다.
구현예 34 또는 77의 방법에서, 변성 완충액은 pH 7.4에서 6 M 구아니딘을 포함한다.
일부 구현예에서, 변성 완충액은 2 mM EDTA를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 DTT를 첨가함으로써 회수된 FGF-1 폴리펩타이드를 환원시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 투석여과에 의해 DTT를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 회수된 FGF-1 폴리펩타이드는 재접힘 완충액에서 재접힘 단계가 적용된다.
일부 구현예에서, 재접힘 완충액은 아르기닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 재접힘 완충액은 1 M 아르기닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 재접힘 완충액은 pH 9-9.5에서 5-50 mM Tris를 포함한다.
일부 구현예에서, 재접힘 완충액은 5 mM 시스테인, 또는 2 mM 시스틴 또는 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, FGF-1은 헤파린과의 소수성 상호작용 칼럼(HIC)에 의해 포획된다.
일부 구현예에서, 치료적으로 효과적인 재조합 돌연변이 hFGF1 단백질을 회수하는 단계는 단백질을 정제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 단계는: 액체 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 한외여과, 횡류 여과, 및 투석여과 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 단계는 헤파린 칼럼 여과를 통한 정제 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 단계는 순수한 단량체 재조합 돌연변이 hFGF1 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 단계는 발열원이 없고, 내독소가 없으며 실질적으로 헤파린이 없는 순수한 단량체 재조합 돌연변이 hFGF1 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
본원에는 구현예 34-97 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드, 이의 동결건조 분말 분획, 또는 이의 액체 제제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본원에는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, 변형된 인간 FGF-1을 암호화하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 서열은 세포질 발현을 위해 설계된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 모노시스트로닉 서열을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 폴리시스트로닉 서열을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 FGF-1 폴리펩타이드 외에 샤페론(chaperone) 펩타이드 서열을 암호화한다.
본원에는 푹스 이영양증, 수포성 각막병증, 각막 궤양(corneal ulcers), 헤르페스 각막병증, 선천성 유전성 내피 이영양증 1, 선천성 유전성 내피 이영양증 2, 후방 다형 각막 이영양증, 안구 건조증, 원추 각막, 격자 각막 이영양증, 과립형 각막 이영양증, 황반 각막 이영양증, 슈나이더 결정 각막 이영양증, 선천성 간질 각막 이영양증, 반점 각막 이영양증, 각막 손상, 안구 손상, 화학적 손상, 발포제 손상, 간질 손상 및 머스터드 가스 각막병증으로 이루어지는 목록으로부터 선택된 질환, 장애, 또는 병태를 가진 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 필요로 하는 대상체에게 적합한 용량의:
(i) 구현예 1-33 중 어느 하나의 주사용 제제, 또는
(ii) 구현예 98의 약학 조성물을 투여하는 단계
를 포함한다.
본원에는 FGF-1의 주사용 제제를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 키트는 점적기 병을 포함하며, 점적기 병은 본원에서 기술된 제제 또는 약학 조성물 중 적어도 한 용량의 변형된 FGF-1를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 점적기 병은 멸균 필터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 용기는 주사기를 포함한다. 일부 구현예에서, 주사기는 투베르굴린 폴리프로필렌 및 유리로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 블로우 필 씰 점적기(blow-fill-seal dropper)와 같은 단위 용량 용기를 포함한다.
일부 구현예에서, 주사기는 본원에 기술된 주사용 제제 또는 약학 조성물로 사전 충전된다.
일부 구현예에서, 키트는 전자 제어 유닛을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 전자 제어 유닛은 일정 부피의 본원에 기술된 주사용 제제 또는 약학 조성물의 투여의 제어를 가능하게 하며, 부피는 적어도 약 10 μL 내지 약 100 μL이다.
참조에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것과 같은 정도로 그 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
도 1은 예시의 일반화된 FGF-1 제조 과정을 도시한다.
도 2a는 부틸 HIC 크로마토그래피 및 점선에 의해 표시된 부분의 용출에 의한 예시의 포획을 도시하며 SDS-PAGE는 FGF-1에 상응하는 단일 17 kDa 밴드를 생성하였다(미도시).
도 2b는 헤파린 칼럼에서 부틸 포획 단계 후 예시의 연마 단계, 및 용리액의 대표적인 SDS-PAGE를 도시한다.
도 3a 및 도 3b는 부틸 및 헤파린 HIC에 포획된, 상이한 재접힘 완충액을 사용하는 실험으로부터의 데이터를 도시한다. 도 3c는 부틸(좌측)과 이어서 헤파린 HIC(우측)에서의 용출의 SDS-PAGE 결과를 도시한다.
도 4a 및 도 4b는 재접힘 완충액에 우레아 또는 구아니딘을 사용하는 대표적인 실험, 폴리소르베이트 20 대비 폴리소르베이트 80의 사용, 및 결과적으로 생성된 단백질의 SDS-PAGE 상에서의 런(run)의 비교로부터 FGF1 회수율을 나타내는 정량적 데이터를 도시한다. 도면에서 각각의 데이터 포인트에 대해, 제1 칼럼은 4℃에서의 재접힘을 나타내고 제2 칼럼은 실온에서의 재접힘을 나타낸다.
도 5는 예시적인 일반화된 FGF-1 제조 과정을 도시한다.
도 6은 이. 콜라이에서 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 발현을 위한 플라스미드 지도를 도시한다.
도 7a, 도 7b, 및 도 7c는 0일째(도 7a), 28일째(도 7b) 및 59일째(도 7c)의 의약 물질의 선명한 피크를 보여주는 대표적인 SEC-HPLC 데이터를 도시한다.
눈의 질환 및 손상은 심각하게 쇠약해질 수 있고, 광범위한 형태로 발생한다. 안구 질환의 한 부류는 머스터드 가스 각막병증이다. 머스터드 가스는 제1차 세계대전 중 1915년 4월에 독일군이 이프르(Ypres) 전장에서 처음으로 방출한 발포성 유독가스이다. 머스터드 가스에의 노출은 수년에 걸쳐 발생하는 장기간 합병증으로 이어질 수 있다. 각막은 흉터가 생기고 불규칙해지며, 콜레스테롤과 칼슘이 조직에 침착되어, 점진적으로 시력 손상을 유도한다. 세극등(slit-lamp) 검사는 상공막(episcleral) 조직이 특징적인 언더글레이즈를 나타내는 것을 보여준다. 백자 외관과 비정상적인 혈관 이상이 일반적이다. 이들은 확장되고 왜곡된 혈관으로 나타나며, 때때로 정맥류(varicosities)와 소시지 모양의 혈관이 동반된 팽대부 모양의 윤곽이 나타난다. 시간이 지남에 따라, 각막의 짙은 혼탁이 발생하며, 위쪽 부분은 돌출된 눈꺼풀에 의해 보호되기 때문에 중앙 부분과 아래쪽 부분에서 가장 분명하게 나타난다. MGK의 두드러진 조직병리학적 특징에는, 예를 들어, 불규칙한 상피 두께, 퇴행성 변화, 두꺼워진 상피 기저막, 각막세포(keratocyte) 손실, 및 보우만 층(Bowman layer) 파괴가 포함된다(Kanavi et al., Chronic and delayed mustard gas keratopathy: a histopathologic and immunohistochemical study, Eur. J Ophthalmol. 2010 Sep-Oct;20(5):839-43). 전형적으로, 각막 발포제 노출 후 1일 이내에 각막 상피(CE)가 기저막(BM)에서 벗겨지고, 각막 부종이 벗겨진 기질에서 발생하며 전체 두께의 각화세포증(keratocytosis)이 상처 가장자리 내에서 명백하다. 5일까지, 상피 캡이 재생되고, 각막 부종은 가라앉기 시작한다. 노출 1주 후, CE는 기초적인 헤미데스모좀 부착물(hemidesmosomal attachment)과 함께 부분적으로 층화된다. 이런 분명한 개선에도 불구하고, 각막은 노출 후 3주가 되자마자 지속적으로 증가된 각막 부종(corneal edema), 재발성 각막 미란(corneal erosion) 및 신생혈관 형성을 포함한 만성 손상의 임상적 징후들을 나타낸다. 8주까지, 기저막 지대는 중증의 변성을 경험한다. 추가로, MGK 영향을 받는 각막은 지연된 상처 치유 과정을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드, 및 그러한 변형된 펩타이드를 포함하는 이의 액체 주사용 제제, 및 다양한 병태, 예컨대 안구 질환, 장애 및 병태(예컨대 푹스 이영양증), 발포제 유도 각막 상피 및 내피 손상(예컨대, 머스터드 가스 각막병증(MGK)), 상처 치유, 심혈관 질환(예컨대, 허혈), 및 신경학적 병태(예컨대, 근위축성 측삭 경화증(ALS))를 치료하기 위해 그러한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 사용하는 방법이 제공된다. 또한 본원에는 변형된 섬유모세포 성장 인자(FGF-1) 폴리펩타이드, 또는 그러한 변형된 펩타이드를 포함하는 약학 조성물 또는 의약을 투여함으로써 화학물질 또는 발포제 유도 손상을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여함으로써 화학적 손상, 예컨대, 화학적 화상에 의해 유도된 머스터드 가스 각막병증(MGK)을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여함으로써 발포제, 예컨대, 질소 머스터드(NM)에 의해 유도된 머스터드 가스 각막병증(MGK)을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 화학전 작용제, 예컨대, 포스젠에 의해 유도된 화학적 또는 열적 손상을 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본원에는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드, 및 이의 액체 주사용 제제가 다양한 병태, 예컨대 안구 질환, 장애 및 병태(예컨대 푹스 이영양증), 발포제 유도 각막 상피 및 내피 손상(예컨대, 머스터드 가스 각막병증(MGK)), 상처 치유, 심혈관 질환(예컨대, 허혈), 및 신경학적 병태(예컨대, 근위축성 측삭 경화증(ALS))를 치료하기 위해 그러한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 사용하는 것에 적합하도록, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드, 및 그러한 변형된 펩타이드를 포함하는 이의 액체 주사용 제제의 제조 방법이 제공된다. 또한 본원에는 변형된 섬유모세포 성장 인자(FGF-1) 폴리펩타이드, 또는 그러한 변형된 펩타이드를 포함하는 약학 조성물 또는 의약을 투여함으로써 화학물질 또는 발포제 유도 손상을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여함으로써 화학적 손상, 예컨대, 화학적 화상에 의해 유도된 머스터드 가스 각막병증(MGK)을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여함으로써 발포제, 예컨대, 질소 머스터드(NM)에 의해 유도된 머스터드 가스 각막병증(MGK)을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 화학전 작용제, 예컨대, 포스젠에 의해 유발된 화학적 또는 열적 손상을 치료하는 단계를 포함한다.
변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 N-말단 메티오닌(N-Met) 잔기를 포함하여 발현되는 본원에 기술된 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 N-말단 펩타이드의 제거를 위해 단백질 가수분해 절단을 필요로 하는 단계 없이 후속적으로 정제된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시는 N-말단 펩타이드의 제거를 위해 단백질 가수분해 절단 단계를 포함하지 않는 신속한 정제 방법에 의해 제조되는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 제공한다. 이것은 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준(GMP) 지침에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 생산에 특히 유리하다. 장점으로는, 절단된 생성물의 후속 정제 및 절단에 사용된 시약의 제거에 대한 필요성의 제거를 포함한 절단 단계의 결여를 들 수 있다. 이것의 추가 장점은 감소된 취급으로 인한 수율의 증가 및 잔류 절단 시약 및 절단 및 절단된 물질의 미절단 물질로부터의 후속 단리를 위해 도입된 오염물에 대한 테스트 필요성의 완화이다.
본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 증가된 안정성(예컨대 열안정성), 감소된 수의 묻힌(buried) 유리 티올, 및/또는 증가된 효과적인 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG) 친화성을 가질 수 있다.
여러 다른 장점은 본원에 기술된 방법에서 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 사용과 관련된다. 예를 들어, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 이의 약학 조성물 또는 제제(예컨대, 안과용 제제)에 헤파린 없이 투여될 수 있어서, 생물학적 기원과 관련된 잠재적인 안전상의 문제를 피할 수 있다. 더불어, 헤파린의 회피는 국소적 헤파린 유도 부작용 또는 기존의 항-헤파린 항체로부터 비롯된 합병증 없이 더 많은 양의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 사용을 허용한다. 나아가, 헤파린의 부재 시에, 변형된 FGF의 조직에의 즉각적인 결합은 최대화되고 전신적 분포가 상당히 감소된다. 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 또한 향상된 국소 격리 및 감소된 재분포 동역학을 가짐으로써, 전달 부위에서 제거 반감기 및 평균 체류 시간(MRT)이 감소되고, 감소된 투약 빈도가 허용되는 이점이 있다. 이것은 증가된 안정성(예컨대 열안정성), 감소된 수의 묻힌 유리 티올, 및/또는 증가된 효과적인 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(HSPG) 친화성을 가지는 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 결과일 수 있다.
본 개시의 FGF-1 폴리펩타이드는, 다양한 구현예에서, 폴리펩타이드의 N-말단에서, 예컨대 첨가, 절단, 또는 첨가와 절단의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 단일 N-말단 메티오닌 잔기의 첨가이다. 일부 구현예에서, 변형은 연장 펩타이드의 첨가이다. 일부 구현예에서, 변형은 FGF-1 폴리펩타이드의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이다. 일부 구현예에서, FGF-1 폴리펩타이드는 N-말단 변형 외에, 하나 이상의 돌연변이가 있는, 서열 번호: 1에 제시된 서열을 포함한다.
본원에 개시된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 몇몇 예는 성숙한 형태의 폴리펩타이드에 N-말단 메티오닌(N-Met) 잔기를 포함한다. 아미노산이 단백질의 N-말단에 첨가될 때 생물학적 활성의 보유의 여부는 예측할 수 없다. 일부 단백질은 이것을 견디며 일부는 그렇지 못하고, 생물학적 활성의 보유 및 안정성의 변화 가능성은 단지 실험적으로만 측정된다. 본 개시는 N-말단 Met 잔기의 첨가가 생물학적 활성 및 안정성의 보유와 함께 허용되는 것을 확인한다.
특정 용어
전술한 일반적 설명 및 이어지는 상세한 설명은 단지 예시적이며 설명하기 위한 것이고 청구되는 어떠한 주제도 제한하지 않는 것이 이해되어야 한다. 본 출원에서, 단수의 사용은 구체적으로 다르게 명시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 것과 같이, 단수 형태를 지칭하는 단어("a", "an" 및 "the")는 분명하게 다르게 가리키지 않는 한 복수의 대상물을 포함한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 다르게 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 나아가, 용어 "포함한" 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함하는", 및 "포함된"의 사용은 제한하는 것이 아니다.
본원에서 사용되는 섹션 제목은 구성상의 목적만을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 청구된 주제가 속하는 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원의 용어에 대해 복수의 정의가 있는 경우에, 본 섹션에서의 정의가 우선시된다. 모든 특허, 특허 출원, 출판물 및 본원에서 언급된 공개된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열(예컨대, GenBank 또는 다른 데이터베이스에서 이용 가능한 서열)은 참조로 포함된다. 참조가 URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소에 대해 이루어진 경우, 그러한 식별자는 변경될 수 있고 인터넷 상에서의 특정 정보는 왔다 갔다 할 수 있지만, 동등한 정보는 인터넷 검색에 의해 찾아볼 수 있는 것이 이해된다. 이에 대한 참조는 그러한 정보의 이용 가능성 및 대중적인 보급성을 증명한다.
본원에서 사용되는 바, 서열과 관련하여 용어 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위하여 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존성 치환도 고려하지 않고, 특정 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정할 목적의 정렬은 기술분야의 숙련성 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어, EMBOSS MATCHER, EMBOSS WATER, EMBOSS STRETCHER, EMBOSS NEEDLE, EMBOSS LALIGN, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 기술분야에 숙련된 사람들은 비교되는 완전한 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
표준 화학 용어의 정의는, 한정하는 것은 아니지만, 문헌 [Carey and Sundberg "Advanced Organic Chemistry 4th Ed". Vols. A(2000) and B(2001), Plenum Press, New York]을 포함한 참조 작업에서 찾아볼 수 있다. 다르게 표시되지 않는 한, 종래 방법은 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 약물학이다.
구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 실험실 과정 및 기법은 현장에서 인식되는 것들이다. 표준 기법은 화학적 합성, 화학적 분석, 약학 조제물, 제제, 및 전달, 및 환자의 치료에 사용될 수 있다. 표준 기법은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 및 조직 배양 및 변형(예컨대, 전기천공, 리포펙션)에 대해 사용될 수 있다. 반응 및 정제 기법은 예컨대, 제조자의 명세가 있는 키트를 사용하여 또는 기술분야에서 일반적으로 성취된 것과 같이 또는 본원에 기술된 것과 같이 수행될 수 있다. 전술한 기법 및 과정은 일반적으로 종래 방법으로 및 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 다양한 일반적인 및 보다 구체적인 참고문헌에서 기술된 것과 같이 수행될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 구성물, 및 시약에 제한되지 않으며 그러한 것들은 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 특정 구현예를 설명할 목적으로만 있는 것이며, 본원에 기술된 방법, 화합물, 조성물의 범주를 제한하려는 의도가 아닌 것이 이해되어야 한다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환, 장애 또는 병태 증상을 완화, 약화 또는 개선하는 것, 추가 증상을 예방하는 것, 증상의 기저 대사 요인을 개선 또는 예방하는 것, 질환, 장애, 또는 병태를 억제하는 것, 예컨대, 질환, 장애, 또는 병태의 발달을 정지시키는 것, 질환, 장애, 또는 병태를 완화시키는 것, 질환, 장애, 또는 병태의 퇴행을 유발하는 것, 질환, 장애, 또는 병태에 의해 유발된 병태를 완화시키는 것, 또는 질환, 장애, 또는 병태의 증상을 중단시키는 것을 포함한다. 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는, 한정하는 것은 아니지만, 예방적 및/또는 치료적 치료를 포함한다.
제제, 조성물 또는 성분과 관련하여 용어 "허용 가능한" 또는 "약학적으로 허용 가능한"은 치료되고 있는 대상체의 일반적인 건강에 지속적인 유해 효과를 갖지 않고 본원에 기술된 변형된 FGF의 생물학적 활성 또는 특성을 없애지 않으며, 상대적으로 무독성인 것을 지칭한다.
특정 변형된 FGF 또는 약학 조성물의 투여에 의한 특정 질환, 장애 또는 병태의 증상의 "개선"이란 용어는 변형된 FGF 또는 약학 조성물의 투여에 기인할 수 있거나 이와 관련될 수 있는, 영구적이거나 일시적이거나, 지속적이거나 일과성인 중증도의 임의의 축소, 발병의 지연, 진행의 둔화, 또는 기간의 단축을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "조합" 또는 "약학 조합"은 하나 이상의 활성 성분의 혼합 또는 조합으로부터 비롯된 생성물을 의미하며 활성 성분의 고정 및 비고정 조합을 모두 포함한다. 용어 "고정된 조합"은 하나의 활성 성분(예컨대, 변형된 FGF) 및 공동 작용제가 모두 환자에게 단일 실체 또는 투여 형태로 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비고정 조합"은 하나의 활성 성분(예컨대, 변형된 FGF) 및 공동 작용제가 환자에게 동시에, 같은 시기에 또는 특정 간격의 시간 제한 없이 순차적으로 별도의 실체로서 투여되는 것을 의미하며, 그러한 투여는 환자의 신체에서 두 작용제의 유효 수준을 제공한다. 후자는 또한 칵테일 요법, 예컨대 3개 이상의 활성 성분의 투여에도 적용된다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "약학 조성물" 또는 "약학 제제"는 하나 이상의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(예컨대, 서열 번호: 2의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드)와 하나 이상의 다른 화학적 구성요소, 예컨대 계면활성제, 완충제, 긴장성 조절제, 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제, 및/또는 다른 부형제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 제제를 지칭한다. 약학 제제는 유기체에 대한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 투여를 용이하게 한다. 한정하는 것은 아니지만, 국소적, 안과, 안내, 안구 주위, 정맥내, 경구, 에어로졸, 비경구 투여를 포함한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여하는 다수의 기법이 기술분야에 존재한다. 일부 구현예에서, 약학 제제는 비활성 성분, 예컨대, 완충제, 계면활성제, 긴장성 조절제, 또는 이들의 조합과 함께 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(예컨대, 서열 번호: 2에 제시된 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "담체"는 관심의 작용제(예컨대, 변형된 FGF)의 세포 또는 조직에의 통합을 용이하게 하는 상대적으로 무독성 화학적 화합물 또는 작용제를 지칭한다.
용어 "희석제"는 전달 전에 관심의 작용제(예컨대, 변형된 FGF)를 희석하기 위해 사용되는 화학적 화합물을 지칭한다. 희석제는 또한 그것이 더 안정적인 환경을 제공하기 때문에 작용제를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 완충 용액에 용해된 염(또한 pH 제어 또는 유지를 제공할 수 있음), 이를테면, 한정하는 것은 아니지만 인산염 완충 식염수 용액이 기술분야에서 희석제로서 활용된다.
용어 "공동 투여" 등은 단일 환자에게 선택된 작용제(예컨대, 변형된 FGF 또는 이의 조성물 및 공동 작용제)의 투여를 포함하는 것을 의미하며, 작용제가 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 또는 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드, 작용제, 조합 또는 약학 조성물이 치료되고 있는 질환, 장애 또는 병태의 증상의 하나 이상을 어느 정도 완화시키기에 충분한 양을 지칭한다. 결과는 질환의 징후, 증상, 또는 요인의 감소 및/또는 완화, 또는 생물학적 체계의 어떠한 다른 바람직한 변경일 수 있다. 예를 들어, 치료적 용도에 대한 "유효량"은 부당한 부작용 없이 원하는 약물학적 효과, 치료적 개선, 또는 질환 증상의 임상적으로 유의미한 감소를 제공하기 위해 필요한 변형된 FGF, 작용제, 조합 또는 약학 조성물의 양이다. 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효량"은 기법, 예컨대 용량 증량 연구를 사용하여 결정될 수 있다. 용어 "치료적 유효량"은, 예를 들어, 예방적 유효량을 포함한다. "유효량"은 변형된 FGF, 조합, 또는 약학 조성물의 대사의 변화, 연령, 체중, 대상체의 일반적인 상태, 치료되는 병태, 치료되는 병태의 중증도, 및 주치의의 판단으로 인해 대상체별로 달라질 수 있다. 예를 들자면, 치료적 유효량은 한정하는 것은 아니지만 용량 증량 임상 시험을 포함한 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.
용어 "예방적 유효량"은 환자에게 적용된 본원에 기술된 변형된 FGF, 화합물, 작용제, 조합 또는 약학 조성물이 치료되고 있는 질환, 병태 또는 장애의 증상의 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 양을 지칭한다. 그러한 예방적 적용에서, 그러한 양은 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 달라질 수 있다. 당업자가 그러한 예방적 유효량을, 한정하는 것은 아니지만, 용량 증량 임상 시험을 포함한 일상적인 실험에 의해 결정하는 것은 기술분야의 숙련도 내에 있는 것으로 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 또는 "환자"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. 단지 예를 들자면, 대상체는, 한정하는 것은 아니지만, 인간을 포함한 포유류일 수 있고, 그에 한정되지 않는다.
용어 "향상시키다" 또는 "향상시키는"은 원하는 효과를 효능 또는 기간에서 증가 또는 연장시키는 것을 의미한다. 예를 들자면, 치료제의 효과를 단독으로 또는 조합하여 "향상시키는" 것은 질환, 장애 또는 병태의 치료에 미치는 작용제의 영향을 효능, 기간 및/또는 크기 중 어느 하나에서 증가 또는 연장시키는 능력을 지칭한다. 환자에서 사용될 때, 이런 용도에 효과적인 양은 질환, 장애 또는 병태의 중증도 및 과정, 이전 치료법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.
용어 "조절하다"는 표적(예컨대, FGF 수용체)의 활성을 변경시키기 위하여, 단지 예를 들자면, 표적의 활성을 향상시키기 위하여, 표적의 활성을 억제 또는 길항하기 위하여, 표적의 활성을 제한하기 위하여, 또는 표적의 활성을 연장시키기 위하여 표적과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 및 약학 조성물은 하나 이상의 각각의 표적(예컨대, 하나 이상의 FGF 수용체)의 활성을 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 세포(예컨대, 각막 내피 세포) 상에서 하나 이상의 FGF 수용체의 활성을 조절(예컨대, 증가)시켜서, 예컨대, 세포 이동 및/또는 세포 증식을 유도할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "표적"은 본원에 기술된 선택적인 결합제(예컨대, 변형된 FGF) 또는 약학 조성물에 의해 결합될 수 있는 생물학적 분자(예컨대, 표적 단백질 또는 단백질 복합체), 예컨대 FGF 수용체, 또는 생물학적 분자의 일부를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "비표적"은 본원에 기술된 선택적인 결합제 또는 약학 조성물에 의해 선택적으로 결합되지 않는 생물학적 분자 또는 생물학적 분자의 일부를 지칭한다.
용어 "표적 활성" 또는 "세포 반응"은 변형된 FGF에 의해 조절될 수 있는 생물학적 활성 또는 변형된 FGF의 FGF 수용체에의 결합으로부터 비롯된 임의의 세포 반응을 지칭한다. 예시의 특정 표적 활성 및 세포 반응에는, 한정하는 것은 아니지만, 결합 친화성, 신호 변환, 유전자 발현, 세포 이동, 세포 증식, 세포 분화, 및 안구 질환, 장애 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상의 개선이 포함된다.
용어 "헤르페스 각막염(keratitis)", "단순 헤르페스 각막염", "HSK", "헤르페스 각막병증", "헤르페스 각막", 및 "헤르페스 각결막염(keratoconjunctivitis)"은 단순 헤르페스 바이러스(HSV)에 의해 전형적으로 유발되는 안구 질환, 장애, 또는 병태를 지칭한다.
변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 발현된 및 성숙한 형태
FGF는 패밀리 7 FGF 수용체 동형(isoform)을 자극하며, 각각의 FGF는 이의 특정 효과를 달성하기 위하여 수용체의 상이한 패턴을 자극한다. 예컨대, Ornitz et al. (1996) The Journal of biological chemistry, 1996, 271(25):15292-7; Zhang et al. (2006) The Journal of biological chemistry, 2006, 281(23):15694-700)을 참고한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 7개의 FGF 수용체 동형 전부에 결합하여 자극하기 때문에 바람직하다. 문헌 [Ornitz et al. (1996) The Journal of biological chemistry, 1996, 271(25):15292-7]을 참고한다.
본원에 개시된 구현예는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 또는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물(예컨대, 안과용 제제)에 관한 것이다. 본원에 개시된 구현예는 또한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 또는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물(예컨대, 안과용 제제)을 투여함으로써 화학적 또는 발포성 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 변형된 FGF-폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기의 치환 또는 돌연변이 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 하나 이상의 첨가를 포함하는 재조합 FGF를 지칭한다.
본원에는 제1 구현예로, 하나 이상의 돌연변이가 있는, 서열 번호: 1로서 제시된 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 제공되며, 변형된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 있는 메티오닌 잔기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 메티오닌(N-Met) 잔기를 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다. 일부 경우에, 제1 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 메니오닌 잔기와 함께 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙되는 동안 N-Met 잔기의 제거를 위한 N-말단 처리가 수행되지 않는다. 그러므로, 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1의 성숙한 형태는 N-Met 잔기 및 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. N-Met 잔기를 포함하는 예시의 변형된 FGF-1 서열은 서열 번호: 2로서 개시된다.
본 개시는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함하는, 본원에 기술된 변형된 FGF-1이 N-Met 잔기가 없는 버전과 유사한 생물학적 활성을 가지는 것을 확인한다. N-말단 메티오닌 제거, 또는 절제는 폴리펩타이드가 리보솜으로부터 나오자마자 발생하는 동시 번역 과정이다. N-말단 메티오닌의 제거는 메티오닌 잔기를 인식한 후 작은 측쇄를 가진 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌, 글리신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 또는 발린을 인식하는 절단 효소인 메티오닌 아미노펩티다제(metAP)의 기질 특이성을 포함한다. 기질 서열 특이성으로 인해, N-Met 잔기와 이어서 페닐알리닌(서열 번호: 1의 위치 1을 참고)을 포함하는 제1 구현예의 변형된 FGF-1는 metAP에 의해 처리되지 않는다. 그러므로, 서열 번호: 1의 바로 위의 메티오닌 잔기를 가진 변형된 FGF-1을 발현시킴으로써, N-말단 잔기로서 메티오닌을 포함하는 성숙한 변형된 FGF-1이 얻어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 구현예에 따르는 변형된 FGF-1은 N-말단 펩타이드와 함께 발현되지 않고 따라서 후속 정제 중에 이의 제거를 위한 단백질 가수분해 절단의 대상이 되지 않는다.
본원에는 제2 구현예로, 하나 이상의 돌연변이가 있는, 서열 번호: 1로서 제시된 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 제공되며, 변형된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 있는 메티오닌 잔기, 및 서열 번호: 3으로서 제시된 펩타이드의 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함한다. 서열 번호: 3의 하나 이상의 잔기를 포함하는 펩타이드는 본원에서 "연장 펩타이드"로서 지칭된다. 그러므로, 제2 구현예에 따르는 변형된 FGF-1은 하나 이상의 돌연변이를 가진, 서열 번호: 1로서 제시된 서열, 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류의 메티오닌 잔기, 및 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한 연장 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 메티오닌 및 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한 연장 펩타이드를 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 메티오닌 잔기, 및 추가로 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한 연장 펩타이드와 함께 발현된다. 일부 구현예에서, 제2 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한, 서열 번호: 3의 5개 잔기를 포함하는 연장 펩타이드와 함께 발현된다. 일부 구현예에서, 제2 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한, 서열 번호: 3의 4개 잔기를 포함하는 연장 펩타이드와 함께 발현된다. 일부 구현예에서, 제2 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한, 서열 번호: 3의 3개 잔기를 포함하는 연장 펩타이드와 함께 발현된다. 일부 구현예에서, 제2 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한, 서열 번호: 3의 2개 잔기를 포함하는 연장 펩타이드와 함께 발현된다. 일부 구현예에서, 제2 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한, 서열 번호: 3의 1개 잔기를 포함하는 연장 펩타이드와 함께 발현된다. 연장 펩타이드의 예시의 서열은 서열 번호: 4-8을 포함한다.
일부 경우에, 연장 펩타이드 및 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는, 제2 구현예의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 메티오닌 잔기의 제거를 위한 N-말단 처리의 대상이 아닌 반면, 일부 경우에 메티오닌은 절단 효소에 의해 절제된다. 전형적으로, 절단 효소는 메티오닌 아미노펩티다제(metAP)이다. 그러므로, 일부 예에서, 제2 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 성숙한 형태는 N-Met 잔기에 이어 본원에 기술된 연장 펩타이드를 포함한다. N-말단 메티오닌, 및 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한 연장 펩타이드의 하나 이상의 잔기를 포함하는, 제2 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 성숙한 형태의 예시의 서열은 서열 번호: 9-13으로서 제시되며, 서열은 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. N-말단 메티오닌, 및 연장 펩타이드를 포함하는 성숙한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 추가의 예시의 서열은 서열 번호: 14-18로서 제시된다. 일부 다른 예에서, 제2 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 성숙한 형태는 N-Met 잔기를 포함하지 않으며 연장 펩타이드만을 포함한다. 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 위치한 연장 펩타이드를 포함하는, 제2 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 성숙한 형태의 예시의 서열은 서열 번호: 19-23으로서 제시되며, 서열은 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 연장 펩타이드의 하나 이상의 잔기를 포함하는 성숙한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 추가의 예시의 서열은 서열 번호: 24-28로서 제시된다. 일부 구현예에서, 메티오닌 잔기는 연장 펩타이드가 알라닌으로(서열 번호: 4에서와 같이) 또는 트레오닌으로(서열 번호: 5에서와 같이) 시작할 때 metAP에 의해 절단된다. 그런 경우에, 성숙한 FGF-1 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 번호: 19, 21, 24, 및 26는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하지 않는다.
본원에는 제3 구현예로, 하나 이상의 돌연변이가 있는, 서열 번호: 1로서 제시된 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 제공되며, 변형된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 위치한 연장 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 연장 펩타이드를 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 위치한 연장 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기와 함께 발현된다. N-말단 메티오닌 잔기가 없이 발현된, 연장 펩타이드를 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 예시의 서열은 서열 번호: 19-23으로서 제시되며, 서열은 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 연장 펩타이드의 하나 이상의 잔기를 포함하며, N-말단 메티오닌 잔기가 없이 발현된 성숙한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 추가의 예시의 서열은 서열 번호: 24-28로서 제시된다.
본원에는 제4 구현예로, 하나 이상의 돌연변이가 있는, 서열 번호: 1로서 제시된 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 제공되며, 변형된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상이 결실된다. 일부 경우에, 절단을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌 잔기와 함께 발현된다. 예를 들어, 제4 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 N-Met 잔기 뒤에 서열 번호: 1의 제2 잔기인 아스파라긴이 이어지는 서열을 가질 수 있다. 일부 경우에, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 N-Met 잔기와 이어서 서열 번호: 1의 제3 잔기인 류신을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 N-Met 잔기와 이어서 서열 번호: 1의 제4 잔기인 프롤린을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 N-Met 잔기와 이어서 서열 번호: 1의 제5 잔기인 프롤린을 포함한다. 연장 펩타이드는 N-Met 잔기와 서열 번호: 1의 제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제5 잔기 사이에 위치할 수 있다. N-Met 잔기 뒤에 서열 번호: 1의 제2, 제3, 제4, 또는 제5 잔기가 이어지는, 제4 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 성숙한 형태의 예는 서열 번호: 37-40에 제시되며, 서열은 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 절단 및 N-Met 잔기를 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 추가의 예는 서열 번호: 41-44에 제공된다.
본 개시는 또한 서열 번호: 1의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드에 관한 것이며, 폴리펩타이드는 N-Met 잔기에 이어지는 연장 펩타이드와 함께 발현되고, 연장 펩타이드는 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 이어진다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 폴리펩타이드는 N-Met 잔기에 이어지는 연장 펩타이드와 함께 발현되고, 연장 펩타이드에는 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 이어진다. N-Met 잔기에 이어지는 연장 펩타이드와 함께 발현되고, 연장 펩타이드에는 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 이어지는 그러한 서열의 예는 서열 번호: 45-68로서 개시되며, 서열은 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 예에서, N-말단 메티오닌은 N-말단 처리에 의해 절단되며 따라서 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 성숙한 형태는 서열 번호: 69-92에서 예시된 것과 같이, 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 이어지는 리더 단편의 하나 이상의 잔기만을 포함하고, 예시의 서열은 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. N-Met 잔기가 없지만 연장 펩타이드 및 N-말단 잔기의 절단을 포함하는 서열의 추가의 예는 서열 번호: 93-117에 제공된다.
일부 예에서, N-Met 잔기는 성숙한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 서열에 보유되며, 따라서 성숙한 형태는 서열 번호: 45-68에 예시된 서열을 포함하고, 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. N-Met 잔기, 연장 펩타이드 및 N-말단 잔기의 절단을 포함하는 서열의 추가의 예는 서열 번호: 118-141에 제공된다.
서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 절단된 버전은 제5 구현예에서, N-말단 메티오닌 잔기 없이, 그리고 추가로 연장 펩타이드 없이 발현된다. 일부 예에서, 제5 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 29-32에 제시된 서열을 포함하며, 서열은 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 제5 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 33-36으로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드, 또는 이의 절단된 버전이 연장 펩타이드가 이어지는 N-말단 메티오닌과 함께 발현되는 경우에, 메티오닌 잔기는 발현 후 폴리펩타이드의 성숙 중에 보유되거나 N-말단에서 제거된다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 N-Met 잔기 다음에 알라닌과 함께 발현되는 경우, 예컨대, 서열 번호: 14의 경우에, 메티오닌은 절단되어 N-Met 잔기를 포함하지 않는 성숙한 FGF-1 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 번호: 19가 생성된다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 N-Met 잔기 다음에 트레오닌과 함께 발현되는 경우, 예컨대, 서열 번호: 16의 경우에, 메티오닌은 절단되어 N-Met 잔기를 포함하지 않는 성숙한 FGF-1 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 번호: 20이 생성된다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 N-Met 잔기 다음에 글루탐산과 함께 발현되는 경우, 예컨대, 서열 번호: 17의 경우에, 메티오닌은 절단되지 않고, N-말단 메티오닌을 포함하며 발현된 형태와 동일한 서열을 갖는 성숙한 FGF-1이 생성된다.
본원에는 제6 구현예로, 위치 67에 돌연변이를 포함하는, 서열 번호: 1로서 제시된 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 67에 돌연변이, 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함하며, N-Met 잔기와 함께 발현된다. 위치 67의 내부 메티오닌은 예를 들어, 알라닌 잔기로 대체될 수 있다. 위치 67의 내부 메티오닌의 부재 시에, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 N-말단 메티오닌은 발현 후, 메티오닌 잔기 뒤의 아미드 결합을 특이적으로 절단하는 작용제인 브롬화 시아노겐(CNBr)을 사용하여 절단될 수 있다. 일부 경우에, 제6 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 연장 펩타이드와 함께 발현된다. 일부 다른 경우에, 제6 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 142-149에서 예시된 것과 같이, 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단을 포함하는 형태로 발현되며, 서열은 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 또 다른 예에서, 제6 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 151-175에서 예시된 것과 같이, 연장 펩타이드 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단을 포함하는 형태로 발현된다. 성숙한 형태의, 제6 구현예에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 추가의 예는 서열 번호: 174-204에 제시된다. 내부 메티오닌 돌연변이를 포함하는 형태로 발현된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 중에서, 폴리펩타이드가 연장 펩타이드로부터의 알라닌 또는 트레오닌 잔기가 이어지는 N-말단 메티오닌과 함께 발현되는 경우, 예컨대, 각각 서열 번호: 175 및 서열 번호: 177의 경우에, N-말단 메티오닌은 폴리펩타이드의 성숙 중에 metAP에 의해 또는 CNBr을 사용하여 절단될 수 있다.
본원에는, 제7 구현예로, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한, 서열 번호: 205로서 제시된 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 제공된다. 본원에는, 제8 구현예로, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한, 서열 번호: 206으로서 제시된 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 제공된다.
본 개시는 추가로 서열 번호: 1의 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드에 관한 것이며, 단 상기 변형된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 아미노산 치환은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드에 도입될 수 있고 생성물은 원하는 활성, 예컨대, 안구 질환을 치료하는데 있어 보유된/개선된 유효성, 푹스 이영양증의 개선에서 증가된 효능, 머스터드 가스 각막병증의 개선된 치료에 대해 스크리닝된다. 아미노산 치환은 또한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드에 도입될 수 있고 생성물은 원하는 물리화학적 특성, 예컨대, 응집 경향 감소, 용해도 개선, 반감기 연장, 안과용 약제로서의 제제화의 용이성, 향상된 안정성, 개선된 유통 기한에 대해 스크리닝된다. 보존성 및 비보존성 아미노산 치환이 모두 고려된다.
위의 구현예들 중 임의의 구현예에서와 같이 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 적어도 136개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 137개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 138개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 139개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 140개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 141개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 142개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 143개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 144개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 145개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 146개 아미노산을 포함하는 형태로 발현된다.
위의 구현예들 중 임의의 구현예에서와 같이 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 적어도 136개 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 137개 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 138개 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 139개 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 140개 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 141개 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 142개 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 143개 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 144개 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 145개 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 146개 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 1에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 9-13으로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함하고, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 14-18로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 19-23으로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함하지 않고, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 24-28로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 19-23으로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함하지 않고, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 37-40으로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함하고, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 41-44로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 45-68로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 69-92로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 93-117로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 118-141로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 29-32로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 단 상기 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 33-36으로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 142-204로부터 선택된 임의의 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 위치 12에서, 예를 들어, 돌연변이 Lys12Val로 돌연변이된 서열 번호: 1에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-말단 메티오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Lys12Val, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-Met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Lys12Val, 연장 펩타이드, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 12에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Lys12Val이 있는 서열을 포함하며, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 67에 메티오닌의 돌연변이를 추가로 포함하고, N-말단에서 메티오닌과 함께 발현되며, 그 메티오닌은 성숙한 형태의 폴리펩타이드에서 절단된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 위치 16에서, 예를 들어, 돌연변이 Cys16Ser로 돌연변이된 서열 번호: 1에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 16에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Cys16Ser, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 16의 위치 16에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이, 연장 펩타이드, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 16에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Cys16Ser가 있는 서열을 포함하며, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 67에서 메티오닌의 돌연변이를 추가로 포함하고, N-말단의 메티오닌과 함께 발현되며, 그 메티오닌은 성숙한 형태의 폴리펩타이드에서 절단된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 위치 66에서, 예를 들어, 돌연변이 Ala66Cys로 돌연변이된 서열 번호: 1에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-말단 메티오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 66에서 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Ala66Cys, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 66에서 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Ala66Cys, 연장 펩타이드, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 N-Met 잔기와 함께 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 66에서 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Ala66Cys가 있는 서열을 포함하며, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 67에 메티오닌의 돌연변이를 추가로 포함하고, N-말단의 메티오닌과 함께 발현되며, 그 메티오닌은 성숙한 형태의 폴리펩타이드에서 절단된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 위치 117에서, 예를 들어, 돌연변이 Cys117Val로 돌연변이된 서열 번호: 1에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 117에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Cys117Val, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 117에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Cys117Val, 연장 펩타이드, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 117에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Cys117Val이 있는 서열을 포함하며, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 67에 메티오닌의 돌연변이를 추가로 포함하고, N-말단의 메티오닌과 함께 발현되며, 그 메티오닌은 성숙한 형태의 폴리펩타이드에서 절단된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 위치 134에서, 예를 들어, 돌연변이 Pro134Val로 돌연변이된 서열 번호: 1에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-말단 메티오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 134에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Pro134Val, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 134에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Pro134Val, 연장 펩타이드, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 134에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Pro134Val이 있는 서열을 포함하며, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 67에 메티오닌의 돌연변이를 추가로 포함하고, N-말단의 메티오닌과 함께 발현되며, 그 메티오닌은 성숙한 형태의 폴리펩타이드에서 절단된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 16, 66, 및 117에서, 예를 들어, 돌연변이 Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val로 돌연변이된 서열 번호: 1에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 16, 66, 및 117에 돌연변이, 예를 들어, 돌연변이 Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 성숙한 형태의 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 16, 66, 및 117에 돌연변이, 예를 들어, 돌연변이 Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val, 연장 펩타이드, 및 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단이 있는 서열을 포함하며, 상기 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 N-met 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 16, 66, 및 117에 돌연변이, 예를 들어, 돌연변이 Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val이 있는 서열을 포함하며, 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 위치 67에 메티오닌의 돌연변이를 추가로 포함하고, N-말단의 메티오닌과 함께 발현되며, 그 메티오닌은 성숙한 형태의 폴리펩타이드에서 절단된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 2 및 9-204로부터 선택된 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 205 또는 206에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 내열성이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 내열성 FGF(예컨대, 내열성 FGF-1)는 또한 동일한 조건 하에서 서열 번호: 1의 폴리펩타이드보다 더 안정적인 서열 번호: 1에 비해 변형된 아미노산 서열을 가진 FGF를 지칭한다. FGF에 내열성을 부여할 수 있는 돌연변이 및 내열성을 평가하는 방법의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제 7,790,682호; 제 7,595,296호; 제 7,696,171호; 제 7,776,825호; 제 7,659,379호; 제 8,119,776호; 제 8,153,770호; 제 8,153,771호; 및 제 8,461,111호; 미국 특허 출원 공개 제 2011/0224404호 및 2013/0130983; 및 Xia et al. PloS one. (2012) 7(11):e48210에서 기술된다. 일부 구현예에서, 위치 12 및/또는 134는 내열성인 변형된 FGF-1을 생성하기 위해 FGF-1에서 돌연변이된다. FGF-1 제제는 특정 온도에서 일정 기간 동안 "안정적인" 것으로 간주될 수 있고, 이것은 FGF-1이 지정된 온도에서 지정된 기간 동안 원래의 순도 및 형태로 존재하는 제제로서 이해된다. 일부 구현예에서, FGF-1은 만약 이의 모노머 형태에 5% 미만, 2% 미만 또는 바람직하게는 1% 미만의 변성 또는 변화가 있다면 원래의 순도 및 형태로 유지되는 것으로 간주될 수 있다. 그러한 변화는 본원에서 논의된 임의의 분석 과정, 예를 들어, 크로마토그래피 과정, ELISA. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 반응성 티올(예컨대, 유리 시스테인)의 수를 감소시키는 하나 이상의 변형을 포함한다. FGF-1의 그러한 변형의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제 7,790,682호; 제 7,595,296호; 제 7,696,171호; 제 7,776,825호; 제 7,659,379호; 제 8,119,776호; 제 8,153,770호; 제 8,153,771호; 및 제 8,461,111호; 미국 특허 출원 공개 제 2011/0224404호 및 제 2013/0130983호; 및 Xia et al. PloS one. (2012) 7(11):e48210에서 기술된다. 일부 구현예에서, 위치 83 및/또는 117은 서열 번호: 1에서 돌연변이되어 반응성 티올의 수를 감소시키는 변형된 FGF-1이 생성된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF는 내부 이황화 결합의 형성을 가능하게 하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 66은 서열 번호: 1에서 돌연변이되어 내부 이황화 결합을 포함하는 변형된 FGF-1이 생성된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 안정성을 위해 제제에 내인성 헤파린 없이 투여될 수 있고, 헤파린 없이 제제화되고 적용될 수 있음으로써 조직 헤파란에 더 많이 결합할 수 있다. 그러한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 수술, 외상 또는 영양장애 상태 및 질환 상태에 노출되는 조직 헤파란에 대해 높은 친화성을 가지며 따라서 적용시 병든 조직에 결하반다. 더불어, 열적으로 더 안정적인 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 실온에서의 제제화 및 보관에 적합하다. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 안정성은 또한 폴리펩타이드가 용액(예컨대, 즉시 방출) 및 지속성 방출 제제 모두로 투여하기에 적합하게 만든다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 위치 12, 16, 66, 117, 및 134 중 하나 이상에서 변형된 서열 번호: 1이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF는 위치 16, 66, 및 117에서 변형된 서열 번호: 1이다. 아미노산 위치는, 예컨대, Ser, Cys, Val, 또는 다른 아미노산으로 치환되어 변형된 아미노산과 야생형 아미노산 사이에 이황화 결합이 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF는 또한 N-Met THX1114로 지칭되는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 Lys12Val, Pro134Val, Ala66Cys, Cys117Val, 및 Pro134Val로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 또는 조성물은 전구약물로서 제조될 수 있다. "전구약물"은 생체내에서 모 약물(parent drug)로 전환되는 작용제를 지칭한다. 전구약물은 종종, 일부 상황에서, 모 약물보다 더 투여가 용이할 수 있기 때문에 유용하다. 이는, 예를 들어, 경구 투여에 의해 생체내에서 이용될 수 있는 반면 모 약물은 그렇지 않다. 전구약물은 또한 모 약물보다 약학 조성물에서 개선된 용해도를 가질 수 있다.
본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 동위원소에 의해(예컨대, 방사성 동위원소로) 또는, 한정하는 것은 아니지만, 발색단 또는 형광 모이어티, 생물발광 표지, 광활성화 또는 화학발광 표지를 포함한 다른 수단에 의해 표지화될 수 있다.
본 개시는 추가로 N-말단 변형(들)을 포함하는 변형된 FGF 폴리펩타이드에 관한 것이며, 변형된 FGF 폴리펩타이드는 FGF-1(서열 번호: 1), FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-15, FGF-16, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, 및 FGF-23, 및 FGF-24를 포함한 FGF 패밀리의 임의의 구성원일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 합성은 기술분야에서 기술된 수단을 사용하여, 본원에 기술된 방법을 사용하여, 또는 이들의 조합에 의해 달성된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF의 서열은 하나 이상의 위치 16, 66, 및 117에서, 예를 들어, 돌연변이 Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val로 돌연변이된 서열 번호: 1에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF는 위치 16, 66 및 117에 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val이 있는 야생형 인간 FGF-1 서열을 포함한다.
변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 제조를 위한 재조합 기법
본원에 제공된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 생성하기 위하여 다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 활용될 수 있다. 그러한 숙주 발현 시스템은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 생성될 수 있고 후속해서 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 변형된 유전자 생성물을 제자리에서 나타낼 수 있는 세포를 나타낸다. 숙주 발현 시스템의 예에는 한정하는 것은 아니지만, 박테리아, 곤충, 식물, 포유류, 이를테면 인간 숙주 시스템, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 변형된 FGF-1 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염된 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터, 예컨대 메탈로티오네인 프로모터, 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터, 예컨대 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, 또는 pSH19 및 pSH15와 같은 효모 유래 플라스미드로부터, 또는 람다 파지 및 이의 유도체와 같은 박테리오파지로부터의 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구성물을 보유한 인간 세포 시스템을 포함한 포유류 세포 시스템, 예컨대, HT1080, COS, CHO, BHK, 293, 3T3이 포함된다. 박테리아 발현 시스템의 예에는 한정하는 것은 아니지만 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli) 유래 플라스미드(예컨대, pMKet, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, 및 pET-3); 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래 플라스미드(예컨대, PUB110, pTP5, 및 pC194)가 포함된다. 일부 구현예에서 박테리아 발현 시스템은 pMKet 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1을 발현시키기 위하여 pMKet 박테리아 발현 벡터의 사용을 포함하는 방법은 변형된 FGF-1의 수율을, 변형된 FGF-1을 암호화하는 서열을 pET 벡터에 하위클로닝하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 약 5배 내지 약 60배 개선시킨다. 일부 구현예에서, pET 벡터에 변형된 FGF1의 하위클로닝을 포함하는 방법은 발효 실행 후 약 0.5 g - 약 0.7 g/100 L의 수율을 유도한다. 일부 구현예에서, pMKet 벡터에 변형된 FGF1의 하위클로닝을 포함하는 방법은 발효 실행 후 약 20 g - 약 40 g/100 L, 예를 들어 37 g/100 L의 수율을 유도한다. 일부 구현예에서, pMKet에 변형된 FGF1을 하위클로닝하는 단계 및 본원에 기술된 기법을 사용하여 벡터로부터 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 방법은 약 82 g/50 L의 수율을 유도한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포 균주는 그것이 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 또는 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형시키고 처리하도록 선택된다. 단백질 생성물의 그러한 변형 및 처리는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역후 처리 및 변형을 위한 특정 메커니즘을 가진다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 처리를 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이 목적을 위해, 일차 전사체의 적절한 처리, 글리코실화, 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포 기계를 가진 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 인간 숙주 세포를 포함한, 그러한 포유류 숙주 세포에는, 한정하는 것은 아니지만 HT1080, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, 및 WI38이 포함된다.
일부 구현예에서, 박테리아 세포는 재조합 FGF 단백질의 발현에 사용된다. 일부 구현예에서 박테리아 세포는 이. 콜라이 세포이다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이 균주는 BL21, BLA21A1, K12 HMS174, 및 W3110으로부터 선택된다. 재조합 펩타이드의 장기간, 고수율 재조를 위해서는 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들어, 재조합 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것보다 오히려, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소, 예컨대, 프로모터, 인핸서 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등에 의해 제어된 DNA, 및 선택 가능한 마커로 형질전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 그것이 발현되는 균주 또는 세포에 의한 코돈 사용을 최대화하기 위해 최적화된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 핵산은 프로모터, 3' UTR 조절 서열, 예를 들어 폴리 A 서열 또는 전사체를 안정화시키고 번역을 돕는 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서 플라스미드 벡터는 선택 마커, 예컨대 항생물질 내성 유전자, 예컨대 카나마이신을 포함한다.
일부 구현예에서 박테리아 발현을 위한 프로모터는 T7 프로모터이다.
일부 구현예에서 박테리아 발현을 위한 프로모터는 Tac 프로모터이다.
일부 구현예에서, 플라스미드는 pBR322 ori 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리아 발현 벡터는 상업적으로 이용 가능한 벡터 백본, 예컨대 pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, 및 pET-T3, 또는 pET-T7 벡터로부터 변형된다.
일부 구현예에서, 단백질의 주변세포질 발현이 의도된다. 재조합 단백질은 봉입체(inclusion body)에 축적될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질의 세포질 발현이 의도된다. 일부 구현예에서, 단백질의 세포질 발현이 의도되며, 단백질은 불용성 단백질이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 세포외 방출에 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산은 적합한 리더 서열, 예컨대 ompA 리더 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산은 리더 서열, 예컨대 ompA 리더 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제조 중에, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는, 특정 단계에서, 주변세포질 공간으로 지시된다. 주변세포질 공간은 봉입체를 포함하며, 그곳에 폴리펩타이드가 축적될 가능성이 있다. 봉입체는 그러면 세포 분획화 후에 수득되어 폴리펩타이드가 회수될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 리더 서열을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서 변형된 FGF-1은 세포에서 세포질 발현에 대해 지시된다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산 구성물은 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율을 증가시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 세포에서 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 발현 증가를 위해 최적화된 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 하나 이상의 변형은 플라스미드에서의 변형을 포함한다. 한 구현예에서, 하나 이상의 변형은 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율을 증가시키기에 적합한 프로모터를 선택하는 것을 포함한다.
추가의 구현예에서, 하나 이상의 변형은 폴리펩타이드를 발현시키기 위하여 숙주 세포를 발달시키는 것을 향하는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 세포 증식을 최대화하기 위하여 적당한 영양 배지를 조정하는 결과를 유도하는 것으로 간주될 수 있다. 한 구현예에서, 적당한 영양 배지는 탄소원을 포함한다. 한 구현예에서, 탄소원은 글루코스 또는 글리세롤이다.
한 구현예에서, 하나 이상의 변형은 숙주 세포에서 플라스미드의 복사물 수 및 발현 효율을 증가시키기 위해 플라스미드에서 만들어진다. 한 구현예에서, 하나 이상의 변형이 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율을 최대화하기 위하여 고려되며, 하나 이상의 변형은:
i. 돌연변이 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산 내에서의 변형;
ii. 프로모터, 인핸서, 5'-미번역 영역, 3'-미번역 영역, 폴리 A 꼬리, 전사체 안정화 요소로부터 선택된, 돌연변이 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산에 회합된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 재조합 핵산 내에서의 변형;
iii. 재조합 핵산을 포함하는 플라스미드의 변형;
iv. 세포 증식을 최대화하기 위한 세포 균주의 변형 또는 세포 균주의 선택;
v. 세포 성장 배지의 변형; 및
vi. 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 과정의 변형
으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 박테리아 세포는 전기천공되거나 또는 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는 플라스미드로 화학적으로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후에, 조작된 세포는 풍부한 배지에서 1-2일 동안 성장이 허용된 후, 선택 배지로 전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 탄소원이 증가된 제조를 위해 발현된 FGF 폴리펩타이드의 팽창을 위해 일정 기간 내에 박테리아 세포 성장을 최대화하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서 박테리아 세포에 대한 탄소원은 글루코스일 수 있다. 일부 구현예에서 박테리아 세포에 대한 탄소원은 글리세롤일 수 있다.
재조합 플라스미드의 선택 가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고 세포가 플라스미드를 이의 염색체 안으로 안정적으로 통합하고 결국 세포주로 클로닝되고 팽창될 수 있는 초점을 형성하기 위해 성장하도록 허용한다. 일부 예에서, 이 방법은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 생성물을 발현하는 세포주를 조작하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 그러한 조작된 세포주는 유전자 생성물의 생물학적 특성에 영향을 미치는 화합물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
본원에 기술된 제조 방법은 변형된 FGF-1을 발현하는 박테리아 배양의 대규모 생산을 형성하기 위해 쉽게 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 1 L 박테리아 배양, 또는 10 L 박테리아 배양, 또는 100 L 박테리아 배양, 또는 500 L 박테리아 배양에서 FGF-1을 생산하기 위해 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 배치당 1 g의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 생산하기 위해 확장 가능하다. 일부 구현예에서, 방법은 배치당 10 g의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 생산하기 위해 확장 가능하다. 일부 구현예에서, 방법은 배치당 100 g의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 생산하기 위해 확장 가능하다. 일부 구현예에서, 방법은 배치당 1 Kg의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 생산하기 위해 확장 가능하다. 일부 구현예에서, 방법은 배치당 10 Kg의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 생산하기 위해 확장 가능하다. 일부 구현예에서, 방법은 배치당 100 Kg의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 생산하기 위해 확장 가능하다.
일반적으로, 종자 배양은 형질전환된 박테리아 세포로부터 형성된다. 접종된 종자 플라스크는 약 235 RPM 및 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 10-14시간 인큐베이션 후에, 각 플라스크로부터의 종자 배양 샘플은 순도(오염 유기체가 관찰되지 않는 습식 마운트의 현미경 관찰), pH, 600 nm에서의 광학 밀도(OD600), 및 멸균율 유지에 대해 테스트될 수 있다. 종자 배양은 OD600 ≥ 1.0 및 오염 유기체가 없음을 입증함으로써 최적 성장을 나타내는 것이 바람직하다. 각 생산 실행으로부터의 종자 플라스크 중 6개가 확장을 위해 선택될 수 있다. 선택 기준에는 12 ± 2시간의 성장 시간, OD600 ≥ 1.0, 및 6개의 플라스크 구성이 포함될 수 있다. 발효기 접종물을 생성하기 위해, 6개 플라스크의 내용물이 대략 6 리터의 총 종자 배양 부피에 대해 BSC 중의 10 L 백(멸균 일회용 바이오프로세스 용기)에 모아질 수 있다.
생산 배지(영양소, 예를 들어, 소이톤 12 g/L, 효모 추출물 24 g/L, 글리세롤 15.1 g/L, 인산이칼륨 12.5 g/L, 인산일칼륨 3.8 g/L, 및 P2000 소포제 0.1 mL/L을 포함함)로 mFGF-1을 발현하는 배양된 이. 콜라이의 발효를 위해 하나 이상의 150 L 발효기가 준비될 수 있다. 생산 배지는 제자리에서 멸균된다. 멸균 배지는 그런 후 황산마그네슘 육수화물 0.4 g/L, 카나마이신 0.050 g/L를 함유한 5 ± 0.1 L 멸균 용액이 보충된다. 하나 또는 하나 이상의 발효기가 적절한 시간에 6 리터의 모아진 종자 배양으로 접종될 수 있다. 발효 배양은 그런 후 60 ± 30분마다 모니터링되고 샘플은 pH, 순도(습식 마운트의 현미경 관찰), 및 OD600에 대해 처리되었다. 용존 산소는 교반 및 공기 유량을 제어함으로써 유지될 수 있다. pH는 인산 및/또는 수산화암모늄의 적절한 무균 첨가를 함으로써 원하는 범위 내로 유지될 수 있다.
일부 구현예에서, mFGF-1의 발현은 배양이 접종 후 3시간 째에 약 4.5의 OD600에 도달했을 때 0.2-0.4 g/L의 아이소프로필-β-D-1-티오-갈락토피라노시드(IPTG) 및 5.0 g/L의 L-아라비노스의 첨가로 유도되었다. 일부 구현예에서, 카나마이신이 있거나 없이, 약 1 mM 또는 0.25 mM IPTG의 농도가 유도에 사용된다. 카나마이신의 존재 하에 유도는, 일부 구현예에서는, 플라스미드 보유 및 세포 생존력을 증가시키는데 필요하지 않지만, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 생산에는 영향을 미친다. 유도의 길이는, 일부 경우에, 약 8-12시간, 약 10-20시간, 약 20시간, 또는 약 24시간이다. 일부 경우에 1 L 규모에서, 카나마이신의 존재 하에 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율(최종 OD/세포 페이스트(g/L)에 의해 측정됨)은 카나마이신의 부재 하에서보다 약 1.1 내지 약 5배, 예컨대, 1.2배 더 크다. 유도의 경우, 일부 구현예에서, 탄소원은 적어도 약 30 g/L의 농도의 글리세롤이고, 온도는 약 37℃이며, pH는 약 6.8이다. 유도 후, 발효는 추가로 3시간 동안 계속될 수 있다. 원심분리 전에 샘플은 SDS-PAGE 및 배양 순도에 의한 분석을 위해 각 발효기로부터 취해질 수 있다. 발효는 간헐적으로 평가될 수 있고 또 다시 1-20시간 동안 성장될 수 있다. 일부 구현예에서, 최종 배양은 50-100, 50-200, 50-250, 70-260 또는 약 100, 200 또는 250의 광학 밀도에 도달한다.
일부 구현예에서, 로트의 수득은 발효 브로스를 연동 펌프 및 튜빙을 통해 원심분리기로 전달하고(분당 0.5 - 0.8 리터) 물 순환 재킷을 사용하여 냉각시키면서 20,000 x g에서 원심분리함으로써 수행될 수 있다. 수득된 세포 페이스트의 질량이 측정되고, 수집되고, 4개의 용기로 나누어져서, ≤-70℃ 냉동고에 배치될 수 있다.
세포 용해: 변형된 FGF-1을 포함하는 냉동된 세포는 적합한 시점에 해동되고, 적합한 완충액, 예를 들어, Tris 및 EDTA를 포함할 수 있는 완충액에 재현탁될 수 있다. 예시의 구현예에서, 세포는 1 mM DTE를 함유한 TES 완충액(50 mM Tris, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7.4)에서 1:5(중량/부피)의 비율로, 즉 1 그램의 세포 페이스트가 5 mL의 완충액에서 해동될 수 있다. 현탁액은 16℃ 미만으로 차가워진 후에 고압 균질화기를 통과할 수 있다. 유의미한 감소가 없을 때까지 각각의 통과 후에 OD600이 모니터링된다. 그런 후 동등한 부피의 TES + 5% Triton X-100이 파열된 세포 현탁액에 혼합될 수 있다. 파열된 세포 현탁액은 발현된 FGF-1 단백질의 회수에 사용될 수 있다. 발현된 단백질은 용해물을 특정 포획 방법, 예컨대 FGF-1 단백질에 특이적으로 결합하고, 나중에 용출되는 아가로스 기반 수지(예컨대, 고도로 교차 결합된 아가로스 기반 수지, 예컨대, CaptoTM DeVirs(Cytiva, BPG 300x500, Part#17-5466))로 패킹된 친화성 칼럼을 통해 통과시킴으로써 파열된 세포로부터 수집될 수 있다. 그러나, FGF-1 회수율 및 수율을 최대화하기 위하여, 단백질은 IB에서의 발현에 대해 지시될 수 있고, 단백질은 봉입체로부터 수집될 수 있다. 예시의 방법에서, 혼합물은 15,900 x g에서 60분 동안 4℃에서 원심분리되어 mFGF-1 함유 봉입체가 수집될 수 있다. 용해 후, 과다발현된 단백질은 원심분리에 의해 이. 콜라이 페이스트로부터의 봉입체(IB)로부터 회수될 수 있다.
일부 구현예에서, 아가로스 기반 수지(예컨대, CaptoTM DeVirs)로 패킹된 친화성 칼럼을 사용하는 포획 방법은 다른 포획 방법과 비교하여 수집된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율 퍼센트를 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 65%, 약 65% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 100% 증가시킨다.
봉입체로부터의 회수: 예시의 구현예에서, FGF-1의 회수를 위해, 세포 페이스트는 2-8℃에서 해동되고, 적합한 완충액에 재현탁될 수 있다. 완충액은 Tris 및 EDTA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 페이스트는 4.5 L의 TES 완충액, pH 7.4(50 mM Tris, 100 mM NaCl, 20 mM EDTA)에서 해동될 수 있고 그런 후 세포는 압력 균질화에 의해 용해될 수 있다. 최대 세포 용해를 달성하기 위해 5회의 균질화 통과(대략 8,000 psi)가 수행될 수 있다. 그런 후 동등한 부피의 TES 완충액 및 5% Triton X-100, pH 7.4가 용해물에 첨가되어 2.5% Triton 농도가 얻어질 수 있다.
혼합물은 편의에 따라 6-20개의 원심분리 병으로 나누어질 수 있고, 그런 후 적어도 30분 동안 225 RPM으로 혼합되면서 대략 15-20℃에서 인큐베이션된다. 병은 15,900 x g 및 4℃에서 60분 동안 원심분리될 수 있다. 상층액은 폐기물로서 버려졌다. 조직 균질화기(Model Omni GLH850)를 사용하여, 회수된 봉입체는 개별적으로 2.5%(중량/부피) Triton X-100을 포함한 TE 완충액(약 1 L, 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 7.4)에 재현탁되고, 병은 적어도 30분 동안 225 RPM으로 혼합되면서 15-20℃에서 인큐베이션되었다. 인큐베이션 후, 병은 45분 동안 15,900 x g 및 4 ℃에서 원심분리되었다. 봉입체 세척 과정, 현탁, 인큐베이션, 및 원심분리는 총 3회 수행되었다. 회수된 봉입체는 2℃-8℃에서 밤새 보관될 수 있다. 봉입체는 Triton이 없는 TE 완충액(약 1 L, 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 7.4)으로 세척되었고 병은 적어도 15분 동안 225 RPM으로 혼합되면서 15-20℃에서 인큐베이션되었다. 일부 구현예에서, IB는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충액으로 세척될 수 있다. 인큐베이션 후, 병은 30분 동안 15,900 x g 및 4℃에서 원심분리되었다. Triton이 없는 세척, 인큐베이션, 및 원심분리는 총 5회 수행되었다. 샘플은 제거되고 이 단계에서 총 단백질 및 SDS-PAGE 쿠마시 염색/밀도계 분석을 위해 제출될 수 있다. 일부 구현예에서, 총 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000 g의 봉입체가 회수될 수 있다. 각 로트에 대해 세척된 봉입체를 함유한 원심분리 병은 ≤-70℃에서 보관될 수 있다.
세척된 봉입체의 가용화: 각 로트에 대한 세척된 봉입체의 가용화는 가용화 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 가용화 완충액은 카오트로픽 구성요소, 예컨대 우레아, 또는 구아니딘 염을 포함할 수 있다. 세척된 봉입체는 보관소에서 제거되어 2-8℃에서(15시간 - 19시간) 해동될 수 있다. 봉입체는 15,900 x G, 4℃에서 60분 동안 원심분리되고, 액체 상이 제거된 후 펠릿의 순중량이 측정되었다. 그런 후 봉입체는 완충액에 가용화되었다. 예시의 가용화 완충액은 4-8 M 구아니딘을 포함할 수 있다. 예시의 가용화 완충액은 6 M 구아니딘을 포함할 수 있다. 예시의 가용화 완충액은 4-6 M 우레아를 포함할 수 있다. 추가적으로, 그러한 완충액은 100 mM Tris, 2 mM EDTA(pH 8.0)를 포함할 수 있다. 완충액은 용액이 시각적으로 균질해질 때까지 10,000 RPM에서 조직 균질화기(예컨대, 모델 Omni GLH850)를 사용하여 2-8℃에서 g당 10 mL 비율로 혼합될 수 있다. 구아니딘은 단백질 변성을 유도하는 카오트로픽제이다. 다이티오에리트리톨(DTE)은 티올에 대한 이황화 결합을 감소시키기 위하여 2-8℃에서 가용화된 봉입체에 대해 10 mg/mL의 최종 농도로 사용될 수 있다. 이 반응은 2-6시간 동안 지속될 수 있다. 그런 후 가용화된 봉입체는 15,900 x g 및 4℃에서 40분 동안 원심분리될 수 있다. 원심분리를 포함한 전체 과정은 5시간 미만일 수 있다. 상층액은 2 L PETG 병에 수집되어 단백질 농도가 테스트되는 동안 2-8℃(25-50분)에서 보관될 수 있다. 단백질 결과를 토대로, 가용화된 봉입체는 희석 완충액(6 M 구아니딘, 100 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 8.0)으로 2.0 ± 0.5 mg/mL의 표적 농도로 희석될 수 있다. DTE는 10 mg/mL의 표적 농도로 첨가되고 혼합될 수 있다. 가용화된 봉입체는 ≤-70℃에서 보관될 수 있다. IB는 100 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 8.0 중의 6 M 구아니딘 염산염에서 그램 IB당 10 mL 완충액의 비율로 가용화될 수 있다. DTE가 첨가되고(10 mg/ml) 3-5시간 후 혼합되고(처음에 조직 균질화기, Polytron PT 3100과 혼합된 후, 자기 교반 막대와 혼합됨), 혼합물은 원심분리될 수 있다(15,900 x g ≥40분). 상층액은 0.45 μm 필터를 통해 여과될 수 있다.
변성된 단백질의 재접힘: 구아니딘-가용화 IB(2 ± 0.5 mg/mL)가 저온 재접힘 완충액에 첨가될 수 있다. 재접힘 완충액은 L-아르기닌을 포함할 수 있다(예컨대, 0.5 M L-아르기닌, 100 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 9.5). 일부 구현예에서 재접힘 완충액은 산화된 글루타티온을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 재접힘 완충액은 환원된 글루타티온을 함유할 수 있다. 가용화된 mFGF-1은 서서히, 예컨대, 적하방식으로 재접힘 용액의 소용돌이에 첨가될 수 있고, 혼합은 2-8℃에서 2시간 동안 지속되었다. 동등한 부피의 3 M 황산암모늄이 재접힘 용액에 첨가되고 2-8℃에서 1시간 동안 교반될 수 있다.
회수된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 검출될 수 있다. 총 단백질 함량은 기술분야에 알려져 있는 하나 이상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 총 단백질 함량은 SDS-PAGE에서 분해된 단백질의 쿠마시 염색에 의해 측정될 수 있다. 회수된 단백질은 HPLC, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)-HPLC를 사용하여 추가로 정제될 수 있다.
단백질의 생물학적 활성은 시험관내에서 세포 증식 검정에 의해 평가될 수 있다. 이 목적을 위해, 내피 세포주가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 섬유모세포가 시험관내 증식 검정에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서 하나 이상의 변형은 세포로부터 변형된 FGF-1의 회수율을 개선시키기 위해 이루어진다. 하나 이상의 개선은 플라스미드 벡터의 개선; 적합한 박테리아 균주의 선택의 개선; 성장 배지의 개선; IPTG로의 유도 시간의 개선; 박테리아의 최대 성장을 위한 유도 시간의 개선; 및 박테리아의 성장을 위한 온도 최적화를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 FGF-1의 수율의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 12배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배 또는 적어도 50배 증가로 이어진다.
변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 이황화 결합 형성
일부 구현예에서, 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 다음 돌연변이 - Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val을 포함하며, 폴리펩타이드는 위치 66과 83의 시스테인 잔기 사이에 내부 이황화 결합을 포함한다. 많은 재조합 단백질의 경우, 정확한 이황화 결합의 형성은 생물학적 활성의 3차원 입체형태를 얻는데 필수적이다. 잘못된 이황화 결합의 형성은 단백질 잘못 접힘 및 봉입체로의 응집으로 이어질 수 있다. 이. 콜라이에서, 시스테인 산화는 전형적으로 주변세포질에서 일어나는데, 그곳에서 이황화 결합이 주로 Dsb 패밀리로부터 유래된 많은 효소에 의해 촉매된 이황화 교환 반응으로 형성된다(Rosano, G. L., & Ceccarelli, E. A. (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology, 5, 172). 대조적으로, 세포질에서의 이황화 결합 형성은 드물다. 이런 상황은 세포질에서 생성되는 이황화 결합을 가진 재조합 단백질, 예컨대 Cys66과 Cys83 사이에 내부 이황화 결합을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 생산에 영향을 미친다. 따라서, 일부 예에서, 이황화 결합 형성을 선호하는 산화성 세포질 환경을 가진 조작된 이. 콜라이 균주가 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 발현을 위한 숙주 세포로서 선택된다(Rosano, G. L., & Ceccarelli, E. A. (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology, 5, 172). 그러한 균주의 예에는 한정하는 것은 아니지만 K-12 배경에 trxB- gor- 유전자형을 가진 Origami(Novagen), 및 BL21(DE3) 배경에 trxB-gor- 유전자형을 가지며 이황화 결합 이성질화효소 DsbC의 염색체 복사물을 구성적으로 발현하는 SHuffle® T7 익스프레스 균주(NEB)가 포함된다. DsbC는 잘못 산화된 단백질의 정확한 형태로의 교정을 촉진하고 또한 이황화 결합을 필요로 하지 않는 단백질의 접힘을 보조할 수 있는 샤페론인 것으로 나타났다. 특정 이론에 매이지 않지만, DsbC의 작용으로 인해, 더 적은 표적 단백질, 예컨대 Cys66과 Cys83 사이에 내부 이황화 결합을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 봉입체로 응집되는 것으로 고려된다. 그러므로, 특정 구현예에서, 본 개시는 Cys66과 Cys83 사이에 내부 이황화 결합을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 세포질 생산을 위한 개선된 방법을 확인한다.
변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 N-Met 잔기와 함께 발현되는 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 N-말단 펩타이드의 제거를 위한 단백질 가수분해 절단을 필요로 하는 단계 없이 후속해서 정제된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시는 N-말단 펩타이드의 제거를 위한 단백질 가수분해 절단 단계를 포함하지 않고, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 신속한 정제 방법을 제공한다. 이것은 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준(GMP) 지침에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 생산에 특히 유리하다. 장점으로는, 절단된 생성물의 후속 정제 및 절단에 사용된 시약의 제거에 대한 필요성의 제거를 포함한 절단 단계의 결여를 들 수 있다. 이것의 추가 장점은 감소된 취급으로 인한 수율의 증가 및 잔류 절단 시약 및 절단 및 절단된 물질의 미절단 물질로부터의 후속 분리를 위해 도입된 오염물에 대한 테스트 필요성의 완화이다.
사용 방법
본원에는, 한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 위의 구현예에서 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 약학 제제를 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류의 안구 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 경우에, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2, 및 9-204로부터 선택된 서열을 포함한다. 본원에는, 한 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같이 서열 번호: 205 또는 206에 제시된 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드, 또는 이를 포함하는 약학 제제를 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, 안구 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 치료될 안구 질환, 장애 또는 병태는 각막 내피층의 질환, 장애, 또는 병태이다. 각막 내피층의 질환, 장애, 또는 병태에는, 한정하는 것은 아니지만, 푹스 이영양증, 수포성 각막병증, 선천성 유전성 내피 이영양증 1, 선천성 유전성 내피 이영양증 2, 및 후방 다형 각막 이영양증이 포함된다.
이론에 매이지는 않지만, 눈의 방수에 전방내로 주사된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 용액(예컨대, 본원에 기술된 약학 제제)은 내피 표면, 특히 건강한 내피층으로 덮이지 않은 각막의 임의의 영역에 결합하는 것으로 여겨진다. 변형된 FGF는 내피 세포의 성장 및 이동을 자극한다. 이것은 내피 이영양증과 관련된 각막 부종을 감소시키며 각막 또는 내피 이식이 필요할 가능성을 감소시킨다. 변형된 FGF의 작용은 최대 이영양증 부위 이외의 부위(전형적으로 각막 중심)에서 발생할 수 있고 또한 각막 주변의 내피 세포 및 섬유주대(trabecular meshwork(TM))의 내피 전구체 풀의 자극을 유도한다.
일부 구현예에서, 치료될 안구 질환, 장애 또는 병태는 각막 내피의 질환, 장애, 또는 병태이다. 각막 내피의 질환, 장애 또는 병태에는, 한정하는 것은 아니지만, 재발성 각막 미란, 지속적인 상피 결손, 안구 건조증, 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome)과 같은 염증 상태, 및 각막 상피 결손이 포함된다.
일부 구현예에서, 치료될 안구 질환, 장애 또는 병태는 헤르페스 각막병증이다. 헤르페스 각막병증은 전형적으로 단순 헤르페스 바이러스(HSV)에 의해 유발된 각막의 감염이다. 일차 감염은 숙주 점막의 감염성 HSV에의 직접적인 노출의 결과일 수 있다. 일차 감염 및 감각 신경절의 잠복기의 확립 후, 바이러스는 자극을 받아 감염성 주기에 돌입할 수 있고, 그로부터 각막으로 복귀된다. 일단 감염되면 이 재발성 감염은 다양한 합병증, 특히 염증 반응을 유발할 수 있고, 염증 반응이 충분히 강하면 각막의 무결성을 손상시켜 각막 궤양, 혼탁, 흐림, 반흔 및 심한 경우 실명으로 이어질 수 있다. 헤르페스 감염에 이차적으로, 만성 헤르페스 각막병증, 신경영양 각막병증(neurotrophic keratopathy), 또는 둘 모두가 발생할 수 있다. 예를 들어, 면역 매개되고 선진국에서 각막 실명의 선두 요인인 간질 감염(stromal infection)은 만성 바이러스 재활성화의 결과로서 발생하고, 신경영양 각막병증, 퇴행성 병태로 이어진다. 정상 각막은 조밀하게 신경이 분포되지만, 혈관이 없다. 일차 바이러스 감염 후 후속 에피소드는 신경을 손상시켜서 감소된 각막 감각(각막 감각저하)으로 이어질 수 있을 뿐만 아니라, 혈관신생, 및 신생혈관 형성으로 이어질 수 있다. 추가의 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 박테리아 또는 진균 감염에 의해 유발된 감염성 각막염을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 내피 기저막 이영양증, Meesmann 청소년 상피 각막 이영양증, 젤라틴성 액상 각막 이영양증, 리쉬(Lisch) 상피 각막 이영양증, 상피하 점액성 각막 이영양증, Reis-Bucklers 각막 이영양증, 또는 Thiel-Behnke 이영양증, 및 재발성 각막 미란을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 안구 병태에는 각막(예컨대, 각막과 방수의 경계면에 있는 각막 표면 또는 내피층)에 대한 손상 또는 PRK, 라식 및 임의의 관통 각막 수술 또는 각막 성형술을 포함하는 각막 수술에 의해 유발된 외과적 파괴가 포함된다.
또한 본원에는 변형된 섬유모세포 성장 인자(FGF-1) 폴리펩타이드, 또는 그러한 변형된 펩타이드를 포함하는 약학 조성물 또는 의약을 투여함으로써 화학물질 또는 발포제 유도 손상을 치료하는 방법이 제공된다.
또한 본원에는 한 구현예에서 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여함으로써 화학적 또는 발포성 손상을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 화학물질 또는 발포제에 의해 유발된 피부 손상 또는 안구 손상을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 폴리펩타이드로서 변형된 FGF-1을 투여함으로써 발포제, 예컨대, 질소 머스터드(NM)에 의해 유도된 머스터드 가스 각막병증을 치료하는 단계를 포함한다. 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드로 MGK를 치료하는 것은, 일부 구현예에서, MGK와 관련된 조직병리학적 병태, 예컨대 각막 내피층의 과형성, 내피-간질 세포 분리 부종, 각막 미란의 개선을 유도한다. 본 개시의 변형된 FGF-1의 투여는, 특정 구현예에서, 부종의 감소 및 각막 미란의 제거를 유도한다. 각막 미란은 전형적으로 각막의 탈상피화를 특징으로 하며 일부 예에서: 변형된 FGF-1의 투여는 각막의 더 빠른 재상피화를 유도하거나 각막 탈상피화의 중증도를 감소시킨다. 한 구현예에서 본원에 기술된 변형된 FGF-1을 투여함으로써 화학물질 또는 발포제에 노출된 환자의 안구 표면 상피를 재생시키는 방법이 기술된다. 일부 구현예에서, 방법은 각막의 재생을 촉진하고, 각막의 변성을 예방하며, 화학적 손상에 대한 장기 후유증을 예방한다. 일부 예에서, 방법은 각막 내피 손상, 각막 상피 손상, 또는 각막 간질 손상을 치료하는 단계를 포함한다. 방법이 각막 내피 손상을 치료하는 경우에, 본원에 기술된 변형된 FGF-1을 투여하는 것은 각막 내피 세포의 기능을 향상시키며 각막의 장기간 변성을 예방한다. 일부 경우에, 방법이 각막 내피 손상을 치료하는 경우에, 본원에 기술된 변형된 FGF-1을 투여하는 것은 각막 부종 및 이차 전방 각막병증을 예방한다. 일부 경우에, 방법이 각막 내피 손상을 치료하는 경우에, 본원에 기술된 변형된 FGF-1을 투여하는 것은 각막 내피 세포의 손실을 예방한다. 일부 구현예에서, 방법은 각막 상피 탈착의 중중도의 감소를 유도한다. 일부 구현예에서, 방법은 간질 반흔과 같은 간질 손상 및 각막 혼탁을 치료하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 안구 병태에는 우발적인 외상 또는 각막에 대한 화학적 또는 열적 손상이 포함된다. 일부 예에서, 화학적 또는 열적 손상은 화학적 화상이다. 일부 예에서, 화학적 또는 열적 손상은 발포제에 의해 유발된다. 일부 예에서, 화학적 또는 열적 손상은 화학전 작용제에 의해 유발된다.
다수의 가정용 및 직업용 화합물은 눈과 피부에 화학적 화상을 유도할 가능성을 가지고 있다. 즉각적인 개입이 없으면, 돌이킬 수 없는 시력 상실 및 외관 손상이 만연할 수 있다. 열 방출 없이 산과 알칼리 작용제를 모두 신속하게 중화시키고 확산을 제한하는 작용제가 화학적 손상을 치료하는데 효과적일 것으로 고려된다. 예시의 화학적 손상에는, 한정하는 것은 아니지만, 알칼리 손상, 산 손상이 포함된다. 화학적 화상의 일반적인 원인에는 황산(H2SO4), 염산(HCl), 수산화 나트륨(NaOH), 석회(CaO), 질산은(AgNO3), 과산화수소(H2O2), 염소 가스 및 임의의 강력한 산화제가 포함된다.
본원에 기술된 화학적 또는 열적 손상을 유발할 수 있는 예시의 화학전 작용제는 포스젠, 두드러기 유발제, 또는 쐐기풀 작용제이다. 포스젠은 실온 및 표준 압력에서 매우 독성인 무색 가스로 0℃에서 발연 액체로 응축된다. 이의 분자식은 COCl2이다. 포스젠은 급성(단기간) 흡입 노출에 의해 매우 유독하다. 폐 부종, 폐 기종(pulmonary emphysema), 및 사망을 포함한 중증의 호흡기 영향이 인간에서 보고되었다. 중증의 안구 자극 및 피부 화상이 눈 또는 피부 노출 후에 유도될 수 있다. 포스젠에 대한 만성(장기간) 흡입 노출은 또한 돌이킬 수 없는 폐 변화, 예컨대 기종 및 섬유증을 유발할 수 있다. 이의 노출은 빠른 침투 및 즉각적인 중증의 피부 손상을 유발하는 능력으로 인한 높은 사망률을 포함한 광범위하고 파괴적인 영향을 유도할 수 있다. 최근 연구 결과는 포스젠 증기에 대한 국소적인 피부 노출이 마우스 모델에서 노출 후 8시간에 노출 후 수분 내에 홍반성 고리, 괴사, 부종, 경미한 두드러기 및 홍반과 함께 노출된 피부의 창백을 유발하는 것을 보여준다. 이들 임상적인 피부 증상은 피부 두께의 증가, 세포자멸성 세포 사멸, 비만 세포 탈과립화, 호중구 침윤을 나타내는 골수과산화효소 활성, p53 인산화 및 축적, 및 COX-2 및 TNFα 수준의 증가를 동반한다. 국소적인 포스젠 노출은 또한 간, 비장, 신장, 폐 및 심장 조직의 혈관에서 RBC의 왕성한 증가와 함께 말초 혈관의 확장을 유도하였다. 이들 사건은 쇼크, 저산소증 및 사망으로 이어지는 혈압의 강하를 유발할 수 있을 것으로 고려된다. 문헌 [Tewari-Singh N, Goswami DG, Kant R, Croutch CR, Casillas RP, Orlicky DJ, Agarwal R, Cutaneous exposure to vesicant phosgene oxime: Acute effects on the skin and systemic toxicity, Toxicol Appl Pharmacol. 2017 Feb 15; 317:25-32]을 참고한다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 발포제 노출에 의해 유발된 다양한 피부 손상을 치료, 예방, 또는 개선하는 방법에 사용될 수 있다.
발포제, 또는 발포성 작용제, 또는 수포제는 화상에 의해 유발된 피부 손상과 유사한 피부 손상을 발생시키는 독성 화합물이다. 이들 작용제는 흡입시 상기도 뿐만 아니라 폐에 영향을 미쳐 폐 부종을 발생시킨다. 예컨대, 문헌 [Ganesan, K., S. K. Raza, and R. Vijayaraghavan (2010) Chemical Warfare Agents, Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences 2.3: 166-178]을 참고한다. 이들 작용제는 또한 중증의 눈 손상을 유발할 수 있다. 2가지 형태의 발포제: 머스터드 및 비소가 있다. 화학전 작용제의 이 부류에서 가장 중요한 물질은 황 머스터드이다. 다른 구성원으로는 질소 머스터드(HN1, HN2 및 HN3), 및 루이사이트(L1, L2 및 L3), 에틸다이클로로아르신, 메틸다이클로로아르신, 페닐다이클로리아르신과 같은 비소 발포제가 있다. 발포제의 구체적인 예에는 한정하는 것은 아니지만 황 머스터드(SM), 비스-(2-클로로에틸) 설파이드, 클로로에틸에틸 설파이드(CEES), 루이사이트, 및 2-클로로-N-(2-클로로에틸)-N-메틸에탄아민 염산염, 질소 머스터드(NM)의 패밀리의 구성원이 포함된다. 본 개시 전체에서 사용되는 바, 용어 발포제, 발포 유발제 또는 화학물질, 발포 작용제 등은 본원에서 구체적으로 열거되는 바와 같은 발포제, 및 다른 화합물, 예컨대 독소 및/또는 화학전 작용제를 의미하는 것으로 간주된다. 황 머스터드는 제1차 세계 대전에서 사용된 이래로 군사적 중요성이 가장 높은 발포제이다. 질소 머스터드는 1930년대에 합성되었지만 전쟁을 위해 대량으로 생산되지는 않았다. 메클로르에타민(HN2, Mustargen)은 암 화학요법제로서 더 평화로운 적용을 찾았으며 수년 동안 이 목적을 위한 표준 화합물로 남아 있다. 루이사이트(L)는 머스터드와 유사한 불연성과 독성으로 인해 1918년에 군사적 목적으로 합성되었지만 전장에서는 사용되지 않았을 가능성이 있다. 머스터드는 방사성 유사체이며 분열하는 세포에 대해 극도로 독성이다. 머스터드는 친유성이며 피부, 대부분의 직물 및 고무에 쉽게 침투한다. 세포막을 통과한 후, 황 머스터드는 고도로 반응성인 설포늄 이온으로 전환된다. 이는 DNA, RNA 및 단백질을 비가역적으로 알킬화하여 세포 사멸을 유발하고; 가장 중요한 표적은 DNA이다. 머스터드는 DNA의 퓨린 염기를 알킬화하여 이를 손상시킨다. 루이사이트는 피부에 의해 훨씬 더 빠르게 흡수되며, 영향을 받은 기관에서 즉시 통증 및 자극을 유발하여 더 전신적인 증상을 생성한다. 이는 설프하이드릴 기에 직접 결합하여 이를 비활성화한다.
화학전에서 황 머스터드(SM), 및 다른 발포 작용제의 사용은 오랫동안 알려져 왔다. 보다 최근인, 2015년 8월에, SM은 ISIS에 의해 이라크의 쿠르드족 공격 뿐만 아니라 시리아 공격에 사용되었다. 머스터드제는 눈, 피부, 및 폐를 손상시키며, 눈이 가장 민감하다. 증상은 노출 후 2 내지 4시간까지는 나타나지 않기 때문에, 노출된 사람은 그들이 머스터드에 노출된 것을 즉시 알지 못한다. 이런 지연은 노출 증상이 마침내 나타날 때 혼란과 공황에 기여하였다. 눈의 경우 이들은 안검 경련(blepharospasm), 눈물 흘림, 자극, 통증, 및 광 공포증으로 이루어진다. 황 머스터드(SM) 증기에 대한 안구 노출로부터 비롯된 각막 손상이 가장 만연된 화학전 손상이다. 안구 노출은 3가지 뚜렷한, 용량 의존성 임상 궤적: 완전한 손상 해결, 만성 손상으로의 즉각적인 전환, 또는 지속적인 안구 증상의 후속 발생이 따르는 명백한 회복을 나타낸다. 이들 후자의 2개의 궤적은 종합적으로 머스터드 가스 각막병증(MGK)으로 알려져 있는 각막 증상의 자리(constellation)를 포함한다. 급성 손상 중의 조직 특이적 손상은 각막 내피 및 윤부 줄기 세포의 재생 능력을 감소시킴으로써 각막을 만성 또는 지연된 형태의 MGK에 취약하게 만들 수 있다.
일부 환자의 경우 MGK는 노출 후 수주 후에 발생한다; 다른 경우 증상이 나타나는데 수년이 걸린다. 이 각막병증은 각막 결막화와 윤부 줄기 세포 결핍을 특징으로 한다. 인간 각막 내피에서, CEC 손실로 인한 갭은 전형적으로 근위 CEC의 확산에 의해 채워진다. 이들 형태학적 변화는 각막과 방수 사이의 장벽이 더 이상 유지될 수 없을 때까지 내피 손실을 보상하여, 지속적인 각막 부종 및 이차 전방 각막병증을 유도한다. 성인 CEC는 생체내에서 증식하지 못하기 때문에, 따라서 CEC의 임의의 손실은 잠재적으로 내피 용량의 영구적인 감소를 나타낸다. 그러므로, 내피 기능이 CEC 확산에 의한 경미한 손상 후 복원될 수 있는 한편, 보다 중증의 손상은 인간 내피의 회복 용량을 초과할 수 있다. 토끼는 제한된 CEC 증식을 경험하여, CEC 손실로부터 회복되는 능력이 개선된다는 점에서 인간과 구별된다. 그러나, 인간에서와 같이, 토끼 내피에 대한 충분히 중증의 손상은 또한 돌이킬 수 없는 각막 대상부전(corneal decompensation) 및 이차 각막병증을 유도한다.
위의 연구를 토대로, 발포제 유도 내피 부전은 MGK 발병의 기저에 있는 원인이 되는 메커니즘일 수 있다는 가설이 세워졌다. 이 가설은 인간 및 토끼에서 관찰된 SM과 MGK 발생 사이의 용량 의존성 뿐만 아니라, 인간 사상자에서 보고되었던 상이한 임상 궤적(해결된 만성 MGK 및 발병이 지연된 MGK)과 일치한다. 이 가설에 따르면, 저용량의 발포제에 대한 각막 노출은 최소한의 내피 독성과 함께 급성 상피 병변을 유도할 수 있고, 각막은 장기간 합병증 없이 회복된다. 대안으로, 각막 내피에 대한 회복할 수 없는 손상을 유발하는 용량의 발포제에 대한 노출은 내피 장벽 부전을 유도할 수 있어서, 이차 전방 각막병증과 함께 지속적인 부종을 발생시킬 수 있다. 중증의 손상 후에, 급성 손상과 MGK 발병 사이에 분명한 지연은 없을 수 있다.
그러므로, 황 머스터드 및 유사하게 작용하는 화학적 독성제, 특히 화학전 작용제로 인한 손상을 최소화하거나 예방하기 위한 조성물 및 방법은 미국 국방부에서 일하는 과학자들에게 중요한 추구이다. 최근 연구는 발포제로서, 머스터드 화합물이 내피-간질 부착의 손실로 이어지는 것을 나타냈다. 각막에서, 미세소관이 형성되고, 일단 충분히 축적되며, 각막 상피는 기저막에 단단히 부착될 수 없어서, 상피 조직이 벗겨지는 것이 유발된다. 그러므로, SM에 대한 효과적인 노출 후 치료법은 각막 상피가 간질에 부착된 채로 유지되는 능력을 향상시키는 것이 바람직하다. 이론에 매이지는 않지만, 각막 상피가 간질에 부착된 채로 유지되는 능력은 일부 기저 상피가 제자리에서 회복될 기회를 허용하여, 기저막 및 간질과의 연결을 유지할 수 있는 것으로 고려된다. 또한 상피-간질 무결성의 주요 역할 중 하나는 헤미데스모좀의 경막 구성요소인 콜라겐 콜라겐 XVII(즉, BP180)라는 가설이 세워졌다. 손상 후에 ADAM9, ADAM10, 및/또는 ADAM17을 포함한 단백질의 ADAM("디스인테그린 및 메탈로프로테이나제") 패밀리에 의한 콜라겐 XVII의 절단으로 이의 기저막으로부터 상피 세포가 방출되고, 이런 절단은 그것이 이동할 수 있게 한다.
TNF-a 전환 효소 또는 TACE로도 알려져 있는 ADAM17은 콜라겐 XVII를 방출하기 위한 "셰다제(sheddase)" 뿐만 아니라 손상에 대한 일반적인 반응이다. 발포제 노출에 의해 유도된 각막 미세수포는 부분적으로, 콜라겐 XVII를 절단할 수 있는 ADAM17의 활성화로 인한 것이라고 가정되었다. 실험 데이터는 발포제 NM에 노출된 각막의 기저막 지대에서 ADAM17 발현의 유도를 확인하였다. 그러므로, ADAM17 발현의 노출후 상향조절을 억제할 수 있는 작용제는 발포제에 의해 유발된 각막 손상의 감쇠에 유용한 것으로 고려된다.
본 개시는 발포제, 예컨대 SM 및 NM에 대한 노출을 치료하거나, 부작용을 감소시키거나, 또는 및 그렇지 않으면 치유를 돕는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 제공한다. 본원에 개시된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 발포제, 예컨대 SM 및/또는 NM에 대한 노출 후 ADAM17의 발현을 예방할 수 있다.
본 개시는 또한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여함으로써, 화학물질 또는 발포제 유도 손상에 대한 노출을 치료하고, 예방하며, 부작용을 감소시키고, 그렇지 않으면 치유를 돕는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 발포제, 예컨대 SM 및/또는 NM에 대한 노출 후 ADAM17의 과다발현을 추가로 예방한다.
야생형 FGF-1 단백질, 예컨대, 서열 번호: 1은 산화 및 알킬화에 취약한 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 가지고 있다. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 포함하지 않는 본 개시의 일부 구현예에서, 그러한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 발포제에 의한 산화 및/또는 알킬화에 덜 취약하다. 실험 데이터는 또한 FGF-1의 수준의 감소를 나타냈고 이의 mRNA는 머스터드 작용제에 대한 노출로부터 비롯된 것으로 알려지며 이런 손실은 각막에서 머스터드 유도 병변의 느린 치유에서 역할을 할 수 있는 것으로 가설이 세워진다. 본 개시의 일부 구현예에서, 유리 시스테인 잔기를 포함하지 않고 따라서 시스테인 변형에 덜 취약하거나 취약하지 않은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 각막 머스터드 병변의 치유를 가속화하는데 효과적이다.
본 개시의 일부 구현예에서, 방법은 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 포함하지 않는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하며, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 발포제에 의한 산화 및/또는 알킬화에 덜 취약하다. 본 개시의 일부 구현예에서, 방법은 유리 시스테인 잔기를 포함하지 않고 따라서 시스테인 변형에 덜 취약하거나 취약하지 않은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 MGK와 관련된 각막 병변의 치유를 가속화하는데 효과적이다.
발포제, 예컨대 황 머스터드(SM) 및 질소 머스터드(NM)에 대한 노출은 수포형성이 지연된 중증의 피부 손상을 유발할 수 있다. 노출된 용량 및 시간에 따라, 부종 및 홍반은 잠재적으로 수포, 궤양, 괴사, 박리, 및 색소침착 변화로 발달할 수 있고, 이는 노출 후 수주 및 심지어 수년간 지속된다. 예컨대, Tewari-Singh N, Agarwal R, Mustard vesicating agent-induced toxicity in the skin tissue and silibinin as a potential countermeasure, Ann N Y Acad Sci. 2016 Jun;1374(1):184-92를 참고한다. 또 다른 예시의 발포제 포스젠 옥심(CX), 두드러기 유발제 또는 쐐기풀 작용제가 또한 잠재적인 화학전 및 테러리스트 무기이다.
일부 구현예에서, 치료될 안구 질환, 장애 또는 병태는 각막 간질의 질환, 장애, 또는 병태이다. 각막 간질의 질환, 장애, 또는 병태에는, 한정하는 것은 아니지만, 원추 각막, 격자 각막 이영양증, 과립형 각막 이영양증, 황반 각막 이영양증, 슈나이더 결정 각막 이영양증, 선천성 간질 각막 이영양증, 반점 각막 이영양증, 외상 또는 화학적 또는 열적 손상, 또는 트라코마와 같은 감염에 이차적인 손상이 포함된다.
추가의 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 각막(예컨대, 각막 내피 구조)의 파괴를 포함하는 각막 이식 과정(예컨대, 데스메막(Descemet's membrane)을 포함하는 각막 이식 또는 과정) 전에, 중에, 또는 후에 적용될 수 있으며, 손상에 대한 각막 또는 안구 표면 세포의 치유 및/또는 세포 반응의 개선의 가속화(예컨대, 이식된 세포의 생존력 및/또는 수명을 증가시킴으로써)가 치료 이점을 유도할 것이다.
추가 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 이식을 위해 제조되는 각막 세포 또는 각막 전구체의 생존력 및 건강을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 기증된 각막 또는 다른 기증된 각막 조직을 위한 기관 배양 배지에 첨가된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 각막 세포를 자극하고 이식 전에 보관될 수 있는 각막의 시간 길이를 증가시킬뿐만 아니라, 각막이 이식에 유용하도록 충분히 건강한 세포를 가질 가능성을 증가시킨다. 또한, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 각막 전구 세포의 성장을 자극하기 위하여 그런 세포를 배양할 때 배양 배지에 사용될 수 있다.
추가의 구현예는 각막 내피 세포를 변형된 FGF(예컨대, 변형된 FGF-1, 예컨대 서열 번호: 2의 서열을 포함하는 것)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 각막 내피 세포의 하나 이상의 섬유모세포 성장 인자 수용체(FGFR)의 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 그러한 방법은 하나 이상의 FGFR의 활성을 증가 또는 자극하기 위해 사용될 수 있고, 그로 인해 증가된 세포 이동 및/또는 세포 증식을 유도할 수 있다.
추가의 구현예에는 본 개시에 따르는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 투여함으로써 대사성 질환을 치료하는 방법이 기술된다. 개시된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드로 치료될 수 있는 예시의 대사성 질환에는 한정하는 것은 아니지만: (1) 당뇨병(제1형 및 제2형), 임신성 당뇨병, 고혈당증(hyperglycemia), 인슐린 저항성(insulin resistance), 비정상적인 글루코스 대사, "당뇨병 전단계"(공복 혈당 장애(IFG) 또는 내당능 장애(IGT)), 및 예를 들어, 췌장 β 세포 파괴와 같은 조직병리학적 변화를 포함한, 고혈당증 상태와 관련된, 또는 이로부터 유도된 기타 생리적 장애를 포함한 글루코스 이용 장애 및 그와 관련된 후유증; (2) 예를 들어, 죽상 동맥경화증(atherosclerosis), 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 뇌혈관 장애 등과 같은 이상지질혈증(dyslipidemias) 및 이의 후유증; (3) 대사성 증후군, 예컨대 비만 및 높아진 체질량과 관련된 다른 병태(한정하는 것은 아니지만, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH), 및 다낭성 난소 증후군(PCOS)과 같은 이의 동반 병적 상태 포함), 및 또한 혈전증(thrombosis), 과응고 및 혈전 유발 상태(동맥 및 정맥), 고혈압, 심혈관 질환, 뇌졸중(stroke) 및 심부전(heart failure); (4) 죽상 동맥경화증, 만성 염증성 장 질환(예컨대, 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)), 천식(asthma), 홍반성 루푸스(lupus erythematosus), 관절염( arthritis), 또는 기타 염증성 류머티스성 장애(inflammatory rheumatic disorder)를 포함한 염증 반응이 포함되는 장애 또는 병태; (5) 예를 들어, 지방육종(liposarcoma), 고형 종양, 및 신생물을 포함한 지방 세포 종양, 지방종 암종과 같은 세포 주기 또는 세포 분화 과정의 장애; (6) 중추 및 말초 신경계의 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease) 및/또는 탈수초 장애(demyelinating disorder) 및/또는 신경염증 과정을 포함하는 신경학적 질환 및/또는 알츠하이머벙(Alzheimer's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 파킨슨병(Parkinson's disease), 진행성 다초점 백질뇌병증(progressive multifocal leukoencephalopathy) 및 길랑-바레 증후군(Guillian-Barre syndrome)을 포함한, 기타 말초 신경병증; (7) 홍반 편평 피부병(erythemato-squamous dermatoses)을 포함한 피부 및 피부학적 장애 및/또는 상처 치유 과정의 장애; 및 (8) 증후군 X, 골관절염(osteoarthritis), 및 급성 호흡기 장애 증후군(acute respiratory distress syndrome)이 포함된다. 또한 치료적 유효량의 개시된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(또는 이를 암호화하는 핵산 분자)를 투여함으로써 식후 및 공복 혈당을 감소시키거나, 인슐린 감수성 및 글루코스 내성을 개선하거나, 전신성 만성 염증을 감소시키거나, 포유류의 간 지방증을 개선하거나, 음식 섭취를 감소시키거나, 또는 이것들의 조합 방법이 기술된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 상처 치유를 위해 투여된다. 상처의 예에는, 한정하는 것은 아니지만, 찰과상, 찢김 골절(avulsion), 타격 상처(예컨대, 개방성 기흉(open pneumothorax)), 화상, 타박상, 총상, 베인 상처, 열린 상처, 관통 상처, 천공 상처, 찔린 상처, 세톤(seton) 상처, 자상, 수술 상처, 피하 상처, 당뇨병성 병변, 또는 접선 상처가 포함된다. 본원에 기술된 화합물 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 상처의 추가의 예에는 급성 병태 또는 상처, 예컨대 열적 화상, 화학적 화상, 방사선 화상, 자외선 과다 노출에 의해 유발된 화상(예컨대, 햇볕 화상); 신체 조직, 예컨대 노동과 출산의 결과로서 회음부에 대한 손상; 의료 절차, 예컨대 회음 절개술(episiotomy) 중에 입은 손상; 절단, 절제, 찰과상을 포함한 외상 유도 손상; 사고로 입은 손상; 수술후 손상 뿐만 아니라, 만성 병태, 예컨대 압력 궤양(pressure sore), 욕창(bedsore), 당뇨병 및 혈액 순환 장애와 관련된 병태, 및 모든 유형의 여드름이 포함된다. 더불어, 상처에는 피부염, 예컨대 농가진(impetigo), 간찰진(intertrigo), 모낭염(folliculitis) 및 습진(eczema), 치과 수술 후 상처; 치주 질환(periodontal disease); 외상에 따르는 상처; 및 종양 관련 상처가 포함될 수 있다. 상처의 또 다른 예에는 동물에게 물림, 동맥 질환, 벌레에 쏘임 및 물림, 뼈 감염, 손상된 피부/근육 이식편, 괴저(gangrene), 피부 찢김 또는 열상(laceration), 피부 노화, 느리거나 치유되지 않는 수술 상처를 포함한 수술 절개, 뇌내 출혈, 동맥류(aneurysm), 피부 무력증(dermal asthenia), 및 수술 후 감염이 포함된다.
본 발명의 치료적 펩타이드는 또한 한정하는 것은 아니지만, 찰과상, 절단, 열상, 물린 상처, 총상, 자상, 화상, 햇볕 화상, 화학적 화상, 수술 상처, 욕창, 방사선 손상에 의해 유발된 외부 상처, 모든 종류의 급성 및 만성 상처, 미용 피부 시술에 의해 생성된 상처 또는 병변을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드는 또한 피부 노화의 영향을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드는 외부 상처의 상처 치유를 가속화하고/거나 상처입은 영역, 또는 노화 및 질환이 있는 피부의 미용적 외관을 개선할 수 있다. 펩타이드는 한정하는 것은 아니지만 심장, 뼈, 뇌, 척수, 망막, 말초 신경 및 일반적으로 급성 및 만성 손상, 질환, 선천성 및 발달상 기형 및 노화 과정이 수행되는 기타 조직 및 기관을 포함한 기관 및 조직에 대해 한정하는 것은 아니지만, 질환, 수술, 총상, 찌르기, 사고, 경색, 허혈성 손상에 의해 유발된 내부 손상을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 화상 손상을 치료하기 위해 투여된다. 예시의 화상 상처에는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 1도 화상(즉, 피부의 피상적인 표면이 붉어짐); 2도 화상(수포액이 제거된 후 자연 치유될 수 있는 수포가 생긴 부상 부위); 3도 화상(전체 피부를 통한 화상이며 일반적으로 상처 치유를 위해 외과 개입이 필요함); 열탕 화상(끓는 고온수, 그리스 또는 라디에이터 유체로부터 발생할 수 있음); 열적 화상(화염으로부터 발생할 수 있고, 일반적으로 깊은 화상); 화학적 화상(산 및 알칼리로부터 발생될 수 있고, 일반적으로 깊은 화상); 전기 화상(집 주변의 저전압 또는 직장에서의 고전압); 폭발 섬광(일반적으로 표면적 손상); 및 접촉 화상(일반적으로 깊고 머플러 테일 파이프, 뜨거운 다리미, 및 스토브로부터 발생할 수 있음)을 포함한 화상의 결과로서 발생하는 궤양을 포함한 "화상 궤양"이 포함된다. 본원에서 사용되는 바, 치유가 지연되거나 어려운 상처에는, 예를 들어, 적어도 부분적으로 1) 장기간 염증 단계, 2) 느리게 형성되는 세포외 매트릭스(ECM), 및 3) 감소된 상피화 속도를 특징으로 하는 상처가 포함될 수 있다.
성장 인자, 예컨대 FGF-1은, FGF-1이 신경 증식 및 성장을 자극하고 신경을 보호할 수 있는 것으로 여겨지기 때문에, 신경 재생 및 신경 치유에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. FGF-1은 척수 손상 및 외상, 예컨대 상완 신경총 손상(brachial plexus injury), 신경면역 장애, 예컨대 급성 또는 특발성 횡단 척수염(TM), 또는 뉴런 또는 신경 조직의 재생 및/또는 보호가 요구되는 기타 다른 질환 또는 병태 후에 신경계 조직을 재생하는데 사용하기 위해 제안되었다. 예컨대, 문헌 [Cheng, H. et al., "Spinal Cord Repair with Acidic Fibroblast Growth Factor as a Treatment for a Patient with Chronic Paraplegia", SPINE 29(14): E284-E288 (2004); 및 Lin, P-H., "Functional recovery of chronic complete idiopathic transverse myelitis after administration of neurotrophic factors", Spinal Cord 44:254-257 (2006)]을 참고한다. FGF-1은 신경영양 활성을 가지며, 축삭 성장을 촉진하고, 척수 손상 및 축삭 재생 모델에서 유익한 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 일부 구현예에서 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 신경 재생을 촉진하고 신경 재생으로부터 혜택을 받는 병태의 치료 방법에 사용될 수 있다. 일부 예시의 방법에서, 신경학적 병태는 근위축성 측삭 경화증(ALS)이다. 일부 예시의 방법에서, 신경학적 병태는 급성 또는 특발성 횡단 척수염(TM)이다. 특정 경우에, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 신경으로부터 혜택을 받는 병태를 치료하기 위해; 재생을 위해 다른 성장 인자, 뿐만 아니라 다른 약학 활성 구성요소와 조합되어 투여될 수 있다.
약학 조성물, 투여 방법, 및 투약
본원에 기술된 변형된 FGF-폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물은, 약학적으로 사용될 수 있는 조제물로 활성 화합물의 처리를 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함한 하나 이상의 생리적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 종래 방식으로 제제화될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 좌우된다. 본원에 기술된 약학 조성물에 적합한 부형제에 대한 추가의 상세한 설명은, 예를 들어, 본원에 그러한 개시에 대해 참조로 포함된 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed.(Lippincott Williams & Wilkins 1999)]에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 약학 조성물은 변형된 FGF과 다른 화학적 구성요소, 예컨대 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제, 및/또는 부형제, 및, 선택적으로, 다른 치료용 및/또는 예방용 성분과의 혼합물을 지칭한다. 약학 조성물은 변형된 FGF의 유기체에의 투여를 용이하게 한다. 본원에 제공된 치료 또는 사용 방법을 실시함에 있어서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 치료적 유효량은 치료될 안구 질환, 장애, 또는 병태를 가진 포유류에게 약학 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 포유류는 인간이다. 치료적 유효량은 질환의 중증도, 대상체의 연령 및 상대적인 건강, 사용된 화합물의 효능 및 기타 요인에 따라 광범위하게 달라질 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 또는 적합한 조성물은 안과학적으로 적합한 또는 허용 가능한 조성물을 포함한다.
약학 조성물(예컨대, 주사에 의한 전달 또는 점안제로서의 적용을 위한)은 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 액체 약학 조성물에는, 예를 들어, 다음 중 하나 이상이 포함될 수 있다: 주사용 물, 식염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매와 같은 멸균 희석제; 항박테리아제; 항산화제; 킬레이트화제; 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같이 긴장성의 조정을 위한 작용제. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 동봉될 수 있다. 생리 식염수가 부형제로서 일반적으로 사용되며, 주사용 약학 조성물 또는 안구로 전달되는(예를 들어, 점안제로서) 조성물은 바람직하게는 멸균성이다.
본원에 기술된 변형된 FGF-폴리펩타이드 또는 약학 조성물은 예를 들어, 국소적으로, 안내로, 전방내로, 경구로, 비경구로, 정맥내로, 복강내로, 비내로(또는 예를 들어, 코, 목구멍, 및 기관지의 점막에 대한 다른 전달 방법) 또는 눈으로의 국소 투여에 의한, 또는 안내 또는 안구 주위 장치에 의한 것을 포함한, 임의의 적합한 수단에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 국소 투여 방식에는, 예를 들어, 국소 적용, 점안제, 안내 주사 또는 안구 주위 주사가 포함될 수 있다. 안구 주위 주사는 전형적으로 결막 아래에 또는 테논강(눈 위에 있는 섬유 조직 아래)으로의 화합물의 주사를 포함한다. 안내 주사는 전형적으로 변형된 FGF 또는 약학 조성물의 유리체로의 주사를 포함한다. 특정 구현예에서, 투여는 예컨대 국소 적용 또는 점안제에 의해서와 같이 비침습성이다. 일부 구현예에서, 투여는 국소적 방법 및 전방내 방법의 조합을 통해 이루어진다.
본원에 기술된 변형된 FGF 또는 이의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한(적합한) 담체 또는 비히클 뿐만 아니라 기술분야에서 일상적으로 사용된 기법을 사용하여 투여를 위해 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 또는 적합한 담체에는 안과학적으로 적합한 또는 허용 가능한 담체가 포함된다. 담체는 특정 변형된 FGF의 용해도에 따라 선택된다. 적합한 안과학적 조성물 및 제제에는, 예컨대 점안제, 주사 등에 의해 눈에 국소적으로 투여 가능한 것들이 포함된다. 점안제의 경우에, 제제에는 또한 선택적으로, 예를 들어, 염화나트륨, 농축 글리세린 등과 같은 등장화제; 인산나트륨, 아세트산나트륨 등과 같은 완충제; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트(또한 폴리소르베이트 80으로도 언급됨), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-라우레이트(또한 폴리소르베이트 20으로도 언급됨), 폴리옥실 스테아레이트 40, 폴리옥시에틸렌 수소화 캐스터유 등과 같은 계면활성제; 시트르산 나트륨, 에덴트산 나트륨 등과 같은 안정화제; 염화벤즈알코늄, 파라벤 등과 같은 보존제; 및 기타 성분과 같은 안과학적으로 부합하는 작용제가 포함될 수 있다. 보존제는, 예를 들어, 약 0.001 내지 약 1.0% 중량/부피의 수준으로 사용될 수 있다. 제제의 pH는 일반적으로 안과학적 제제에 대해 허용 가능한 범위 내에, 예컨대 약 pH 4 내지 8의 범위 내에 있다.
주사의 경우, 변형된 FGF 또는 약학 조성물은 주사 등급 식염수 용액에, 주사용 리포솜 용액, 서방성 중합체 시스템 등의 형태로 제공될 수 있다. 안내 및 안구 주위 주사는 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Spaeth, Ed., Ophthalmic Surgery: Principles of Practice, W. B. Sanders Co., Philadelphia, Pa., 85-87, 1990]을 포함한 수많은 출판물에서 기술된다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF 또는 약학 조성물(예컨대, 안과용 제제)은 미세바늘을 통해 각막으로 투여된다(Jiang et al. (2007). Invest Ophthalmol Vis Sci 48(9): 4038-4043). 미세바늘 어레이는 변형된 FGF 또는 약학 조성물로 코팅되고 미세바늘이 각막 간질로 침투하지만 전체 각각을 침투하지는 않도록 각막에 대해 가압된다. 그런 후 그것은 제거되고, 변형된 FGF 또는 약학 조성물은 각막 간질 뒤에 남겨진다. 이 변형된 FGF 또는 약학 조성물은 각막 세포가 증식하고 이동하도록 자극하고, 간질 세포가 정상적으로 가지는 반흔 반응을 억제한다.
일부 구현예에서, 조성물은 안내 전달을 위해 제제화될 수 있다. 안내 전달은 유리체내 전달, 각막 감염, 전방내 전달을 포함한다. 일부 구현예에서 조성물은 전방내 전달을 위해 제제화된다. 일부 구현예에서 조성물은 유리체내 전달을 위해 제제화된다. 제제는 주사용 액체이고, 매우 작은 부피를 포함할 수 있으며, 주사용 액체 제제의 밀도는 표적화된 공간에서 이의 방출이 조직에 대한 손상을 유발하지 않도록 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 전방내 전달을 위한 부피는 약 100 마이크로리터, 약 100 마이크로리터 미만, 약 20 마이크로리터 미만, 약 10 마이크로리터 미만, 약 5 마이크로리터 미만, 약 2.5 마이크로리터 미만, 또는 약 1 마이크로리터이다. 본원에는 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 서열 번호: 1에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 돌연변이; 및 L-메티오닌을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포함하는, 안내 전달을 위한 주사용 제제가 제공된다. 제제의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 약 95% 이상 순수하게 존재할 수 있고 폴리펩타이드는 제제 에 모노머 형태로 있다. 청구항 제1항의 제제에서, 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한 연장 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 주사용 제제는 다음 서열, 서열 번호: 2, 205, 206, 3-8, 14-18, 24-28, 93-117, 118-141, 146-149, 및 174-204 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열에 대해 적어도 90% 동일하거나, 또는 이의 단편인 서열을 포함하는 변형된 FGF-1을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 주사용 제제가 이로써 제공되며, 제제는 필요한 용량 및 농도의 변형된 FGF-1, 및 염화나트륨; 황산암모늄; 인산일칼륨; 이염기성 인산나트륨 이수화물; 에틸렌다이아민테트라아세트산; 및 L-메티오닌 중 하나 이상을 포함하는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 주사용 제제는 변형된 FGF1; 적어도 약 50 mM의 이염기성 인산나트륨 이수화물; 적어도 약 100 mM의 염화나트륨; 적어도 약 10 mM의 황산암모늄; 적어도 약 0.1 mM의 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA); 적어도 약 5 mM의 L-메티오닌; 및 적어도 약 0.01%의 폴리소르베이트 80(중량/부피)을 포함할 수 있다. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포함하는 주사용 제제는 Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val, Lys12Val, Cys16Ser, Ala66Cys, Cys117Val, 및 Pro134Val로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 펩타이드 ALTEK의 적어도 하나의 잔기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 다음의 돌연변이: Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val을 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 위치한 메티오닌 잔기, 및 N-말단 메티오닌과 서열 번호: 1의 위치 1 사이에 위치한 펩타이드 ALTEK의 적어도 하나의 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제 또는 그 안의 약학적으로 적합한 부형제는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 L-메티오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, L-메티오닌은 제제에 1 mM 내지 20 mM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, L-메티오닌은 제제에 2 mM 내지 10 mM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, L-메티오닌은 제제에 1 mM 내지 10 mM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, L-메티오닌은 제제에 2.5 mM 내지 15 mM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, L-메티오닌은 제제에 약 5 mM의 농도로 존재한다. 비강, 목구멍, 및 기도로의 전달을 포함하는, 점막 경로를 통한 적어도 하나의 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 전달을 위해, 조성물은 에어로졸의 형태로 전달될 수 있다. 화합물은 점막내 전달에 대해 액체 또는 분말 형태일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 적합한 추진제, 예컨대 탄화수소 추진제(예컨대, 프로판, 부탄, 아이소부탄)가 있는 가압된 에어로졸 용기를 통해 전달될 수 있다. 조성물은 네뷸라이저 또는 분무기와 같은 비가압 전달 시스템을 통해 전달될 수 있다.
적합한 경구 투여 형태에는, 예를 들어, 경질 또는 연질 젤라틴, 메틸셀룰로오스 또는 소화관에서 쉽게 용해되는 또 다른 적합한 물질의 정제, 알약, 향낭, 또는 캡슐이 포함된다. 적합한 무독성 고체 담체, 예를 들어, 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 탈크, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등이 사용될 수 있다(예컨대, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro, 21st Ed. Mack Pub. Co., Easton, PA (2005)] 참고).
본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 또는 약학 조성물은 지속성 또는 느린 방출용으로 제제화될 수 있다. 그러한 조성물은 일반적으로 잘 알려져 있는 기술을 사용하여 제조되고, 예를 들어, 안구 주위, 안내, 직장, 경구 또는 피하 이식에 의해, 또는 원하는 표적 부위에서의 이식에 의해, 또는 국소 적용에 의해 투여될 수 있다. 지속성 방출 제제는 담체 매트릭스에 분산되고/거나 속도 제어 막에 둘러싸인 저장소 내에 함유된 작용제를 함유할 수 있다. 그러한 제제 내에서 사용하기 위한 부형제는 생체 부합하고 또한 생분해성일 수 있다; 바람직하게 제제는 상대적으로 일정한 수준의 활성 구성요소 방출을 제공한다. 지속성 방출 제제 내에 함유된 활성 화합물의 양은 이식 부위, 방출 속도 및 예상 기간, 및 치료될 또는 예방될 병태의 성질에 따라 달라진다.
안구 경로를 통해 투여된 약물 또는 조성물의 전신성 약물 흡수는 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있다(예컨대, Lee et al., Int. J. Pharm. 233:1-18(2002) 참고). 한 구현예에서, 본원에 기술된 화합물은 국소적 안구 전달 방법에 의해 전달된다(예컨대, Curr. Drug Metab. 4:213-22 (2003) 참고). 조성물은 점안제, 고약, 또는 연고 등의 형태, 예컨대 수성 점안제, 수성 안과용 현탁액, 비수성 점안제, 및 비수성 안과용 현탁액, 겔, 안과용 연고 등의 형태일 수 있다. 겔을 제조하는 경우, 예를 들어, 카르복시비닐 중합체, 메틸 셀룰로스, 알긴산나트륨, 하이드록시프로필 셀룰로스, 에틸렌 말레산 무수물 중합체 등이 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 변형된 FGF 용액 또는 약학 조성물(예컨대, 안과용 제제)은 히알루론산, 카르복시메틸 셀룰로스, 또는 편안한 안용액을 생성하기 위해 증가된 안구 내약성, 점도 및 삼투압을 제공하는 기타 다당류를 함유한다.
적어도 하나의 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 FGF 또는 약학 조성물의 용량은 환자(예컨대, 인간)의 상태, 즉, 안구 질환, 장애, 또는 병태의 단계, 일반적인 건강 상태, 연령, 및 의학 기술분야에 숙련된 사람이 용량을 결정하기 위해 사용할 기타 요인에 따라 상이할 수 있다. 조성물이 점안제로서 사용되는 경우, 예를 들어, 단위 용량당 1 내지 여러 방울, 바람직하게는 한 두 방울(한 방울당 약 50 μl)이 매일 약 1 내지 약 6회 적용될 수 있다.
약학 조성물은 의학 기술분야에 숙련된 사람에 의해 결정된 대로 치료될(또는 예방될) 질환, 장애, 또는 병태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 적절한 용량 및 적합한 기간 및 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환, 장애, 또는 병태의 유형 및 중증도, 활성 성분의 특정 형태, 및 투여 방법과 같은 요인들에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 치료적 및/또는 예방적 이익(예컨대, 개선된 임상 결과, 예컨대 보다 빈번한 완전한 또는 부분적인 관해, 또는 더 이상의 질환 없음, 또는 증상 중증도의 감소)을 제공하기에 충분한 양으로 조성물(들)을 제공한다. 예방적 용도의 경우, 용량은 안구 질환, 장애, 또는 병태를 예방, 발병을 지연, 또는 중증도를 감소시키기에 충분하여야 한다. 최적 용량은 일반적으로 실험 모델 및/또는 임상 시험을 사용하여 결정될 수 있다. 최적 용량은 환자의 체질량, 체중, 또는 혈액 부피에 따라 달라질 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 일일 용량으로서 일정 기간 동안 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 만성적으로 또는 장기간 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 수일, 수주, 수개월, 수년 동안 투여되거나 또는 대상체의 일생에 걸쳐 지속적인 요법일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 약 7일, 15일, 약 21일, 약 30일, 약 3개월, 약 6개월, 약 12개월, 약 18개월, 약 2년, 약 5년, 약 7년, 약 10년, 약 15년, 약 20년, 약 25년, 약 30년, 약 35년, 또는 약 40년 동안 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 요법은 다양한 요인에 따라 개별 대상체에 대해 결정될 수 있다. 일부 예에서, 치료 요법은 화학적 또는 열적 손상을 유발하는 화합물, 예컨대 발포 화합물에 대한 노출 수준에 따라 달라진다. 일부 구현예에서, 치료 요법은 급성 노출의 경우 약 2주이고 장기 노출의 경우 수개월 내지 1년이다. 일부 구현예에서, 치료 요법은 만성적이다. 일부 예에서, 요인에는, 한정하는 것은 아니지만, 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 투여에 대한 반응으로 각막 조직의 변성 정도의 변화의 측정이 포함될 수 있다. 일부 예에서, 요인에는, 한정하는 것은 아니지만, 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 투여에 대한 반응으로 MGK 후유증의 개선이 포함될 수 있다. 일부 예에서, 요인에는, 한정하는 것은 아니지만, 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 투여에 대한 반응으로 각막 내피 병변의 치유가 포함될 수 있다. 일부 예에서, 요인에는, 한정하는 것은 아니지만, 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 투여에 대한 반응으로 각막 상피 세포 증식이 포함될 수 있다. 일부 예에서, 요인에는, 한정하는 것은 아니지만, 본 개시의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 투여에 대한 반응으로 푹스 이영양증과 관련된 증상의 감소가 포함될 수 있다. 구현예에서, 조성물에 대한 즉각적인 반응, 예를 들어, 푹스 이영양증과 관련된 증상의 즉각저인 감소를 나타내는 대상체는 나중에 또는 여러 번의 용량 후에 조성물에 대한 반응을 나타내는 대상체보다 덜 빈번한 용량을 필요로 할 수 있다.
변형된 FGF-1 폴리펩타이드 또는 약학 조성물의 용량은 대상체의 임상 상태, 병태 및 연령, 투여 형태 등에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 점안제의 경우에, 본원에 기술된 변형된 FGF가, 예를 들어, 약 10 ug/ml 내지 약 100 mg/ml의 변형된 FGF로 주당 1회 내지 7회 투여될 수 있다.
또한 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 및 약학 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체 및 적어도 하나의 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 본원에 기술된 또는 기술분야에서 실시된 임의의 한 방법에 따라 변형된 FGF를 합성한 후 화합물을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제제화하는 단계에 의해 제조될 수 있다. 조성물의 제제화가 적절할 것이고 한정하는 것은 아니지만, 화합물의 전달 경로, 용량, 및 안정성을 포함한 여러 요인에 따라 달라질 것이다.
적어도 하나의 본원에 기술된 변형된 FGF는 인간 또는 다른 비인간 척추동물에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 FGF는 그것이 약 5% 미만 또는 약 1% 미만, 또는 약 0.1% 미만의 다른 유기 분자, 예컨대, 예를 들어, 합성 방법의 하나 이상의 단계에서 생성된 오염 중간체 또는 부산물을 함유한다는 점에서 실질적으로 순수하다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 하나 이상의 조합이 투여될 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 적용에서, 조성물은 이미 질환 또는 병태를 앓고 있는 환자에게, 질환 또는 병태의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이런 용도에 효과적인 양은 질환 또는 병태의 중증도 및 과정, 이전의 치료법, 환자의 건강 상태, 체중, 및 약물에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.
예방적 적용에서, 본원에 기술된 조성물은 특정 질환, 장애 또는 병태에 취약하거나 또는 위험한 환자에게 투여된다. 그러한 양은 "예방적 유효량 또는 용량"인 것으로 정의된다. 이런 용도에서, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 달라진다.
환자의 병태가 개선되지 않는 경우에, 의사의 재량으로, 조성물의 투여는 환자의 질환 또는 병태의 증상을 개선하거나 또는 그렇지 않으면 제어 또는 제한하기 위하여 환자의 생애 기간 전체를 포함한 만성적으로, 즉, 연장된 기간 동안 투여될 수 있다.
환자의 상태가 개선되지 않는 경우에, 의사의 재량으로, 조성물의 투여는 연속적으로 제공될 수 있다; 대안으로, 투여되는 약물의 용량은 일시적으로 감소되거나 특정 기간 동안 일시적으로 중단될 수 있다(즉, "약물 휴일").
일단 환자의 병태가 개선되면, 유지 용량이 필요에 따라 투여된다. 후속해서, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 다가 증상의 함수로서, 개선된 질환, 장애 또는 병태가 유지되는 수준으로 감소될 수 있다. 그러나, 환자는 증상이 재발할 때 장기간에 걸쳐 간헐적 치료를 필요로 할 수 있다.
원하는 용량은 단일 용량으로 또는 동시에(또는 짧은 시간에 걸쳐) 또는 적절한 간격으로, 예를 들어 1일당 2, 3, 4 또는 그 이상의 하위 용량으로서 투여된 분할된 용량으로서 편리하게 제공될 수 있다.
본원에 기술된 약학 조성물은 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태일 수 있다. 단위 투여 형태에서, 제제는 하나 이상의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 적절한 양을 함유하는 단위 용량으로 나누어진다. 단위 투여량은 제제의 별개의 양을 함유한 포장 형태일 수 있다. 비제한적인 예는 바이알 또는 앰풀의 포장된 정제 또는 캡슐 및 분말이다. 수성 현탁 조성물은 단일 용량의 재밀봉할 수 없는 용기 또는 재밀봉 가능한 용기에 포장될 수 있다. 대안으로, 다중 용량 재밀봉 가능한 용기가 사용될 수 있고, 그 경우에 조성물에 보존제를 포함하는 것이 전형적이다. 단지 예를 들자면, 비경구 주사용 제제는, 한정하는 것은 아니지만 앰풀을 포함한 단위 투여 형태로, 또는 보존제가 첨가된 다중 용량 용기로 제공될 수 있다.
그러한 치료 요법의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서, 한정하는 것은 아니지만, LD50(집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)의 측정을 포함한, 표준 약학 과정에 의해 측정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 용량 비율은 치료적 지수이고 이는 LD50과 ED50 사이의 비율로서 표시될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위로 제제화하는 데 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 투여량은 바람직하게 최소 독성으로 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 활용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다.
벌크 의약 물질 제제 및 약학 제제
본 개시의 구현예는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(예컨대, 서열 번호: 2의 서열을 포함하는 FGF-1 폴리펩타이드)를 염화나트륨, 황산암모늄 및 인산수소이나트륨 이수화물 중 적어도 하나를 포함하는 제제에 벌크 의약 물질(BDS)로서 제공한다. 일부 구현예에서, BDS는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포로부터, 예를 들어, 부틸 세파로스 급속 흐름 칼럼을 사용하여 정제된 후, 용출 완충액(벌크 의약 물질을 보관하기 위한 제제) 중의 용액으로서 보관된다. 정제 중에, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 전형적으로 구배로 용출되고, 따라서, 일부 경우에, 용출 완충액은 정확한 조성을 갖지 않는다. 예를 들어, 일부 경우에, 용출 완충액은 염화나트륨, 황산암모늄, 및 인산수소이나트륨 이수화물을 포함하며 약 7.4의 pH를 가진다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 염화나트륨, 예컨대 약 200 mM, 약 300 mM, 약 400 mM, 약 500 mM, 약 600 mM, 약 700 mM, 약 800 mM, 약 900 mM, 약 1000 mM의 염화나트륨; 약 100 mM 내지 약 500 mM의 황산암모늄, 예컨대 약 200 mM, 약 300 mM, 약 310 mM, 약 320 mM, 약 330 mM, 약 340 mM, 약 360 mM, 약 370 mM, 약 380 mM, 약 390 mM, 약 400 mM, 약 500 mM의 황산암모늄; 및 약 1mM 내지 약 50 mM의 인산수소이나트륨 이수화물, 예컨대 약 2 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 약 25 mM, 약 26 mM, 약 27 mM, 약 28 mM, 약 29 mM, 또는 약 30 mM의 인산수소이나트륨 이수화물, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, BDS는 약 6 내지 약 8의 pH를 갖는 제제에 보관된다.
본 개시의 구현예는 pH 5.8에서 히스티딘/폴리소르베이트/소르비톨 제제로 구성된 약학 제제를 제공한다. 약학 제제와 관련된 다양한 장점에는, 한정하는 것은 아니지만, 가시적인 미립자의 결여, SE-HPLC에 의한 거의 일정한 주요 피크 면적, SE-HPLC에 의한 시간 경과에 따른 가용성 응집체의 낮은 백분율, 및 시간 경과에 따른 pH의 제어가 포함된다. 일부 구현예에서, 히스티딘은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 예컨대 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 100 mM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 약학 제제는 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성, 양친매성 계면활성제, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 약학 제제는 폴리소르베이트, 예컨대, PS20, PS80을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 약 0.01% 내지 약 10%의 농도로 존재하는 P80을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 적어도 약 0.005%, 적어도 약 0.01%, 적어도 약 0.015%, 적어도 약 0.02%, 적어도 약 0.03%, 적어도 약 0.04%, 적어도 약 0.05%, 적어도 약 0.06%, 적어도 약 0.07%, 적어도 약 0.08%, 적어도 약 0.09%, 또는 적어도 약 0.1%의 농도의 폴리소르베이트 80, NF(PS80)(% 중량/부피)을 포함한다. 다른 구현예에서, 제제는 약 0.005% 내지 약 0.1% PS80, 약 0.005% 내지 약 0.02% PS80, 약 0.005% 내지 약 0.05% PS80, 약 0.01% 내지 약 0.02% PS80, 약 0.02% 내지 약 0.1% PS80 또는 약 0.01% 내지 약 0.03% PS80을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.01%의 농도의 PS80을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.02%의 농도의 PS80을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.03%의 농도의 PS80을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 약 0.04%의 농도의 PS80을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.05%의 농도의 PS80을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.06%의 농도의 PS80을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.07%의 농도의 PS80을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.08%의 농도의 PS80을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.09%의 농도의 PS80을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.1%의 농도의 PS80을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 적어도 약 0.005%, 적어도 약 0.01%, 적어도 약 0.015%, 적어도 약 0.02%, 적어도 약 0.03%, 적어도 약 0.04%, 적어도 약 0.05%, 적어도 약 0.06%, 적어도 약 0.07%, 적어도 약 0.08%, 적어도 약 0.09%, 또는 적어도 약 0.1%의 농도의 폴리소르베이트 20, NF(PS20)(% 중량/부피)을 포함한다. 다른 구현예에서, 제제는 약 0.005% 내지 약 0.1% PS20, 약 0.005% 내지 약 0.02% PS20, 약 0.005% 내지 약 0.05% PS20, 약 0.01% 내지 약 0.02% PS20, 약 0.02% 내지 약 0.1% PS20 또는 약 0.01% 내지 약 0.03% PS20을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.01%의 농도의 PS20을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.02%의 농도의 PS20을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.03%의 농도의 PS20을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 약 0.04%의 농도의 PS20을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.05%의 농도의 PS20을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.06%의 농도의 PS20을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.07%의 농도의 PS20을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.08%의 농도의 PS20을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.09%의 농도의 PS20을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.1%의 농도의 PS20을 포함한다. 다른 구현예에서, 약학 제제는, 예를 들어, 안내 주사, 전방내 주사, 안구 주위 주사, 정맥내 주사, 복강내 주사, 또는 비강내 주사를 포함하는 적합한 수단에 의해 대상체에게 전달된다.
일부 구현예에서, 약학 제제는 알코올 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서 알코올 화합물은 소르비톨, 에리트리톨, 자일리톨, 글리세롤, 만니톨, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서 알코올 화합물은 긴장성 조절제, 예컨대, 소르비톨이다. 일부 구현예에서, 알코올 화합물은 약 1% 내지 약 10%로 존재하는 소르비톨이다. 일부 구현예에서, 제제는 염화나트륨인 긴장성 조절제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학 제제는 글리세린을 포함한다.
특정 구현예에서, 제제는 적어도 약 0.25%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 0.75%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5%, 적어도 약 2%, 적어도 약 2.5%, 적어도 약 3%, 적어도 약 3.5%, 적어도 약 4%, 적어도 약 4.5%, 적어도 약 5%, 적어도 약 7.5% 또는 적어도 약 10%의 농도의 소르비톨(% 중량/부피) USP를 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 0.5% 내지 약 5% 소르비톨, 약 0.5% 내지 약 4% 소르비톨, 약 0.5% 내지 약 1.5% 소르비톨, 약 1% 내지 약 2% 소르비톨, 또는 약 2.5% 내지 약 3.5% 소르비톨을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학 제제는 약 5.8, 약 4.5 내지 약 6.5, 약 4.0 내지 약 6.0, 약 4.0 내지 약 6.5 미만, 약 5.0 내지 약 6.0, 약 5.1 내지 약 5.9, 약 5.2 내지 약 5.8, 약 5.3 내지 약 5.4, 약 5.4 내지 약 5.5, 약 4.1 내지 약 6.1, 약 4.2 내지 약 6.2, 약 4.3 내지 약 6.3, 약 4.4 내지 약 6.4, 약 4.5 내지 약 6.5, 약 4.6 내지 약 6.6, 약 4.7 내지 약 6.7, 약 4.8 내지 약 6.8, 약 4.9 내지 약 6.9, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 4.1 내지 약 5.1, 약 4.2 내지 약 5.2, 약 4.3 내지 약 5.3, 약 4.4 내지 약 5.4, 약 4.5 내지 약 5.5, 약 4.6 내지 약 5.6, 약 4.7 내지 약 5.7, 약 4.8 내지 약 5.8, 약 4.9 내지 약 5.9, 약 5.0 내지 약 6.0, 약 6.1 미만, 약 6.2 미만, 약 6.3 미만, 약 6.4 미만, 약 6.5 미만, 약 6.6 미만, 약 6.7 미만, 약 6.8 미만, 약 6.9 미만, 약 7.0 미만의 pH를 가진다.
일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(예컨대, 서열 번호: 2의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드)는 본원에 기술된 약학 제제에 활성 성분을 포함하며 약 100 pg/mL 내지 약 1000 μg/mL, 약 500 pg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 0.0001 μg/mL 내지 약 0.0005 μg/mL, 약 0.0005 μg/mL 내지 약 1.0 μg/mL, 약 1.0 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 40, 약 40 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 50 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 70 μg/mL, 약 70 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 90 μg/mL, 약 90 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 110 μg/mL, 약 110 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 130 μg/mL, 약 130 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 150 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 170 μg/mL, 약 170 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 190 μg/mL, 약 190 μg/mL 내지 약 200 μg/mL의 농도로 존재한다.
본 개시의 구현예는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드; 적어도 약 200 mM 내지 약 1000 mM의 농도의 염화나트륨; 약 50 mM 내지 약 500 mM의 농도의 황산암모늄; 약 1 mM 내지 약 50 mM의 농도의 인산수소이나트륨을 포함하는 벌크 의약 물질 제제를 제공한다. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 하기 아미노산 잔기를 포함한다: 위치 16에서 Ser, 위치 66에서 Cys, 및 위치 117에서 Val. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 농도는 적어도 약 0.1 g/mL 내지 약 10 g/mL, 예컨대 약 0.2 g/mL 내지 약 15 g/mL, 약 0.3 g/mL 내지 약 20 g/mL, 약 1 g/mL 내지 약 5 g/mL, 약 1 g/mL 내지 약 4 g/mL, 약 2 g/mL 내지 약 3 g/mL이다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 농도는 약 3 g/mL이다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 800 mM의 농도의 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 320 mM의 농도의 황산암모늄을 포함한다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 20 mM의 농도의 인산수소이나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 7 내지 약 9의 pH를 가진다. 일부 구현예에서, 벌크 의약 물질 제제는 약 7.4의 pH를 가진다. 일부 구현예에서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 -60℃ ± 10℃의 온도에서 보관될 때 안정적이다.
본 개시의 구현예는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질감염된 박테리아 세포의 배양에서 봉입체로부터 단리된 다시 접힌 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 정제를 포함하는 제조 방법을 제공하며, 정제는 아가로스 기반 수지(예컨대, CaptoTM DeVirS 수지)로 패킹된 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 다시 접힌 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포획하는 단계, 이어서 부틸 세파로스 수지로 패킹된 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 연마하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 연마 단계로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 회수율은, 헤파린 수지로 패킹된 크로마토그래피 칼럼을 사용하며 다른 것은 동일한 제조 방법에서 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 연마하는 단계 후 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 회수율보다 약 10% 내지 약 40% 더 크거나, 또는 약 10% 내지 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 크며, 예컨대 약 11% 더 크거나, 약 12% 더 크거나, 약 13% 더 크거나, 약 14% 더 크거나, 약 15% 더 크거나, 약 16% 더 크거나, 약 17% 더 크거나, 약 18% 더 크거나, 약 19% 더 크거나, 약 20% 더 크거나, 약 25% 더 크거나, 약 30% 더 크거나, 약 35% 더 크거나, 약 40% 더 크다.
병용 치료
변형된 FGF-1 폴리펩타이드 및 약학 조성물은 또한 치료될 병태에 대한 치료 가치에 대해 선택되는 다른 치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 및 약학 조성물은 또한 발포성 손상을 치료하기 위한 치료 가치에 대해 선택되는 다른 치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 그러한 작용제는 동일한 약학 조성물로 투여될 필요는 없으며, 상이한 물리적 및 화학적 특성으로 인해, 상이한 경로에 의해 투여되어야 할 수 있다. 가능한 경우, 동일한 약학 조성물에서 투여 방식 및 투여의 타당성을 결정하는 것은 임상의의 지식 범위 내에 있다. 초기 투여는 현장에서 인식된 확립된 프로토콜에 따라 이루어질 수 있고, 그런 후에는, 관찰된 효과를 토대로, 투여량, 투여 방식 및 투여 횟수는 임상의에 의해 수정될 수 있다.
사용된 이들 선택적인 추가 작용제의 특정 선택은 주치의의 진단과 환자 상태에 대한 판단 및 적절한 치료 프로토콜에 따라 달라질 것이다. 작용제는 질환, 장애, 또는 병태의 본질, 환자의 상태, 및 사용된 작용제의 실제 선택에 따라 동시에(예컨대, 동시에, 본질적으로 동시에 또는 동일한 치료 프로토콜 내에) 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 치료 프로토콜 중에 각각의 치료제의 투여 순서, 및 투여의 반복 횟수의 결정은 치료되는 질환 및 환자의 상태의 평가 후에 의사의 지식 범위 내에 있다.
본원에 개시된 병용 요법을 구성하는 약제는 병용 투여 형태이거나 또는 실질적으로 동시 투여를 위해 의도된 별도의 투여 형태일 수 있다. 병용 요법을 구성하는 약제는 또한 2 단계 투여를 요구하는 요법에 의해 투여되는 치료 화합물과 함께 순차적으로 투여될 수 있다. 2 단계 투여 요법은 활성 작용제의 순차적인 투여 또는 별도의 활성 작용제의 간격을 둔 투여를 필요로 할 수 있다. 다중 투여 단계 사이의 기간은 각각의 약제의 특성, 예컨대 약제의 효능, 용해도, 생체 이용률, 혈장 반감기 및 동역학적 프로파일에 따라 수 분 내지 수 시간으로 다양할 수 있다. 표적 분자 농도의 일주기 변화도 또한 최적 용량 간격을 결정할 수 있다.
치료적으로 효과적인 투여량은 약물이 치료 조합에 사용되는 경우 달라질 수 있다. 병용 치료 요법에 사용하기 위한 약물 및 기타 작용제의 치료적으로 효과적인 투여량을 실험적으로 측정하는 방법은 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 독성 부작용을 최소화하기 위해 더 자주, 더 낮은 용량을 제공하는 규칙적인 투약의 사용이 문헌에 광범위하게 기술되어 있다. 병용 치료는 환자의 임상 관리를 돕기 위해 다양한 시간에 시작하고 중단하는 주기적인 치료를 추가로 포함한다.
예를 들어, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 스테로이드, 항생물질, 항염증제, IL-1 또는 IL-1의 유사체와 같은 사이토카인, 또는 IL-17 억제제와 같은 사이토카인의 길항물질과 같은 다른 활성 성분을 함유하는 제제에 혼입될 수 있다.
다른 예시의 사이토카인에는, 한정하는 것은 아니지만, 인터류킨(예컨대, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-1α, IL-1β, 및 IL-1 RA), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 온코스타틴 M, 에리트로포이에틴, 백혈구 억제 인자(LIF), 인터페론, B7.1(또한 CD80으로서 알려짐), B7.2(또한 B70, CD86으로서 알려짐), TNF 패밀리 구성원(TNF-α, TNF-β, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail), 및 이동 억제 인자 MIF가 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 조합 또는 약학 조성물은 면역 체계의 활성을 감소, 억제, 또는 방지하기 위하여 면역억제 요법으로 투여된다. 면역억제 요법은 이식된 기관 및 조직의 거부반응을 방지하기 위하여; 자가면역 질환 또는 자가면역 기원인 가능성이 가장 많은 질환의 치료를 위해; 그리고 일부 다른 비자가면역 염증 질환의 치료를 위해 임상적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 및 약학 조성물은, 한정하는 것은 아니지만, 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID) 및 코르티코스테로이드(글루코코르티코이드)를 포함한 하나 이상의 항염증제와 함께 투여된다.
NSAID에는, 한정하는 것은 아니지만: 아스피린, 살리실산, 겐티스산, 살리실산 마그네슘 콜린, 살리실산 콜린, 살리실산 마그네슘 콜린, 살리실산 콜린, 살리실산 마그네슘, 살리실산 나트륨, 다이플루니살, 카프로펜, 페노프로펜, 페노프로펜 칼슘, 플루오로바이프로펜, 이부프로펜, 케토프로펜, 나부톤, 케톨로락, 케토롤락 트로메타민, 나프록센, 옥사프로진, 다이클로페낙, 에토돌락, 인도메타신, 설린닥, 톨메틴, 메클로페나메이트, 메클로페나메이트 나트륨, 메페남산, 피록시캄, 멜록시캄, 및 COX-2 특이적 억제제(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 셀레콕십, 로페콕십, 발데콕십, 파레콕십, 에토리콕십, 루미라콕십, CS-502, JTE-522, L-745,337 및 NS398)가 포함된다.
코르티코스테로이드에는, 한정하는 것은 아니지만: 베타메타손, 프레드니손, 알클로메타손, 알도스테론, 암시노니드, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 시클레소니드, 클로베타솔, 클로베타손, 클로코르톨론, 클로프레드놀, 코르티손, 코르티바졸, 데플라자코트, 데옥시코르티코스테론, 데소니드, 데속시메타손, 데속시코르톤, 덱사메타손, 디플로라손, 디플루코르톨론, 디플루프레드네이트, 플루클로롤론, 플루드로코르티손, 플루드록시코르타이드, 플루메타손, 플루니솔리드, 플루오시놀론 아세토나이드, 플루오시노니드, 플루오코르틴, 플루오코르톨론, 플루오로메톨론, 플루페롤론, 플루프레드니덴, 플루티카손, 포르모코르탈, 할시노니드, 할로메타손, 하이드로코르티손/코르티솔, 하이드로코르티손 아세포네이트, 하이드로코르티손 부테프레이트, 하이드로코르티손 부티레이트, 로테프레드놀, 메드리손, 메프레드니손, 메틸프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 아세포네이트, 모메타손 퓨로에이트, 파라메타손, 프레드니카베이트, 프레드니손/프레드니솔론, 리멕솔론, 틱소코르톨, 트라이암시놀론, 및 울로베타솔이 포함된다.
항염증제로서 사용된 다른 작용제에는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 2005/0227929호에서 개시된 것들이 포함된다.
일부 상업적으로 이용 가능한 항염증제에는, 한정하는 것은 아니지만: Arthrotec®(다이클로페낙 및 미소프로스톨), Asacol®(5-아미노살리실산), Salofalk®(5-아미노살리실산), Auralgan®(항피린 및 벤조카인), Azulfidine®(설파살라진), Daypro®(옥사프로진), Lodine®(에토돌락), Ponstan®(메페남산), Solumedrol®(메틸프레드니솔론), Bayer®(아스피린), Bufferin®(아스피린), Indocin®(인도메타신), Vioxx®(로페콕십), Celebrex®(셀레콕십), Bextra®(발데콕십), Arcoxia®(에토리콕십), Prexige®(루미라콕십), Advil®, Motrin®(이부프로펜), Voltaren®(다이클로페낙), Orudis®(케토프로펜), Mobic®(멜록시캄), Relafen®(나부메톤), Aleve®, Naprosyn®(나프록센), Feldene®(피록시캄)이 포함된다.
한 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은, 한정하는 것은 아니지만, BAY u9773(EP 00791576; 1997. 8. 27. 공개 참고), DUO-LT(Tsuji et al, Org. Biomol. Chem., 1, 3139-3141, 2003), 자피르루카스트(Accolate®), 몬테루카스트(Singulair®), 프란쿨라스트(Onon®), 및 이들의 유도체 또는 유사체를 포함한 류코트리엔 수용체 길항물질과 함께 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 및 약학 조성물은 하나 이상의 Rho 키나제 억제제와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 및 약학 조성물은, 한정하는 것은 아니지만 상피 성장 인자(EGF) 및 신경 성장 인자(NGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 변형 성장 인자 알파 및 베타(TGF-알파 및 TFG-베타), 혈소판 유래 내피 성장 인자(PD-ECGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 에리트로포이에틴, 콜로니 자극 인자(CSF), 대식세포-CSF(M-CSF), 과립구/대식세포 CSF(GM-CSF) 및 산화 질소 생성효소(NOS)를 포함한 하나 이상의 추가 성장 인자와 함께 투여된다. 예컨대, 문헌 [Joyce et al. (2009) Invest Ophthalmol. Vis Sci. 50:2116-2122]을 참고한다.
키트/제조 물품
본원에 기술된 치료적 적용에 사용하기 위하여, 키트 및 제조 물품이 또한 본원에 제공된다. 그러한 키트에는 운반체, 포장, 또는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하기 위해 구획화된 용기가 포함되며, 각각의 용기(들)는 본원에 기술된 방법에 사용될 별도의 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 들 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다.
본원에 제공된 제조 물품은 포장재를 함유한다. 의약품 포장에 사용하기 위한 포장재는, 예컨대, 미국 특허 제 5,323,907호, 제 5,052,558호 및 제 5,033,252호를 포함한다. 약학 포장재의 예에는, 한정하는 것은 아니지만, 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 병 및 선택된 제제 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 포장재가 포함된다. 본원에 제공된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드 및 약학 조성물의 광범위한 안과용 제제는 본원에 기술된 변형된 FGF 또는 약학 조성물의 투여에 의해 이익을 얻을 임의의 안구 질환, 장애 또는 병태에 대한 다양한 치료로서 고려된다.
예를 들어, 용기(들)는 서열 번호: 2의 서열을 가지는 변형된 FGF-1과 같은 변형된 FGF를 포함할 수 있다. 용기(들)는 선택적으로 멸균 접근 포트를 가진다. 그러한 키트는 선택적으로 본원에 기술된 방법에서의 용도와 관련된 식별 설명 또는 라벨 또는 지침이 있는 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 안내 전달을 위한 주사용 액체 제제에 적합하거나 적합하도록 설계될 수 있다. 키트는 저부피 바이알로서 설계될 수 있고 원추형 인서트(insert)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 점적기 병이다. 일부 구현예에서, 점적기 병은 주사용 제제에서 적어도 한 용량의 변형된 FGF-1을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 점적기 병은 멸균 필터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 용기는 주사기를 포함한다. 일부 구현예에서, 주사기는 투베르쿨린 폴리프로필렌 및 유리로 이루어지는 군으로부터 선택된 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 주사기는 주사용 제제로 사전에 채워진다. 일부 구현예에서, 키트는 전자 제어 유닛을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 전자 제어 유닛은 선행 섹션에서 기술된 것에 따라 주사용 제제의 투여 부피를 제어할 수 있고, 부피는 적어도 약 10 마이크로리터 내지 약 100 마이크로리터이다. 일부 구현예, 청구항 제107항의 키트에서, 점적기 병은 위에서 기술된 구현예 중 임의의 하나의 주사용 제제, 또는 본 개시의 임의의 곳에서 기술된 약학 조성물에 적어도 한 용량의 변형된 FGF-1을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 점적기 병은 멸균 필터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 주사기를 포함한다. 일부 구현예에서, 주사기는 투베르쿨린 폴리프로필렌 및 유리로 이루어지는 군으로부터 선택된 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 주사기는 위에서 기술된 구현예 중 임의의 하나의 주사용 제제, 또는 본 개시의 임의의 곳에서 기술된 약학 조성물로 사전에 채워진다. 키트는 전자 제어 유닛을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전자 제어 유닛은 청구항 제1항 내지 제45항 중 어느 하나에 따르는 주사용 제제, 또는 청구항 제90항 내지 제95항 중 어느 하나에 따르는 약학 조성물의 투여 부피를 제어할 수 있고, 부피는 적어도 약 10 μL 내지 약 100 μL이다.
일부 구현예에서, 키트는 전형적으로 하나 이상의 추가 용기를 포함할 수 있으며, 각각의 용기는 본원에 기술된 변형된 FGF의 사용을 위해 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다양한 물질(예컨대 선택적으로 농축된 형태의 시약, 및/또는 장치) 중 하나 이상을 포함한다. 그러한 물질의 비제한적인 예에는, 한정하는 것은 아니지만, 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기; 내용물 및/또는 사용 지침을 열거한 운반체, 포장, 용기, 바이알 및/또는 튜브 라벨, 및 사용 지침이 있는 포장 인서트가 포함된다. 전형적으로 또한 지침 세트가 포함될 것이다.
라벨은 용기 상에 있거나 용기에 회합될 수 있다. 라벨을 형성하는 문자, 숫자 또는 기타 문자가 용기 자체에 부착, 몰딩 또는 에칭될 때 라벨은 용기 상에 있을 수 있다; 라벨은, 예를 들어 포장 인서트로서 용기를 보유하는 용기 또는 운반체 내에 존재할 때 용기에 회합될 수 있다. 라벨은 내용물이 특정 치료 적용에 사용될 것을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 라벨은 또한 예컨대 본원에 기술된 방법에서 내용물을 사용하기 위한 지시사항을 나타낼 수 있다.
특정 구현예에서, 변형된 FGF 약학 조성물은 본원에 제공된 화합물을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 함유할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여를 위한 지침이 수반될 수 있다. 팩 또는 디스펜서에는 또한 의약품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형태의 용기와 관련된 통지가 수반될 수 있으며, 이 통지는 인간 또는 수의학적 투여를 위한 약물 형태의 기관 승인을 반영한다. 그러한 통지는, 예를 들어, 처방 약물에 대해 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 라벨링, 또는 승인된 제품 삽입물일 수 있다. 부합하는 약학 담체에 제제화된 본원에 제공된 변형된 FGF를 함유하는 조성물이 또한 제조되고, 적절한 용기에 배치되고, 표시된 병태의 치료를 위해 라벨링될 수 있다.
실시예
이들 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구범위의 범주를 제한하지 않는다. 본원에 기술된 실시예에서 사용된 출발 물질 및 시약은 합성되거나 상업적 공급처로부터 얻을 수 있다.
실시예 1: 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 치료 효능을 평가하기 위한 예시의 방법: 재조합 기법 섹션에서 기술된 방법을 사용하여 생성된, 서열 번호: 2의 서열(N-Met-TTHX1114) 또는 서열 번호: 205의 서열(TTHX1001)을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 NIH-3T3 섬유모세포 세포 증식 검정을 사용하여 생물학적 활성에 대해 평가하였다. 서열 번호: 2 및 서열 번호: 205의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 모두 섬유모세포의 증식을 유도하는 유효성의 견지에서 비슷한 능력을 나타냈다. 서열 번호: 2의 서열(N-Met-TTHX1114) 또는 서열 번호: 205의 서열(TTHX1001)을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를, 아래에서 기술되는 것과 같이, 안과 질환의 실험 모델에서 추가로 평가한다.
건강한 기증자로부터의 인간 각막 내피 세포의 일차 배양물(계대 1)을 소 태아 혈청(FBS, 8%)의 존재 하에 24 웰 플레이트 상에 시딩하고 24시간 후 낮은(0.8%) FBS가 있는 배지에서 다양한 농도의 N-Met-TTHX1114(서열 번호: 2), TTHX1001(서열 번호: 205), 또는 wt-FGF-1(서열 번호: 1)로 처리한다. 8% FBS 그룹을 양성 대조군으로서 활용한다. 결과는 인간 각막 상피 세포 증식을 자극하는데 있어 N-Met-TTHX1114가 TTHX1001 또는 wt-FGF-1보다 더 강력하였고 그 안에서 용량 반응성인 것을 나타낸다. N-Met-TTHX1114의 EC50은 wt-FGF-1 또는 다른 테스트된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(TTHX1001; 서열 번호: 205)보다 약 100배 더 낮았다.
본원에 기술된 약학 조성물의 치료 효과를 평가하기 위해 질소 머스터드(NM)를 사용하는 예시의 각막 손상 모델을 사용할 수 있다. 토끼 각막 기관 배양 모델 시스템을 사용하여 NM에 대한 노출 후의 치유를 평가하였다. 토끼의 눈(생후 8-12주령)을 취하여 2 mm 공막 테두리가 있는 각막을 눈에서 절개하고, 스팟 플레이트에 상피면이 아래로 가도록 배치하고, 오목한 부분을 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM) 중의 558C 용융 아가(0.75%)로 채웠다. 용액이 겔화되면, 상피 층에 접근할 수 있도록 각막을 거꾸로 놓는다. 배양을 60 mm 직경 파이렉스 조직 배양 접시에 놓는다. 13MEM-NEAA(최소 필수 배지 비필수 아미노산), 13 RMPI 1640 비타민 용액, 13 항생물질/항진균제, 아스코르브산(0.45 mM), 및 시프로플록사신(10 lg/ml)을 함유한 고글루코스 DMEM을 제조한다. 고글루코스 DMEM을 공막 테두리에 첨가하여, 각막이 공기에 노출되게 한다. 접시를 5% CO2가 있는 37℃ 가습 인큐베이터에 배치한다. 각각의 배양의 상피를 500 μL 배지로 보습하고, 7 내지 9시간마다 중심 각막 위로 적하방식으로 첨가한다. 발포제인 NM을 중심 각막 위로 적하방식으로 첨가한다. 각막 샘플(아가 지지체로부터 벗겨냄)을 최적 절단 온도(OCT, Tissue-Tek; Sakura, Torrance, CA, USA) 화합물을 함유한 저온 성형체에 상피면을 아래로 향하게 놓고 조직학 및 면역형광을 위해 급속 냉동시키거나, 또는 웨스턴 블롯 및 ADAM17 활성 검정을 포함한 추가 단백질 분석을 위해 직접 급속 냉동시킨다(InnoZyme TACE 활성 검정 키트; Calbiochem, Billerica, MA, USA).
NM을 중심 각막 위에 적용한 후, 배양을 발포제를 제거하지 않고 37℃ 인큐베이터에 2시간 동안 되돌린다. 이 인큐베이션 후에, 오염된 배지를 제거하고, 새로운 배지를 접시의 수준이 공막 테두리 상부에 도달할 때까지 중심 각막에 첨가한다. 그런 후에 대조군 비노출 및 노출된 각막을 37℃로 되돌려 22시간 동안 인큐베이션하고, 3회의 짧은 주기 동안만 제거하여 20 μL 배지를 N-Met-TTHX1114 치료법을 받지 않은 노출된 샘플에 첨가하거나, 또는 치료법으로서 20 μL의 N-Met-TTHX1114를 중심 각막에 첨가한다. 제1 met-TTHX1114 적용은 8시간 동안 놓아두고, 제2 적용은 9시간 동안 놓아두며, 제3 적용은 5시간 동안 놓아둔다. 그러므로, 2시간 노출 길이 및 후속 치료는 총 24시간이다.
NM에 의해 영향을 받은 손상에는 다음이 포함된다: (a) 상피층의 과형성, 이것은 간질로 내려가는 상피 세포의 수 및 깊이의 증가에 의해 분명하다. 이것은 하향 과형성으로서 언급된다. 비노출(나이브) 각막은 약간의 하향 과형성을 나타내지만 NM에 노출된 각막만큼 광범위하지 않다; (b) 기저 상피 세포의 상부를 향해 솟아있는 기저 세포 핵; 및 (c) 상피-간질 분리. 조직병리학적 영향은 노출 후 4일 정도로 초기에 볼 수 있다. 조직병리학적 등급은 N-Met-TTHX1114로의 치료로 개선된다. N-Met-TTHX1114 처리 각막 섹션은 미처리 각막으로부터의 섹션과 비교하여 더 낮은 점수(더 적은 손상을 나타냄)를 나타낸다. 주변 각막 상피층 자극은 각막 상피 세포(CEC)의 EdU 통합을 통해 평가한다. 토끼 CEC의 일차 배양을 표준 과정, 예컨대, 문헌 [Kay et al.(Kay et al. Investigative ophthalmology & visual science. 1993;34(3):663-72; Lee et al., Investigative ophthalmology & visual science. 2009;50(5):2067-76)]에서 기술된 과정을 사용하여 확립한다. 세포를 NM에 2시간 동안 노출시킨다. 증식 검정을, 예컨대, Click-IT 검정 키트(Life Technologies)를 사용하여 12-웰 플레이트에서 수행한다. EdU의 각막 상피 세포로의 통합은 상피 증식의 지표이다. EdU가 통합된 각막 상피 세포 백분율은 NM 노출 후에, 미처리 대조군에 비교하여 N-Met-TTHX1114로 처리된 경우 더 낮다.
유사한 모델에서, 황 머스터드를 사용하여 실험적 각막 내피 손상을 유도할 수 있고 N-Met-TTHX1114(또는 모의)를 테스트 해결을 위해 투여할 수 있다. 토끼 각막에 노출 후 8주 후에, 내피 세포 형태 및 구조를 테스트 그룹(또한 해결된 눈으로서 언급됨)과 모의 대조군 그룹(나중에 MGK가 발병함) 사이에서 비교한다. 해결된 눈은 임상 평가 중에 각막 미란, 신혈관형성, 또는 각막 흐림과 같은 특징적인 MGK 후유증의 부재에 의해 구별되며 6주까지 모의 노출된 대조군과 통계적으로 구별할 수 없는 각막 두께를 가졌다. 해결된 눈의 Enface 주사 현미경 사진은 다각형 세포의 잘 조직된 단층을 가진 모의 노출 대조군과 놀랍도록 유사한 것으로 나타난다. 평균 CEC 크기는 대조군 각막과 비교하여 해결된 눈에서 증가한다; 그렇지 않으면, 해결된 각막은 후방 표면 전체에서 유의미한 가변성을 나타내지 않는다. 대조적으로, MGK 내피로 모의 대조군 처리된 토끼는 동물들 중에서 세포 모양 및 세포 크기에서 광범위한 가변성을 드러내며, 이는 역동적인 손상 과정을 나타낸다. 내피 형태의 초점 가변성은 개별 각막에서 일상적으로 관찰되며, 일부 영역은 확대되었지만 모자이크 CEC를 나타내고 다른 영역은 상당한 무조직을 나타내며, 정점 수포의 다양한 정도, 벗겨진 DM을 보이는 영역, 및 명확하게 묘사된 세포 경계 부족을 보인다. 이들 현상은 N-Met-TTHX1114 처리 해결된 내피에서는 관찰되지 않는다. N-Met-TTHX1114 처리 해결된 각막의 투과 전자 현미경 이미지는 나이브 내피와 매우 유사하다. 대조적으로, MGK 병리가 있는 모의 대조군 처리된 내피는 후각막 섬유질 막의 부종 및/또는 침착과 일치하는 후방 DM의 확산성 비후를 나타낸다. MGK 각막은 또한 세포질 희박화, 과도한 액포화, 및 팽창된 소포체를 포함한, CEC 스트레스 또는 손상의 광범위한 마커를 나타낸다. 24시간 이미지와 유사하고 최근에 벗겨진 DM을 다시 채우기 위한 지속적인 시도를 암시하는, 겹치는 세포 과정의 높은 빈도가 있다.
헤르페스 각막병증의 치료를 위해 FGF-1 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 번호: 2(N-Met-TTHX1114) 또는 서열 번호: 205(TTHX1001)의 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 치료 효과를 평가하기 위하여 다음의 방법을 채택할 수 있다.
헤르페스 각막병증이 있는 환자의 그룹을 이 연구를 위해 선택한다. 환자를 3 그룹으로 나눈다. 제1 하위 그룹의 환자는 눈으로, 안과용 제제, 예컨대 인산염 완충 식염수(pH 7.2), 0.3% 프로필렌 글리콜, 0.4% 폴리에틸렌 글리콜 400, 및 0.05% 하이드록시프로필 구아르에 제제화된 약 500 pg/ml(즉, 0.0005 μg/ml)의 N-met TTHX1114(서열 번호: 2)를 함유하는 점안제를 투여한다. 제2 하위 그룹의 환자는 눈으로, 안과용 제제, 예컨대 인산염 완충 식염수(pH 7.2), 0.3% 프로필렌 글리콜, 0.4% 폴리에틸렌 글리콜 400, 및 0.05% 하이드록시프로필 구아르에 제제화된 약 500 pg/ml(즉, 0.0005 μg/ml)의 TTHX1001(서열 번호: 205)을 함유하는 점안제를 투여한다. 제3 하위 그룹의 환자는 눈으로, N-Met-TTHX1114(서열 번호: 2) 또는 TTHX1001(서열 번호: 205)을 함유하지 않지만 다른 것은 제1 및 제2 하위 그룹에 투여한 것과 동일한 모의 안과용 제제를 투여한다. 3개의 하위 그룹 전부에 대해, 점안제를 환자가 자체 투여하거나 간호사 또는 간병인이 투여한다. N-Met-TTHX1114(서열 번호: 2) 함유 안과용 제제, TTHX1001(서열 번호: 205) 함유 안과용 제제, 및 모의 안과용 제제를 각각 제1, 제2, 및 제3 하위 그룹의 환자에게 최대 30일 동안 1일 2회 투여한다.
N-Met-TTHX1114(서열 번호: 2)를 함유하는 안과용 제제 및 TTHX1001(서열 번호: 205)을 함유하는 안과용 제제는 제1 및 제2 하위 그룹에 속하는 환자의 대부분에서 약 14일 이내에, 통증 및 염증의 기간의 감소와 함께 헤르페스성 각막 궤양이 치유되는 결과를 유도하는 것으로 관찰된다. 나아가, N-Met-TTHX1114(서열 번호: 2) 함유 안과용 제제, TTHX1001(서열 번호: 205) 함유 안과용 제제로 각각 치료된 제1 및 제2 하위 그룹의 환자의 눈은 모의로 치료된 제3 하위 그룹의 환자보다 각막 흐림 및 반흔이 줄어들었다.
예를 들어, 서열 번호: 206(TTHX1114) 또는 서열 번호: 205(TTHX1001)의 서열을 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 인간 각막 내피 세포(HCEC) 증식에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 건강한 기증자로부터의 인간 각막 내피 세포의 일차 배양물(계대 1)을 소 태아 혈청(FBS, 8%)의 존재 하에 24 웰 플레이트 상에 시딩하고 24시간 후 낮은(0.8%) FBS가 있는 배지에서 다양한 농도의 TTHX1114(서열 번호: 206), TTHX1001(서열 번호: 205), 또는 wt-FGF-1(서열 번호: 1)로 처리한다. 8% FBS 그룹을 양성 대조군으로서 활용한다. 결과는 인간 각막 상피 세포 증식을 자극하는데 있어 TTHX1114가 TTHX1001 또는 wt-FGF-1보다 더 강력하였고 그 안에서 용량 반응성인 것을 나타낸다. TTHX1114의 EC50은 wt-FGF-1 또는 다른 테스트된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(TTHX1001; 서열 번호: 205)보다 약 100배 더 낮았다.
실시예 2: 확장 가능한 재조합 인간 FGF-1의 제조 방법: 안내 치료제로서 FGF-1을 생성하기 위한 예시적인 일반화된 방법을 도 1에서 개략적으로 도시한다. 일반화된 방법은 추가로 발전되고 다양한 변형이 이루어진다. 간단히 설명하며, 이. 콜라이를 변형된 인간 FGF-1(N-Met-TTHX1114)을 암호화하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환한다.
한 예시의 세트에서, 이. 콜라이 코돈 최적화된 인간 FGF-1(TTHX1114) 서열을 Nde1/BamH1 클로닝 제한 부위를 사용하여 pET26b(+) 벡터에 하위클로닝하여 pET26_TTHX1114 플라스미드를 얻었다. hFGF-1을 암호화하는 예시의 이. 콜라이 코돈 최적화된 서열을 아래에 제공한다:
Figure pct00001
한 예시의 세트에서, 이. 콜라이 코돈 최적화된 인간 FGF-1 서열을 Nde1/BamH1 부위를 사용하여 pMKet 벡터 백본에 하위클로닝하여 리더 서열이 없는, 예컨대 ompA 리더 서열이 없는 pMKet_TTHX1114 플라스미드를 얻었다. pMKet 벡터는 pBR322 ori 서열을 포함한다.
예시의 한 세트에서, ompA 리더 서열은 TTHX1114 코딩 서열의 상류에 삽입되어 FGF-1 폴리펩타이드의 주변 세포질 발현을 지시하는 OA_TTH1114pMKet 플라스미드가 얻어진다. 리더 ompA 서열을 암호화하는 예시의 핵산 서열을 아래에 제공한다:
5'-ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTTGCGC AAGCT-3'.
예시의 ompA 아미노산 서열은 MKKTAIAIAVALAGFATVAQA이다.
FGF-1 서열을 N 말단 fMet와 함께 또는 없이 테스트한다.
테스트된 숙주 세포는 이. 콜라이 BL 21 균주, 및 이. 콜라이 W3110 균주이다.
숙주 세포를 2YT의 테스트 배지, 또는 탄소원으로서 글루코스 또는 글리세롤을 포함하는 주문형 합성 배지에서 성장시킨다. 배양을 전체에서 카나마이신의 존재 하에 두었다.
형질전환된 이. 콜라이 세포를 발효 배양에서 팽창시켰고 10 L 분취액을 예시의 FGF-1 제조에 사용하였다. 발효 실행 T1 F01E(10 L)로부터 100 g의 이. 콜라이 세포 페이스트의 재현탁에 이어 세포 용해, 봉입체(IB)의 분리, - 가용화 완충액에서의 희석, 재접힘 완충액(1:20 부피/부피)에서의 재접힘을 하였다. 250 ml의 FGF-1을 포함하는 재접힘 완충액을 부틸 및 헤파린 HIC 칼럼에 통과시켰다.
위에서 기술된 일반화된 프로토콜을 사용하는 한 예시의 실행에서, 수율은 재접힘 완충액 L당 약 0.6 mg의 FGF-1이었다. 0.25 L 재접힘으로부터 대략 0.2-0.25 mg의 FGF가 얻어졌다(1 mg/L 정도). 정제된 단백질의 동일성을 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.
예시의 실행에서, BL21 세포에서 pMKet TTX1114(ompA 리더 서열 없음)를 사용하고, 합성 배지에서 성장시켜서 ompA 리더 서열을 포함하는 플라스미드보다 개선된 수율을 유도하였는데, 수율은 약 10배까지 개선되었다. 도 2a는 부틸 포획 크로마토그래피 칼럼(예컨대, Capto DeVirs(Cytiva, BPG 300x500, Part#17-5466))으로부터의 용리액을 도시하며 도 2b는 표시된 바와 같이 A215 및 A280에서 검출된, 헤파린 HIC로부터의 용리액을 도시한다. 점선에 의해 표시된 용리액 분획을 SDS-PAGE 상에서 런닝시켰고 웨스턴 블롯 분석은 모노머의 존재를 보여주었다. 이 검정에 사용한 칼럼은 5 ml 부틸 4FF였고, 샘플 로딩은 1.5 M 황산암모늄의 첨가에 의해 250 ml로 조정되었으며; pH 7.4에서 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4로 용출하였다. 헤파린 칼럼 용출된 샘플로부터의 예시의 웨스턴 블롯 결과를 도 2b에 도시한다. 또 다른 예시의 방법에서, 프로토콜에 몇몇 조정이 이루어졌다. 1 L 배양에 대한 클론 스크린을 아래의 표 1에 나타낸 조건을 사용하여 실행시켰다:
Figure pct00002
위의 최적화 연구로부터, 고밀도 세포를 얻었다. 합성 배지 및 이. 콜라이 BL21 균주를 코돈 최적화된 FGF-1을 암호화하는 서열을 가진 pMKet 플라스미드로 형질전환하여 예상하지 못한 3 g/L FGF-1의 고수율을 얻었고, 이것은 표에서 나타낸 것과 같이, 다른 실험 변화보다 약 5-30배의 증가이다.
변형된 FGF-1을 제조하기 위한 예시의 방법에서, 수행한 단계는 다음과 같았다:
· 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 6 M 구아니딘, 0.1 M NaCl, pH 7.4에 가용화된 10 g의 제조된 IB
· 50 mM DTT의 첨가(2시간 동안)에 의한 hFGF의 환원
· 투석여과/한외여과를 통한 DTT의 제거
· 대략 1.0의 A280으로의 빠른 희석을 통한 재접힘(밤새 RF)
· 재접힘 완충액:
· I(RFB): 1 M 아르기닌, 50 mM Tris, 0.1 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 9.5
· II(RFD): 5 mM Tris, 2 mM 시스틴, 5 mM 시스테인, pH 9.0
· 침전을 제거하기 위한 원심분리
· 헤파린을 통한 포획을 위해: pH 조정 및 희석으로 농도를 <25 mS/cm로 감소시키고(필요하다면), 이어서 HIC(C4)에 의한 헤파린 용출액의 염 조정
· 칼럼: 헤파린 HiTrap HP(5 mL)
완충액:
I(평형/세척 I): PBS pH 7.0
II(세척 II): PBS + 0.6 M NaCl pH 7.0
III(용출): PBS + 1.2 M NaCl pH 7.0
구배: 0-100% 완충액 III(10CV)
유량: 5 mL/분
· HIC(C4)를 통한 포획을 위해: 1.5 M 황산암모늄까지 염 첨가, pH 7.4로 pH 조정.
재접힘 완충액 I 및 II를 사용한 경우의 각각의 용리액 프로파일을 도 3a 및 3b에 도시한다. 헤파린 HiTrap 후 상응하는 SDS-PAGE 이미지를 평가하였다(미도시). 이들 연구는 재접힘 완충액 1(RFB)을 사용하는 것이 재접힘 완충액 2(RFD)를 사용하는 것보다 상당히 더 나은 결과를 유도한 것을 나타냈다. RFD는 무거운 침전물을 생성하였다.
또 다른 예시의 연구에서, HIC를 사용하는 포획 스크리닝을 주변 온도에서 수행하였다. 다음의 과정을 사용하였다:
· 12 mM PO4, pH 7.0에 10 g의 세포 펠릿 재현탁
· HPH(2x 400 바, T < 25℃)를 통한 세포 용해
· 17500 x g, 30분, 8℃에서 원심분리
· 헤파린을 통한 포획을 위해: 50 mL 용해물 → pH 조정 → 로딩
· HIC(C4)를 통한 포획을 위해: 50 mL 용해물 → 1.5 M 황산암모늄까지 염 첨가, pH 7.4로 pH 조정 → 로딩.
용출된 부틸 HIC로부터의 분광 데이터를 도 3c(좌측)에 도시하며, 이후에 헤파린 칼럼에서 실행하여, 더 예리한 생성물 피크를 얻었다. 도 3c(우측).
또 다른 예시의 연구에서, 우레아 및 구아니딘 완충액에서의 가용화에 대한 비교가 이루어졌다. 봉입체(IB)의 세척이 있거나 없이 우레아 및 구아니딘에서의 IB의 가용화를 테스트하였다. 또한 IB 세척에 폴리소르베이트 20 또는 80의 사용을 테스트하였다. 결과는 PS20 및 PS80이 둘 다 비슷한 효과를 가졌음을 나타냈다. 가용화된 FGF의 순도는 두 세척 접근법 사이에서 비슷하였다. 가용화된 FGF의 수율은 두 계면활성제에 대해 비슷하였다.
예시의 방법에서, 클론을 미생물 발현을 위해 추가로 최적화한다. 새로운 구성물을 상이한 균주에 형질전환하여 성장시키고 FGF 생산성을 상이한 배지에서 테스트하였다. 각각의 구성물/균주 조합을 맞춤 합성 배지에서, 또는 2TY 배지에서 성장시켰다. 탄소원은 글리세롤 또는 글루코스였다. 2의 OD600까지 성장시킨 후, 배양을 1 mM IPTG로 유도하였다(c: 37℃에서 20시간 동안 발현; p: 26℃에서 20시간 동안 발현). 주변 세포질 구성물을 삼투압 충격으로 수행하였고 그런 후 초음파로 처리하여 세포를 파괴하여 개방시켰다. 주변 세포질 발현 및 세포질 발현을 위한 구성물을 다음과 같이 생성한다(표 2 및 표 3):
Figure pct00003
Figure pct00004
BL21 균주 및 W3110 균주에서 발현된 세포질 구성물과 BL21 균주 및 W3110 균주에서 발현된 주변 세포질 구성물의 비교를 수행하였다. 더불어, 모든 구성물을 사내에서 및 탄소원으로서 글루코스뿐만 아니라 글리세롤이 있는 2TY 배지에서 배양하였다. 2의 OD600까지 성장시킨 후, 배양을 1 mM IPTG로 유도하였다(세포질: 37℃에서 20시간 동안 발현; 주변 세포질: 26℃에서 20시간 동안 발현). 주변 세포질 구성물을 삼투압 충격으로 수행하였고 그런 후 초음파로 처리하여 세포를 파괴하여 개방시켰다.
pMKet 구성물은 프로모터가 없는 기존의 플라스미드, 또는 본원에 기술된 다른 변형보다 변형된 FGF-1 단백질의 미생물 발현의 경우 상당히 더 우수하였다.
또 다른 예시의 연구에서, 우레아를 재접힘 완충액에 사용하였고, PS 20을 계면활성제로서 사용하였다. 구아니딘을 변성에 사용하였다. 재접힘을 실온 및 2-8℃(이전에 개시된 재접힘 완충액)에서 수행하였다. 재접힘 후, 샘플을 스핀 칼럼을 사용하여 투석여과하여 DTT를 제거하였다. 각각의 RF 접근법을 높은 전도성으로 인해 희석하였다. 헤파린 칼럼을 5 ml HiTrap 헤파린으로, 완충액 A(평형): PBS, pH 7.0; 완충액 B(세척): PBS, 0.6 M NaCl, pH 7.0; 완충액 C(용출): PBS, 1.2 M NaCl, pH 7.0을 사용하여 설정하였다. 샘플을 각 단계 후에 취하여 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다. 설정을 아래의 표 4에서 요약한다:
Figure pct00005
표 5는 각각의 수율을 나타낸다:
Figure pct00006
단백질은 SDS-PAGE에서 분해되고, 정량화된 FGF-1 회수율을 도 4a-4b에 나타낸 데이터에 도시한다. 크기 배제 크로마토그래피를 Agilent Advance Bio SEC 300A, 기공 크기 2.7 μm를 사용하여 설정하였다. 런닝 완충액은 pH 7.4에서 0.5 M NaCl이 있는 PBS를 포함하였다. 유량을 0.75 mL/분으로 조정하였고, 20분 동안 실행시켰다. 흡광도를 A215 nm에서 관찰하였다. 각각의 SEC 피크를 각 실행에 대해 평가하였다. 재접힘 완충액 A 및 B는 변성 용액으로서 구아니딘을 포함한 과정에서 더 나은 결과를 보여주었다. 또한, IB 가용화를 위해 사용된 카오트로픽제는 재접힘 성능에 영향을 미치지 않았던 것으로 나타난다. 재접힘 완충액 C 및 D는 우레아가 사용되었을 때 A 및 B(저비용)보다 약간 더 낫다. 또한 재접힘은 4℃에서 약간 더 나았던 것으로 나타났다.
실시예 3: 벌크 의약 물질의 제조 조건
봉입체의 발효 및 일차 회수
예시의 연구는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2) 벌크 의약 물질(BDS)의 발효, 봉입체의 수득/회수, 정제, 분리 및 테스트를 포함한다. TTHX1114 BDS의 cGMP 제조를 서열 번호: 2의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 발현을 위한 핵산 서열을 포함하는 이. 콜라이 BL21 pMKet의 마스터 세포 배치(MCB)를 사용하여 수행하였다.
MCB를 함유하는 해동된 바이알의 내용물을 혼합하여 사전 배양을 위한 합성 배지: 5.2　g/L (NH4)2SO4, 4.4　g/L NaH2PO4 x 2 H2O, 4.0　g/L KCl, 5.3　g/L 시트르산 x H2O, 1.3　g/L Na2HPO4 x 2 H2O, 0.5 g/L NaCl, 1　g/L MgSO4 x 7 H2O, 0.3　g/L CaCl2 x 2 H2O, 0.1　g/L FeCl3 x 6 H2O, 1 x TES(21 mg/L ZnSO4 x 7H2O, 24 mg/L MnSO4 x H2O, 8 mg/L CuSO4 x 5　H2O, 4 mg/L CoSO4 x 7H2O, 0.3 mg/L H3BO3, 0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O), 글리세롤 10　g/L, 50 mg/L의 카나마이신, 10 g/L 박토 효모 추출물 및 16 g/L 파이톤 펩톤을 함유한 종자 플라스크를 접종하는데 사용하였다. 접종된 종자 플라스크를 배양이 약 2-5의 OD에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다.
주 배양을 150 L 생물 반응기에서 50 L의 출발 부피의 배양 배지(30 g/L 글리세롤, 5.2 g/L (NH4)2SO4; 4.4 g/L NaH2PO4 x 2H2O; 4.0 g/L KCl; 5.3 g/L 시트르산 x H2O; 1.3 g/L Na2HPO4 x 2H2O; 0.5 g/L NaCl; 1.0 g/L MgSO4 x 7H2O; 0.3 g/L CaCl2 x 2H2O; 0.1 g/L FeCl3 x 6H2O; 1 x TES(21 mg/L ZnSO4 x 7H2O, 24 mg/L MnSO4 x H2O, 8 mg/L CuSO4 x 5H2O, 4 mg/L CoSO4 x 7H2O, 0.3 mg/L H3BO3, 0.2 mg/L Na2MoO4 x 2H2O), 1 mL/L 소포제, 10 g/L 박토 효모 추출물 및 16 g/L 파이톤 펩톤)로 수행하였다. 주 배양을 500 mL의 사전 배양으로 접종한 후 37℃에서 pH 6.8에서 산소 제한 없이 인큐베이션하였다. pH를 25% 수산화 암모늄 및 1 M 인산의 첨가에 의해 조절하였다. pO2-피크로 표시되는, 배양 배지에서 초기 양의 글리세롤(30 g/L)이 소비된 후, 2.333 kg/시간의 공급 속도로 45% 수성 글리세롤의 일정한 공급을 시작하였다. 공급을 시작하고 대략 10시간 후, 아이소프로필-β-D-1티오갈락토피라노시드(IPTG)의 1 mM의 최종 농도까지의 첨가에 의해 생성물 형성을 유도하였고 글리세롤 공급의 첨가 속도를 낮추었다(0.973 kg/시간의 공급 속도로 45% 수성 글리세롤). 유도로부터 수득까지의 시간을 유도 단계 또는 생성물 형성 단계로 불렀다.
유도 단계를 발효기 배지를 약 18 ± 2℃로 냉각시킴으로써 중단하고 현미경 분석을 위해 샘플을 취하였다. 바이오매스를 원심분리(40 내지 100 L/시간의 유량에서 8 L 보울로 연속 CEPA 원심분리)에 의해 회수하고 18℃ ± 2℃로 냉각시키면서 18,000 x g에서 원심분리하였다. 세포 페이스트를 세포 파괴 완충액(48 mM Tris, 2 mM EDTA, 96 mM NaCl, pH 7.4)에 ≤15℃에서 재현탁하고 재현탁된 세포를 2 주기의 950 ± 50 바에서의 고압 균질화(SPX 균질화기)에 의해 파괴하였다. 균질화 단계 중에 생성물 함유 용액을 계속해서 냉각시켰다.
세포 파괴 후, 봉입체(IB)를 이전과 같이 원심분리에 의해 회수하고 가용성 불순물을 상이한 완충액을 사용하여 5회 연속 세척 주기에 의해 세척하였다(200 L 교반 탱크): 세척 1 및 2, 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 0.2% 폴리소르베이트 80, pH 7.4; 세척 3 및 4, 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 2% 폴리소르베이트 80, 20 mM DTT, pH　7.4; 세척 5, 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM DTT, pH 7.4. 세척을 완료한 후, 봉입체를 ≤-60℃에서 보관하였다.
봉입체의 가용화 및 재접힘
가용화 및 추가의 처리를 위해, 절반의 세척된 봉입체(약 1 kg)를 보관소로부터 꺼내어 2-8℃에서 해동하였다(1-3일). IB를 총 25 L의 가용화 완충액(50 mM Tris, 2 mM EDTA, 6 M 구아니딘, 100 mM NaCl, pH 7.4)에 재현탁하였다. ULTRA-TURRAX(IKA)를 5 000 내지 8 000 rpm에서 8 - 10분 동안 S50N-G45G 프로브와 함께 이어서 7 000 내지 10 000 rpm에서 추가로 8 - 10분 동안 S50N-G45F 프로브와 함께 사용하고 최종적으로 60분 동안 교반을 실시하여 분산을 달성하였다. IB의 재현탁 후, DTT를 50 mM의 최종 농도로 첨가하고 이황화 결합을 15시간 동안 티올로 환원시켰다. 그런 후 DTT를 Pall Centrasette 시스템(PES 막이 있는 10 kDa Sartocon, Sartorius Stedim Biotech, Part #3021463907E)을 사용하여 한외여과를 통해 다시 제거하였다. 그런 후 생성물을 550　L의 재접힘 완충액(1 M 아르기닌 염산염, 0.1 M NaCl, 5 mM EDTA, 30 mM NaOH, 1 mM GSSG; 5 mM GSH, pH 7.4)에 서서히 첨가하고 9시간 동안 인큐베이션한다. 마지막으로, 생성물을 깊이 여과에 의해 정화하고 후속해서 0.2 μm 바이오버든 감소 멤브레인(Sartopore 2 XLG 캡슐; 0.8/0.2 μm 보유율; PES로 만들어진 필터 멤브레인, Sartorius Stedim Biotech, Part #5445307G)을 통해 500 L 백으로 여과한다.
변형된 FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2)를 함유하는 여과된 다시 접힌 단백질 용액을 후속해서, 아래에서 기술되는 것과 같이, 추가의 하류 처리에 사용하였다.
벌크 의약 물질의 크로마토그래피 정제 및 충전
다시 접힌 FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2)를 결합을 확실하게 하기 위해 물로 1:1 희석한 후 Capto DeVirs(Cytiva, BPG 300x500, Part#17-5466)로 패킹된 칼럼(15.6 L 부피)을 사용하여 포획하였다. 칼럼을 실온에서 21.2 - 179.9 L/시간 런의 유량으로, 0% 내지 100% 완충액 1B(완충액 1A의 100% 내지 0%에 상응함)로부터의 선형 구배로 용출하였다. 용출 후에, 칼럼을 5 CV에 걸쳐 100% 완충액 1B에서 유지하였다. 완충액 1B= 78.13 g/L 염화나트륨; 0.20 g/L 염화칼륨; 1.78 g/L 인산수소이나트륨 이수화물; 0.27 g/L 인산이수소칼륨; pH　7.4(100% 내지 0% 완충액 1A: 8.00 g/L 염화나트륨; 0.20 g/L 염화칼륨; 1.78 g/L 인산수소이나트륨 이수화물; 0.27 g/L 인산이수소칼륨; pH　7.4에 상응함). 완충액 1A = 8.00 g/L 염화나트륨; 0.20 g/L 염화칼륨; 1.78 g/L 인산수소이나트륨 이수화물; 0.27 g/L 인산이수소칼륨; pH 7.4. 완충액 1B is 78.13 g/L 염화나트륨; 0.20 g/L 염화칼륨; 1.78 g/L 인산수소이나트륨 이수화물; 0.27 g/L 인산이수소칼륨; pH 7.4.
용출액을 단일 분획으로 수집하였다. 수집한 용출액을 0.2 μm 필터(Sartopore 2 XLG Art. No.: 5445307G8)로 여과하고 15-25℃에서 24시간 미만 동안 보관하였다. Capto DeVirs 칼럼을 사용하는 포획 단계 후의 수율은 약 1.74 g/L용출액의 농도에서 대략 120 g의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2)였다.
이 칼럼 단계 후에, 생성물을 황산암모늄(1.0 M 최종 농도) 및 염화나트륨(2.5 M 최종 농도)의 첨가에 의해 연마에 대해 조건화하였다. 연마를 부틸 세파로스 4FF(Cytiva, BPG 300x500, Part#17-0980)로 패킹되고 20 mM 인산수소이나트륨 이수화물; pH 7.4로 평형화된 칼럼(10.6 L 부피)을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 달성하였다. 칼럼을 3상 부피의 동일한 완충액으로 세척하였다. 생성물을 10 CV에 걸쳐 실온에서 51.3 L/시간 실행의 유량으로 0% 내지 100% 완충액 2B(100% 내지 0% 완충액 2A에 상응함)로부터의 선형 구배로 용출하였다. 완충액 2A = 20 mM 인산수소이나트륨 이수화물; pH 7.4 및 완충액 2B = 2.5 M 염화나트륨, 1 M 황산암모늄, 20 mM 인산수소이나트륨 이수화물, pH 7.4. 용출액을 Stedim 백(1 x 50 L)으로 옮겼다. 연마 단계 후 수율은 3 g/L의 농도의 약 92 g의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2)였다. 부틸 세파로스 FF 칼럼을 사용하는 연마 단계에서의 수율은 대략 50%였고, 연마 단계에 헤파린 수지를 사용함으로써 얻어진 대략 20%의 수율에 비교하여 상당히 개선되었다.
위의 방법에 따라 정제된 벌크 의약 물질(BDS)을 부틸 세파로스 FF 칼럼의 용출 완충액 중의 용액으로서 보관하였다. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2)는 구배로 용출되는 것으로 관찰되었고, 따라서 완충액은 정확한 조성물을 갖지 않지만 pH 7.4에서 대략 800 mM 염화나트륨, 320 mM 황산암모늄 및 20 mM 인산수소이나트륨 이수화물을 함유하였다.
정제된 BDS를 연동 펌프를 사용하여 제2 Stedim 멸균 백으로 여과하였다(Millipak 100 감마 골드, 0.22 μm, Merk, Part # MPGL1GCF3). 위에서 기술된 과정으로부터 벌크 의약 물질의 전체 수율은 50 L 배양으로부터 약 82 g이었다.
위에서 제조된 의약 물질의 충전을 여과된 단백질 용액을 고밀도 폴리에틸렌 스크류 캡이 있는, 감마-멸균되고, 발열원이 없는 폴리에틸렌 병으로 무균적으로 분배함으로써 수행하였다. 벌크 의약 물질의 분취액을 약 -60℃ ± 10℃의 온도에서 보관하였다.
실시예 4: 약학 제제
서열 번호: 2의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포함하는 약학 제제의 상이한 변화를 평가하기 위한 예시의 일반화된 연구는, 최적화된 안정성 및 감소된 분해 경향의 약학 제제를 확인하기 위하여, 2개의 상이한 계면활성제 조건에 걸쳐 3개의 상이한 pH 값에서 10 mM 대비 1 mM 히스티딘 완충액의 비교를 포함하였다. 안정성을 확장된 육안 검사, 크기 배제 HPLC(SE-HPLC), 플로우캠(FlowCam) 분석과 같은 두 가지 방법에 의해 측정하였다. 육안 검사를 흑백 배경에 대해 백색 광원(13 W 형광 튜브) 하에 수행하였다. 매 시점에서 모든 제제의 디지털 사진을 획득하였다. 플로우캠 입자 이미징 시스템은 입자의 자동 분석을 위해 광학, 전자학, 및 유체 공학을 조합한다. 광학 시스템을 입자가 유동 셀을 통과함에 따라 유체에서 입자의 실시간 이미지를 포착하기 위해 사용한다. 이미징 소프트웨어는 입자 크기 및 형태를 평가하는 능력을 제공한다. 모든 샘플을 75 토르에서 30분 동안 탈기한 후 깔끔하게 분석하였다.
예를 들어, 확장된 육안 검사 방법을 사용하여 약물 침전을 관찰하였고 SE-HPLC 분석을 사용하여 약물 분해 및 고분자량(HMW) 종 형성을 관찰하였다. 약학 제제의 제조 후에, 최종 제제를 실온(대략 20℃)에서 덮개가 있는 튜브 랙에서 벤치탑에 보관하였다. 육안 검사 및 SE-HPLC 분석을 제조 후 0, 5, 14, 28, 및 59일차에 수행하였다.
예시의 연구에서, 6.5를 초과하는 pH인 경우 샘플에서 제조 후 곧 가시적인 침전이 발생한다. 히스티딘 농도와 무관하게, 5.8의 pH를 가진 샘플이 용액으로 약물을 유지하는 데 더 우수하고 입자는 제조 후 59일이 될 때까지 10 mM 히스티딘 완충액에서 볼 수 없으며, 28일 째에 1 mM 히스티딘 완충액에서 단 하나의 부유 입자가 관찰된다. 모든 PS20 제제는 SE-HPLC에 의해 5일 째에 모두 PS80 대응물보다 더 낮게 회수되기 때문에 5일 후에 검사하지 않는다.
2 라운드의 계면활성제 스크리닝을 수행하였다. 제1 라운드에서, 약 0.1 mg/mL(100 μg/mL) 농도의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2)를 pH 6에서 10 mM 시트레이트, 300 mM NaCl에서 제제화하였다. 다양한 계면활성제를 테스트하였다 - 그리고 FGF-1 제제를 계면활성제 스톡 용액으로 스파이크하여 다음과 같이 최종 농도를 얻었다: 0.1%(중량/부피) 틸록사폴, 0.01%(중량/부피) 폴리소르베이트 80(PS80), 및 0.1%(중량/부피) 폴록사머 188(F-68). 계면활성제가 없는 FGF-1 제제를 대조군으로서 사용하였다. 별도의 라운드의 계면활성제 스크리닝에서, FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2)를 1.046 M NaCl, 0.419 M 황산암모늄, 20 mM 인산수소이나트륨 이수화물, pH 7.4(부틸 용출액) 중의 약 0.25 mg/mL(250 μg/mL)의 농도로 제제화하였다. 제2 라운드의 계면활성제 스크린의 경우, 10 mM 시트레이트 및 300 mM NaCl 또는 부틸 용출액 제제를 함유한 제제의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2)를 다양한 제제로 투석하였고(표 6 참고) 투석 후 의약 물질의 농도는 각각의 제제 완충액에서 0.25 mg/mL로부터 약 0.1 mg/mL로 감소하였고 Crystal Zenith 바이알을 약 1.25 mL의 부피로 채웠다. 다음의 표는 계면활성제 스크린 라운드 2에 대한 상세한 내용을 제공한다.
Figure pct00007
각각의 제제로부터의 샘플 바이알을 주변 온도에서 1000 rpm에서 약 4시간 동안 진탕기 상에서 교반 스트레스에 대해 테스트하였고 동일한 제제의 바이알을 스트레스를 받지 않은 정적 대조군(주변 온도에서 4시간 동안 보관됨)으로서 사용하였다. 4시간 교반 스트레스 후에, 스트레스를 받은 샘플은 5회 주기의 냉동 및 해동을 적용하였다(냉동낼 때까지 -20℃에서 보관한 후, 해동될 때까지 주변 온도에 놓아둠). 스트레스를 받지 않은 샘플을 냉동-해동 주기 기간 동안 5℃에서 보관하였다. 교반 및 냉동-해동 스트레스가 끝난 후에, 샘플을 육안 검사 및 플로우캠에 의해 분석하였다.
제1 라운드의 계면활성제 스크리닝의 경우, 계면활성제가 있거나 없는 모든 정적 샘플은 투명하고, 무색이었으며, 소수의 미세한 미립자를 나타냈다. 교반 및 냉동-해동 주기를 겪은, 계면활성제가 없는 샘플은 약간 불투명한 것으로 여겨지며 많은 미세한 입자를 함유하였다. 0.1% 틸록사폴 또는 0.1% F-68을 함유한 샘플은 투명하고, 무색이었으며, 교반 및 냉동-해동 주기시 백색의 얇게 벗겨지는 침전물을 나타냈다. 한편 0.01% PS80을 함유한 스트레스를 받은 샘플은 투명하고 무색이었으며 많은 미세한 입자를 가졌다. 플로우캠 분석에서, 모든 정적 샘플은 적당한 차감된 미세한 입자 수를 나타냈다. 0.1% F-68을 함유한 교반된 샘플은 다른 계면활성제 조건의 교반된 샘플과 비교하여 가장 낮은 입자 수를 나타냈다. 그러나, 스트레스를 받은 F-68 샘플은 여전히 미세한 입자의 유의미한 증가를 보였다. 계면활성제가 없는 교반 및 냉동-해동 샘플은 최고의 미세한 입자 농도를 생성하였다.
제2 라운드의 계면활성제 스크리닝의 경우, 계면활성제가 없는 모든 정적 샘플은 투명하고, 무색이었으며, 소수의 가시적인 입자를 나타냈다. 새로운 DS(부틸 용출액) 소르비톨 샘플은 외관상 다른 샘플보다 더 투명하였고 용액에서 많은 미세 기포를 나타냈다. NaCl 및 0.1% PS20이 있는 새로운 DS(부틸 용출액)를 제외하고, PS20을 함유한 모든 정적 샘플은 투명하고, 무색이었으며, 가시적인 입자가 없었다. 0.1% PS20을 함유한 새로운 DS NaCl 샘플은 투명하고, 무색이었으며, 소수의 가시적인 입자를 나타냈다. 소르비톨을 함유한 교반된 샘플은 일반적으로 투명하고, 무색이었으며, 소수의 가시적인 입자를 나타냈다. NaCl을 함유한 교반된 샘플은 일반적으로 외관상 약간 불투명하였고 가시적인 입자를 나타냈다.
PS80을 함유한 모든 정적 샘플은 투명하고, 무색이었으며, 일반적으로 가시적인 입자가 없었다. 소르비톨을 함유한 교반된 샘플은 일반적으로 투명하고, 무색이었으며, 소수의 가시적인 입자를 나타냈다. NaCl을 함유한 교반된 샘플은 일반적으로 외관상 약간 불투명하였고 가시적인 입자를 나타냈다. F-68을 함유한 모든 정적 샘플은 투명하고, 무색이었으며, 가시적인 입자가 없었다. F-68을 함유한 모든 교반된 샘플은 투명하고, 무색이었으며, 소수의 가시적인 입자를 나타냈다. 제2 라운드의 계면활성제 스크리닝 후 플로우캠 분석과 관련하여 - 소르비톨을 가진 제제는 일반적으로 NaCl이 있는 제제에 비해 더 낮은 차감된 미세한 입자 농도를 나타냈다. 새로운 의약 물질(부틸 용출액)은 스트레스 후에, 모든 계면활성제 조건 전체에서, 제제와 관계 없이(소르비톨 대비 NaCl) 이전의 의약 물질(시트레이트 제제)과 비교하여 상당히 더 낮은 미세한 입자 농도를 나타냈다. 전체적으로, 0.10% PS80을 함유한 소르비톨 제제 중의 새로운 DS(부틸 용출액)가 스트레스 후에 미세한 입자 함량의 가장 적은 양의 변화를 나타냈다.
SE-HPLC 분석에서, 소르비톨 제제 중의 새로운 DS(부틸 용출액) 및 0.05% 또는 0.1% PS80이 정적 및 스트레스 조건 하에서 비슷한 프로파일을 나타냈다. 0.05% 또는 0.10% PS80이 있는 소르비톨 제제 중의 모든 새로운 DS(부틸 용출액) 샘플은 2개의 HMW 종(HMW 피크 1의 경우 약 0.5%, HMW 피크 2의 경우 7.8-8%, 및 주 피크의 경우 약 약 91.6-91.8%의 % 면적)을 나타낸 소르비톨 및 PS20을 함유한 새로운 DS(부틸 용출액) 샘플과 비교하여 하나의 HMW 피크(피크 1의 경우 약 7% 및 주 피크의 경우 92-93%의 % 면적)를 나타냈다.
가속화된 안정성 연구를 서열 번호: 2의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드에 대한 다양한 약학 제제로 후속해서 수행하였다. 가속화된 안정성 연구는 5개의 상이한 보관 온도에서 보관되면서 8주에 걸쳐 다양한 검정에 의해 제제를 평가하였다. 데이터를 초기 시점(0 시간), 급성 스트레스시, 및 최종 시점(40℃의 경우 T=2주 및 모든 다른 온도의 경우 T=8주)에 수집하였다. pH 변화 연구를 또한 약학 제제 평가 및 최적화 연구의 일부로서 수행하였다. 가속화된 안정성 연구로부터의 결론은 낮은 pH가 히스티딘/폴리소르베이트/소르비톨 제제에 서열 번호: 2의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포함하는 약학 제제에 최적이라는 것이었고 이것은 육안 검사, 플로우캠 분석, 및 SE-HPLC에 의해 두 가지 방법으로 지지되었다. SE-HPLC에서, 예를 들어, 주 피크는 낮은 pH 샘플에서 더 높았고, 이것은 낮은 pH 수준에서 더 적은 응집 및/또는 분해가 있고, 더 많은 온전한 모노머가 검출되도록 하는 것을 나타낸다. 반면, 더 높은 pH 수준의 샘플은 각 시점에서 낮은 pH에서의 샘플보다 가용성 응집체의 백분율이 더 높았다. 시간 경과에 따른 HMW 종의 이들 증가는 또한 pH가 증가함에 따라 악화되는 것으로 보인다. 달리 말하면, 시간 경과에 따라 pH와 HMW 종 존재 사이에 양의 상관관계가 관찰되었다.
추가의 연구에서, 제제 중의 히스티딘의 농도는 10 mM에서 1 mM로 감소되었고 HMW 피크 면적 백분율에 미치는 그런 변화의 영향은 SE-HPLC를 사용하여 평가하였다. 표 8에서 제공되는 것과 같이, pH 5.8에서의 제제는 히스티딘 농도와 관계 없이, 6.0보다 큰 pH에서의 제제와 비교하여 더 낮은 HMW 피크를 입증하였다.
두 상이한 계면활성제 조건에 걸쳐 3개의 상이한 pH 값에서의 후보 제제, 예컨대, 10 대비 1 mM 히스티딘 완충액의 상이한 변화를 비교하였다(표 7). 비교된 파라미터는 pH가 10과 반대로 여전히 1 mM 히스티딘 완충액에서 제어되는지를 측정하기 위해 선택하였다. 이들 제제를 비교하는 일차 목표는 유망한 후보 제제, 및/또는 임의의 이의 변이체가 실온에서 100(±20%) μg/mL TTHX1114 제제에 대해 최대 1개월의 적합한 안정성을 제공했는지를 추론하는 것이었다. 두 번째로, 히스티딘 농도가 저하되고/거나 pH가 약간 상승한 변화에서, 이들 조정이 적용시 잠재적으로 보다 진정적인(soothing) 점안제로 이어질 수 있기 때문에 동일한 정도의 안정성이 달성될 수 있는지를 학습하는 것이 바람직하였다.
Figure pct00008
안정성을 (i) 약물 침전을 관찰하기 위한 확장된 육안 검사 방법 및 (ii) 약물 분해 및 HMW 종 형성을 관찰하기 위한 SE-HPLC 분석에 의해 측정하였다. 제조 후, 최종 제제를 실온(대략 20℃)의 덮개가 있는 튜브 랙에서 벤치탑에 보관하였다. 육안 검사 및 SE-HPLC 분석을 제조 후 0, 5, 14, 28, 및 59일차에 수행하였다. 특정 시점에 잘 수행되지 않은 제제를 후속 시점에 분석으로부터 배제하였다. 추가적으로, pH를 남아 있는 제제에서 59일 째에 다시 측정하여 연구 과정 동안 이동이 발생하지 않았음을 확실하게 하였다.
희석제 및 스톡 용액 제조
L-히스티딘이 없는 2개의 기본 희석제를 제조하였다: 희석제 A(0.2% PS80/10% 소르비톨)를 PS80 및 소르비톨을 탈이온(DI) H2O에 용해시킴으로써 제조하였다. 이것을 DI H2O로 500 mL로 희석한 후 0.2 μm 폴리에테르설폰(PES) 막 진공 필터 유닛을 통해 여과하였다. 제2 기본 희석제는 희석제 B(0.2% PS20/10% 소르비톨)였고 PS20 및 소르비톨을 DI H2O에 용해시킴으로써 제조하였다. 이것을 DI H2O로 500 mL로 희석한 후 0.2 μm PES 막 진공 필터 유닛을 통해 여과하였다.
기본 희석제를 제조한 후, 투석 완충액의 2개의 상이한 농축 스톡 용액을 제조하였다. 스톡 A(9.29 mM 히스티딘/ 0.929% PS80/ 46.43% 소르비톨)를 소르비톨, PS80, 및 L-히스티딘을 DI H2O에 첨가하고 용해시킴으로써 제조하였다. 이것을 DI H2O로 3.5 L로 희석하고 이중 2 L를 병뚜껑 0.2 μm PES 막 진공 필터를 통해 멸균된 2 L 병으로 여과하였다. 스톡 B(9.18 mM 히스티딘/ 0.909% PS20/ 45.45% 소르비톨)를 소르비톨, PS80, 및 L-히스티딘을 DI H2O에 첨가하고 용해시킴으로써 제조하였다. 이것을 DI H2O로 2750 mL로 희석하고 이중 2 L를 병뚜껑 0.2 μm PES 막 진공 필터를 통해 별도의 멸균된 2 L 병으로 여과하였다.
변형된 FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2) 분취액을 -70℃ 냉동고의 보관소로부터 꺼낸 후 1시간 동안 실온에서 해동되도록 하면서 스톡 용액을 원하는 1x 농도의 투석 완충액으로 희석하였다: 2 mM 히스티딘/0.2% 폴리소르베이트 80 또는 20/10% 소르비톨. 해동된 샘플을 잘 섞고 O.D를 280 nm에서 측정하였다. 투석을 실온(RT)에서 1:100 비율의 샘플 대 투석 완충액(30 mL의 샘플: 3000 m의 투석 완충액) 및 2회의 후속 완충액 교환으로 수행하였다. 제1 교환을 시작 시간 후 2시간 후에 수행하였고, 제2 교환을 시작 시간 후 4시간 후에 수행하였다. 제2 교환 후, 샘플을 밤새 실온에서(13시간 이상) 투석되도록 하였다. 그런 후 TTHX114가 2 mM 히스티딘/ 0.2% PS80 또는 20/ 10% 소르비톨에서 제제화되었다.
두 투석 샘플을 두 부분으로 나누었다(2A.1 + 2A.2 및 2B.1 + 2B.2). 2A/B.1 용액에, 10x, 180 mM, 히스티딘이 보충된 희석제 A 또는 B를 첨가함으로써 히스티딘 농도를 20 mM로 증가시켰다. 이들 10x 히스티딘 용액을 40 mL의 희석제 A 및 B 각각에 1.117 g의 L-히스티딘을 첨가함으로써 제조하였다.
용액 2A.1의 경우, 희석제 A 용액 중의 1.6 mL의 10x 히스티딘을 14.4 mL의 투석된 샘플에 첨가하였다. 용액 2B.1의 경우, 희석제 B 중의 1.8 mL의 10x 히스티딘을 14.6 mL의 투석된 샘플에 첨가한 후 1.6 mL의 희석제 B를 첨가하였다. 2A.1 및 2B.1 용액에서 히스티딘 농도를 최대 20 mM로 상승시킨 것 외에, 이들 희석은 또한 그런 부분에서 TTHX1114 농도를 200 μg/mL로 상승시켰다. 투석된 두 샘플(2A/B.2 용액)의 다른 부분을 2 mM 히스티딘이 보충되어 있는 희석제 A 또는 B로 200 μg/mL TTHX1114로 간단하게 희석하였다(180 mM 용액을 각각의 희석제로 1:90으로 희석함으로써 제조됨). 2A.1 + 2A.2 및 2B.1 + 2B.2는 모든 구성요소에서 2x이다. 샘플을 0.2 μm 셀룰로스 아세테이트 주사기 필터를 통해 여과하였다. 미립자 현탁액에 대한 육안 검사를 실시하였고 0-3의 척도 및 >3의 단일 순위로 순위를 매겼으며, 여기서 0은 가시적인 현탁된 미립자가 없는 것을 의미한다.
결과: 히스티딘 농도와 관계 없이, pH 5.8 샘플은 용액으로 약물을 유지하는데 더 우수하였고 입자는 제조 후 59일까지 10 mM 히스티딘 완충액에서 볼 수 없었으며, 28일 째에 1 mM 히스티딘 완충액에서 단 하나의 부유 입자를 관찰하였다. SE-HPLC에 의해 5일 째에 모두 PS80 대응물보다 더 낮게 회수되기 때문에 모든 PS20 제제를 5일 후에 검사하지 않았다. 대표적인 SE-HPLC 피크를 도 7에 도시한다.
Figure pct00009
pH 유지
0일에 필수 pH를 조정한 후(표 6 참고) pH를 다시 59일 째에 평가하여 제제의 pH에 이동이 없었음을 확실하게 하였다. 두 히스티딘 농도 샘플은 연구 과정 동안 pH를 잘 유지하였고 유의미한 이동은 관찰되지 않았다.
Figure pct00010
전체적으로, 연구는 약물 생성물(서열 번호: 2의 FGF-1 폴리펩타이드)이 실온에서 적어도 28일 동안 안정적인 제제를 설명하였다. 최적화된 제제는 연장된 시간 동안 가시적인 미립자의 결여, SE-HPLC에 의한 거의 일정한 주 피크 면적, SE-HPLC에 의한 시간 경과에 따른 가용성 응집체의 낮은 백분율, 및 시간 경과에 따른 pH의 제어로 인한 pH 5.8의 10 mM 히스티딘/0.1% PS80/5% 소르비톨 제제이다. 유사한 경향을 1 mM 히스티딘/ 0.1% PS80/ 5% 소르비톨을 함유한 제제에 대해 관찰하였고 약물 생성물(서열 번호: 2의 FGF-1 폴리펩타이드)이 적어도 59일 동안 안정적인 것으로 밝혀진 또 다른 제제를 만들었다.
실시예 5. 변형된 인간 FGF-1의 플라스미드, 클로닝 및 발현
이 실시예는 박테리아에서 변형된 FGF-1 폴리펩타이드(서열 번호: 2)의 제조를 기술한다. 이. 콜라이(BL21 유능한 세포)에서 조작된(변형된) 인간 FGF-1(TTHX1114)의 발현을 허용하기 위하여 표적 단백질의 암호화 서열을 코돈 용법, 전사 및 번역 효율 및 mRNA 안정성을 포함하여 이. 콜라이 발현에 대해 최적화하고 GenScript에 의해 드노보 합성하고 발현 플라스미드에 하위클로닝하였다. 선택된 플라스미드 TTHX1114_pMKet에 대한 플라스미드 지도를 도 6에 도시한다. 설계된 구성물은 임의의 말단 융합이 없는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 유전자 정보를 암호화한다.
변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 주변 세포질 축적을 위해, 성숙한 단백질을 외막 단백질의 리더 펩타이드(ompA, oA)에 의해 N-말단에서 융합시켰다. 이 리더 서열은 전구단백질의 주변 세포질 공간으로의 전좌에 필요하며, 번역 후에 신호 펩티다제 I(SP-1)을 통해 절단된다. 플라스미드는 카나마이신 내성을 부여하는 서열을 가진다. 삽입물을 플라스미드 백본 TTHX1114_pMKet에 하위클로닝하였다. 주변 세포질 구성물을 pMKet 백본(플라스미드 명칭: oA-TTHX1114_pMKet)에 하위클로닝하였다. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 발현을 IPTG 의존성 프로모터인 Tac 프로모터에 의해 제어하였다.
스크리닝 후, 예컨대, 샤페론의 바이시스트로닉 공동 발현을 허용하기 위한 추가 서열의 변형된 FGF-1 ORF의 하류로의 삽입을 확실하게 하기 위하여 주변 세포질 구성물을 설계하였다(조작된 hFGF-1에 대한 예시의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열에서 2개의 중단 코돈(밑줄)과 BamHI 제한 부위(이탤릭체) 사이의 서열을 아래에 제공한다(길이: 438 bp, 플랭킹 부위 포함함):
Figure pct00011
주변 세포질 축적을 위한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 예시의 서열을 아래에 제공한다:
Figure pct00012
전좌 후, 서열 번호: 2의 성숙한 FGF-1 폴리펩타이드가 생성되었다.
구현예
구현예 1은
(a) 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호: 1에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드; 및
(b) L-메티오닌
을 포함하는 제제를 제공한다.
구현예 2는 제제가 안내 전달을 위한 주사용 제제인 것인 구현예 1의 제제를 제공한다.
구현예 3은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 위치한 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 것인 구현예 1의 제제를 제공한다.
구현예 4는 폴리펩타이드가 N-말단 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한 연장 펩타이드를 추가로 포함하는 것인 구현예 1의 제제를 제공한다.
구현예 5는 연장 펩타이드가 서열 번호: 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 서열 번호: 4-8에 제시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 구현예 4의 제제를 제공한다.
구현예 6은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 폴리펩타이드의 성숙한 형태인 것인 구현예 1-5 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 7은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 14-18로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 1-6 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 8은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 24-28로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 1-6 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 9는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 93-117로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 1-6 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 10은 폴리펩타이드가 연장 펩타이드에 대해 N-말단의 메티오닌 잔기를 추가로 포함하는 것인 구현예 1-6 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 11은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 118-141로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 1-6 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 12는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 136개 아미노산을 포함하는 형태로 발현되는 것인 구현예 1-11 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 13은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 성숙한 형태의 적어도 141개 아미노산을 포함하는 것인 구현예 1-11 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 14는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 1의 위치 67에 돌연변이를 포함하는 것인 구현예 1-13 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 15는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단을 추가로 포함하는 것인 구현예 1-14 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 16은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 146-149로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 1-15 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 17은 폴리펩타이드가 서열 번호: 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 연장 펩타이드를 추가로 포함하는 것인 구현예 1-16 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 18은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 174-204로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 1-16 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 19는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 2, 또는 서열 번호: 205에 제시된 서열을 포함하는 것인 구현예 1-18 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 20은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 폴리펩타이드의 성숙한 형태인 것인 구현예 19의 제제를 제공한다.
구현예 21은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 구현예 1-20 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 22는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 1의 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 Lys12Val, Cys16Ser, Ala66Cys, Cys117Val, 및 Pro134Val로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 펩타이드 ALTEK의 적어도 하나의 잔기를 추가로 포함하는 것인 구현예 1-20 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 23은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 1의 다음의 돌연변이: Cys16Ser, Ala66Cys, 및 Cys117Val을 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 위치한 메티오닌 잔기, 및 N-말단 메티오닌과 서열 번호: 1의 위치 1 사이에 위치한 펩타이드 ALTEK의 적어도 하나의 잔기를 포함하는 것인 구현예 1-22 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 24는 제제가 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 것인 구현예 1의 제제를 제공한다.
구현예 25는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 제제에서 95% 이상 순수한 모노머 형태인 것인 구현예 1의 제제를 제공한다.
구현예 26은
a. 적어도 약 50 mM 이염기성 인산나트륨 이수화물;
b. 적어도 약 100 mM 염화나트륨;
c. 적어도 약 10 mM 황산암모늄;
d. 적어도 약 0.1 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA);
e. 적어도 약 5 mM L-메티오닌, 및
f. 적어도 약 0.01% 폴리소르베이트 80(중량/부피)
중 적어도 하나를 추가로 포함하는 것인 구현예 25의 제제를 제공한다.
구현예 27은 제제가 적어도 약 0.01 mM 내지 약 10 mM인 EDTA의 농도의 EDTA를 포함하는 것인 구현예 26의 제제를 제공한다.
구현예 28은 제제가 황산암모늄을 포함하고, 황산암모늄의 농도는 적어도 약 0.01 mM 내지 약 100 mM인 것인 구현예 26의 제제를 제공한다.
구현예 29는 제제가 적어도 약 0.01 mM 내지 약 100 mM의 L-메티오닌을 포함하는 것인 구현예 26의 제제를 제공한다.
구현예 30은 변형된 FGF-1이 푹스 이영양증, 수포성 각막병증, 헤르페스 각막병증, 선천성 유전성 내피 이영양증 1, 선천성 유전성 내피 이영양증 2, 후방 다형 각막 이영양증, 안구 건조증, 원추 각막, 격자 각막 이영양증, 과립형 각막 이영양증, 황반 각막 이영양증, 슈나이더 결정 각막 이영양증, 선천성 간질 각막 이영양증, 반점 각막 이영양증, 각막 손상, 안구 손상, 화학적 손상, 발포성 손상, 간질 손상 및 머스터드 가스 각막병증으로 이루어지는 목록으로부터 선택된 하나 이상의 질환, 장애, 또는 병태를 치료하기에 적합한 농도로 존재하는 것인 구현예 1의 제제를 제공한다.
구현예 31은 제제가 전방내로 투여되는 것인 구현예 1 또는 30의 제제를 제공한다.
구현예 32는 제제가 유리체내로 투여되는 것인 구현예 1 또는 30의 제제를 제공한다.
구현예 33은 제제가 약 -20℃의 온도에서 적어도 약 2주 내지 약 4주 동안 안정적인 것인 구현예 1-31 중 어느 하나의 제제를 제공한다.
구현예 34는 치료적으로 효과적인 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 제조하기 위한 확장 가능한 방법을 제공하며, 방법은:
a. 재조합 핵산 구성물을 적합한 이. 콜라이 세포에 도입하는 단계로서, 재조합 핵산 구성물은 pBR322 유도 ori 서열을 포함하는 벡터에 삽입된, 세포질 발현을 위한 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 것인 단계,
b. 세포를 적합한 항생물질을 포함하는 합성 성장 배지에서 약 20시간 동안 성장시키는 단계; 및
c. 세포로부터 치료적으로 효과적인 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 단계
를 포함하며,
단계 c에서 회수된 변형된 FGF-1의 수율은 pBR322 유도 ori 서열을 포함하는 벡터, 합성 성장 배지, 또는 이들의 조합을 사용하는 것을 포함하지 않는 방법보다 적어도 2배 더 높다.
구현예 35는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열; 또는 서열 번호: 1의 위치 12, 16, 66, 117, 및 134에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열을 포함하는 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 36은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 (i) Ala66Cys 돌연변이, (ii) Cys16Ser 돌연변이, (iii) Cys117Ser 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 37은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 1의 제1 잔기의 상류에 위치한 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 38은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 N-말단 메티오닌 잔기와 서열 번호: 1의 제1 잔기 사이에 위치한 연장 펩타이드를 추가로 포함하는 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 39는 연장 펩타이드가 서열 번호: 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 구현예 38의 방법을 제공한다.
구현예 40은 연장 펩타이드가 서열 번호. 4-8에 제시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 구현예 39의 방법을 제공한다.
구현예 41은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 폴리펩타이드의 성숙한 형태인 것인 구현예 34-40 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 42는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 14-18로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 34-41 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 43은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 24-28로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 34-42 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 44는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 93-117로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 34-43 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 45는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 연장 펩타이드의 N-말단에 메티오닌 잔기를 추가로 포함하는 것인 구현예 34-44 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 46은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 118-141로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 34-45 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 47은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 136개 아미노산을 포함하는 형태로 발현되는 것인 구현예 34-46 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 48은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 성숙한 형태의 적어도 141개 아미노산을 포함하는 것인 구현예 34-46 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 49는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 1의 처음 5개 잔기 중 하나 이상의 절단을 추가로 포함하는 것인 구현예 34-48 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 50은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 146-149, 및 174-204로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 구현예 34-49 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 51은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 연장 펩타이드를 추가로 포함하는 것인 구현예 34-50 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 52는 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 서열 번호: 2 서열 번호: 205에 제시된 서열을 포함하는 것인 구현예 34-51 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 53은 적합한 세포가 이. 콜라이 세포, 균주 BL21, K12 HMS174, 또는 W3110인 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 54는 재조합 핵산 구성물이 T7 또는 tac 프로모터를 포함하는 pMKet_TTHX1114인 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 55는 합성 배지가 탄소원으로서의 글리세롤, 펩톤 및 효모를 포함하는 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 56은 pMKet_TTHX1114를 발현하는 BL21 세포가 카나마이신의 존재 하에 37℃에서 20시간 동안 성장된 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 57은 재조합 핵산 구성물이 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율을 증가시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함하는 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 58은 하나 이상의 변형이 세포에서 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 증가된 발현을 위한 서열 최적화를 포함하는 것인 구현예 57의 방법을 제공한다.
구현예 59는 하나 이상의 변형이 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율을 증가시키기 위한 적합한 프로모터를 선택하는 것을 포함하는 것인 구현예 57의 방법을 제공한다.
구현예 60은 세포 증식을 최대화하기 위해 적당한 영양 배지에서 세포를 성장시키는 단계를 추가로 포함하고, 적당한 영양 배지는 탄소원을 포함하며, 탄소원은 글루코스 또는 글리세롤인 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 61은 플라스미드가 pMKet, 또는 이의 유도체 또는 변이체인 것인 구현예 57의 방법을 제공한다.
구현예 62는 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율을 최적화하기 위하여 하나 이상의 변형을 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 하나 이상의 변형 과정은 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산 내에서의 변형; 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산에 작동 가능하게 회합된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 재조합 핵산 내에서의 변형; 재조합 핵산을 포함하는 플라스미드의 변형; 세포 증식을 최대화하기 위한 세포 균주의 변형 또는 세포 균주의 선택; 및 세포 성장 배지의 변형으로부터 선택되는 것인 구현예 34-61 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 63은 재조합 핵산을 도입하는 단계가 세포에서 재조합 핵산을 전기천공하는 단계를 포함하는 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 64는 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 단계가 세포의 주변 세포질 봉입체로부터 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 65는 회수 단계가 변성 완충액에서 봉입체에 대해 가용화를 수행하는 단계, 및 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 것인 구현예 64의 방법을 제공한다.
구현예 66은 변성 완충액이 우레아 또는 구아니딘을 포함하는 것인 구현예 65의 방법을 제공한다.
구현예 67은 변성 완충액이 2 mM EDTA를 추가로 포함하는 것인 구현예 66의 방법을 제공한다.
구현예 68은 회수된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 DTT를 첨가함으로써 환원시키는 단계를 추가로 포함하고, DTT를 투석여과에 의해 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 구현예 65-67 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 69는 회수된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드가 재접힘 완충액에서 재접힘되는 것인 구현예 65-68 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 70은 재접힘 완충액이 L-아르기닌을 포함하는 것인 구현예 69의 방법을 제공한다.
구현예 71은 재접힘 완충액이 5 mM 시스테인, 또는 2 mM 시스틴 또는 둘 다를 포함하는 것인 구현예 69 또는 70의 방법을 제공한다.
구현예 72는 FGF-1이 헤파린이 있는 소수성 상호작용 칼럼(HIC)에 의해 포획되는 것인 구현예 69-71 중 어느 하나의 방법을 제공한다.
구현예 73은 치료적으로 효과적인 재조합 돌연변이 hFGF1 단백질을 회수하는 단계가 단백질을 정제하는 단계를 포함하고, 정제 단계는 액체 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 한외여과, 횡류 여과, 및 투석여과 중 하나 이상을 포함하는 것인 구현예 34의 방법을 제공한다.
구현예 74는 구현예 34-73 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드, 이의 동결건조된 분말 분획, 또는 이의 액체 제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
구현예 75는 푹스 이영양증, 수포성 각막병증, 헤르페스 각막병증, 선천성 유전성 내피 이영양증 1, 선천성 유전성 내피 이영양증 2, 후방 다형 각막 이영양증, 안구 건조증, 원추 각막, 격자 각막 이영양증, 과립형 각막 이영양증, 황반 각막 이영양증, 슈나이더 결정 각막 이영양증, 선천성 간질 각막 이영양증, 반점 각막 이영양증, 각막 손상, 안구 손상, 화학적 손상, 발포성 손상, 간질 손상 및 머스터드 가스 각막병증으로 이루어지는 목록으로부터 선택된 질환, 장애, 또는 병태를 가진 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 (i) 구현예 1-33 중 어느 하나의 주사용 제제, 또는 (ii) 구현예 74의 약학 조성물의 적합한 용량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
구현예 76은 FGF-1의 주사용 제제를 포함하는 키트를 제공한다.
구현예 77은 점적기 병을 포함하며, 점적기 병은 적어도 한 용량의 변형된 FGF-1을 구현예 1-33 중 어느 하나의 제제 또는 구현예 74의 약학 조성물에 제공할 수 있는 것인 구현예 76의 키트를 제공한다.
구현예 78은 점적기 병은 멸균 필터를 추가로 포함하는 것인 구현예 76 또는 77의 키트를 제공한다.
구현예 79는 용기가 주사기를 포함하는 것인 구현예 76-78 중 어느 하나의 키트를 제공한다.
구현예 80은 주사기가 투베르쿨린 폴리프로필렌 및 유리로 이루어지는 군으로부터 선택된 물질을 포함하는 것인 구현예 79의 키트를 제공한다.
구현예 81은 주사기가 구현예 1-33 중 어느 하나에 따르는 주사용 제제 또는, 구현예 74에 따르는 약학 조성물로 사전에 채워지는 것인 구현예 79 또는 80의 키트를 제공한다.
구현예 82는 전자 제어 유닛을 추가로 포함하는 것인 구현예 79-81 중 어느 하나의 키트를 제공한다.
구현예 83은 전자 제어 유닛이 구현예 1-33 중 어느 하나에 따르는 주사용 제제 또는, 구현예 74에 따르는 약학 조성물의 투여 부피를 제어할 수 있고, 부피는 적어도 약 10 μL 내지 약 100 μL인 것인 구현예 82의 키트를 제공한다.
서열 표
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Claims (38)

  1. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드,
    약 1 mM 내지 약 20 mM의 농도의 시트레이트 또는 히스티딘,
    약 0.01% 내지 약 10%(중량/부피)의 농도의 계면활성제, 및
    약 1% 내지 약 10%(중량/부피) 또는 약 50 mM 내지 약 200 mM의 농도의 긴장성 조절제
    를 포함하며,
    변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 하기 아미노산 잔기: 위치 16에서 Ser, 위치 66에서 Cys, 및 위치 117에서 Val을 포함하는 것인 약학 제제.
  2. 제1항에 있어서, 약 1 mM 또는 약 10 mM의 농도의 히스티딘을 포함하는 약학 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 계면활성제의 농도는 약 0.1%(중량/부피)인 약학 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트인 약학 제제.
  5. 제4항에 있어서, 폴리소르베이트는 PS-20 또는 PS-80인 약학 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리소르베이트는 PS-80인 약학 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 긴장성 조절제는 소르비톨이고 약학 제제는 약 5%(중량/부피)의 농도의 소르비톨을 포함하는 약학 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4.5 내지 약 6.5의 pH를 갖는 약학 제제.
  9. 제8항에 있어서, 약 5.8의 pH를 갖는 약학 제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 농도는 약 0.0005 μg/mL 내지 약 200 μg/mL인 약학 제제.
  11. 제10항에 있어서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 농도는 약 100 μg/mL인 약학 제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는, (i) 육안 검사에 의한 가시적인 미립자의 결여 및 (ii) SE-HPLC 검정에서 고분자량 종에 대한 5% 미만의 피크 면적 중 어느 하나에 의해 측정되는 바와 같이, 실온에서 보관될 때 적어도 28일 동안 안정적인 것인 약학 제제.
  13. 제12항에 있어서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 실온에서 보관될 때 적어도 50일 동안 안정적인 것인 약학 제제.
  14. 제13항에 있어서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 제제가 실온에서 보관될 때 적어도 59일 동안 안정적인 것인 약학 제제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 국소 적용, 점안제로서의 적용, 안내 주사, 또는 안구 주위 주사에 적합한 약학 제제.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안내 전달을 위한 주사용 제제인 약학 제제.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유리체내 전달을 위한 주사용 제제인 약학 제제.
  18. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드; 적어도 약 200 mM 내지 약 1000 mM의 농도의 염화나트륨; 약 50 mM 내지 약 500 mM의 농도의 황산암모늄; 약 1 mM 내지 약 50 mM의 농도의 인산수소이나트륨을 포함하며, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 하기 아미노산 잔기: 위치 16에서 Ser, 위치 66에서 Cys, 및 위치 117에서 Val을 포함하는 것인 벌크 의약 물질 제제.
  19. 제18항에 있어서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 농도는 적어도 약 0.1g/mL 내지 약 10 g/mL인 벌크 의약 물질 제제.
  20. 제19항에 있어서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 농도는 약 3 g/mL인 벌크 의약 물질 제제.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약 800 mM의 농도의 염화나트륨을 포함하는 벌크 의약 물질 제제.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약 320 mM의 농도의 황산암모늄을 포함하는 벌크 의약 물질 제제.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 20 mM의 농도의 인산수소이나트륨을 포함하는 벌크 의약 물질 제제.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 약 7 내지 약 9의 pH를 갖는 벌크 의약 물질 제제.
  25. 제24항에 있어서, 약 7.4의 pH를 갖는 벌크 의약 물질 제제.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 -60℃ ± 10℃의 온도에서 보관될 때 안정적인 것인 벌크 의약 물질 제제.
  27. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질감염된 박테리아 세포의 배양에서 봉입체로부터 단리된 다시 접힌 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 정제를 포함하는 제조 방법으로서, 정제는 리간드로서 덱스트란 설페이트에 커플링된 고도로 가교결합된 아가로스 염기 매트릭스에 다시 접힌 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 포획하는 단계, 이어서 부틸 세파로스 수지로 패킹된 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 연마하는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 연마 단계로부터의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 회수율은, 헤파린 수지로 패킹된 크로마토그래피 칼럼을 사용하며 다른 것은 동일한 제조 방법에서 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 연마하는 단계 후의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 회수율보다 약 10% 내지 약 40% 더 큰 것인 제조 방법.
  29. a. 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 구성물을 이.콜라이(E.Coli) 세포에 도입하는 단계로서, 구성물은 번역된 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 세포의 주변 세포질 공간 내로 표적화하도록 구성되는 것인 단계,
    b. 세포를 적합한 항생물질을 포함하는 합성 성장 배지에서 약 20시간 동안 성장시키는 단계; 및
    c. 세포로부터 치료적으로 효과적인 변형된 FGF-1 폴리펩타이드를 회수하는 단계
    를 포함하며,
    회수된 변형된 FGF-1의 수율은 1 L 이상의 규모에서 적어도 3 g/L인, 치료적으로 효과적인 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 확장 가능한 제조 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 FGF-1 폴리펩타이드는 서열 번호: 2에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 하기 아미노산 잔기: 위치 16에서 Ser, 위치 66에서 Cys, 및 위치 117에서 Val을 포함하는 것인 확장 가능한 제조 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 이.콜라이 세포는 균주 BL21, K12 HMS174, 및 W3110으로부터 선택되는 것인 확장 가능한 제조 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산 구성물은 T7 또는 tac 프로모터를 포함하는 pMKet_TTHX1114인 확장 가능한 제조 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 성장 배지는 탄소원으로서의 글리세롤, 펩톤 및 효모를 포함하는 것인 확장 가능한 제조 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 이.콜라이 세포는 BL21 세포이고 pMKet_TTHX1114를 발현하는 BL21 세포는 37℃에서 약 20시간 동안 카나마이신의 존재 하에 성장되는 것인 확장 가능한 제조 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산 구성물은 세포로부터 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 수율을 증가시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함하는 것인 확장 가능한 제조 방법.
  36. 제35항에 있어서, 하나 이상의 변형은 세포에서의 변형된 FGF-1 폴리펩타이드의 증가된 발현을 위한 핵산 서열 코돈 최적화를 포함하는 것인 확장 가능한 제조 방법.
  37. 변형된 FGF1-1 폴리펩타이드를 암호화하기 위한 핵산 서열로서, 핵산은 서열 번호: 207의 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  38. Tac 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 서열 번호: 207을 포함하는 박테리아 발현 벡터.
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