CN116710568A - 重组修饰成纤维细胞生长因子及其治疗用途 - Google Patents

重组修饰成纤维细胞生长因子及其治疗用途 Download PDF

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Abstract

本文描述了合适的修饰成纤维细胞生长因子(FGF)制剂和制备方法，用于在眼中递送；包含此类修饰FGF多肽的多肽、药物组合物和药物；以及使用此类修饰FGF多肽治疗或预防受益于FGF施用的病状的方法。

Description

重组修饰成纤维细胞生长因子及其治疗用途
交叉引用
本申请要求在2020年6月26日提交的美国临时申请号63/044,980的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本文描述了修饰成纤维细胞生长因子(FGF)多肽；包含此类修饰FGF多肽的药物组合物和药物；以及制备和使用此类修饰FGF多肽以治疗或预防受益于FGF施用的病状的方法。
背景技术
FGF是在发育和成体组织中广泛表达的大多肽(Baird等人,Cancer Cells,3:239-243,1991)并且在多种生理功能中发挥作用(McKeehan等人,Prog.Nucleic AcidRes.Mol.Biol.59:135-176,1998；Burgess,W.H.等人,Annu Rev.Biochem.58:575-606(1989))。FGF家族包括至少二十二名成员(Reuss等人,Cell Tissue Res.313:139-157(2003))。
发明内容
一个实施方案提供了一种药物制剂，其包含：
修饰FGF-1多肽，
浓度为约1mM至约20mM的柠檬酸盐或组氨酸，
浓度为约0.01％至约10％(w/v)的表面活性剂，和
浓度为约1％至约10％(w/v)或约50mM至约200mM的张力调节剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列并且包含以下氨基酸残基：第16位的Ser、第66位的Cys和第117位的Val。
在一些实施方案中，药物制剂包含浓度为约1mM或约10mM的组氨酸。在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.1％(w/v)。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯。在一些实施方案中，聚山梨酯是PS-20或PS-80。在一些实施方案中，聚山梨酯是PS-80。在一些实施方案中，张力调节剂是山梨醇，并且其中药物制剂包含浓度为约5％(w/v)的山梨醇。在一些实施方案中，药物制剂的pH为约4.5至约6.5。在一些实施方案中，药物制剂的pH为约5.8。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的浓度为约0.0005μg/mL至约200μg/mL。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的浓度为约100μg/mL。在一些实施方案中，如通过以下中任一项所测量，修饰FGF-1多肽在室温下储存时稳定至少28天：(i)通过目视检查，没有可见颗粒，以及(ii)在SE-HPLC(尺寸排阻-高效液相色谱法)测定中，高分子量物质的峰面积小于5％。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽在室温下储存时稳定至少50天。在一些实施方案中，当制剂在室温下储存时，修饰FGF-1多肽稳定至少59天。在一些实施方案中，制剂适用于外用应用、呈滴眼剂应用、眼内注射或眼周注射。在一些实施方案中，制剂是用于眼内递送的可注射制剂。在一些实施方案中，制剂是用于玻璃体内递送的可注射制剂。
一个实施方案提供了一种散装原料药制剂，其包含：修饰FGF-1多肽；浓度为至少约200mM至约1000mM的氯化钠；浓度为约50mM至约500mM的硫酸铵；浓度为约1mM至约50mM的磷酸氢二钠，其中修饰FGF-1多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列并且包含以下氨基酸残基：第16位的Ser、第66位的Cys和第117位的Val。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的浓度为至少约0.1g/mL至约10g/mL。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的浓度为约3g/mL。在一些实施方案中，散装原料药制剂包含浓度为约800mM的氯化钠。在一些实施方案中，散装原料药制剂包含浓度为约320mM的硫酸铵。在一些实施方案中，散装原料药制剂包含浓度为约20mM的磷酸氢二钠。在一些实施方案中，散装原料药制剂的pH为约7至约9。在一些实施方案中，散装原料药制剂的pH为约7.4。在一些实施方案中，散装原料药制剂中的修饰FGF-1多肽在-60℃±10℃的温度下储存时稳定。
一个实施方案提供了一种制造方法，其包括对从细菌细胞的培养物中的包涵体分离的复性的修饰FGF-1多肽的纯化，细菌细胞用包含用于编码修饰FGF-1多肽的核酸的载体转染，其中纯化包括使用与作为配体的硫酸葡聚糖偶联的高度交联琼脂糖基础基质捕获所述复性的修饰FGF-1多肽，接着使用填充有丁基琼脂糖凝胶树脂的色谱柱，通过疏水相互作用色谱法精细纯化(polishing)。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽从精细纯化步骤的回收率比在其他方面相同的制造方法中使用填充有肝素树脂的色谱柱通过疏水相互作用色谱法进行的精细纯化步骤之后修饰FGF-1多肽的回收率高约10％至约40％。
一个实施方案提供了一种用于生产治疗有效的修饰FGF-1多肽的可扩展方法，所述方法包括：
a.将包含编码所述修饰FGF-1多肽的核酸序列的重组核酸构建体引入大肠杆菌细胞，其中所述构建体被配置为将翻译的修饰FGF-1多肽靶向所述细胞的周质空间中，
b.使所述细胞在包含合适的抗生素的合成生长培养基中生长约20小时；以及
c.从所述细胞回收治疗有效的修饰FGF-1多肽，
其中在1L或更大的规模下，回收的修饰FGF-1的产量为至少3g/L。
在可扩展方法的一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列并且包含以下氨基酸残基：第16位的Ser、第66位的Cys和第117位的Val。在可扩展方法的一些实施方案中，大肠杆菌细胞选自菌株BL21、K12 HMS174和W3110。在可扩展方法的一些实施方案中，重组核酸构建体是包含T7或tac启动子的pMKet_TTHX1114。在可扩展方法的一些实施方案中，合成生长培养基包含作为碳源的甘油、蛋白胨和酵母。在可扩展方法的一些实施方案中，大肠杆菌细胞是BL21细胞，并且其中使表达pMKet_TTHX1114的BL21细胞在37℃下，在卡那霉素的存在下生长约20小时。在可扩展方法的一些实施方案中，重组核酸构建体包含用于增加来自细胞的修饰FGF-1多肽的产量的一种或多种修饰。在可扩展方法的一些实施方案中，一种或多种修饰包括使细胞中修饰FGF-1多肽的表达增加的核酸序列密码子优化。
一个实施方案提供了一种用于编码修饰FGF1-1多肽的核酸序列，所述核酸包含序列SEQ ID NO:207。一个实施方案提供了一种细菌表达载体，其包含可操作地连接至Tac启动子的SEQ ID NO:207。
在一个实施方案中，本文提供了一种重组修饰FGF-1多肽，其包含具有一个或多个突变的示出为SEQ ID NO:1的序列，其中多肽包含位于SEQ ID NO:1的第一个残基上游的N-末端甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，多肽还包含位于N-末端甲硫氨酸残基与SEQ IDNO:1的第一个残基之间的延伸肽。在一些实施方案中，延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，延伸肽包含SEQ ID NO.4-8中所示的任一序列。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:14-18的序列。
本文提供了一种制剂，其包含：(a)重组FGF-1多肽，其包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含至少1、2、3、4或5个单氨基酸突变；和(b)L-甲硫氨酸。在一些实施方案中，制剂是用于眼内递送的可注射制剂。
在一些实施方案中，多肽还包含位于N-末端甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一个残基之间的延伸肽。在一些实施方案中，延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，延伸肽包含SEQ ID NO.4-8中所示的任一序列。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQID NO:14-18的序列。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:24-28的序列。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:93-117的序列。在一些实施方案中，多肽还包含在延伸肽N-末端的甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:118-141的序列。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含136个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含至少141个氨基酸。
在一些实施方案中，重组修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第67位的突变。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽还包含SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:146-149的序列。
在一些实施方案中，多肽还包含延伸肽，其包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:174-204的序列。
在一些实施方案中，多肽重组修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:205中所示的序列。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含一个或多个选自以下的突变：Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变，所述突变选自以下：Lys12Val、Cys16Ser、Ala66Cys、Cys117Val和Pro134Val，并且其中修饰FGF-1多肽还包含肽ALTEK的至少一个残基。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含一个或多个突变，所述突变包含SEQ IDNO:1的以下突变：Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，其中修饰FGF-1多肽包含位于SEQ IDNO:1的第一个残基上游的甲硫氨酸残基，以及位于N-末端甲硫氨酸与SEQ ID NO:1的第1位之间的肽ALTEK的至少一个残基。
在一些实施方案中，制剂包含人血清白蛋白(HSA)和/或聚山梨酯80。
在一些实施方案中，制剂包含L-甲硫氨酸。
在一些实施方案中，制剂包含L-甲硫氨酸和聚山梨酯80。
在一些实施方案中，制剂还包含以下中的至少一种：
-至少约50mM磷酸氢二钠二水合物；
-至少约100mM氯化钠；
-至少约10mM硫酸铵；
-至少约5mM L-甲硫氨酸，和
-至少约0.01％聚山梨酯80(w/v)。
在一些实施方案中，制剂还包含以下中的至少一种：
-至少约50mM磷酸氢二钠二水合物；
-至少约100mM氯化钠；
-至少约10mM硫酸铵；
-至少约0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；
-至少约5mM L-甲硫氨酸，和
-至少约0.01％聚山梨酯80(w/v)。
在一些实施方案中，制剂包含EDTA，EDTA的浓度为至少约0.01mM至约10mM。
在一些实施方案中，制剂包含硫酸铵，并且其中硫酸铵的浓度为至少约0.01mM至约100mM。
在一些实施方案中，制剂包含至少约0.01mM至约100mM的L-甲硫氨酸。
在一些实施方案中，重组FGF-1以适合于治疗选自以下的一种或多种疾病、病症或病状的浓度存在：Fuch营养不良(Fuch's dystrophy)、大疱性角膜病变(bullouskeratopathy)、疱疹性角膜病变(herpetic keratopathy)、先天性遗传性内皮营养不良1(congenital hereditary endothelial dystrophy 1)、先天性遗传性内皮营养不良2、多形性角膜后层营养不良(posterior polymorphous corneal dystrophy)、干眼综合征(adry eye syndrome)、圆锥角膜(keratoconus)、格子状角膜营养不良(lattice cornealdystrophy)、颗粒状角膜营养不良(granular corneal dystrophy)、斑状角膜营养不良(macular corneal dystrophy)、施奈德结晶状角膜营养不良(Schnyder crystallinecorneal dystrophy)、先天性基质角膜营养不良(congenital stromal cornealdystrophy)、斑点状角膜营养不良(fleck corneal dystrophy)、角膜损伤(cornealinjury)、眼外伤(ocular injury)、化学性损伤(chemical injury)、起疱性损伤(vesicantinjury)、基质损伤(stromal injury)和芥子气角膜病变(mustard gas keratopathy)。
在一些实施方案中，本文提供一种药物组合物或制剂，其有助于将修饰FGF-1多肽施用于生物体。本领域中存在多种施用修饰FGF-1多肽的技术，包括但不限于：外用施用、眼用施用、眼内施用、眼周施用、静脉内施用、口服施用、气溶胶施用和肠胃外施用。
在一些实施方案中，药物组合物是液体眼用制剂。在一些实施方案中，药物制剂是外用施用的，或者通过向角膜中微针注射来施用，或者前房内施用。局部施用的方式可以包括例如外用应用、滴眼剂、眼内注射或眼周注射。眼周注射通常涉及将化合物注射在结膜下或注射到特农氏间隙(Tennon's space)(在覆盖眼睛的纤维组织之下)中。眼内注射通常涉及将修饰FGF或药物组合物注射到玻璃体中。在某些实施方案中，施用是非侵入性的，诸如通过外用应用或滴眼剂。在一些实施方案中，施用是通过外用和前房内方法的组合。
在一些实施方案中，制剂是前房内施用的。
在一些实施方案中，制剂是玻璃体内施用的。
在一些实施方案中，制剂在约-20℃的温度下稳定至少约2周至约4周。
本文提供了一种用于生产治疗有效的修饰FGF-1多肽的可扩展方法，所述方法包括：(a)将包含编码修饰FGF-1多肽的序列的重组核酸构建体引入细胞中，其中重组核酸构建体包含；其中修饰FGF-1多肽由细胞产生；以及(b)从细胞回收治疗有效的修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，可扩展方法包括：(a)将重组核酸构建体引入合适的大肠杆菌细胞中，其中重组核酸构建体包含编码修饰FGF-1多肽的序列，以用于细胞质表达，序列被插入在包含pBR322衍生的ori序列的载体中；b.使细胞在包含合适的抗生素的合成生长培养基中生长约20小时；以及c.从细胞回收治疗有效的修饰FGF-1多肽，其中在步骤c回收的修饰FGF-1的产量是不包括使用包含pBR322衍生的ori序列的载体、合成生长培养基或其组合的方法的至少2倍。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的一个或多个突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含Ala66Cys突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含Cys16Ser突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含Cys117Ser突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含位于SEQ ID NO:1的第一个残基上游的N-末端甲硫氨酸残基。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽还包含位于N-末端甲硫氨酸残基与SEQ IDNO:1的第一个残基之间的延伸肽。在一些实施方案中，延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，延伸肽包含SEQ ID NO.4-8中所示的任一序列。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:14-18的序列。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:24-28的序列。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:93-117的序列。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽还包含在延伸肽N-末端的甲硫氨酸残基。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:118-141的序列。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含136个氨基酸的形式表达。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含至少141个氨基酸。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽还包含SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:146-149的序列。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽还包含延伸肽，其包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:174-204的序列。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:2SEQ ID NO:205中所示的序列。
在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生1g修饰FGF-1多肽。
在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生10g修饰FGF-1多肽。
在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生100g修饰FGF-1多肽。
在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生1Kg修饰FGF-1多肽。
在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生10Kg修饰FGF-1多肽。
在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生100Kg修饰FGF-1多肽。
在一些实施方案中，所述方法可以扩展成产生至少100L细胞储备液的批量制剂。
在一些实施方案中，细胞是酵母细胞或细菌。
在一些实施方案中，细胞是细菌，其中细菌是大肠杆菌。
在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞，菌株BLA21A1。
在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞，菌株K12 HMS174或W3110。
在一些实施方案中，重组核酸构建体呈质粒的形式。
在一些实施方案中，重组核酸构建体包含用于增加来自细胞的修饰FGF-1多肽的产量的一种或多种修饰。
根据实施方案69所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括使所述细胞中所述修饰FGF-1多肽的表达增加的序列优化。
在一些实施方案中，一种或多种修饰包括质粒中的修饰。
在一些实施方案中，一种或多种修饰包括选择合适的启动子，以便增加来自细胞的修饰FGF-1多肽的产量。
在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞在足够的营养培养基中生长，以便使细胞增殖最大。
在一些实施方案中，足够的营养培养基包含碳源。
在一些实施方案中，碳源是葡萄糖或甘油。
在一些实施方案中，质粒是pMKet或其衍生或修饰。
在一些实施方案中，所述方法还包括一种或多种修饰过程，以便使来自细胞的修饰FGF-1多肽的产量最大，其中所述一种或多种修饰过程选自：
i.在编码突变FGF-1多肽的重组核酸内的修饰；
ii.在包含一个或多个与编码突变FGF-1多肽的重组核酸相关的调控元件的重组核酸内的修饰，调控元件选自启动子、增强子、5'-非翻译区、3'-非翻译区、poly A尾、转录物稳定元件；
iii.对包含重组核酸的质粒的修饰；
iv.对细胞株的修饰或对细胞株的选择，以便使细胞增殖最大；
v.对细胞生长培养基的改良；以及
vi.从细胞回收修饰FGF-1多肽的过程中的修饰。
在一些实施方案中，引入重组核酸包括对细胞中的重组核酸进行电穿孔。
在一些实施方案中，从细胞回收修饰FGF-1多肽包括从细胞的周质包涵体回收蛋白质。
在一些实施方案中，回收包括使包涵体在变性缓冲液中溶解，以及回收FGF-1多肽。
在一些实施方案中，变性缓冲液包含尿素或胍。
根据实施方案34或77所述的方法，其中变性缓冲液包含在pH7.4下的6M胍。
在一些实施方案中，变性缓冲液还包含2mM EDTA。在一些实施方案中，所述方法还包括通过添加DTT减少回收的FGF-1多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括通过渗滤去除DTT。
在一些实施方案中，使回收的FGF-1多肽在复性缓冲液中进行复性。
在一些实施方案中，复性缓冲液包含精氨酸。
在一些实施方案中，复性缓冲液包含1M精氨酸。
在一些实施方案中，复性缓冲液包含在pH 9-9.5下的5-50mM Tris。
在一些实施方案中，复性缓冲液包含5mM半胱氨酸或2mM胱氨酸或两者。
在一些实施方案中，FGF-1通过具有肝素的疏水相互作用柱(HIC)被捕获。
在一些实施方案中，回收治疗有效的重组突变hFGF1蛋白包括纯化所述蛋白质。在一些实施方案中，纯化包括以下中的一种或多种：液相色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、超速离心、横向流过滤和渗滤。在一些实施方案中，纯化包括通过肝素柱过滤进行纯化的步骤。在一些实施方案中，纯化包括回收纯的单体重组突变hFGF1蛋白。在一些实施方案中，纯化包括回收不含病原体、不含内毒素且基本上不含肝素的纯单体重组突变hFGF1蛋白。
本文提供了一种药物组合物，其包含通过根据实施方案34-97中任一项所述的方法产生的修饰FGF-1多肽、其冻干粉末级分或其液体制剂。
本文提供了一种质粒载体，其包含编码修饰人FGF-1的重组核酸序列，所述序列可操作地连接至一个或多个调控序列。在一些实施方案中，重组核酸序列被设计用于细胞质表达。在一些实施方案中，重组核酸可以编码单顺反子序列。在一些实施方案中，重组核酸可以编码多顺反子序列。在一些实施方案中，重组核酸编码除FGF-1多肽之外的伴侣肽序列。
本文提供了一种治疗患有选自以下的疾病、病症或病状的对象的方法：Fuch营养不良(Fuch's dystrophy)、大疱性角膜病变(bullous keratopathy)、角膜溃疡(cornealulcers)、疱疹性角膜病变(herpetic keratopathy)、先天性遗传性内皮营养不良1(congenital hereditary endothelial dystrophy 1)、先天性遗传性内皮营养不良2、多形性角膜后层营养不良(posterior polymorphous corneal dystrophy)、干眼综合征(adry eye syndrome)、圆锥角膜(keratoconus)、格子状角膜营养不良(lattice cornealdystrophy)、颗粒状角膜营养不良(granular corneal dystrophy)、斑状角膜营养不良(macular corneal dystrophy)、施奈德结晶状角膜营养不良(Schnyder crystallinecorneal dystrophy)、先天性基质角膜营养不良(congenital stromal cornealdystrophy)、斑点状角膜营养不良(fleck corneal dystrophy)、角膜损伤(cornealinjury)、眼外伤(ocular injury)、化学性损伤(chemical injury)、起疱性损伤(vesicantinjury)、基质损伤(stromal injury)和芥子气角膜病变(mustard gas keratopathy)，所述方法包括向有需要的对象施用合适剂量的以下物质：
(i)根据实施方案1-33中任一项所述的可注射制剂，或
(ii)根据实施方案98所述的药物组合物。
本文提供了一种试剂盒，其包括FGF-1的可注射制剂。在一些实施方案中，试剂盒包括滴瓶，其中滴瓶能够提供至少一个剂量的在本文所述的制剂或药物组合物中的修饰FGF-1。在一些实施方案中，滴瓶还包括无菌过滤器。在一些实施方案中，容器包括注射器。在一些实施方案中，注射器包含选自结核菌素聚丙烯和玻璃的材料。在一些实施方案中，试剂盒包括单位剂量容器，诸如吹灌封点滴器(blow-fill-seal dropper)。
在一些实施方案中，注射器预填充有本文所述的可注射制剂或药物组合物。
在一些实施方案中，试剂盒还包括电子控制单元。在一些实施方案中，电子控制单元能够控制一定体积的本文所述的可注射制剂或药物组合物的施用，其中体积为至少约10μL至约100μL。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均以引用的方式整体并入本文，其引用程度如同特别且单独地指示将每个单独的出版物或专利申请以引用的方式并入。
附图说明
图1示出了示例性一般化FGF-1制造过程。
图2A示出了通过虚线SDS-PAGE所示的通过对级分的丁基HIC色谱法和洗脱的示例性捕获产生对应于FGF-1(未示出)的单个17kDa谱带。
图2B示出了在肝素柱中丁基捕获步骤之后的示例性精细纯化步骤，以及洗脱液的代表性SDS-PAGE。
图3A和图3B示出了来自使用不同复性缓冲液在丁基和肝素HIC中捕获的实验的数据。图3C显示了在丁基中(左)，之后在肝素HIC中(右)洗脱的SDS-PAGE结果。
图4A和图4B显示了指示从代表性实验的FGF1回收的定量数据，所述实验使用在复性缓冲液中的尿素和胍，使用聚山梨酯20与聚山梨酯80，并且比较在SDS-PAGE上运行的所得蛋白质。对于图中的每个数据点，第一列表示在4℃下的复性，并且第二列表示在室温下的复性。
图5示出了示例性一般化FGF-1制造过程。
图6示出了用于在大肠杆菌中表达修饰FGF-1多肽的质粒图谱。
图7A、图7B和图7C描绘了显示原料药在第0天(图7A)、第28天(图7B)和第59天(图7C)的清晰峰的代表性SEC-HPLC数据。
具体实施方式
眼睛的疾病和对眼睛的损伤可能严重地使人衰弱，并且以多种形式发生。一类眼部疾病是芥子气角膜病变。暴露于芥子气可能导致长期并发症，这些并发症在多年内发展。角膜变得有瘢痕且不规则，并且胆固醇和钙沉积在其组织中，导致视力逐渐受损。裂隙灯检查显示，巩膜外层组织显示出特征性釉底(underglaze)。白瓷(white porcelain)外观和不寻常的血管异常是常见的。这些表现为扩大、扭曲的血管，有时为伴有静脉曲张和香肠样血管的壶腹状轮廓。随着时间的流逝，发生角膜致密的浑浊化，在中央和下部部分最为明显，因为上部部分已被悬垂的眼睑保护。MGK的主要组织病理学特征包括例如上皮厚度不规则、退行性变化、上皮基底膜增厚、角膜细胞损失和Bowman层破坏。(Kanavi等人,Chronic anddelayed mustard gas keratopathy:ahistopathologic and immunohistochemicalstudy,Eur.J Ophthalmol.2010Sep-Oct；20(5):839-43)。通常，在角膜起疱剂暴露的一天内，角膜上皮(CE)从基底膜(BM)脱落，剥脱的基质中发展角膜水肿，并且在伤口边缘，全层角膜细胞化(keratocytosis)明显。五天内，上皮帽(epithelial cap)再生，并且角膜水肿开始消退。暴露之后一周，CE部分分层，伴有初步的半桥粒附接。尽管有这种明显的改善，但是角膜在暴露之后三周内便发展出慢性损伤的临床特征，包括持续升高的角膜水肿、重新发生的角膜糜烂和新生血管形成。八周内，基底膜区经历严重退化。此外，MGK影响的角膜似乎表现出伤口愈合过程延迟。
本文提供了修饰FGF-1多肽，及包含此类修饰肽的其液体可注射制剂，以及使用此类修饰FGF-1多肽治疗各种病状的方法，病状诸如眼部疾病、病症和病状(例如，Fuch营养不良)、起疱剂诱导的角膜上皮和内皮损伤(例如，芥子气角膜病变(MGK))、伤口愈合、心血管疾病(例如，局部缺血)和神经系统病状(例如，肌萎缩性侧索硬化症(ALS))。本文还提供了一种通过施用修饰的成纤维细胞生长因子(FGF-1)多肽或包含此类修饰的肽的药物组合物或药剂来治疗化学或起疱剂诱导的损伤的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过施用本文所述的修饰FGF-1多肽来治疗由化学损伤(例如，化学灼伤)诱导的芥子气角膜病变(MGK)。在一些实施方案中，所述方法包括通过施用本文所述的修饰FGF-1多肽来治疗由起疱剂(例如，氮芥子气(NM))诱导的芥子气角膜病变(MGK)。在一些实施方案中，所述方法包括治疗由化学战剂(例如，光气)引起的化学或热损伤。
本文还提供了制造修饰FGF-1多肽及包含此类修饰肽的其液体可注射制剂的方法，使得修饰FGF-1多肽及其液体可注射制剂适合于使用此类修饰FGF-1多肽治疗各种病状的方法，病状诸如眼部疾病、病症和病状(例如，Fuch营养不良)、起疱剂诱导的角膜上皮和内皮损伤(例如，芥子气角膜病变(MGK))、伤口愈合、心血管疾病(例如，局部缺血)和神经系统病状(例如，肌萎缩性侧索硬化症(ALS))。本文还提供了一种通过施用修饰的成纤维细胞生长因子(FGF-1)多肽或包含此类修饰的肽的药物组合物或药剂来治疗化学或起疱剂诱导的损伤的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过施用本文所述的修饰FGF-1多肽来治疗由化学损伤(例如，化学灼伤)诱导的芥子气角膜病变(MGK)。在一些实施方案中，所述方法包括通过施用本文所述的修饰FGF-1多肽来治疗由起疱剂(例如，氮芥子气(NM))诱导的芥子气角膜病变(MGK)。在一些实施方案中，所述方法包括治疗由化学战剂(例如，光气)引起的化学或热损伤。
在本文所述的一些实施方案中，在修饰FGF-1多肽表达为具有N-末端甲硫氨酸(N-Met)残基的情况下，随后对多肽进行纯化，而无需进行需要用于去除N-末端肽的蛋白水解裂解的步骤。因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰FGF-1多肽，其通过快速纯化方法制备，而不涉及用于去除N-末端肽的蛋白水解裂解步骤。按照良好生产规范(goodmanufacturing practice，GMP)指南，这对于生产修饰FGF-1多肽来说特别有利。优点包括不含裂解步骤，包括消除对裂解产物进行后续纯化和去除用于裂解的试剂的需要。此举的另一个优点是由于处理减少而产量增加，以及减少了测试为了裂解和后续分离裂解材料与未裂解材料所引入的残余裂解试剂和污染物的需要。
本文所述的修饰FGF-1多肽有可能稳定性(例如，热稳定性)增加、隐藏的游离硫醇数减少和/或有效硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)亲和力增加。
几个其他优点与修饰FGF-1多肽在本文所述的方法中的使用相关联。例如，本文所述的修饰FGF-1多肽可以在其药物组合物或制剂(例如，眼用制剂)中不具有肝素的情况下施用，避免与肝素的生物学来源相关的潜在安全问题。此外，避免肝素允许使用较高剂量的修饰FGF-1多肽，而不会因局部肝素诱导的不良事件或先前存在的抗肝素抗体导致并发症。此外，在不存在肝素的情况下，修饰FGF与组织的立即结合最大化，并且全身分布显著减少。本文所述的修饰FGF-1多肽的优点还在于局部螯合作用增强并且重新分布动力学降低，因此增加了在递送部位处的消除半衰期和平均停留时间(MRT)，并且实现给药频率降低。这可能归因于稳定性(例如，热稳定性)增加、隐藏的游离硫醇数减少和/或有效硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)亲和力增加的本文所述的修饰FGF-1多肽。
在各种实施方案中，本公开的FGF-1多肽包含在多肽的N-末端的修饰，诸如添加、截短或添加和截短的组合。在一些实施方案中，修饰是添加单个N-末端甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，修饰是添加延伸肽。在一些实施方案中，修饰是FGF-1多肽的前五个残基中的一个或多个的截短。在一些实施方案中，FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:1中所示的序列，其具有一个或多个突变以及N-末端修饰。
本文所公开的修饰FGF-1多肽的几个实例以多肽的成熟形式包含N-末端甲硫氨酸(N-Met)残基。当将氨基酸添加到蛋白质的N-末端时，生物活性的保留是不可预测的。一些蛋白质对此具有耐受性，但一些蛋白质没有，并且生物活性的保留和稳定性变化的可能性仅是凭经验确定的。本公开确定了N-末端Met残基的添加是耐受的，保留了生物活性和稳定性。
特定术语
应当理解，上文的一般描述与下文详述两者均仅具有示例性和说明性并且不限制任何要求保护的主题。在本申请中，除非另外明确陈述，否则使用单数包括复数。必须注意，除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。在本申请中，除非另有陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。
本文使用的章节标题仅出于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与要求的主题所属理解相同的含义。在针对本文的术语存在多个定义的情况下，以本章节中的定义为准。本文提及的所有专利、专利申请、出版物和公开的核苷酸和氨基酸序列(例如，可在GenBank或其他数据库中获得的序列)都以引用方式并入。在提及URL或其他此类标识符或地址时，应理解此类标识符可以更改，并且互联网上的特定信息可以更新，但可以通过搜索互联网找到等价的信息。参考文献证明此类信息的可用性和公众传播。
如本文所用，关于序列的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为：在比对序列并引入空位(如果需要以实现最大序列同一性百分比)后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以本领域熟知的各种方式来实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如EMBOSS MATCHER、EMBOSS WATER、EMBOSS STRETCHER、EMBOSS NEEDLE、EMBOSS LALIGN、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
标准的化学术语的定义可以见于参考工具书中，包括但不限于Carey和Sundberg“ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4TH ED.”Vols.A(2000)和B(2001),Plenum Press,NewYork。除非另有说明，否则为质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。
除非提供具体定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的术语以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中公认的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。可以例如按照制造商说明书使用试剂盒、或按本领域中通常所完成的或如本文所述执行反应和纯化技术。上述技术和程序一般可以用常规方法执行，并且如本发明中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献所述。
应理解，本文所述的方法和组合物不限于本文所述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂，因此可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，且不旨在限制本文所述的方法、化合物、组合物的范围。
术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括减轻、缓解或改善某一疾病、病症或病状的症状；预防额外症状；改善或预防症状的根本代谢原因；抑制疾病、病症或病状，例如，阻止疾病、病症或病状的发展；缓解疾病、病症或病状；使疾病、病症或病状消退；缓解由疾病、病症或病状引起的状况；或者停止疾病、病症或病状的症状。术语“治疗”包括但不限于预防性和/或治疗性治疗。
关于制剂、组合物或成分的术语“可接受的”或“药学上可接受的”是指对正在治疗的对象的一般健康状况没有持久的有害影响或不消除本文所述的修饰FGF的生物活性或特性，并且相对无毒。
术语通过施用特定修饰FGF或药物组合物来“改善”特定疾病、病症或病状的症状，是指可以归因于或与施用修饰FGF或药物组合物有关的任何严重性减轻、发作延迟、进展减缓或持续时间缩短，无论是永久性的还是临时性的，持久性的还是暂时性的。
如本文所用，术语“组合”或“药物组合”意指由多于一种活性成分混合或组合而成的产物，并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”意指一种活性成分(例如，修饰FGF)和助剂(co-agent)以单个实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指一种活性成分(例如，修饰FGF)和助剂均呈单独的实体在没有特定中间时间限制的情况下同时、并行或顺序施用于患者，其中此类施用在患者体内提供有效水平的两种剂。后者还适用于混合物疗法，例如，三种或更多种活性成分的施用。
如本文可互换使用的术语“药物组合物”或“药物制剂”是指包含一种或多种修饰FGF-1多肽(例如，SEQ ID NO:2的修饰FGF-1多肽)与一种或多种其他化学组分诸如表面活性剂、缓冲剂、张力调节剂、载剂、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或其他赋形剂或其任何组合的制剂。药物制剂有助于将修饰FGF-1多肽施用于生物体。本领域中存在多种施用修饰FGF-1多肽的技术，包括但不限于：外用施用、眼用施用、眼内施用、眼周施用、静脉内施用、口服施用、气溶胶施用和肠胃外施用。在一些实施方案中，药物制剂包含作为活性药物成分的修饰FGF-1多肽(例如，包含如SEQ ID NO:2中所示的序列的修饰FGF-1多肽)以及非活性成分，例如，缓冲剂、表面活性剂、张力调节剂或其组合。
如本文所用，术语“载剂”是指有助于将感兴趣的剂(例如，修饰FGF)并入细胞或组织中的相对无毒的化合物或剂。
术语“稀释剂”是指在递送前用于稀释感兴趣的剂(例如，修饰FGF)的化合物。稀释剂还可以用于稳定剂，因为它们可以提供更稳定的环境。溶解在缓冲溶液中的盐(其还可以提供pH控制或维持)在本领域中用作稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。
术语“共同施用”等意指涵盖将选定的剂(例如，修饰FGF或其组分和助剂)施用于单个患者，并且旨在包括通过相同或不同施用途径或在相同或不同时间下施用各剂的治疗方案。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的本文所述的修饰FGF-1多肽、剂、组合或药物组合物将足以在一定程度上缓解正治疗的疾病、病症或病状的一种或多种症状的量。结果可以是疾病的体征、症状或病因的减轻和/或缓解，或者生物系统的任何其他期望变化。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供期望的药理作用、治疗改善或疾病症状的临床上显著的减轻而无不当的不良副作用所需的修饰FGF、剂、组合或药物组合物的量。在任何个体情况下的适当“有效量”可以使用诸如剂量递增研究的技术来确定。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。应当理解，“有效量”可能由于以下方面的变化而在对象之间有所不用：修饰FGF、组合或药物组合物的代谢；对象的年龄、体重、一般状况；正治疗的病症；正治疗的病症的严重性；以及处方医师的判断。仅以举例的方式，治疗有效量可以通过常规实验确定，所述实验包括但不限于剂量递增临床试验。
术语“预防有效量”是指应用于患者的本文所述的修饰FGF、化合物、剂、组合或药物组合物将在一定程度上缓解正治疗的疾病、病状或病症的一种或多种症状的量。在此类预防应用中，此类量可能取决于患者的健康状态、体重等。通过常规实验，包括但不限于剂量递增临床试验，确定此类预防有效量被认为完全在本领域的技术内。
如本文所用的术语“对象”或“患者”是指作为治疗、观察或实验的目标的动物。仅以举例的方式，对象可以是但不限于哺乳动物，包括但不限于人类。
术语“增强(enhance/enhancing)”意指增加或延长预期效果的效力或持续时间。以举例的方式，单独或组合“增强”治疗剂的效果是指在效力、持续时间和/或幅度方面增加或延长各剂对疾病、病症或病状的治疗的作用的能力。当在患者中使用时，对于此用途有效的量将取决于疾病、病症或病状的严重性和病程；先前的疗法；患者的健康状态和对于药物的反应；以及治疗医师的判断。
术语“调节”意指直接或间接地与靶标(例如，FGF受体)相互作用，以便改变靶标的活性，包括(仅以举例的方式)增强靶标的活性、抑制或拮抗靶标的活性、限制靶标的活性或延长靶标的活性。在一些实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽和药物组合物可以调节一种或多种相应靶标(例如，一种或多种FGF受体)的活性。在一些实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽调节(例如，增加)细胞(例如，角膜内皮细胞)上的一种或多种FGF受体的活性，导致例如细胞迁移和/或细胞增殖。
如本文所用，术语“靶标”是指能够被选择性结合剂(例如，修饰FGF)或本文所述的药物组合物结合的生物分子(例如，靶蛋白或蛋白复合物)，诸如FGF受体，或生物分子的一部分。如本文所用，术语“非靶标”是指未被选择性结合剂或本文所述的药物组合物选择性结合的生物分子或生物分子的一部分。
术语“靶标活性”或“细胞反应”是指能够通过修饰FGF调节的生物活性或者由修饰FGF与FGF受体的结合所致的任何细胞反应。某些示例性靶标活性和细胞反应包括但不限于结合亲和力、信号转导、基因表达、细胞迁移、细胞增殖、细胞分化和与眼部疾病、病症或病状相关联的一种或多种症状的改善。
术语“疱疹性角膜炎”、“单纯疱疹性角膜炎”、“HSK”、“疱疹性角膜病变”、“疱疹性角膜”和“疱疹性角膜结膜炎”是指通常由单纯疱疹病毒(HSV)引起的眼部疾病、病症或病状。
修饰FGF-1多肽的表达和成熟形式
FGF刺激一个家族七种FGF受体同种型，并且每种FGF刺激不同模式的受体以实现其特定效果。参见例如，Ornitz等人,(1996)The Journal of biological chemistry,1996,271(25):15292-7；Zhang等人,(2006)The Journal of biological chemistry,2006,281(23):15694-700)。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽是优选的，因为它结合并刺激所有七种FGF受体同种型。参见Ornitz等人,(1996)The Journal of biologicalchemistry,1996,271(25):15292-7。
本文所公开的实施方案涉及一种修饰FGF-1多肽或包含修饰FGF-1多肽的药物组合物(例如，眼用制剂)。本文所公开的实施方案还涉及一种通过施用修饰FGF-1多肽或包含修饰FGF-1多肽的药物组合物(例如，眼用制剂)来治疗化学损伤或起疱损伤的方法。如本文所用，修饰FGF-多肽是指包含SEQ ID NO:1的一个或多个不同氨基酸残基的取代或突变、和/或一个或多个氨基酸残基的一个或多个缺失、和/或一个或多个氨基酸残基的一个或多个添加的重组FGF。
在第一实施方案中，本文提供一种修饰FGF-1多肽，其包含示出为SEQ ID NO:1的序列，具有一个或多个突变，其中修饰多肽还包含在SEQ ID NO:1的第一个残基上游的甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，包含N-末端甲硫氨酸(N-Met)残基的修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些情况下，根据第一实施方案的修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的一个或多个突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽在宿主细胞中表达为具有在SEQ ID NO:1的第一个残基上游的甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽在成熟期间不经受用于去除N-Met残基的N-末端加工。因此，在一些实施方案中，修饰FGF-1的成熟形式包含N-Met残基和在SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的一个或多个突变。包含N-Met残基的示例性修饰FGF-1序列公开为SEQ ID NO:2。
本公开确定了，如本文所述的修饰FGF-1以成熟形式包含N-Met残基，具有与不具有N-Met残基的型式类似的生物活性。N-末端甲硫氨酸去除或删除是一旦多肽从核糖体形成便发生的共翻译过程。N-末端甲硫氨酸的去除涉及裂解酶甲硫氨酸氨肽酶(metAP)的底物特异性，所述酶识别在具有小侧链的氨基酸残基诸如丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸之前的甲硫氨酸残基。由于这种底物序列特异性，第一实施方案的修饰FGF-1(其包含在苯丙氨酸之前的N-Met残基，参见SEQ ID NO:1的第1位)未被metAP加工。因此，通过将修饰FGF-1表达为具有直接在SEQ ID NO:1上游的甲硫氨酸残基，可以获得包含甲硫氨酸作为其N-末端残基的成熟的修饰FGF-1。在一些实施方案中，根据第一实施方案的修饰FGF-1表达为不具有N-末端肽，并且因此在后续纯化期间不经受用于去除所述肽的蛋白水解裂解。
在第二实施方案中，本文提供一种修饰FGF-1多肽，其包含具有一个或多个突变的示出为SEQ ID NO:1的序列，其中修饰多肽还包含在SEQ ID NO:1的第一个残基上游的甲硫氨酸残基和示出为SEQ ID NO:3的肽的一个或多个氨基酸。包含SEQ ID NO:3的一个或多个残基的肽在本文中称为“延伸肽”。因此，根据第二实施方案的修饰FGF-1包含具有一个或多个突变的示出为SEQ ID NO:1的序列、在SEQ ID NO:1的第一个残基上游的甲硫氨酸残基和位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一个残基之间的延伸肽。在一些实施方案中，包含N-末端甲硫氨酸和位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一个残基之间的延伸肽的修饰FGF-1多肽为多肽的成熟形式。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的一个或多个突变，所述多肽在宿主细胞中表达为具有在SEQ ID NO:1的第一个残基上游的甲硫氨酸且还具有位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一个残基之间的延伸肽。在一些实施方案中，根据第二实施方案的修饰FGF-1多肽表达为具有位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一个残基之间的包含SEQ ID NO:3的五个残基的延伸肽。在一些实施方案中，根据第二实施方案的修饰FGF-1多肽表达为具有位于甲硫氨酸残基与SEQID NO:1的第一个残基之间的SEQ ID NO:3的四个残基。在一些实施方案中，根据第二实施方案的修饰FGF-1多肽表达为具有位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一个残基之间的SEQ ID NO:3的三个残基。在一些实施方案中，根据第二实施方案的修饰FGF-1多肽表达为具有位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一个残基之间的SEQ ID NO:3的两个残基。在一些实施方案中，根据第二实施方案的修饰FGF-1多肽表达为具有位于甲硫氨酸残基与SEQID NO:1的第一个残基之间的SEQ ID NO:3的一个残基。延伸肽的示例性序列包括SEQ IDNO:4-8。
在一些情况下，第二实施方案的修饰FGF-1多肽包含延伸肽和N-末端甲硫氨酸残基，不经受用于去除甲硫氨酸残基的N-末端加工，而在一些情况下，甲硫氨酸通过裂解酶被删除。通常，裂解酶是甲硫氨酸氨肽酶(metAP)。因此，在一些实例中，根据第二实施方案的修饰FGF-1多肽的成熟形式包含在如本文所述的延伸肽之前的N-Met残基。包含N-末端甲硫氨酸和位于甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一个残基之间的延伸肽的一个或多个残基的根据第二实施方案的修饰FGF-1多肽的成熟形式的示例性序列示出为SEQ ID NO:9-13，其中所述序列还包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸处的一个或多个突变。包含N-末端甲硫氨酸和延伸肽的成熟的修饰FGF-1多肽的额外示例性序列示出为SEQ ID NO:14-18。在一些其他实例中，根据第二实施方案的修饰FGF-1多肽的成熟形式不包含N-Met残基但仅包含延伸肽。包含位于SEQ ID NO:1的第一个残基上游的延伸肽的根据第二实施方案的修饰FGF-1多肽的成熟形式的示例性序列示出为SEQ ID NO:19-23，其中所述序列还包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸处的一个或多个突变。包含延伸肽的一个或多个残基的成熟的修饰FGF-1多肽的额外示例性序列示出为SEQ ID NO:24-28。在一些实施方案中，当延伸肽以丙氨酸(如SEQ ID NO:4中)或苏氨酸(如SEQ ID NO:5中)开始时，甲硫氨酸残基通过metAP裂解。在那些情况下，成熟的FGF-1多肽不包含N-末端甲硫氨酸残基，例如SEQ ID NO:19、21、24和26。
在第三实施方案中，本文提供一种修饰FGF-1多肽，其包含示出为SEQ ID NO:1的序列，具有一个或多个突变，其中修饰多肽还包含位于SEQ ID NO:1的第一个残基上游的延伸肽。在一些实施方案中，包含延伸肽的修饰FGF-1多肽是多肽的成熟形式。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的一个或多个突变，所述多肽在宿主细胞中表达为具有位于SEQ ID NO:1的第一个残基上游的延伸肽的一个或多个氨基酸残基。表达为不具有N-末端甲硫氨酸的包含延伸肽的修饰FGF-1多肽的示例性序列示出为SEQ ID NO:19-23，其中所述序列还包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸处的一个或多个突变。包含延伸肽的一个或多个残基并且表达为不具有N-末端甲硫氨酸残基的成熟的修饰FGF-1多肽的额外示例性序列示出为SEQ ID NO:24-28。
在第四实施方案中，本文提供一种修饰FGF-1多肽，其包含示出为SEQ ID NO:1的序列，具有一个或多个突变，其中修饰多肽还包含SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的修饰FGF-1多肽为多肽的成熟形式。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的一个或多个突变，其中SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个是缺失的。在一些情况下，包含截短的修饰FGF-1多肽表达为具有N-末端甲硫氨酸残基。例如，根据第四实施方案的修饰FGF-1多肽可以具有其中N-Met残基在SEQ ID NO:1的第二个残基天冬酰胺之前的序列。在一些情况下，修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第三个残基亮氨酸之前的N-Met残基。在一些情况下，修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第四个残基脯氨酸之前的N-Met残基。在一些情况下，修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第五个残基脯氨酸之前的N-Met残基。延伸肽可以位于N-Met残基与SEQ ID NO:1的第一个、第二个、第三个、第四个或第五个残基之间。根据第四实施方案的修饰FGF-1多肽的成熟形式的实例，其中N-Met残基在SEQ ID NO:1的第二个、第三个、第四个或第五个残基之前，显示于SEQ ID NO:37-40中，其中所述序列还包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸处的一个或多个突变。包含截短和N-Met残基的修饰FGF-1多肽的额外实例提供于SEQ ID NO:41-44中。
本公开还涉及包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变的修饰FGF-1多肽，其中多肽表达为具有在延伸肽之前的N-Met残基，并且延伸肽在SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短之前。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的一个或多个突变，其中多肽表达为具有在延伸肽之前的N-Met残基，并且延伸肽在SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短之前。表达为具有在延伸肽之前的N-Met残基的此类序列的实例，所述延伸肽在SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短之前，公开为SEQ ID NO:45-68，其中所述序列还包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸处的一个或多个突变。在一些实例中，N-末端甲硫氨酸通过N-末端加工被裂解掉，并且因此，修饰FGF-1多肽的成熟形式仅包含在SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短之前的前导片段的一个或多个残基，如SEQ ID NO:69-92中所例示，其中示例性序列还包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸处的一个或多个突变。不具有N-Met残基但包含延伸肽和N-末端残基的截短的序列的额外实例提供于SEQ ID NO:93-117中。
在一些实例中，N-Met残基保留在成熟的修饰FGF-1多肽序列中，并且因此，成熟形式包含如SEQ ID NO:45-68中所例示的序列，还包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸处的一个或多个突变。包含N-Met残基、延伸肽和N-末端残基的截短的序列的额外实例提供于SEQ ID NO:118-141中。
在第五实施方案中，包含在SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的一个或多个突变的修饰FGF-1多肽的截短型式表达为不具有N-末端甲硫氨酸残基且还不具有延伸肽。在一些实例中，根据第五实施方案的成熟的修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:29-32中所示的序列，其中所述序列还包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸处的一个或多个突变。在一些实例中，根据第五实施方案的修饰FGF-1多肽包含选自SEQ IDNO:33-36的序列。
在包含在SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的一个或多个突变的修饰FGF-1多肽或其截短型式表达为具有在延伸肽之前的N-末端甲硫氨酸的情况下，在表达之后，甲硫氨酸残基保留或在多肽成熟期间从N-末端裂解掉。在一些实例中，在修饰FGF-1多肽表达为具有在N-Met残基旁边的丙氨酸的情况下，例如SEQ ID NO:14，甲硫氨酸被裂解，以得到不包含N-Met残基的成熟FGF-1多肽，例如SEQ ID NO:19。在一些实例中，在修饰FGF-1多肽表达为具有在苏氨酸-Met残基旁边的苏氨酸的情况下，例如SEQ ID NO:16，甲硫氨酸被裂解，以得到不包含N-Met残基的成熟FGF-1多肽，例如SEQ ID NO:20。在一些实例中，在修饰FGF-1多肽表达为具有在N-Met残基旁边的谷氨酸的情况下，例如SEQ ID NO:17，甲硫氨酸不被裂解，以得到包含N-末端甲硫氨酸并且具有与表达形式相同的序列的成熟FGF-1。
在第六实施方案中，本文提供了一种修饰FGF-1多肽，其包含示出为SEQ ID NO:1的序列，包含在67位的突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第67位的突变，在第12、16、66、117和134位的一个或多个另外的突变，并且表达为具有N-Met残基。在第67位的内部甲硫氨酸可以被例如丙氨酸残基替代。在不存在第67位的内部甲硫氨酸的情况下，修饰FGF-1多肽的N-末端甲硫氨酸可以在表达后，使用溴化氰(CNBr)(特异性裂解甲硫氨酸残基之后的酰胺键的剂)进行裂解。在一些情况下，根据第六实施方案的修饰FGF-1多肽表达为具有延伸肽。在一些其他情况下，根据第六实施方案的修饰FGF-1多肽以包含SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的形式表达，如SEQ ID NO:142-149中所例示，其中所述序列还包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸处的一个或多个突变。在其他实例中，根据第六实施方案的修饰FGF-1多肽以包含延伸肽和SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的形式表达，如SEQ ID NO:151-175中所例示。根据第六实施方案的修饰FGF-1多肽的额外实例以其成熟形式示出于SEQ ID NO:174-204中。在以包含内部甲硫氨酸突变的形式表达的修饰FGF-1多肽中，在多肽表达为具有在延伸肽的丙氨酸或苏氨酸残基之前的N-末端甲硫氨酸的情况下，分别地例如SEQ IDNO:175和SEQ ID NO:177，N-末端甲硫氨酸可以在多肽成熟期间通过metAP或使用CNBr裂解掉。
在第七实施方案中，本文提供了一种修饰FGF-1多肽，其包含示出为SEQ ID NO:205的序列，用于在本文所述的方法中使用。在第八实施方案中，本文提供了一种修饰FGF-1多肽，其包含示出为SEQ ID NO:206的序列，用于在本文所述的方法中使用。
本公开还涉及修饰FGF-1多肽，其包含SEQ ID NO:1的缺失、插入和取代的任何组合，条件是所述修饰多肽包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变。可以将氨基酸取代引入到修饰FGF-1多肽中，并且针对所需活性筛选产物，活性例如在治疗眼部病症中保留/改善的有效性、在改善Fuch营养不良中增加的效力、改善芥子气角膜病变的治疗。还可以将氨基酸取代引入修饰FGF-1多肽中，并且针对所需物理化学特性筛选产物，特性例如不易聚集、改善的溶解度、延长的半衰期、配制为眼用药物的简便性、增强的稳定性、改善的储存期。考虑了保守和非保守氨基酸取代。
如任何上述实施方案中任一项，修饰FGF-1多肽以包含至少136个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含137个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含138个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含139个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含140个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含141个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含142个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含143个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含144个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含145个氨基酸的形式表达。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽以包含146个氨基酸的形式表达。
如在上文实施方案中的任一项中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含至少136个氨基酸。在一些实例中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含137个氨基酸。在一些实例中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含138个氨基酸。在一些实例中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含139个氨基酸。在一些实例中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含140个氨基酸。在一些实例中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含141个氨基酸。在一些实例中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含142个氨基酸。在一些实例中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含143个氨基酸。在一些实例中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含144个氨基酸。在一些实例中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含145个氨基酸。在一些实例中，修饰FGF-1多肽以成熟形式包含146个氨基酸。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与SEQ ID NO:1的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽以多肽的成熟形式包含N-Met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:9-13的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽以其成熟形式包含N-Met残基，并且多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:14-18的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽以其成熟形式包含N-Met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:19-23的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽以其成熟形式不包含N-Met残基，并且多肽包含在对应于SEQID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:24-28的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽以其成熟形式不包含N-Met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:19-23的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽以其成熟形式不包含N-Met残基，并且多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQID NO:37-40的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽以其成熟形式包含N-Met残基，并且多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:41-44的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽以其成熟形式包含N-Met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:45-68的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸位置处的一个或多个突变，并且所述多肽以其成熟形式不包含N-Met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:69-92的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，包含在对应于SEQID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸位置处的一个或多个突变，并且所述多肽以其成熟形式包含N-Met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ IDNO:93-117的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽以其成熟形式不包含N-Met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:118-141的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽以其成熟形式包含N-Met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:29-32的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，条件是所述多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的氨基酸位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:33-36的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:142-204的任一序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含与在第12位突变(例如，突变Lys12Val)的SEQ ID NO:1的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第12位的突变，例如突变Lys12Val，并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-Met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第12位的突变，例如突变Lys12Val，具有延伸肽并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1突变包含具有在SEQ ID NO:1的第12位的突变，例如突变Lys12Val的序列，其中多肽还包含在SEQ ID NO:1的第67位的甲硫氨酸的突变，并且表达为具有N-末端甲硫氨酸，所述甲硫氨酸从成熟形式的多肽被裂解掉。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含与在第16位突变(例如，突变Cys16Ser)的SEQ ID NO:1的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第16位的突变，例如突变Cys16Ser，并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:16的第16位的突变，例如突变Cys16Ser，具有延伸肽并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1突变包含具有在SEQ ID NO:1的第16位的突变，例如突变Cys16Ser的序列，其中多肽还包含在SEQ ID NO:1的第67位的甲硫氨酸的突变，并且表达为具有N-末端甲硫氨酸，所述甲硫氨酸从成熟形式的多肽被裂解掉。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含与在第66位突变(例如，突变Ala66Cys)的SEQ ID NO:1的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第66位的突变，例如突变Ala66Cys，并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第66位的突变，例如突变Ala66Cys，具有延伸肽并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1表达为具有N-Met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1突变包含具有在SEQ ID NO:1的第66位的突变，例如突变Ala66Cys的序列，其中多肽还包含在SEQ IDNO:1的第67位的甲硫氨酸的突变，并且表达为具有N-末端甲硫氨酸，所述甲硫氨酸从成熟形式的多肽被裂解掉。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含与在第117位突变(例如，突变Cys117Val)的SEQ ID NO:1的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第117位的突变，例如突变Cys117Val，并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第117位的突变，例如突变Cys117Val，具有延伸肽并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1突变包含具有在SEQ ID NO:1的第117位的突变，例如突变Cys117Val的序列，其中多肽还包含在SEQ ID NO:1的第67位的甲硫氨酸的突变，并且表达为具有N-末端甲硫氨酸，所述甲硫氨酸从成熟形式的多肽被裂解掉。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含与在第134位突变(例如，突变Pro134Val)的SEQ ID NO:1的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第134位的突变，例如突变Pro134Val，并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第134位的突变，例如突变Pro134Val，具有延伸肽并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1突变包含具有在SEQ ID NO:1的第134位的突变，例如突变Pro134Val的序列，其中多肽还包含在SEQ ID NO:1的第67位的甲硫氨酸的突变，并且表达为具有N-末端甲硫氨酸，所述甲硫氨酸从成熟形式的多肽被裂解掉。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含与在SEQ ID NO:1的第16、66和117位以例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val突变的SEQ ID NO:1的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第16、66和117位的突变，具有例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含具有在SEQ ID NO:1的第16、66和117位的突变，具有例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，具有延伸肽，并且具有SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短的序列，其中所述修饰FGF-1多肽包含N-met残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1突变包含具有在SEQ ID NO:1的第16、66和117位的突变，具有例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val的序列，其中多肽还包含在SEQ ID NO:1的第67位的甲硫氨酸的突变，并且表达为具有N-末端甲硫氨酸，所述甲硫氨酸从成熟形式的多肽被裂解掉。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与选自SEQ ID NO:2和9-204的序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的序列包含与SEQ ID NO:205或206的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽是热稳定的。如本文所用，热稳定的FGF(例如，热稳定的FGF-1)是指相对于SEQ ID NO:1具有修饰的氨基酸序列的FGF，其也比在相同序列下的SEQ ID NO:1的多肽更稳定。能够赋予FGF(例如，FGF-1)热稳定性的突变的实例和用于评估热稳定性的方法描述于例如美国专利号7,790,682、7,595,296、7,696,171、7,776,825、7,659,379、8,119,776、8,153,770、8,153,771和8,461,111；美国专利申请号2011/0224404和2013/0130983；以及Xia等人,PloS one.(2012)7(11):e48210中。在一些实施方案中，FGF-1中的第12和/或134位发生突变以生成热稳定的修饰FGF-1。FGF-1制剂可以被认为在某一温度下“稳定”一段时间，其被理解为其中的FGF-1在指定温度下以其原始纯度和形式存在指定时间的制剂。在一些实施方案中，如果单体形式中的降解或变化小于5％、小于2％或优选地小于1％，则FGF-1可以被视为保持其原始纯度和形式。这种变化可以通过本文所讨论的任何分析程序来检测，例如色谱程序、ELISA、SDS-PAGE和蛋白质印迹。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含减少反应性硫醇(例如，游离半胱氨酸)数的一个或多个修饰。FGF-1中此类修饰的实例描述于例如美国专利号7,790,682、7,595,296、7,696,171、7,776,825、7,659,379、8,119,776、8,153,770、8,153,771和8,461,111；美国专利申请号2011/0224404和2013/0130983；以及Xia等人,PloS one.(2012)7(11):e48210中。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1中的第83和/或117位发生突变以生成减少反应性硫醇数的修饰FGF-1。
在一些实施方案中，修饰FGF包含使得能够形成内部二硫键联的一个或多个修饰。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1中的第66位发生突变以生成包含内部二硫键联的修饰FGF-1。
在一些实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽可以在制剂中不具有外源性肝素的情况下施用以实现稳定性，它们可以在不具有肝素的情况下配制并应用，并且因此更能够结合组织乙酰肝素。此类修饰FGF-1多肽对在手术、创伤或营养不良状况和疾病状态中暴露的组织乙酰肝素具有高亲和力，并且因此在应用时与患病组织结合。此外，热稳定性更强的修饰FGF-1多肽适合于在室温下配制和储存。修饰FGF-1多肽的稳定性还使它们适合于以溶液(例如，即刻释放)和持续释放制剂的形式施用。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽是在第12、16、66、117和134位中的一个或多个处修饰SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，修饰FGF是在第16、66和117位修饰的SEQ ID NO:1。氨基酸位置可以被例如Ser、Cys、Val或其他氨基酸取代以在修饰的氨基酸与野生型氨基酸之间产生二硫键联。在一些实施方案中，修饰FGF包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，还称为N-Met THX1114。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含一个或多个选自以下的突变：Lys12Val、Pro134Val、Ala66Cys、Cys117Val和Pro134Val。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含序列SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽或组合物可以制备为前药。“前药”是指在体内转化为母体药物的剂。前药往往是有用的，因为在一些情况下，它们可以比母体药物更容易施用。例如，它们可以通过口服施用而可生物利用，而母体药物并非如此。前药在药物组合物中还可以具有相对于母体药物改善的溶解性。
本文所述的修饰FGF-1多肽可以用同位素(例如用放射性同位素)或通过其他方式进行标记，包括但不限于使用发色团或荧光部分、生物发光标记、光激活或化学发光标记。
本公开还涉及包含N-末端修饰的修饰FGF多肽，其中修饰FGF多肽可以是FGF家族的任一成员，包括FGF-1(SEQ ID NO:1)、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、和FGF-23和FGF-24。
在一些实施方案中，如本文所述的修饰FGF-1多肽的合成是使用本领域中所述的手段、使用本文所述的方法或其组合来完成的。
在一些实施方案中，修饰FGF的序列包含与在第16、66和117位中的一个或多个处以例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val突变的SEQ ID NO:1的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，修饰FGF包含具有在第16、66和117位的突变(例如突变Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val)的野生型人FGF-1序列。
用于制备修饰FGF-1多肽的重组技术
可以利用多种宿主表达载体系统来产生本文所提供的修饰FGF-1多肽。此类宿主表达系统代表可以借以产生并随后纯化修饰FGF-1多肽的载体，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表现出修饰基因产物的细胞。宿主表达系统的实例包括但不限于细菌、昆虫、植物、哺乳动物，包括人类宿主系统，诸如但不限于用重组病毒表达载体(例如，杆状病毒(baculovirus))感染的昆虫细胞系统，所述载体含有编码修饰FGF-1多肽的核苷酸序列；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaicvirus)，CaMV；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)，TMV)感染或用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统，所述载体含有修饰FGF-1多肽的编码序列的；或携带含有启动子的重组表达构建体的哺乳动物系统，包括人类细胞系统，例如HT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3，所述启动子来源于哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)，或来源于哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；疫苗病毒7.5K启动子)，或来源于酵母来源的质粒(例如，pSH19和pSH15)，或来源于噬菌体(诸如λ期及其衍生物)。细菌表达系统的实例包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)来源的质粒(例如，pMKet、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13和pET-3)；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的质粒(例如，PUB110、pTP5和pC194)。在一些实施方案中，细菌表达系统包含pMKet载体。在一些实施方案中，与包括将编码修饰FGF-1的序列亚克隆至pET载体中的方法相比，包括使用pMKet细菌表达载体表达修饰FGF-1的方法将修饰FGF-1的产量提高约5倍至约60倍。在一些实施方案中，在发酵轮次之后，包括将修饰FGF1亚克隆于pET载体中的方法产生约0.5g-约0.7g/100L的产量。在一些实施方案中，在发酵轮次之后，包括将修饰FGF1亚克隆于pMKet载体中的方法产生约20g-约40g/100L的产量，例如，37g/100L。在一些实施方案中，包括将修饰FGF1亚克隆于pMKet中以及使用本文所述的方法纯化来自载体的蛋白质的方法产生约82g/50L的产量。
在一些实施方案中，选择宿主细胞株，使得其调节插入序列的表达，或以期望的特定方式修饰并加工基因产物。此类对蛋白质产物的修饰和加工可能对蛋白质的功能而言是重要的。不同宿主细胞具有翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保对表达的外来蛋白质进行正确的修饰和加工。为此，可以使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞，包括人类宿主细胞，包括但不限于HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38。
在一些实施方案中，将细菌细胞用于表达重组FGF蛋白。在一些实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，大肠杆菌菌株选自BL21、BLA21A1、K12 HMS174和W3110。为了长期、高产量地产生重组肽，稳定表达是期望的。例如，可以将稳定表达重组修饰FGF-1多肽的细胞系工程化。在一些实施方案中，可以用受适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择标志物转化宿主细胞，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。在一些实施方案中，将包含编码FGF-1多肽的序列的重组核酸优化，以便使表达它的菌株或细胞的密码子使用最大。在一些实施方案中，包含编码FGF-1多肽的序列的重组核酸被可操作地连接至启动子3'UTR调控序列，例如poly A序列或稳定转录物的序列，并且帮助翻译。在一些实施方案中，质粒载体包含选择标志物，诸如抗生素抗性基因，诸如卡那霉素。
在一些实施方案中，用于细菌表达的启动子是T7启动子。
在一些实施方案中，用于细菌表达的启动子是Tac启动子。
在一些实施方案中，质粒包含pBR322 ori序列。
在一些实施方案中，细菌表达载体是从可商购获得的载体主链修饰的，诸如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13和pET-T3或pET-T7载体。
在一些实施方案中，预期蛋白质的周质表达。重组蛋白可能在包涵体中积累。在一些实施方案中，预期蛋白质的细胞质表达。在一些实施方案中，预期蛋白质的细胞质表达，其中蛋白质是不溶性蛋白质。在一些实施方案中，可能需要重组多肽以实现细胞外释放。在一些实施方案中，编码多肽的重组核酸可以包含合适的前导序列，诸如ompA前导序列。在一些实施方案中，编码修饰FGF-1多肽的重组核酸不包含前导序列，诸如ompA前导序列。在一些实施方案中，在制造期间，修饰FGF-1多肽在特定步骤中被引导至周质空间。周质空间包含包涵体，多肽可能在其中积累。然后可以在回收多肽的细胞分级分离之后收获包涵体。在一些实施方案中，重组核酸不包含前导序列。在一些实施方案中，修饰FGF-1被引导用于细胞中的细胞质表达。
在一些实施方案中，重组核酸构建体包含用于增加来自细胞的修饰FGF-1多肽的产量的一种或多种修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰包括使修饰FGF-1多肽在细胞中的表达增加的序列优化。在一个实施方案中，一种或多种修饰包括质粒中的修饰。在一个实施方案中，一种或多种修饰包括选择合适的启动子，以便增加来自细胞的修饰FGF-1多肽的产量。
在另外的实施方案中，考虑一种或多种修饰来开发用于表达多肽的宿主细胞。在一些实施方案中，可以考虑一种或多种修饰，从而调整足够的营养培养基以便使细胞增殖最大。在一个实施方案中，足够的营养培养基包含碳源。在一个实施方案中，碳源是葡萄糖或甘油。
在一个实施方案中，在质粒中进行一种或多种修饰以增加质粒在宿主细胞中的拷贝数和表达效率。在一个实施方案中，考虑一种或多种修饰，以便使来自细胞的修饰FGF-1多肽的产量最大，其中一种或多种修饰可以选自：
i.在编码突变FGF-1多肽的重组核酸内的修饰；
ii.在包含一个或多个与编码突变FGF-1多肽的重组核酸相关的调控元件的重组核酸内的修饰，调控元件选自启动子、增强子、5'-非翻译区、3'-非翻译区、poly A尾、转录物稳定元件；
iii.对包含重组核酸的质粒的修饰；
iv.对细胞株的修饰或对细胞株的选择，以便使细胞增殖最大；
v.对细胞生长培养基的改良；以及
vi.从细胞回收修饰FGF-1多肽的过程中的修饰。
在一些实施方案中，用质粒电穿孔或化学转化细菌细胞，所述质粒包含有包含编码FGF-1多肽的序列的重组核酸。在引入外来DNA后，可以使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基。在一些实施方案中，使用一种或多种碳源，以便使细菌细胞生长在一段时间内最大，从而扩增表达的FGF多肽以实现产量增加。在一些实施方案中，细菌细胞的碳源可以是葡萄糖。在一些实施方案中，细菌细胞的碳源可以是甘油。
重组质粒中的可选择标志物赋予选择抗性并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中，并且生长以形成基因座，细胞转而可进行克隆并扩增成细胞系。在一些实例中，所述方法可以有利地用于工程化表达修饰FGF-1多肽产物的细胞系。此类工程化细胞系可能特别可用于筛选和评价影响基因产物的生物学的化合物。
本文所述的生产方法可以容易地扩展以形成表达修饰FGF-1的细菌培养物的大规模生产。在一些实施方案中，所述方法可以扩展以在1L细菌培养物、或10L细菌培养物、或100L细菌培养物、或500L细菌培养物中产生FGF-1。在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生1g修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生10g修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生100g修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生1Kg修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生10Kg修饰FGF-1多肽。在一些实施方案中，所述方法可以扩展成每批产生100Kg修饰FGF-1多肽。
通常，种子培养物从转化的细菌细胞形成。孵育的种子瓶可在约235RPM和37℃下孵育。孵育10-14h之后，可以测试来自每个烧瓶的种子培养物样品的纯度(湿片(wetmount)的显微镜观察，未观察到污染生物体)、pH、在600nm下的光密度(OD600)和无菌性保持。种子培养物需要通过证明OD600≥1.0并且没有污染生物体来表现出最佳生长。可以选择来自每个产生轮次的六个种子瓶用于放大。选择标准可以包括生长时间12±2h、OD600≥1.0以及具有六个烧瓶。为了产生发酵罐接种物，可以将六个烧瓶的内容物汇集到10L袋(无菌一次性生物过程容器)中的BSC中，总种子培养体积为大约六升。
可以制备一个或多个150L发酵罐以便用生产培养基(其包含营养物质，例如大豆胨(soytone)12g/L、酵母提取物24g/L、甘油15.1g/L、磷酸氢二钾12.5g/L、磷酸二氢钾3.8g/L和P2000消泡剂0.1mL/L)发酵所培养的表达mFGF-1的大肠杆菌。将生产培养基原位灭菌。然后将无菌培养基补充5±0.1L无菌溶液，所述溶液含有七水硫酸镁0.4g/L、卡那霉素0.050g/L。可以将一个或多于一个发酵罐在适当的时间用六升汇集的种子培养物接种。然后每60±30min监测一次发酵培养物，并且针对pH、纯度(湿片的显微镜观察)和OD600对样品进行处理。可以通过控制搅拌和空气流速来维持溶解氧。可以通过适当地无菌添加磷酸和/或氢氧化铵来将pH维持在期望的范围内。
在一些实施方案中，当培养物在接种后3小时达到约4.5的OD600时，以添加0.2-0.4g/L异丙基-β-D-1-硫代-吡喃半乳糖苷(IPTG)和5.0g/L L-阿拉伯糖诱导mFGF-1的表达。在一些实施方案中，在具有或不具有卡那霉素的情况下，使用浓度约1mM或0.25mM IPTG用于诱导。在一些实施方案中，在卡那霉素存在下的诱导不是增加质粒保留和细胞活力所需的，但是影响修饰FGF-1多肽的产生。在一些情况下，诱导时长为约8-12小时、约10-20小时、约20小时或约24小时。在一些情况下，在1L规模下，在卡那霉素存在下的修饰FGF-1多肽的产量(如通过最终OD/细胞糊(g/L)所测量)是不存在卡那霉素的情况的约1.1至约5倍，例如1.2倍。对于诱导，在一些实施方案中，碳源是甘油，例如浓度为至少约30g/L，温度为约37℃，并且pH为约6.8。在诱导之后，可以再继续发酵三小时。在离心之前，可以从每个发酵罐中取出样品以便通过SDS-PAGE和培养物纯度进行分析。可以间歇地评价发酵并且可以使发酵再生长1-20小时。在一些实施方案中，最终培养物达到50-100、50-200、50-250、70-260或约100、200或250的光密度。
在一些实施方案中，各批的收获可以通过经由蠕动泵和管材将发酵液转移至离心机(每分钟0.5-0.8升)并且在使用水循环夹套冷却的同时在20,000x g下离心来进行。可以测量收获的细胞糊的质量、将细胞糊收集、分到四个容器中，并且放置在≤-70℃的冰箱中。
细胞裂解：可以在合适的时间解冻冷冻的包含FGF-1的细胞，并且将它们重新悬浮于合适的缓冲液中，例如，缓冲液可以包含Tris和EDTA。在示例性实施方案中，可以在含有1mM DTE的TES缓冲液(50mM Tris，20mM EDTA，100mM NaCl，pH7.4)中解冻细胞，比率为1:5(w/v)，即1克细胞糊在5mL缓冲液中。可以将悬浮液冷却至低于16℃，之后运行通过高压匀化器。在每次通过之后监测OD600，直到没有显著下降。然后可以将等体积的TES+5％ TritonX-100混合至破裂细胞悬浮液中。破裂细胞悬液可用于回收表达的FGF-1蛋白。可以通过使裂解液通过特定捕获方法，诸如填充有基于琼脂糖的树脂(例如，高交联的基于琼脂糖的树脂，诸如，CaptoTM DeVirs(Cytiva,BPG 300x500,部件号17-5466))的亲和柱(其特异性结合FGF-1并且之后被洗脱)来从破裂细胞收集表达的蛋白质。然而，为了使FGF-1回收率和产量最大，可以引导蛋白质在IB中表达，并且可以从包涵体中收集蛋白质。在示例性方法中，可以在4℃下，以15,900x g将混合物离心60min，以收集含有mFGF-1的包涵体。裂解之后，可以通过离心，从来自大肠杆菌糊的包涵体(IB)回收过表达的蛋白质。
在一些实施方案中，与其他捕获方法相比，使用填充有基于琼脂糖的树脂(例如，CaptoTM DeVirs)的亲和柱的捕捉方法使收集的FGF-1多肽的产量百分比增加约1％至约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约30％至约35％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％、约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约100％。
从包涵体回收：在示例性实施方案中，对于FGF-1的回收，可以将细胞糊在2-8℃下解冻，重新悬浮于合适的缓冲液中。缓冲液可以包含Tris和EDTA。例如，可以在4.5L pH 7.4的TES缓冲液(50mM Tris,100mM NaCl,20mM EDTA)中解冻细胞糊，然后可以通过压力匀化将细胞裂解。可以进行五次匀化(大约8,000psi)以实现最大细胞裂解。然后可以将等体积的TES缓冲液和5％ Triton X-100pH 7.4添加至裂解液中，以获得2.5％ Triton浓度。
可以方便时将混合物分至6-20个离心瓶中，然后将其在以225RPM摇动的情况下，在大约15-20℃下孵育至少30min。可以将瓶子在15,900x g和4℃下离心60min。上清液作为废物被丢弃。使用组织匀化器(型号Omni GLH850)，将回收的包涵体单独地重新悬浮于具有2.5％(w/v)Triton X-100的TE缓冲液(约1L，50mM Tris，20mM EDTA，pH 7.4)中，并且将瓶子在以225RPM摇动的情况下在15-20℃下孵育至少30min。孵育之后，将瓶子在15,900x g和4℃下离心45min。包涵体洗涤过程悬浮、孵育和离心进行总计三次。回收的包涵体可以在2℃-8℃下储存过夜。包涵体用不具有Triton的TE缓冲液(约1L，50mM Tris，20mM EDTA，pH7.4)洗涤，并且将瓶子在以225RPM摇动的情况下在15-20℃下孵育至少15min。在一些实施方案中，IB可以在包含聚山梨酯20或聚山梨酯80的缓冲液中洗涤。孵育之后，将瓶子在15,900x g和4℃下离心30min。在没有Triton的情况下的洗涤、孵育和离心可以进行总计五次。在此阶段，可以取出样品并提交用于总蛋白质和SDS-PAGE考马斯染色/密度测定分析。在一些实施方案中，可以回收总共100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000g包涵体。含有每批的洗涤的包涵体的离心瓶可以在≤-70℃下储存。
洗涤的包涵体的溶解：可以使用溶解缓冲液对每批的洗涤的包涵体进行溶解。溶解缓冲液可以包含离液组分，诸如尿素或胍盐。洗涤的包涵体可以从储存中取出并在2-8℃下解冻(15h-19h)。包涵体可在15,900x G、4℃下离心60min，并且在去除液相之后，确定沉淀物的净重。然后可以将包涵体溶解在缓冲液中。示例性溶解缓冲液可以包含4-8M胍。示例性溶解缓冲液可以包含6M胍。示例性溶解缓冲液可以包含4-6M尿素。此外，此类缓冲液可以包含100mM Tris、2mM EDTA(pH 8.0)。可以使用组织匀化器(例如，型号Omni GLH850)，在2-8℃下以10mL/g的比率在10,000RPM下混合缓冲液，直到溶液视觉上均一。胍是导致蛋白质变性的离液剂。可以在2-8℃下将最终浓度10mg/mL的二硫赤藓糖醇(DTE)用于溶解的包涵体，以将二硫键还原为硫醇。这个反应可能持续2-6小时。然后可将溶解的包涵体在15,900xg和4℃下离心40min。包括离心在内的完整过程可能少于五小时。可以将上清液收集到2LPETG瓶中并在2-8℃下储存(25-50min)，同时测试蛋白质浓度。基于蛋白质结果，可以用稀释缓冲液(6M胍，100mM Tris，2mM EDTA，pH 8.0)将溶解的包涵体稀释至目标浓度2.0±0.5mg/mL。可以添加DTE之目标浓度10mg/mL并且混合。可以在≤-70℃下储存溶解的包涵体。可以10mL缓冲液/克IB的比率，将IB溶解于含6M盐酸胍的100mM Tris，2mM EDTA，pH 8.0中。可以添加DTE(10mg/ml)，并且在混合(初始用组织匀化器Polytron PT 3100，接着用磁力搅拌棒)3-5h之后，可以将混合物离心(15,900x g≥40min)。可以使上清液过滤通过0.45μm过滤器。
变性蛋白质的复性：可以将胍溶解的IB(2±0.5mg/mL)添加至冷缺的复性缓冲液中。复性缓冲液可以包含L-精氨酸。(例如，0.5ML-精氨酸，100mM Tris，2mM EDTA，pH 9.5)。在一些实施方案中，复性缓冲液可以含有氧化型谷胱甘肽。在一些实施方案中，复性缓冲液可以含有还原型谷胱甘肽。可以将溶解的mFGF-1缓慢(例如，逐滴)添加至复性溶液的涡旋中，并且在2-8℃下继续混合2h。可以将等体积的3M硫酸铵添加至复性溶液中并且在2-8℃下搅拌1h。
可以通过SDS-PAGE检测回收的蛋白质。总蛋白质含量可以通过本领域已知的一种或多种方法测量。例如，总蛋白质含量可以通过在SDS-PAGE中拆分的蛋白质的考马斯染色来测量。回收的蛋白质可以使用HPLC(例如，尺寸排阻色谱法(SEC)-HPLC)进一步纯化。
蛋白质的生物活性可以通过体外细胞增殖测定来评估。为此，可以使用内皮细胞系。在一些实施方案中，成纤维细胞可用于体外增殖测定。
在一些实施方案中，进行一种或多种修饰以提高来自细胞的修饰FGF-1的回收率。一种或多种改善包括：质粒载体的改善；合适的细菌菌株的选择的改善；生长培养基的改善；使用IPTG的诱导时间的改善；细菌的最大生长的孵育时间的改善；以及优化细菌生长的温度。在一些实施方案中，一种或多种修饰导致至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍或至少50倍的修饰FGF-1的产量的增加。
修饰FGF-1多肽中的二硫键形成
在一些实施方案中，本公开的修饰FGF-1多肽包含以下在SEQ ID NO:1中的突变：Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，其中多肽包含在第66与83位的半胱氨酸残基之间的内部二硫键。对于许多重组蛋白，正确二硫键的形成对于获得其生物活性三维构象来说至关重要。错误的二硫键的形成可能导致蛋白质错误折叠和聚集成包涵体。在大肠杆菌中，半胱氨酸氧化通常发生在周质中，其中二硫键在由大量酶(主要来自Dsb家族)催化的二硫键交换反应中形成(Rosano,G.L.和Ceccarelli,E.A.(2014).Recombinant protein expressionin Escherichia coli:advances and challenges.Frontiers in Microbiology,5,172)。相比之下，细胞质中很少形成二硫键。这种情况影响了在细胞质中产生的具有二硫键的重组蛋白的产生，诸如包含在Cys66与Cys83之间的内部二硫键的修饰FGF-1多肽。因此，在一些实例中，选择具有有利于二硫键形成的氧化细胞质环境的工程化大肠杆菌菌株作为宿主细胞，以便表达修饰FGF-1多肽(Rosano,G.L.和Ceccarelli,E.A.(2014).Recombinantprotein expression in Escherichia coli:advances and challenges.Frontiers inMicrobiology,5,172)。此类菌株的实例包括但不限于：Origami(Novagen)，其在K-12背景中具有trxB-gor-基因型；和T7 Express菌株(NEB)，其在BL21(DE3)背景中具有trxB-gor-基因型并且组成性地表达二硫键异构酶DsbC的染色体拷贝。已经显示，DsbC促进将错误氧化的蛋白质校正成其正确形式，并且还是可以帮助折叠不需要二硫键的蛋白质的伴侣蛋白。不受特定理论的束缚，预期由于DsbC的作用，较少的靶蛋白(诸如包含在Cys66与Cys83之间的内部二硫键联的修饰FGF-1多肽)聚集成包涵体。因此，在某些实施方案中，本公开确定了一种用于细胞质产生包含在Cys16与Cys83之间的内部二硫键的修饰FGF-1多肽的改善方法。
在一些实施方案中，在修饰FGF-1多肽表达为具有N-Met残基的情况下，随后对多肽进行纯化，而无需用于去除N-末端肽的需要蛋白水解裂解的步骤。因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种快速纯化本文所述的修饰FGF-1多肽的方法，而不涉及用于去除N-末端肽的蛋白水解裂解步骤。按照良好生产规范(good manufacturing practice，GMP)指南，这对于生产修饰FGF-1多肽来说特别有利。优点包括不含裂解步骤，包括消除对裂解产物进行后续纯化和去除用于裂解的试剂的需要。此举的另一个优点是由于处理减少而产量增加，以及减少了测试为了裂解和后续分离裂解材料与未裂解材料所引入的残余裂解试剂和污染物的需要。
使用方法
在一个实施方案中，本文提供了一种治疗哺乳动物的眼部疾病、病症或病状的方法，该方法包括向哺乳动物施用如上述实施方案中所述的修饰FGF-1多肽或如本文所述的包含所述多肽的药物制剂。在一些情况下，在本文所述方法中使用的修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:2和9-204的序列。在一个实施方案中，本文提供了一种治疗哺乳动物的眼部疾病、病症或病状的方法，该方法包括向哺乳动物施用包含如SEQ ID NO:205或206中所示的序列的修饰FGF-1多肽或如本文所述的包含所述多肽的药物制剂。
在一些实施方案中，待治疗的眼部疾病、病症或病状是角膜内皮层的疾病、病症或病状。角膜内皮层的疾病、病症或病状包括但不限于Fuch营养不良、大疱性角膜病变、先天性遗传性内皮营养不良1、先天性遗传性内皮营养不良2和多形性角膜后层营养不良。
不受理论的束缚，据信前房内注射到眼睛房水中的修饰FGF-1多肽的溶液(例如，如本文所述的药物制剂)结合至内皮表面，并且尤其是角膜没有被健康的内皮层覆盖的任何区域。修饰FGF刺激内皮细胞的生长和迁移。这减少了与内皮营养不良相关联的角膜水肿，并降低了需要角膜或内皮移植的可能性。修饰FGF的作用可以发生在除营养不良最严重的部位(通常在角膜中心)以外的部位，并且还导致对小梁网(TM)中的角膜和内皮祖细胞池中的内皮细胞的刺激。
在一些实施方案中，待治疗的眼部疾病、病症或病状是角膜上皮的疾病、病症或病状。角膜上皮的疾病、病症或病状包括但不限于复发性角膜糜烂、持续性上皮缺陷、干眼综合征、炎性病状诸如Stevens-Johnson综合征和角膜上皮缺陷。
在一些实施方案中，待治疗的眼部疾病、病症或病状是疱疹性角膜病变。疱疹性角膜病变通常是由单纯疱疹病毒(HSV)引起的角膜感染。原发感染可能是宿主粘膜直接暴露于传染性HSV的结果。在原发感染并且在感觉神经节中建立潜伏期之后，病毒可能被刺激以进入感染周期，然后从感染周期回到角膜。一旦出现这种情况，这种复发性感染可能引起各种并发症，尤其是炎性反应，如果炎性反应足够强烈，就可能危害角膜的完整性，导致角膜溃疡、不透明、混浊、瘢痕形成以及在严重的情况下的失明。继发于疱疹感染，可能发展慢性疱疹性角膜病变、神经营养性角膜病变或两者。例如，基质感染是免疫介导的并且是发达国家中角膜失明的主要原因，由于慢性病毒再激活而发生，并且导致神经营养性角膜病变，这是一种退行性病状。正常的角膜密集地受神经支配，但没有血管。原发病毒感染后的后续发作不仅可能损害神经，导致角膜知觉下降(角膜感觉减退(hypoesthesia))，还可能导致血管生成(angiogenesis)和新生血管形成(neovascularization)。在另外的实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽可以用于治疗由细菌或真菌感染引起的感染性角膜炎。
在另外的实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽可以用于治疗上皮基底膜营养不良(epithelial basement membrane dystrophy)、Meesmann青少年性角膜上皮营养不良(Meesmann juvenile epithelial corneal dystrophy)、胶滴状角膜营养不良(gelatinous drop-like corneal dystrophy)、Lisch角膜上皮营养不良、角膜上皮下粘液营养不良(subepithelial mucinous corneal dystrophy)、Reis-Bucklers角膜营养不良或Thiel-Behnke营养不良和复发性角膜糜烂。
在一些实施方案中，眼部病状包括对角膜(例如，角膜表面或角膜和房水界面处的内皮层)的损伤或由角膜手术(包括PRK、LASIK和任何穿透性角膜手术或角膜成形术)引起的手术破碎。
本文还提供了一种通过施用修饰的成纤维细胞生长因子(FGF-1)多肽或包含此类修饰的肽的药物组合物或药剂来治疗化学或起疱剂诱导的损伤的方法。
在一个实施方案中，本文还提供了一种通过施用如本文所述的修饰FGF-1多肽来治疗化学损伤或起疱损伤的方法。在一些实施方案中，所述方法包括治疗由化学或起疱剂引起的皮肤损伤或眼部损伤。在一些实施方案中，所述方法包括通过施用本文所述的修饰FGF-1多肽来治疗由起疱剂(例如，氮芥子气(NM))诱导的芥子气角膜病变。在一些实施方案中，如本文所述，用修饰FGF-1多肽治疗MGK改善与MGK相关联的组织病理学病状，诸如角膜上皮层的过度增生、上皮-基质细胞分离水肿、角膜糜烂。在某些实施方案中，施用本公开的修饰FGF-1减少水肿减少并且消除角膜糜烂。角膜糜烂通常特征在于角膜的去上皮形成(de-epithelialization)，并且在一些实例中，施用修饰FGF-1导致角膜更快的重新上皮形成或降低角膜去上皮形成的严重性。在一个实施方案中描述了一种通过施用如本文所述的修饰FGF-1使暴露于化学或起疱剂的患者的眼部表面上皮再生的方法。在一些实施方案中，所述方法促进角膜再生，防止角膜退化，并且预防化学损伤的长期后遗症。在一些实例中，所述方法包括治疗角膜内皮损伤、角膜上皮损伤或角膜基质损伤。在所述方法治疗角膜内皮损伤的情况下，如本文所述施用修饰FGF-1增强角膜内皮细胞的功能并且预防角膜的长期退化。在一些情况下，在所述方法治疗角膜内皮损伤的情况下，如本文所述施用修饰FGF-1预防角膜水肿和继发性前角膜病变。在一些情况下，在所述方法治疗角膜内皮损伤的情况下，如本文所述施用修饰FGF-1预防角膜内皮细胞的损失。在一些实施方案中，所述方法降低角膜上皮脱离的严重性。在一些实施方案中，所述方法包括治疗基质损伤，例如基质瘢痕形成和角膜不透明。
在一些实施方案中，眼部病状包括对角膜的意外创伤或化学或热损伤。在一些实例中，化学或热损伤是化学灼伤。在一些实例中，化学或热损伤是由起疱剂引起的。在一些实例中，化学或热损伤是由化学战剂引起的。
多种家庭和职业化合物有可能诱导对眼睛和皮肤的化学灼伤。在不及时干预的情况下，可能出现不可逆转的视力损失和毁容。设想快速中和酸剂和碱剂而不释放热量并且限制扩散的剂有效治疗化学损伤。示例性化学损伤包括但不限于碱损伤、酸损伤。化学灼伤的常见来源包括硫酸(H2SO4)、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、石灰(CaO)、硝酸银(AgNO3)、过氧化氢(H2O2)、氯气和任何强氧化剂。
可引起本文所述的化学损伤或热损伤的示例性化学战剂是光气、致痒素或荨麻剂。光气是一种在室温和标准压力下毒性高的无色气体，其在0℃下冷凝成发烟液体。其分子式为COCl2。急性(短期)吸入暴露光气会是剧毒的。在人类中已报道了严重的呼吸系统影响，包括肺部水肿、肺部气肿和死亡。眼睛或皮肤暴露之后可能导致严重的眼部刺激和皮肤灼伤。慢性(长期)吸入暴露于光气还可能引起不可逆的肺部变化，诸如气肿和纤维化。它的暴露可能导致广泛且破坏性的影响，包括由于其快速渗透和即刻造成严重皮肤损伤的能力所致的高死亡率。最近的研究结果显示，在小鼠模型中，局部皮肤暴露于光气蒸气在暴露后数分钟内至暴露后8h导致暴露的皮肤发白并伴有红斑状环、坏死、水肿、轻度荨麻疹和红斑。这些临床皮肤表现伴随着皮肤厚度增加、凋亡细胞死亡、肥大细胞脱粒、髓过氧化物酶活性指示中性粒细胞浸润、p53磷酸化和积累以及COX-2和TNFα水平增加。局部光气暴露还导致外周血管扩张并伴有肝、脾、肾、肺和心脏组织血管中RBC的大量增加。预期这些事件可能引起血压下降，从而导致休克、缺氧和死亡。参见Tewari-Singh N,Goswami DG,Kant R,Croutch CR,Casillas RP,Orlicky DJ,Agarwal R,Cutaneous exposure to vesicantphosgene oxime:Acute effects on the skin and systemic toxicity,Toxicol ApplPharmacol.2017Feb 15；317:25-32。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽可用于治疗、预防或改善由起疱剂暴露引起的各种皮肤损伤的方法。
起疱剂(Vesicant)、或起疱剂(vesicant agent)、或发疱剂(blistering agent)是产生类似于灼伤引起的皮肤损伤的有毒化合物。吸入这些剂影响上呼吸道以及肺，产生肺部水肿。参见例如，Ganesan,K.,S.K.Raza和R.Vijayaraghavan(2010)Chemical WarfareAgents,Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences 2.3:166–178。这些剂还可能引起严重的眼部损伤。起疱剂有两种形式：芥子气和含砷制剂。这类化学战剂中最重要的物质是硫芥子气。其他成员包括氮芥子气(HN1、HN2和HN3)以及砷起疱剂诸如路易氏剂(L1、L2和L3)、乙基二氯胂、甲基二氯胂、苯基二氯胂。起疱剂的具体实例包括但不限于硫芥子气(SM)、双-(2-氯乙基)硫醚、氯乙基乙基硫醚(CEES)、路易氏剂和2-氯-N-(2-氯乙基)-N-甲基乙胺盐酸盐(氮芥子气(NM)家族的成员)。如本公开通篇所使用，术语起疱剂(vesicant)、致起疱剂或化学品、起疱剂(vesicating agent)等被认为意指如本文具体列举的起疱剂，以及其他化合物，诸如毒素和/或化学战剂。硫芥子气是自从在WWI中使用以来军事意义最高的起疱剂。氮芥子气是20世纪30年代合成的，但并未大量生产用于战争。双氯乙基甲胺(mechlorethamine)(HN2,Mustargen)已发现作为癌症化疗剂有较多的和平应用，并且多年来一直是用于此目的的标准化合物。路易氏剂(L)于1918年被合成用于军事目的，因为它具有不可燃性和类似于芥末的毒性，但可能没有在战场上使用过。芥子气是拟辐射的，并且对分裂细胞有极大的毒性。芥子气是亲脂性的，并且容易渗透皮肤、大多数纺织物和橡胶。穿过细胞膜之后，硫芥子气被转化为高反应性硫鎓离子。它不可逆地烷基化DNA、RNA和蛋白质，引起细胞死亡；最重要的目标是DNA。芥子气使DNA的嘌呤碱基烷基化并破坏它们。路易氏剂被皮肤吸收得更快，并且它即刻引起受影响器官的疼痛和刺激，并产生更具全身性的症状。它直接与巯基结合并使它们失活。
在化学战中使用硫芥子气(SM)和其他起疱剂早已为人所知。芥子气损伤眼睛、皮肤和肺，其中眼睛最为敏感。由于症状在暴露之后2至4小时才出现，因此暴露者不是即刻知道他们暴露于芥子气。当暴露的症状最终出现时，这种延迟导致了混乱和恐慌。对于眼睛，这些症状由眼睑痉挛、流泪、刺激、疼痛和畏光。由眼睛暴露于硫芥子气(SM)蒸气引起的角膜损伤是最普遍的化学战损伤。眼部暴露表现出三种不同的剂量依赖性临床轨迹：完全损伤消退、即刻转变为慢性损伤或明显恢复，随后出现持续性眼部表现。后两条轨迹包括一系列角膜症状，这些症状统称为芥子气角膜病变(MGK)。急性损伤期间的组织特异性损伤可能降低角膜内皮细胞和角膜缘干细胞的再生能力，从而使角膜易患慢性或延迟形式的MGK。
对于一些患者，MGK发生在暴露之后数周；在其他情况下，需要数年时间才表现出来。这种角膜病变的特征在于角膜结膜化(conjunctivalization)和缘干细胞缺陷。已经显示，在人角膜内皮细胞中，由于CEC损失导致的间隙通常通过近端CEC的扩散来填补。这些形态变化补偿了内皮的损失，直到角膜与房水之间的屏障无法再维持，导致持续性角膜水肿和继发性前角膜病变。因为成人CEC不在体内增殖，所以CEC的任何损失都可能代表内皮容量的永久性降低。因此，虽然内皮功能可以在CEC扩散引起的轻度损伤后恢复，但更严重的损伤可能超过人内皮的修复能力。兔子与人不同，因为它们可以进行有限的CEC增殖，从而提高它们从CEC损失恢复的能力。然而，与人一样，对兔内皮的足够严重的损伤也会导致不可逆的角膜代偿失调和继发性角膜病变。
基于上述研究，假设起疱剂诱导的内皮衰竭可能是MGK发病机制的潜在因果机制。这一假设与在人和兔子中观察到的SM与MGK的发展之间的剂量依赖性以及在人类伤亡中报道的不同临床轨迹(解决的慢性MGK和延迟发作的MGK)一致。根据这一假设，角膜暴露于低剂量起疱剂可能导致急性上皮损害，内皮毒性最小，并且角膜恢复无长期并发症。替代地，暴露于对角膜内皮造成不可修复的损伤的剂量的起疱剂可能导致内皮屏障失效，产生持续性水肿并伴有继发性前角膜病变。严重损伤之后，急性损伤与MGK发作之间可能没有明显的延迟。
因此，用于最小化或预防由硫芥子气和类似作用化学毒剂(特别是化学战剂)引起的损伤的组合物和方法是为美国国防部工作的科学家的重要追求。最近的研究显示，作为起疱剂，芥子气化合物导致上皮-间质附着的损失。在角膜中，形成微泡，并且一旦积累足够多，角膜上皮编无法牢牢固定至基底膜，导致上皮组织脱落。因此，需要一种有效的针对SM的暴露后治疗，以增强角膜上皮保持附着于基质的能力。不受理论的束缚，预期角膜上皮保持附着于基质的能力可能允许一些基底上皮有机会原位恢复，维持它们与其基底膜和基质的连接。还假设，上皮-基质完整性的关键参与者之一是胶原蛋白XVII(即，BP180)，它是半桥粒的跨膜组分。损伤之后，通过ADAM(“解聚素和金属蛋白酶”)蛋白家族(包括ADAM9、ADAM10和/或ADAM17)裂解胶原蛋白XVII从基底膜释放上皮细胞，并且这种裂解允许它们迁移。
ADAM17，还称为TNF-a转化酶或TACE，是对损伤的一般反应以及释放胶原蛋白XVII的“脱落酶(sheddase)”。据推测，由起疱剂暴露引起的角膜微水泡部分是由于ADAM17的激活，从而能够裂解胶原蛋白XVII。实验数据证实了在暴露于起疱剂NM的角膜的基底膜区域处ADAM17表达的诱导。因此，设想能够抑制ADAM17表达的暴露后上调的剂可用于减轻由起疱剂引起的角膜损伤。
本公开提供了修饰FGF-1多肽，其治疗、减少暴露于起疱剂诸如SM和NM的不利影响以及以其他方式帮助暴露的愈合。本文公开的修饰FGF-1多肽能够防止ADAM17在暴露于起疱剂诸如SM和/或NM之后的过表达。
本公开还提供了一种通过施用修饰FGF-1多肽来治疗、预防、减少暴露于化学或起疱剂诱导的损伤的不利影响以及以其他方式帮助暴露的愈合的方法。在一些实施方案中，本文所公开的方法还防止ADAM17在暴露于起疱剂诸如SM和/或NM之后的过表达。
野生型FGF-1蛋白，例如SEQ ID NO:1，具有易受氧化和烷基化影响的未配对半胱氨酸残基。在本公开的一些实施方案中，其中修饰FGF-1多肽不包含未配对半胱氨酸残基，此类修饰FGF-1多肽不易受起疱剂的氧化和/或烷基化影响。实验数据还指示FGF-1水平的降低及其mRNA已知是暴露于芥子气剂而引起，并且假设这种损失可能在芥子气诱导的角膜损害的缓慢愈合中起作用。在本公开的一些实施方案中，不包含游离半胱氨酸残基并因此不易受或不受半胱氨酸修饰影响的修饰FGF-1多肽有效加速角膜芥子气损害的愈合。
在本公开的一些实施方案中，所述方法包括施用不包含未配对半胱氨酸残基的修饰FGF-1多肽，所述修饰FGF-1多肽不易受起疱剂的氧化和/或烷基化影响。在本公开的一些实施方案中，所述方法包括施用修饰FGF-1多肽，其不包含游离半胱氨酸残基并因此不易受或不受半胱氨酸修饰影响。在一些实施方案中，本文公开的方法可有效加速与MGK相关联的角膜损害的愈合。
暴露于起疱剂(诸如硫芥子气(SM)和氮芥子气(NM))可能引起严重的皮肤损伤伴延迟的起泡。根据暴露的剂量和时间，水肿和红斑可能发展成水泡、溃疡、坏死、脱屑和色素沉着变化，这些变化在暴露之后持续数周甚至数年。参见例如，Tewari-Singh N,AgarwalR,Mustard vesicating agent-induced toxicity in the skin tissue and silibininas a potential countermeasure,Ann N Y Acad Sci.2016Jun；1374(1):184-92。另一种示例性起疱剂光气肟(CX)是一种致痒素或荨麻剂，也是潜在的化学战和恐怖主义的武器。
在一些实施方案中，待治疗的眼部疾病、病症或病状是角膜基质的疾病、病症或病状。角膜基质的疾病、病症或病状包括但不限于圆锥角膜、格子状角膜营养不良、颗粒状角膜营养不良、斑状角膜营养不良、施奈德结晶状角膜营养不良、先天性基质角膜营养不良、斑点状角膜营养不良、创伤或化学或热损伤或者继发于感染的损伤(诸如沙眼)。
在另外的实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽可以在涉及角膜(例如，角膜内皮结构)的破碎的角膜移植程序(例如，涉及德斯密氏膜的角膜移植程序)之前、期间或之后应用，其中加速角膜或眼部表面细胞的愈合和/或改善细胞对损伤的反应(例如，通过增加移植续保的活力和/或寿命)将产生治疗益处。
在另外的实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽可以用于增加准备用于移植的角膜细胞或角膜祖细胞的活力和健康。向捐赠的角膜或其他捐赠的角膜组织的器官培养基中添加的修饰FGF-1多肽刺激角膜细胞并且增加角膜在移植之前可以储存的时间长度，并且增加角膜具有可用于移植的足够健康的细胞的可能性。另外，当培养角膜祖细胞以刺激那些细胞的生长时，可以在培养基中使用修饰FGF-1多肽。
另外的实施方案涉及调节角膜内皮细胞中的一种或多种成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的活性的方法，该方法包括使所述角膜内皮细胞与修饰FGF(例如，修饰FGF-1，诸如包含序列SEQ ID NO:2的那些)接触。此类方法可以用于增加或刺激一种或多种FGFR的活性，从而可以导致细胞迁移和/或细胞增殖增加。
在另外的实施方案中描述了通过施用根据本公开的修饰FGF-1多肽来治疗代谢疾病的方法。可以用所公开的修饰FGF-1多肽治疗的示例性代谢疾病包括但不限于：(1)葡萄糖利用紊乱(glucose utilization disorder)和与其相关联的后遗症，包括糖尿病(diabetes mellitus)(1型糖尿病和2型糖尿病)、妊娠期糖尿病(gestational diabetes)、高血糖(hyperglycemia)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、葡萄糖代谢异常(abnormalglucose metabolism)、“糖尿病前期(pre-diabetes)”(空腹血糖受损(Impaired FastingGlucose，IFG)或糖耐量减低(Impaired Glucose Tolerance，IGT))和与高糖状况相关联或由高糖状况引起的其他生理紊乱，例如组织病理变化，诸如胰腺β细胞破坏；(2)血脂紊乱(dyslipidemia)及其后遗症，诸如像动脉粥样硬化(atherosclerosis)、冠状动脉疾病(coronary artery disease)、脑血管障碍(cerebrovascular disorders)等等；(3)其他病状，其可能与代谢综合征相关联，诸如肥胖和体重增加(包括其共病病状，诸如但不限于非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)和多囊卵巢综合征(polycystic ovariansyndrome，PCOS))，并且还包括血栓、高凝状态和血栓前状态(动脉和静脉)、高血压、心血管疾病、中风和心力衰竭；(4)涉及炎性反应的病症或病状，包括动脉粥样硬化、慢性炎性肠病(例如，克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)、哮喘、红斑狼疮(lupuserythematosus)、关节炎或其他炎性风湿性病症；(5)细胞周期或细胞分化过程紊乱，诸如脂肪细胞瘤、脂肪瘤癌包括例如脂肪肉瘤、实体瘤和赘瘤；(6)中枢和周围神经系统的神经退行性疾病和/或脱髓鞘病症和/或涉及神经炎性过程和/或其他周围神经病变的神经系统疾病，包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、帕金森病(Parkinson's disease)、进行性多灶性脑白质病(progressive multifocalleukoencephalopathy)和吉兰-巴雷综合征(Guillian-Barre syndrome)；(7)皮肤和皮肤学病症和/或伤口愈合过程的障碍，包括红斑鳞状皮肤病(erythemato-squamousdermatoses)；以及(8)其他病症，诸如X综合征(syndrome X)、骨关节炎(osteoarthritis)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome)。还描述了通过施用治疗有效量的所公开的修饰FGF-1多肽(或编码所述多肽的核酸分子)来减少进食和空腹血糖，改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐量，减少全身性慢性炎症，改善哺乳动物的肝脏脂肪变性，减少食物摄入或其组合的方法。
在一些实施方案中，施用修饰FGF-1多肽以便伤口愈合。伤口的实例包括但不限于擦伤、撕脱伤、吹伤(blowing wound)(例如，开放性气胸(open pneumothorax))、灼伤、挫伤、枪击伤、割伤、开放性伤口、贯通伤(penetrating wound)、穿孔伤(perforatingwound)、刺伤(puncture wound)、皮下串线伤(séton wound)、戳伤(stab wound)、手术伤口(surgical wound)、皮下伤口(subcutaneous wound)、糖尿病损伤或切线伤(tangentialwound)。可以用本文所述的化合物和组合物治疗的伤口的其他实例包括：急性病状或伤口，诸如热灼伤、化学灼伤、辐射灼伤、由过度暴露于紫外线辐射引起的灼伤(例如，晒伤)；对人体组织的损伤，诸如由分娩和生产所致的会阴部损伤；在医学过程期间(诸如会阴切开术)持续的损伤；创伤诱导的损伤，包括切割伤、切口、表皮脱落；自意外持续的损伤；术后损伤，以及慢性病状，诸如压疮、褥疮、与糖尿病和循环不良相关的病状和所有类型的痤疮。此外，伤口可以包括：皮炎，诸如脓疱病、擦烂、毛囊炎和湿疹；牙科手术后的伤口；牙周病；创伤后的伤口；和肿瘤相关联的伤口。伤口的其他实例包括动物咬伤、动脉疾病、昆虫叮咬和咬伤、骨感染、受损的皮肤/肌肉移植物、坏疽、皮肤撕裂或裂伤、皮肤老化、手术切口(包括愈合缓慢或不愈合的手术伤口)、脑内出血、动脉瘤、皮肤无力和术后感染。
本发明的治疗性肽还可以用于治疗由以下但不限于以下引起的外部伤口：擦伤、切割伤、裂伤、咬伤、枪弹伤、戳伤、灼伤、晒伤、化学烧伤、手术伤口、褥疮、辐射损伤、所有类型的急性和慢性伤口、由美容皮肤手术引起的伤口或损害。所述肽还可以用于改善皮肤老化的效应。所述肽可以加速外部伤口的伤口愈合和/或改善受伤区域或易受老化和疾病影响的皮肤的外表外观。所述肽可以用于治疗由(但不限于)对于器官和组织的疾病、手术、枪击、戳刺、意外、梗塞、缺血性损伤所引起的内部损伤，所述器官和组织包括但不限于心脏、骨、脑、脊髓、视网膜、周围神经以及易受急性和慢性损伤、疾病、先天和发育畸形和老化过程影响的其他组织和器官。
在一些实施方案中，施用修饰FGF-1多肽以用于治疗烧灼损伤。示例性烧灼伤口包括但不限于“烧灼溃烂”，包括例如由烧灼损伤而发生的溃烂形成，包括一度灼伤(即，浅表的皮肤区域变红)；二度灼伤(损伤部位起泡，所述损伤部位可能在去除了水泡液之后自然愈合)；三度灼伤(遍及整个皮肤的灼伤，并且通常需要手术干预以实现伤口愈合)；烫伤(可能由于滚烫的热水、油脂或散热器流体而发生)；热灼伤(可能由于火焰而发生，通常是深度灼伤)；化学灼伤(可能由酸和碱引起，通常是深度灼伤)；电灼伤(房屋周围的低电压或工作时的高电压)；爆炸闪光(通常是浅表损伤)；以及接触灼伤(通常是深度的并且可能由于回气管尾管、铬铁和炉灶而发生)。如本文所用，延迟愈合或难以愈合的伤口可包括例如特征至少部分地在于以下的伤口：1)发炎期延长；2)形成细胞外基质(ECM)缓慢；以及3)上皮形成速率减小。
已经显示，生长因子(例如，FGF-1)在神经再生和神经愈合中发挥重要作用。FGF-1已被提出在脊髓损伤或创伤(诸如臂丛损伤)、神经免疫病症(诸如急性或特发性横贯性脊髓炎(TM))或期望神经元或神经组织的再生和/或保护的任何其他疾病或病状之后再生神经系统组织中使用，因为FGF-1被认为刺激神经增殖和生长并且可能具有神经保护作用。参见例如，Cheng,H.等人,“Spinal Cord Repair with Acidic Fibroblast Growth Factoras a Treatment for a Patient with Chronic Paraplegia,”SPINE 29(14):E284-E288(2004)；以及Lin,P-H.,“Functional recovery of chronic complete idiopathictransverse myelitis after administration of neurotrophic factors,”Spinal Cord44:254-257(2006)。已知FGF-1具有神经营养活性，促进轴突生长，并且在脊髓损伤和轴突再生的模型中发挥有益作用。因此，在一些实施方案中，本公开的修饰FGF-1多肽促进神经再生并且可以用于治疗受益于神经再生的病状的方法。在一些示例方法中，神经系统病状是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在一些示例方法中，神经系统病状是急性或特发性横贯性脊髓炎(TM)。在某些情况下，修饰FGF-1多肽可以与其他生长因子以及其他药物活性组分组合使用，以用于治疗受益于神经再生的病状。
药物组合物、施用方法和给药
包含如本文所述的修饰FGF-多肽的药物组合物可以以常规方式使用一种或多种生理上可接受的载剂(包括赋形剂和助剂)来配制，所述载剂促进将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。关于本文所述的药物组合物的合适赋形剂的额外细节可以见于例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCo.,Easton,Pennsylvania1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.,编著.,Pharmaceutical Dosage Forms,MarcelDecker,New York,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,第7版.(Lippincott Williams&Wilkins1999)，它们的此类公开以引用的方式并入本文。
如本文所用，药物组合物是指修饰FGF与其他化学组分(诸如载剂、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂)以及任选地其他治疗和/或预防成分的混合物。药物组合物有助于将修饰FGF施用于生物体。在实践本文提供的治疗方法或用途中，将治疗有效量的本文所述的修饰FGF-1多肽以药物组合物的形式施用于患有待治疗的眼部疾病、病症或病状的哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。治疗有效量可以广泛地根据疾病严重性、对象的年龄和相对健康、所使用的化合物的效力和其他因素而广泛变化。药学上可接受或合适的组合物包括眼科学上合适或可接受的组合物。
药物组合物(例如，用于通过注射递送或作为滴眼剂施用)可以呈液体或固体的形式。液体药物组合物可以包括例如一种或多种以下物质：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(优选地生理盐水)、林格溶液、等渗氯化钠、可以用作溶剂或悬浮介质的固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂；抗氧化剂；螯合剂；缓冲剂；以及用于调节张力的剂，诸如氯化钠或葡萄糖。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水通常用作赋形剂，并且可注射药物组合物或经眼递送的组合物(例如，作为滴眼剂)优选是无菌的。
本文所述的修饰FGF-多肽或药物组合物可以通过任何合适的方式递送至对象，所述方式包括例如外用、眼内、前房内、口服、肠胃外、静脉内、腹膜内、鼻内(或向粘膜(例如鼻子、咽喉和支气管)的其他递送方法)或通过向眼睛局部施用，或通过眼内或眼周装置。局部施用的方式可以包括例如外用应用、滴眼剂、眼内注射或眼周注射。眼周注射通常涉及将化合物注射在结膜下或注射到特农氏间隙(在覆盖眼睛的纤维组织之下)中。眼内注射通常涉及将修饰FGF或药物组合物注射到玻璃体中。在某些实施方案中，施用是非侵入性的，诸如通过外用应用或滴眼剂。在一些实施方案中，施用是通过外用和前房内方法的组合。
本文所述的修饰FGF或其药物组合物可以使用药学上可接受的(合适的)载剂或媒介物以及本领域常规使用的技术配制以用于施用。药学上可接受或合适的载剂包括眼科上合适或可接受的载剂。载剂是根据特定修饰FGF的溶解度来选择的。合适的眼科组合物和制剂包括向眼睛局部施用的那些，诸如通过滴眼剂、注射剂等。在滴眼剂的情况下，制剂还可以任选地包含例如眼科上相容的剂，诸如等渗剂，诸如氯化钠、浓缩甘油等等；缓冲剂，诸如磷酸钠、乙酸钠等等；表面活性剂，诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(也称为聚山梨酯80)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(也称为聚山梨酯20)、聚氧乙烯硬脂酸酯40、聚氧乙烯氢化蓖麻油等等；稳定剂，诸如柠檬酸钠、依地酸钠等等；防腐剂，诸如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯等等；和其他成分。可以例如以约0.001至约1.0％重量/体积的水平使用防腐剂。制剂的pH通常在眼科制剂可接受的范围内，诸如在约pH 4至8的范围内。
对于注射，修饰FGF或药物组合物可以在注射级盐水溶液中，呈可注射脂质体溶液、缓慢释放聚合物系统等等形式提供。眼内和眼周注射是本领域技术人员已知的并且描述于许多出版物中，包括例如Spaeth编著.,Ophthalmic Surgery:Principles ofPractice,W.B.SandersCo.,Philadelphia,Pa.,85-87,1990。
在一些实施方案中，修饰FGF或药物组合物(例如，眼用制剂)通过微针施用于角膜中(Jiang等人(2007).Invest Ophthalmol Vis Sci48(9):4038-4043)。微针阵列涂覆有修饰FGF或药物组合物并压贴在角膜上，使得微针刺入角膜基质中但不刺入整个角膜。然后将其移除，并且修饰FGF或药物组合物留在角膜基质中。这种修饰FGF或药物组合物可以刺激角膜细胞增殖和迁移，并抑制基质细胞通常具有的瘢痕形成反应。
在一些实施方案中，组合物可以被配制用于眼内递送。眼内递送包括玻璃体内递送、角膜注射、前房内递送。在一些实施方案中，组合物被配制成用于前房内递送。在一些实施方案中，组合物被配制成用于玻璃体内递送。所述制剂是可注射液体，可以包含非常小的体积，并且可以调整可注射液体制剂的密度，使得其在目标空间中的释放不对组织造成损伤。在一些实施方案中，前房内递送的体积为约100微升、小于约100微升、小于约20微升、小于约10微升、小于约5微升、小于约2.5微升或约1微升。本文提供了一种用于眼内递送的可注射制剂，其包含：修饰FGF-1多肽，其包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或具有与SEQID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含至少1、2、3、4或5个单氨基酸突变；和L-甲硫氨酸。制剂中修饰FGF-1多肽可以以大于约95％的纯度存在，并且多肽在制剂中呈单体形式。根据权利要求1所述的制剂，其中多肽还包含位于N-末端甲硫氨酸残基与SEQ IDNO:1的第一个残基之间的延伸肽。在一些实施方案中，可注射制剂可以包含修饰FGF-1，其包含以下序列SEQ ID NO:2、205、206、3-8、14-18、24-28、93-117、118-141、146-149和174-204中任一个中所示的氨基酸劽，或与所述序列具有至少90％同一性的序列，或者是其片段。
在一些实施方案中，特此提供一种可注射制剂，所述制剂包含所需剂量和浓度的修饰FGF-1以及赋形剂，所述赋形剂包含以下中的一种或多种：氯化钠；硫酸铵；磷酸二氢钾；磷酸氢二钠二水合物；乙二胺四乙酸；和L-甲硫氨酸。在一些实施方案中，可注射制剂可以包含：修饰FGF1；至少约50mM磷酸氢二钠二水合物；至少约100mM氯化钠；至少约10mM硫酸铵；至少约0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；至少约5mM L-甲硫氨酸；和至少约0.01％聚山梨酯80(w/v)。包含修饰FGF-1多肽的可注射制剂可以包含一种或多种选自以下的突变：Cys16Ser、Ala66Cys、和Cys117Val、Lys12Val、Cys16Ser、Ala66Cys、Cys117Val和Pro134Val，并且其中修饰FGF-1多肽还包含肽ALTEK的至少一个残基。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽包含一个或多个突变，所述突变包含SEQ ID NO:1的以下突变：Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，其中修饰FGF-1多肽包含位于SEQ ID NO:1的第一个残基上游的甲硫氨酸残基，以及位于N-末端甲硫氨酸与SEQ ID NO:1的第1位之间的肽ALTEK的至少一个残基。
在一些实施方案中，制剂或其中的药学上合适的赋形剂包含人血清白蛋白(HSA)和/或聚山梨酯80。在一些实施方案中，制剂包含L-甲硫氨酸。在一些实施方案中，L-甲硫氨酸在制剂中以1mM至20mM的浓度存在。在一些实施方案中，L-甲硫氨酸在制剂中以2mM至10mM的浓度存在。在一些实施方案中，L-甲硫氨酸在制剂中以1mM至10mM的浓度存在。在一些实施方案中，L-甲硫氨酸在制剂中以2.5mM至15mM的浓度存在。在一些实施方案中，L-甲硫氨酸在制剂中以约5mM的浓度存在。为了通过粘膜途径递送包含本文所述的修饰FGF-1多肽中至少一种的组合物，包括递送至鼻道、咽喉和气道，组合物可以呈气溶胶的形式递送。化合物可以呈液体或粉末形式以用于粘膜内递送。例如，组合物可以通过具有合适推进剂(诸如烃推进剂，(例如，丙烷、丁烷、异丁烯))的加压气溶胶容器递送。组合物可以通过非加压递送系统(诸如喷雾器或雾化器)递送。
合适的口服剂型包括例如片剂、丸剂、小药囊或硬或软明胶、甲基纤维素或易于在消化道中溶解的另一合适材料的胶囊。可使用合适的无毒固体载剂，其包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。(参见例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro,第21版.Mack Pub.Co.,Easton,PA(2005))。
本文所述的修饰FGF-1多肽或药物组合物可以被配制用于持续释放或缓慢释放。此类组合物通常可以使用众所周知的技术制备并且通过例如眼周、眼内、直肠、口服或皮下植入，或者通过在期望的目标部位植入，或者通过外用应用来施用。持续释放制剂可以含有分散在载剂基质中和/或容纳在由速率控制膜包围的贮库内的剂。用于在此类制剂内使用的赋形剂是生物相容的并且还可以是生物可降解的；优选地所述制剂提供相对恒定水平的活性组分释放。持续释放制剂内所含活性化合物的量取决植入的部位、释放的速率和预期的持续时间以及待治疗或预防的病状的本质。
通过眼部途径施用的药物或组合物的全身药物吸收是本领域技术人员已知的(参见例如，Lee等人,Int.J.Pharm.233:1-18(2002))。在一个实施方案中，本文所述的化合物通过外用眼部递送方法递送(参见例如，Curr.Drug Metab.4:213-22(2003))。组合物可以呈滴眼剂、药膏或软膏等等形式，诸如水性滴眼剂、水性眼用混悬液、非水性滴眼剂和非水性眼用混悬液、凝胶、眼用软膏等。为了制备凝胶，可以使用例如羧乙烯基聚合物、甲基纤维素、海藻酸钠、羟丙基纤维素、乙烯马来酸酐聚合物等等。
在另一实施方案中，修饰FGF溶液或药物组合物(例如，眼用制剂)含有透明质酸、羧甲基纤维素或提供增加的眼部耐受性、粘度和渗透度以产生舒适的眼部溶液的其他多糖。
修饰FGF或包含本文所述的修饰FGF-1多肽中至少一种的药物组合物的剂量可能不同，这取决于患者(例如，人)的状况，即，眼部疾病、病症或病状的阶段、一般健康状况、年龄和医学领域的技术人员将用以确定剂量的其他因素。当组合物用作滴眼剂时，可以每天施用约1至约6次例如每单位剂量1至数滴，优选地1或2滴(每1滴约50μl)。
如医学领域的技术人员所确定，药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病、病症或病状的方式施用。适当的剂量以及合适的施用持续时间和频率将通过诸如以下因素确定：患者的状况、患者疾病、病症或病状的类型和严重性、活性成分的具体形式和施用方法。通常，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处(例如，改善的临床结果，诸如更频繁的完全或部分缓解、或更长时间的无疾病或症状严重性的减轻)的量提供组合物。对于预防性使用，剂量应足以预防眼部疾病、病症或病状、延迟其发作或减轻其严重性。最佳剂量通常可以使用实验模型和/或临床试验确定。最佳剂量可能取决于患者的体质、体重或血容量。
在各种实施方案中，本公开的修饰FGF-1多肽可以在一段时间内作为日剂量施用于对象。在一些实施方案中，本公开的修饰FGF-1多肽可以长期或长时间施用。在一些实施方案中，本公开的修饰FGF-1多肽可以施用几天、几周、几个月、几年的时间段或在对象的一生中继续治疗。在一些实施方案中，本公开的修饰FGF-1多肽可以施用约7天、15天、约21天、约30天、约3个月、约6个月、约12个月、约18个月、约2年、约5年、约7年、约10年、约15年、约20年、约25年、约30年、约35年或约40年的时间段。在一些实施方案中，可以根据各种因素为个体对象确定治疗方案。在一些实例中，治疗方案取决于暴露于引起化学损伤或热损伤的化合物(诸如起疱化合物)的水平。在一些实施方案中，治疗方案对于短期暴露是大约2周，而对于长时间暴露是几个月至一年。在一些实施方案中，治疗方案是长期的。在一些实例中，因素可以包括但不限于角膜组织退化程度回应于施用本公开的修饰FGF-1多肽而变化的确定。在一些实例中，因素可以包括但不限于回应于施用本公开的修饰FGF-1多肽的MGK后遗症的改善。在一些实例中，因素可以包括但不限于回应于施用本公开的修饰FGF-1多肽的角膜内皮损害的愈合。在一些实例中，因素可以包括但不限于回应于施用本公开的修饰FGF-1多肽的角膜上皮细胞增殖。在一些实例中，因素可以包括但不限于回应于施用本公开的修饰FGF-1多肽的与Fuch营养不良相关联的症状的减少。在实施方案中，与在稍后时间或在数次剂量之后表现出对组合物的反应的对象相比，表现出对组合物的即刻反应(例如，与Fuch营养不良相关联的症状的即刻减少)的对象可能需要较低频率的剂量。
可以根据对象的临床状态、状况和年龄、剂型等等，合适地选择修饰FGF-1多肽或药物组合物的剂量。在滴眼剂的情况下，可以施用本文所述的修饰FGF，例如约10ug/ml至约100mg/ml的修饰FGF，每周一次至数次。
还提供了制造本文所述的修饰FGF-1多肽和药物组合物的方法。包含药学上可接受的赋形剂或载剂和本文所述的修饰FGF-1多肽中至少一种的组合物可以通过根据本文所述或本领域中实践的方法中任一种合成修饰FGF，然后将化合物与药学上可接受的载剂一起配制来制备。组合物的配方将是适当的并且取决于若干因素，包括但不限于化合物的递送途径、剂量和稳定性。
可将本文所述的至少一种修饰FGF施用于人类或其他非人类脊椎动物。在某些实施方案中，修饰FGF是基本上纯的，因为它含有少于约5％或少于约1％、或少于约0.1％的其他有机分子，诸如在例如合成方法的一个或多个步骤中产生的污染中间体或副产物。在其他实施方案中，可以施用本文所述的一种或多种修饰FGF-1多肽的组合。
可以施用本文所述的组合物以用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，向已经罹患疾病或病状的患者施用组合物，其量足以治愈或至少部分地阻止疾病或病状的症状。对于此用途有效的量将取决于疾病或病状的严重性和病程、先前的疗法、患者的健康状态、体重和对于药物的反应以及治疗医师的判断。
在预防应用中，将本文所述的组合物施用于易受特定疾病、病症或病状影响或以其他方式处于其风险中的患者。这种量被定义为“预防有效量或剂量”。在此用途中，精确量也取决于患者的健康状态、体重等等。
在医生判断后，患者的病状并未改善的情况下，组合物的施用可以是长期施用，即，持续较长的一段时间，包括患者生命的整个持续时间，以便改善患者的疾病或病状或者以其他方式控制或限制其症状。
在患者的状态改善的情况下，在医生判断后，可以连续地给予组合物的施用；替代地，施用的药物的剂量可以暂时减少或暂时停止一定时间长度(即，“休药期”)。
一旦患者的病状得以改善，就施用维持剂量(如果需要的话)。随后，可以根据症状，将剂量、或施用频率、或两者降低至保留改善的疾病、病症或病状的水平。然而，如果症状有任何复发，则患者就可能需要长时间的间歇治疗。
所需剂量可以方便地以单剂量提供，或呈同时(或在短时间段内)或以适当的间隔(例如，呈每天两次、三次、四次或跟多次亚剂量)施用的分次剂量提供。
本文所述的药物组合物可以呈适用于精确剂量的单次施用的单位剂型。在单位剂型中，制剂被分成含有适当量的一种或多种修饰FGF-1多肽的单位剂量。单位剂量可以呈含有离散量的制剂的包装的形式。非限制性实例是包装的片剂或胶囊以及在小瓶或安瓿中的散剂。水性悬浮液组合物可以被包装在单剂量不可重新闭合的容器或可重新闭合的容器中。替代地，可以使用多剂量不可重新闭合的容器，在这种情况下通常在组合物中包含防腐剂。仅以举例的方式，用于肠胃外注射的制剂可以呈单位剂型提供，所述单位剂型包括但不限于安瓿，或于添加有防腐剂的多剂量容器中提供。-
可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序确定此类治疗方案的毒性和治疗功效，包括但不限于确定LD50(群体的50％致死剂量)和ED50(群体的50％治疗有效剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为LD50与ED50之间的比率。表现出高治疗指数的化合物是优选的。可以在配制用于人的一系列剂量中使用从细胞培养测定和动物研究获得的数据。此类化合物的剂量优选处于包括ED50同时毒性最小的循环浓度的范围内。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径而在此范围内变化。
散装原料药制剂和药物制剂
本公开的实施方案提供了一种作为制剂中的散装原料药(BDS)的修饰FGF-1多肽(例如，包含序列SEQ ID NO:2的FGF-1多肽)，所述制剂包含氯化钠、硫酸铵和磷酸氢二钠二水合物中的至少一种。在一些实施方案中，在使用例如丁基琼脂糖凝胶快速流动柱从表达修饰FGF-1多肽的宿主细胞纯化之后，BDS呈溶液储存于洗脱缓冲液(其被配制用于储存散装原料药)中。在纯化期间，修饰FGF-1多肽通常以梯度洗脱，并且因此，在一些情况下，洗脱缓冲液没有精确的组成。例如，在一些情况下，洗脱缓冲液包含氯化钠、硫酸铵和磷酸氢二钠二水合物并且具有约7.4的pH。在一些实施方案中，散装原料药制剂包含约100mM至约1000mM氯化钠，诸如约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM、约1000mM氯化钠；约100mM至约500mM硫酸铵，诸如约200mM、约300mM、约310mM、约320mM、约330mM、约340mM、约360mM、约370mM、约380mM、约390mM、约400mM、约500mM硫酸铵；和约1mM至约50mM磷酸氢二钠二水合物，诸如约2mM、约5mM、约10mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM或约30mM磷酸氢二钠二水合物；或其组合。在一些实施方案中，BDS储存在pH为约6至约8的制剂中。
本公开的实施方案提供了一种药物制剂，其由pH 5.8的组氨酸/聚山梨酯/山梨醇制剂构成。与药物制剂相关联的各种优点包括但不限于没有可见颗粒、SE-HPLC的主峰面积几乎恒定、SE-HPLC的可溶性聚集体随时间的百分比低以及pH随时间控制。在一些实施方案中，组氨酸以约0.1mM至约10mM，诸如约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约25mM、约30mM、约40mM、约50mM、约100mM的浓度存在。在一些实施方案中，药物制剂包含表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂可以包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂及其任何组合。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯。在一些实施方案中，药物制剂包含聚山梨酯，例如PS20、PS80。在一些实施方案中，制剂包含以约0.01％至约10％的浓度存在的PS80。在一些实施方案中，制剂包含浓度为至少约0.005％、至少约0.01％、至少约0.015％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％或至少约0.1％的聚山梨酯80，NF(PS80)(％w/v)。在其他实施方案中，制剂包含约0.005％至约0.1％ PS80、约0.005％至约0.02％ PS80、约0.005％至约0.05％ PS80、约0.01％至约0.02％ PS80、约0.02％至约0.1％ PS80或约0.01％至约0.03％ PS80。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.01％的PS80。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.02％的PS80。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约0.03％的PS80。在一个具体实施方案中，组合物包含浓度为约0.04％的PS80。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约0.05％的PS80。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.06％的PS80。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.07％的PS80。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.08％的PS80。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.09％的PS80。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.1％的PS80。在一些实施方案中，制剂包含浓度为至少约0.005％、至少约0.01％、至少约0.015％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％或至少约0.1％的聚山梨酯20，NF(PS20)(％w/v)。在其他实施方案中，制剂包含约0.005％至约0.1％PS20、约0.005％至约0.02％ PS20、约0.005％至约0.05％ PS20、约0.01％至约0.02％ PS20、约0.02％至约0.1％ PS20或约0.01％至约0.03％ PS20。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.01％的PS20。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.02％的PS20。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约0.03％的PS20。在一个具体实施方案中，组合物包含浓度为约0.04％的PS20。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约0.05％的PS20。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.06％的PS20。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.07％的PS20。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.08％的PS20。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.09％的PS20。在其他实施方案中，组合物包含浓度为约0.1％的PS20。在其他实施方案中，通过合适的方式将药物制剂递送至对象，包括例如眼内注射、前房内注射、眼周注射、静脉内注射、腹膜内注射或鼻内注射。
在一些实施方案中，药物制剂包含醇化合物。在一些实施方案中，醇化合物是山梨醇、赤藓醇、木糖醇、甘油、甘露醇或其任何组合。在一些实施方案中，醇化合物是张力调节剂，例如山梨醇。在一些实施方案中，醇化合物是山梨醇，其以约1％至约10％存在。在一些实施方案中，制剂包含张力调节剂，其为氯化钠。在一些实施方案中，药物制剂包含甘油。
在某些实施方案中，制剂包含浓度为至少约0.25％、至少约0.5％、至少约0.75％、至少约1％、至少约1.5％、至少约2％、至少约2.5％、至少约3％、至少约3.5％、至少约4％、至少约4.5％、至少约5％、至少约7.5％或至少约10％的山梨醇(％w/v)USP。在其他实施方案中，组合物包含约0.5％至约5％山梨醇、约0.5％至约4％山梨醇、约0.5％至约1.5％山梨醇、约1％至约2％山梨醇或约2.5％至约3.5％山梨醇。
在一些实施方案中，药物制剂的pH为约5.8、约4.5至约6.5、约4.0至约6.0、约4.0至小于约6.5、约5.0至约6.0、约5.1至约5.9、约5.2至约5.8、约5.3至约5.4、约5.4至约5.5、约4.1至约6.1、约4.2至约6.2、约4.3至约6.3、约4.4至约6.4、约4.5至约6.5、约4.6至约6.6、约4.7至约6.7、约4.8至约6.8、约4.9至约6.9、约5.0至约7.0、约4.1至约5.1、约4.2至约5.2、约4.3至约5.3、约4.4至约5.4、约4.5至约5.5、约4.6至约5.6、约4.7至约5.7、约4.8至约5.8、约4.9至约5.9、约5.0至约6.0、小于约6.1、小于约6.2、小于约6.3、小于约6.4、小于约6.5、小于约6.6、小于约6.7、小于约6.8、小于约6.9、小于约7.0。
在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽(例如，SEQ ID NO:2的修饰FGF-1多肽)构成如本文所述的药物制剂中的活性成分，并且以约100pg/mL至约1000μg/mL、约500pg/mL至约200μg/mL、约0.0001μg/mL至约0.0005μg/mL、约0.0005μg/mL至约1.0μg/mL、约1.0μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约20μg/mL至约30μg/mL、约30μg/mL至约40、约40μg/mL至约50μg/mL、约50μg/mL至约60μg/mL、约60μg/mL至约70μg/mL、约70μg/mL至约80μg/mL、约80μg/mL至约90μg/mL、约90μg/mL至约100μg/mL、约100μg/mL至约110μg/mL、约110μg/mL至约120μg/mL、约120μg/mL至约130μg/mL、约130μg/mL至约140μg/mL、约140μg/mL至约150μg/mL、约150μg/mL至约160μg/mL、约160μg/mL至约170μg/mL、约170μg/mL至约180μg/mL、约180μg/mL至约190μg/mL、约190μg/mL至约200μg/mL的浓度存在。
本公开的一个实施方案提供了一种散装原料药制剂，其包含修饰FGF-1多肽；浓度为至少约200mM至约1000mM的氯化钠；浓度为约50mM至约500mM的硫酸铵；浓度为约1mM至约50mM的磷酸氢二钠。修饰FGF-1多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列并且包含以下氨基酸残基：第16位的Ser、第66位的Cys和第117位的Val。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的浓度为至少约0.1g/mL至约10g/mL，诸如约0.2g/mL至约15g/mL、约0.3g/mL至约20g/mL、约1g/mL至约5g/mL、约1g/mL至约4g/mL、约2g/mL至约3g/mL。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽的浓度为约3g/mL。在一些实施方案中，散装原料药制剂包含浓度为约800mM的氯化钠。在一些实施方案中，散装原料药制剂包含浓度为约320mM的硫酸铵。在一些实施方案中，散装原料药制剂包含浓度为约20mM的磷酸氢二钠。在一些实施方案中，散装原料药制剂的pH为约7至约9。在一些实施方案中，散装原料药制剂的pH为约7.4。在一些实施方案中，修饰FGF-1多肽在-60℃±10℃的温度下储存时是稳定的。
本公开的实施方案提供了一种制造方法，其包括对从细菌细胞的培养物中的包涵体分离的复性的修饰FGF-1多肽的纯化，细菌细胞用包含用于编码修饰FGF-1多肽的核酸的载体转染，其中纯化包括使用填充有基于琼脂糖的树脂(例如，CaptoTM DeVirS树脂)的色谱柱捕获复性的修饰FGF-1多肽，接着使用填充有丁基琼脂糖凝胶树脂的色谱柱，通过疏水相互作用色谱法精细纯化。在一些实施方案中，来自精细纯化步骤的修饰FGF-1多肽的回收率比在其他方面相同的制造方法中使用填充有肝素树脂的色谱柱通过疏水相互作用色谱法进行的精细纯化步骤之后修饰FGF-1多肽的回收率高约10％至约40％、或约10％至约50％、60％、70％、80％、90％或100％，诸如约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％。
组合治疗
修饰FGF-1多肽和药物组合物还可以与其他治疗剂组合使用，所述治疗剂针对它们对于待治疗的病状的治疗价值而被选择。修饰FGF-1多肽和药物组合物还可以与其他治疗剂组合使用，所述治疗剂针对它们对于治疗起疱损伤的治疗价值而被选择。此类剂不必在同一药物组合物中施用，并且由于不同的物理和化学特征而可能必须通过不同途径施用。在同一组合物中的施用模式和施用合理性(在可能的情况下)的确定完全在医师的知识范围内。初始施用可以根据本领域中认可的建立的方案进行，然后基于所观察到的作用，剂量、施用模式和施用时间可以由医师修改。
所使用的这些任选的额外剂的具体选择将取决于主治医师的诊断和他们对患者的状况的判断以及适当的治疗方案。根据疾病、病症或病状的本质、患者的状况和所使用的剂的实际选择，这些剂可以并行(例如，同时、基本上同时或在同一治疗方案内)或顺序地施用。在评价所治疗的疾病和患者的状况之后，在治疗方案期间每种治疗剂的施用顺序和施用的重复次数的确定完全在医师的知识范围内。
构成本文所公开的组合疗法的药剂可以是组合剂型或预期用于基本上同时施用的单独剂型。构成组合疗法的药剂也可以通过需要两步施用的方案与所施用的治疗性化合物顺序施用。两步施用方案可能需要活性剂的顺序施用或单独活性剂的间隔施用。根据每种药剂的特性，诸如药剂的效力、溶解性、可生物利用性、血浆半衰期和动力学曲线，多个施用步骤之间的时间段的范围可以是几分钟至若干小时。靶分子浓度的昼夜变化也可以决定最佳剂量间隔。
当药物用于治疗组合时，治疗有效剂量可以变化。在文献中描述了用于以实验方法确定用于组合治疗方案的药物和其他剂的治疗有效剂量的方法。例如，在文献中具体地描述了节律给药(即，提供更频繁的较低剂量以便使毒性副作用最小化)的用途。组合治疗还包括定期治疗，其在不同时间处开始和停止以帮助患者的临床管理。
例如，修饰物可以并入至含有其他活性成分的制剂中，诸如类固醇、抗生素、消炎药、细胞因子(例如IL-1或IL-1的类似物)或细胞因子的拮抗剂(诸如IL-17的抑制剂)。
其他示例性细胞因子包括但不限于白介素(例如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-1α、IL-1β和IL-1RA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、抑瘤素M、促红细胞生成素、白血病抑制因子(LIF)、干扰素、B7.1(也称为CD80)、B7.2(也称为B70,CD86)、TNF家族成员(TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail)以及迁移抑制因子MIF。
在一些实施方案中，本文所述的组合或药物组合物在免疫抑制疗法中施用以降低、抑制或预防免疫系统的活动。免疫抑制疗法临床上用于：预防植入的器官和组织的排斥反应；治疗自身免疫疾病或最有可能来源于自身免疫的疾病；以及治疗一些其他非自身免疫炎性疾病。
在一些实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽和药物组合物与一种或多种抗炎剂一起施用，抗炎剂包括但不限于非甾体抗炎药(NSAID)和皮质类固醇(糖皮质激素)。
NSAID包括但不限于：阿司匹林(aspirin)、水杨酸(salicylic acid)、龙胆酸(gentisic acid)、水杨酸胆碱镁(choline magnesium salicylate)、水杨酸胆碱(cholinesalicylate)、水杨酸胆碱镁、水杨酸胆碱、水杨酸镁(magnesium salicylate)、水杨酸钠(sodium salicylate)、二氟尼柳(diflunisal)、卡普洛芬(carprofen)、菲诺洛芬(fenoprofen)、非诺洛芬钙(fenoprofen calcium)、氟比洛芬(fluorobiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘丁酮(nabutone)、酮洛酸(ketolorac)、酮咯酸氨丁三醇(ketorolac tromethamine)、萘普生(naproxen)、奥沙普秦(oxaprozin)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美汀(tolmetin)、甲氯芬那酸盐(meclofenamate)、甲氯芬那酸钠(meclofenamate sodium)、甲芬那酸(mefenamic acid)、吡罗昔康(piroxicam)、美洛昔康(meloxicam)和COX-2特异性抑制剂(诸如但不限于塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、伐地考昔(valdecoxib)、帕瑞考昔(parecoxib)、依托考昔(etoricoxib)、罗美昔布(lumiracoxib)、CS-502、JTE-522、L-745,337和NS398)。
皮质类固醇包括但不限于：倍他米松(betamethasone)、泼尼松(prednisone)、阿氯米松(alclometasone)、醛固酮(aldosterone)、安西奈德(amcinonide)、倍氯米松(beclometasone)、倍他米松、布地奈德(budesonide)、环索奈德(ciclesonide)、氯倍他索(clobetasol)、氯倍他松(clobetasone)、氯可托龙(clocortolone)、氯泼尼醇(cloprednol)、可的松(cortisone)、可的伐唑(cortivazol)、地夫可特(deflazacort)、去氧皮质脂酮(deoxycorticosterone)、地索奈德(desonide)、去羟米松(desoximetasone)、去氧皮质酮(desoxycortone)、地塞米松(dexamethasone)、二氟拉松(diflorasone)、二氟可龙(diflucortolone)、二氟泼尼酯(difluprednate)、氟氯奈德(fluclorolone)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟氢缩松(fludroxycortide)、氟米松(flumetasone)、氟尼缩松(flunisolide)、乙酸氟轻松(fluocinolone acetonide)、氟西奈德(fluocinonide)、氟可丁(fluocortin)、氟可龙(fluocortolone)、氟米龙(fluorometholone)、氟培龙(fluperolone)、氟泼尼定(fluprednidene)、氟替卡松(fluticasone)、福莫可他(formocortal)、哈西奈德(halcinonide)、卤米松(halometasone)、氢化可的松(hydrocortisone/cortisol)、氢化可的松醋丙酯(hydrocortisone aceponate)、氢化可的松丁丙酯(hydrocortisone buteprate)、氢化可的松丁酸酯(hydrocortisone butyrate)、氯替泼诺(loteprednol)、甲羟松(medrysone)、甲基泼尼松(meprednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、甲泼尼龙醋丙酯(methylprednisolone aceponate)、糠酸莫美他松(mometasone furoate)、帕拉米松(paramethasone)、泼尼卡酯(prednicarbate)、泼尼松/泼尼松龙(prednisolone)、瑞美松龙(rimexolone)、替可的松(tixocortol)、曲安西龙(triamcinolone)和乌倍他索(ulobetasol)。
用作抗炎剂的其他剂包括美国专利公布2005/0227929中所公开的那些，所述公布以引用的方式并入本文。
一些可商购获得的抗炎剂包括但不限于：(双氯芬酸(diclofenac)和米索前列醇(misoprostol))、/>(5-氨基水杨酸)、/>(5-氨基水杨酸)、(安替比林(antipyrine)和苯佐卡因(benzocaine))、/>(柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine))、/>(奥沙普秦(oxaprozin))、/>(依托度酸(etodolac))、(甲芬那酸(mefenamic acid))、/>(甲泼尼龙)、/>(阿司匹林(aspirin))、/>(阿司匹林)、/>(吲哚美辛(indomethacin))、/>(罗非昔布(rofecoxib))、/>(塞来昔布(celecoxib))、/>(伐地考昔(valdecoxib))、/>(依托考昔(etoricoxib))、/>(罗美昔布(lumiracoxib))、(布洛芬(ibuprofen))、/>(双氯芬酸)、/>(酮洛芬(ketoprofen))、/>(美洛昔康(meloxicam))、/>(萘丁美酮(nabumetone))、(萘普生(naproxen))、/>(吡罗昔康(piroxicam))。
在一个实施方案中，本文所述的组合物与白三烯受体拮抗剂一起施用，所述受体包括但不限于BAY u9773(参见EP 00791576；公开于1997年8月27日)、DUO-LT(Tsuji等人,Org.Biomol.Chem.,1,3139-3141,2003)、扎鲁司特(zafirlukast)孟鲁斯特(montelukast)/>普仑司特(prankulast)/>及其衍生物或类似物。
在一些实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽和药物组合物与一种或多种Rho激酶抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的修饰FGF-1多肽和药物组合物与一种或多种额外生长因子一起施用，生长因子包括但不限于表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)。参见例如，参见Joyce等人(2009)Invest Ophthalmol.Vis Sci.50:2116–2122，血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子α和β(TGF-α和TFG-β)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞/巨噬细胞CSF(GM-CSF)和一氧化氮合酶(NOS)。
试剂盒/制品
为了在本文所述的治疗应用中使用，本文还提供了试剂盒和制品。此类试剂盒可以包括载剂、包装或容器，其被分隔以容纳一个或多个容器，诸如小瓶、管等等，每个容器包括待用于本文所述的方法的单独元素中的一种。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。
本文所提供的制品含有包装材料。用于包装药学产品的包装材料包括例如美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252。药学包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适用于选定制剂和施用和治疗的预定方式的任何包装材料。设想本文所提供的修饰FGF-1多肽和药物组合物的各种各样的眼用制剂为可通过施用本文所述的修饰FGF和药物组合物而获益的任何眼部疾病、病症或病状的多种治疗。
例如，容器可以包括修饰FGF，诸如具有序列SEQ ID NO:2的修饰FGF-1。容器可选地具有无菌入口。此类试剂盒任选地包括化合物以及与其在本文所述的方法中的使用相关的鉴定描述或标签或说明书。
在一些实施方案中，试剂盒可以适用于或设计成适用于用于眼内递送的可注射液体制剂。试剂盒可以设计为低容量小瓶并且可以包括锥形插入物。在一些实施方案中，试剂盒为滴瓶。在一些实施方案中，滴瓶可以能够提供至少一个剂量的在可注射制剂中的修饰FGF-1。在一些实施方案中，滴瓶还包括无菌过滤器。在一些实施方案中，容器包括注射器。在一些实施方案中，注射器包含选自结核菌素聚丙烯和玻璃的材料。在一些实施方案中，注射器预填充有可注射制剂。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括电子控制单元。在一些实施方案中，电子控制单元能够控制根据前述部分中所述的一定体积的可注射制剂的施用，其中体积为至少约10微升至约100微升。在一些实施方案中，根据权利要求107所述的试剂盒，其中滴瓶能够提供至少一个剂量的在上文所述的实施方案中任一项所述的可注射制剂或本公开任何地方所述的药物组合物中的修饰FGF-1。在一些实施方案中，滴瓶还可以包括无菌过滤器。在一些实施方案中，容器包括注射器。在一些实施方案中，注射器包含选自结核菌素聚丙烯和玻璃的材料。在一些实施方案中，注射器预填充有根据上文所述的实施方案中任一项的可注射制剂或本公开任何地方所述的药物组合物。试剂盒还可以包括电子控制单元。在一些实施方案中，电子控制单元能够控制一定体积的根据权利要求1-45中任一项的可注射制剂或根据权利要求90-95中任一项的药物组合物的施用，其中体积至少为约10μL至约100μL。
在一些实施方案中，试剂盒通常可以包括一个或多个额外容器，每个容器具有从商业和用户角度看使用本文所述的修饰FGF期望的各种材料(诸如，试剂，任选地呈浓缩形式，和/或装置)中的一种或多种。此类材料的非限制性实例包括但不限于缓冲液、稀释剂、填料、针、注射器；载体、包装、容器、小瓶和/或列出内容物和/或使用说明书的管标签以及具有使用说明书的包装插页。通常还包括一组说明书。
标签可以在容器上或与容器结合。当形成标签的字母、数字或其他字符附接、模塑或蚀刻到容器本身中时，标签可以在容器上，当标签存在于也容纳容器的接收器或载体内时，标签可以与容器缔结，例如作为包装插页。标签可以用于指示内容物用于特定治疗性应用。标签还可以指示使用内容物的指示，诸如在本文所述的方法中。
在某些实施方案中，修饰FGF药物组合物可以提供于包装或分配器装置中，包装或分配器可以容纳一个或多个含有本文所提供的化合物的单位剂型。包装可以例如含有金属或塑料箔，诸如泡罩包装。包装或分配器装置可以随附有施用说明书。包装或分配器还可以随附有规定药物制剂的制造、使用或销售的呈由政府机构指定的形式的与容器相关的通知，所述通知体现由所述机构批准所述药物的形式用于人类或兽医学施用。例如，此类通知可以是由美国食品和药物管理局批准的药物标签，或批准的产品插页。还可以制备在相容的药用载剂中配制的含有本文所提供的修饰FGF的组合物，将其放置于适当的容器中，并且贴上关于治疗所指示的病状的标签。
实施例
这些实施例仅仅出于说明性目的提供，并且不限制本文提供的权利要求的范围。本文所述的实施例中使用的起始材料和试剂可以是合成的或者可以从商业来源获得。
实施例1：用于评价修饰FGF-1多肽的治疗效果的示例性方法：使用NIH-3T3成纤维细胞增殖测定评价了使用如重组技术部分中所述的方法生成的包含序列SEQ ID NO:2(N-Met-TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的修饰FGF-1多肽的生物活性。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:205的修饰FGF-1多肽呈现了在诱导成纤维细胞的增殖的有效性方面可比的能力。如下文所述，在眼科疾病的实验模型中进一步评价了包含序列SEQ ID NO:2(N-Met-TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的修饰FGF-1多肽。
将来自健康供体的人角膜内皮细胞的原代培养物(第1代)在存在胎牛血清(FBS,8％)的情况下接种至24孔板上，并且24小时后用不同浓度的在具有低(0.8％)FBS的培养基中的N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)、TTHX1001(SEQ ID NO:205)或wt-FGF-1(SEQ ID NO:1)处理。8％ FBS组充当阳性对照。结果指示，N-Met-TTHX1114在刺激人角膜内皮细胞增殖方面比TTHX1001或wt-FGF-1更有效，并且在其中具有剂量反应性。N-Met-TTHX1114的EC50是wt-FGF-1或其他测试的修饰FGF-1多肽(TTHX1001；SEQ ID NO:205)的约1/100。
使用氮芥子气(NM)的示例性角膜损伤模型可以用于评价本文所述的药物组合物的治疗效果。使用兔角膜器官培养模型系统评价暴露于NM之后的愈合。获得兔眼睛(8-12周龄)，并且从眼睛解剖出具有2mm巩膜边缘的角膜，将其以上皮面朝下的方式放置于点滴板中，并且凹陷处填充558C含熔化琼脂(0.75％)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)。一旦溶液胶凝，就将角膜翻转，使得能够触及上皮层。将培养物放置于60mm直径的pyrex组织培养皿中。制备l高葡萄糖DMEM，其含有13MEM-NEAA(最低必需培养基-非必需氨基酸)、13RMPI1640维生素溶液、13抗生素/抗霉菌剂、抗坏血酸(0.45mM)和环丙沙星(101g/ml)。添加高葡萄糖DMEM，最多至巩膜边缘，使角膜暴露在空气。将培养皿放置于具有5％ CO2的37℃加湿培养箱中。每种培养物的上皮细胞用500μL培养基润湿，每7至9小时滴加至中央角膜上。将起疱剂NM滴加至中央角膜上。将角膜样品(从其琼脂支持物上剥离)以上皮面朝下的方式放置于含有最佳切割温度(OCT，Tissue-Tek；Sakura，Torrance，CA，USA)化合物的冷冻包埋模具(cryomold)中，并且快速冷冻以用于组织学和免疫荧光，或者直接速冻以用于进一步的蛋白质分析，包括蛋白质印迹和ADAM17活性测定(InnoZyme TACE活性测定试剂盒；Calbiochem，Billerica，MA，USA)。
在将NM应用至中央角膜之后，在不去除起疱剂的情况下，将培养物放回37℃培养箱中，持续2小时。孵育之后，去除被污染的培养基，并且将新鲜的培养基添加至中央角膜，直到培养皿中的液面达到巩膜边缘的顶部。然后使对照的未暴露和暴露的角膜回到37℃，以进行22小时的孵育，仅在三个短时间段内取出以将20μL培养基添加至未接受N-Met-TTHX1114疗法的暴露样品，或将作为疗法的20μL N-Met-TTHX1114添加至中央角膜。第一次met-TTHX1114应用程序持续8小时，第二次持续9小时，并且第三次持续5小时。因此，2小时暴露和后续处理的时长总计为24小时。
NM造成的损伤包括以下：(a)上皮层的过度增生，其通过上皮细胞下推至基质中数目和深度的增加而明显。这被称为向下过度增生。未暴露(初始)的角膜显示出一些向下过度增生，但是其不像暴露于NM的角膜那样大范围；(b)基底细胞核向基底上皮细胞顶部上升；以及(c)上皮-间质分离。组织病理学效应早在暴露后四天就可见。通过用N-Met-TTHX1114处理改善了组织病理学分级。与来自未处理的角膜的切片相比，N-Met-TTHX1114处理的角膜切片表现出较低的得分(指示损伤较轻)。通过角膜上皮细胞(CEC)的EdU并入评估了周围角膜上皮层刺激。使用标准程序，例如Kay等人(Kay等人,Investigativeophthalmology&visual science.1993；34(3):663-72；Lee等人,Investigativeophthalmology&visual science.2009；50(5):2067-76)描述的程序，建立了兔CEC的原代培养物。将细胞暴露于NM，持续两小时。使用例如Click-IT测定试剂盒(LifeTechnologies)，在12孔板中进行增殖测定。EdU向角膜上皮细胞中的并入是上皮增殖的指标。与未处理的对照相比，在NM暴露之后，用N-Met-TTHX1114处理时的并入EdU的角膜上皮细胞百分比较低。
在类似的模型中，可以使用硫芥子气诱导实验性角膜内皮损伤，并且可以施用N-Met-TTHX1114(或假)以用于测试分辨率。暴露于兔角膜之后八周，比较测试组(也称为分辨眼)与假对照组(其稍后发展为MGK)之间的内皮细胞形态和结构。分辨眼通过在临床评价期间不存在特征性MGK后遗症，诸如角膜糜烂、新生血管形成或角膜混浊来区分，并且其角膜厚度到6周为止在统计学上与假暴露对照不可区分。发现分辨眼的enface扫描显微照片与假暴露对照惊人地相似，具有组织良好的单层多边形细胞。与对照角膜相比，分辨眼的平均CEC大小增加；原本，分辨角膜在后表面不表现出显著的变异性。相比之下，具有MGK内皮的假对照治疗兔显示出动物之间细胞形状和细胞大小的广泛变异性，指示动态损伤过程。在个别角膜中常规地观察到内皮形态中的局部变异性，一些区域表现出扩大但镶嵌型的CEC，而其他区域则显示出显著的结构破坏，有不同程度的顶端起泡、显示剥落的DM的区域和缺乏清晰描绘的细胞边界。在N-Met-TTHX1114处理的分辨内皮中没有观察到这些现象。N-Met-TTHX1114处理的分辨角膜的透射电子显微镜图像与初始内皮非常相似。相比之下，具有MGK病理学的假对照处理的内皮表现出后DM的扩散增厚，与水肿和/或角膜后纤维膜的沉积一致。MGK角膜还表现出CEC应激或损伤的广泛标志物，包括细胞质变稀薄、过度空泡形成和内质网肿胀。重叠细胞过程的频率很高，与24小时图像相似并且表明正在进行重新填充最近剥落的DM的尝试。
可以采用以下方法来FGF-1多肽(例如包含序列SEQ ID NO:2(N-Met-TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的修饰FGF-1多肽)对于评价治疗疱疹性角膜病变的治疗效果。
为此项研究选择了一组具有疱疹性角膜病变的患者。将患者分成三个亚组。向第一亚组中的患者眼部施用眼用制剂，例如滴眼剂，其含有配制于磷酸盐缓冲盐水(at pH7.2)中的约500pg/ml(即，0.0005μg/ml)的N-met TTHX1114(SEQ ID NO:2)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶。向第二亚组中的患者眼部施用眼用制剂，例如滴眼剂，其含有配制于磷酸盐缓冲盐水(at pH 7.2)中的约500pg/ml(即，0.0005μg/ml)的TTHX1001(SEQ ID NO:205)、0.3％丙二醇、0.4％聚乙二醇400和0.05％羟丙基瓜尔胶。向第三亚组中的患者眼部施用假眼用制剂，不含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)或TTHX1001(SEQ ID NO:205)但是在其他方面与向第一和第二亚组施用的相同。对于所有三个亚组，滴眼剂由患者自行施用，或者由护士或护理人员施用。分别向第一、第二和第三亚组的患者施用含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂、含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂和假眼用制剂，每天两次，至多30天。
观察到，含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂和含有TTHX1001(SEQ IDNO:205)的眼用制剂导致属于第一和第二亚组的大多数患者在约14天内疱疹性角膜溃疡的愈合，以及疼痛和炎症的持续时间的缩短。此外，与假装治疗的第三亚组的患者相比，分别用含有N-Met-TTHX1114(SEQ ID NO:2)的眼用制剂和含有TTHX1001(SEQ ID NO:205)的眼用制剂治疗的第一和第二亚组的患者的眼睛的角膜浑浊和瘢痕形成较少。
为了研究包含例如序列SEQ ID NO:206(TTHX1114)或SEQ ID NO:205(TTHX1001)的修饰FGF-1多肽对人角膜内皮细胞(HCEC)增殖的影响，将来自健康供体的人角膜内皮细胞的初代培养物(第1代)在存在胎牛血清(FBS，8％)的情况下接种至24孔板中，并且24小时后用不同浓度的在具有低(0.8％)FBS的培养基中的TTHX1114(SEQ ID NO:206)、TTHX1001(SEQ ID NO:205)或wt-FGF-1(SEQ ID NO:1)处理。8％ FBS组充当阳性对照。结果指示，TTHX1114在刺激人角膜内皮细胞增殖方面比TTHX1001或wt-FGF-1有效，并且在其中具有剂量反应性。TTHX1114的EC50是wt-FGF-1或其他测试的修饰FGF-1多肽(TTHX1001；SEQ ID NO:205)的约1/100。
实施例2：制备可扩展的重组人FGF-1的方法：用于产生作为眼内治疗剂的FGF-1的示例性一般化方法描绘于图1中的示意图中。一般化方法被进一步开发，并且进行了各种修改。简而言之，用包含编码修饰的人FGF-1(N-Met-TTHX1114)的重组核酸序列的质粒转化大肠杆菌。
在一个示例性集合中，使用Nde1/BamH1克隆限制位点将大肠杆菌密码子优化的人FGF-1(TTHX1114)序列亚克隆于pET26b(+)载体中以获得pET26_TTHX1114质粒。下文提供了编码hFGF-1的示例性大肠杆菌密码子优化序列：
CATATGTTTAATCTGCCGCCGGGTAACTATAAGAAACCGAAACTGTTGTACAGCTCTAATGGTGGCCACTTCCTGCGTATCCTGCCGGACGGCACCGTCGATGGTACCCGTGACCGCAGCGATCAACACATTCAACTGCAACTGAGCGCCGAGAGCGTGGGCGAAGTTTACATTAAGTCCACTGAAACGGGCCAGTACCTGTGTATGGACACCGATGGCCTGCTGTACGGTTCGCAGACGCCAAATGAAGAGTGCCTGTTCTTGGAGCGTCTGGAAGAGAACCACTATAACACCTACATTAGCAAGAAACATGCGGAGAAAAACTGGTTTGTGGGTCTGAAGAAAAATGGTTCCGTCAAGCGCGGTCCTCGTACGCATTATGGCCAGAAAGCAATCTTGTTCCTGCCGCTGCCGGTTAGCAGCGACTAATGACTCGAG。
在一个示例性集合中，使用Nde1/BamH1位点将大肠杆菌密码子优化的人FGF-1序列亚克隆于pMKet载体骨架(vector backbone)中以获得pMKet_TTHX1114质粒，没有前导序列，诸如没有ompA前导序列。pMKet载体包含pBR322 ori序列。
在一个示例性集合中，将ompA前导序列插入于TTHX1114编码序列上游以获得OA_TTH1114pMKet质粒，其指导FGF-1多肽的周质表达。下文提供了编码ompA前导序列的示例性核酸序列：
5'-ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTTGCGC AAGCT-3'。
示例性ompA氨基酸序列是MKKTAIAIAVALAGFATVAQA。
在有或没有N末端fMet的情况下测试了FGF-1序列。
测试的宿主细胞是大肠杆菌BL 21菌株和大肠杆菌W3110菌株。
使宿主细胞在2YT的测试培养基或包含葡萄糖或甘油作为碳源的定制合成培养基中生长。培养物始终存在卡那霉素。
将转化的大肠杆菌细胞在发酵培养物中扩增，并且将10L等分试样用于示例性FGF-1产生。将来自发酵运行T1 F01E(10L)的100g大肠杆菌糊重新悬浮，接着进行细胞裂解，分离包涵体(IB)，在溶解缓冲液中稀释，在复性缓冲液(1:20vol/vol)中复性。将250ml包含FGF-1的复性缓冲液送至丁基和肝素HIC柱中。
在使用上文所述的一般化方案的一个示例性运行中，每升复性缓冲液产生约0.6mg FGF-1。从0.25L复性获得大约0.2-0.25mg FGF(约1mg/L)。通过蛋白质印迹确认纯化蛋白质的身份。
在示例性运行中，使用在BL21细胞中的pMKet TTX1114(不具有ompA前导序列)，并且在合成培养基中生长，导致与包含ompA前导序列的质粒相比的产量提高，产量提高约10倍。图2A显示来自丁基捕获色谱柱(例如，Capto DeVirs(Cytiva，BPG 300x500，部件号17-5466))的洗脱液，并且图2B显示来自肝素HIC的洗脱液，其如所指示在A215和A280下检测。对由虚线指示的洗脱液级分运行SDS-PAGE和蛋白质印迹，显示存在单体。此测定中使用的柱是5ml丁基4FF，通过添加1.5M硫酸铵调整样品上样250ml；用pH 7.4的10mM Na2HPO4、2mMKH2PO4洗脱。来自肝素柱洗脱样品的示例性蛋白质印迹结果显示在图2B中。在另一示例性方法中，对方法进行了若干调整。使用如以下表1中所指示的条件运行对1L培养物的克隆筛选：
表1.筛选1L培养物中的克隆
从上文优化研究获得了高密度的细胞。合成培养基和用具有编码密码子优化的FGF-1的序列的pMKet质粒转化的大肠杆菌BL21菌株得到意想不到的高产量3g/L FGF-1，其是其他实验变化的约5-30倍，如表中所示。
在用于制备修饰FGF-1的示例性方法中，进行如下步骤：
·将10g制备的IB溶解在pH 7.4的50mM Tris，2mM EDTA，6M胍，0.1M NaCl中
·通过添加50mM DTT(在2h内)还原hFGF
·通过渗滤/超滤去除DTT
·通过快速稀释至A280大约1.0来复性(RF过夜)
·复性缓冲液：
·I(RFB)：1M精氨酸，50mM Tris，0.1M NaCl，5mM EDTA，pH 9.5
·II(RFD)：5mM Tris、2mM胱氨酸、5mM半胱氨酸，pH 9.0·离心以去除沉淀物
·对于通过肝素进行捕获：调整pH并稀释以降低浓度<25mS/cm(如果需要的话)，然后通过HIC(C4)进行肝素洗脱液的盐调整
·柱：肝素HiTrap HP(5mL)
缓冲剂：
I(平衡/洗涤I)：PBS pH 7.0
II(洗涤II)：PBS+0.6M NaCl pH7.0
III(洗脱)：PBS+1.2M NaCl pH7.0
梯度：0-100％缓冲液III(10CV)
流速：5mL/min
·对于通过HIC(C4)捕获：向1.5M硫酸铵中添加盐，将pH调整至pH 7.4。
使用复性缓冲液I和II的相应洗脱液特征图如图3A和3B中所示。评价了肝素HiTrap之后对应的SDS-PAGE图像(未显示)。这些研究指示，使用复性缓冲液1(RFB)产生的结果显著优于使用复性缓冲液2(RFD)。RFD产生大量沉淀物。
在另一示例性研究中，使用HIC的捕获筛选在环境温度下进行。使用了以下程序：
·将10g细胞沉淀物重新悬浮于pH 7.0的12mM PO4中
·通过HPH(2x 400巴，T<25℃)进行细胞裂解
·在17500x g下离心，30min，8℃
·对于通过肝素捕获：50mL裂解物→pH调整→上样
·对于通过HIC(C4)捕获：50mL裂解物→将盐添加至1.5M硫酸铵中，将pH调整至pH7.4→上样。
显示了来自洗脱的丁基HIC的光谱数据，图3C(左)，其后在肝素柱中运行，产生较尖锐的产物峰图3C(右)。
在另一示例性研究中，针对在尿素和胍缓冲液中的溶解进行了比较。测试了包涵体(IB)在洗涤或不洗涤IB的情况下在尿素和胍中的溶解。还测试了在洗涤IB时聚山梨酯20或80的使用。结果指示，PS20和PS80具有可比的效果。两种洗涤方法之间溶解的FGF的纯度是可比的。两种洗涤剂的溶解的FGF产量是可比的。
在示例性方法中，进一步优化克隆以用于微生物表达。将新的构建体转化到不同的菌株中并生长，并且在不同的培养基中测试了FGF的产量。使每个构建体/菌株组合在定制的合成培养基或2TY培养基中生长。碳源是甘油或葡萄糖。在生长至OD600为2之后，用1mMIPTG诱导培养物(c：在37℃下表达20h；p：在26℃下表达20h)。对周质构建体进行渗透压休克，然后用超声波处理以打开细胞。周质表达和细胞质表达的构建体生成如下(表2和表3)：
表2.周质表达的构建体
启动子 ori 前导序列 菌株
tac pBR322 ompA BL21
tac pBR322 ompA W3110
表3.细胞质表达的构建体
启动子 ori 前导序列 菌株
T7 pBR322 - BL21(DE3)
tac pBR322 - BL21
比较了在BL21菌株和W3110菌株中表达的细胞质构建体以及在BL21菌株和W3110菌株中表达的周质构建体。此外，所有构建体均在内部且用具有甘油以及葡萄糖作为碳源的2TY培养基培养。在生长至OD600为2之后，用1mM IPTG诱导培养物(细胞质：在37℃下表达20h；周质：在26℃下表达20h)。对周质构建体进行渗透压休克，然后用超声波处理以打开细胞。
对于修饰FGF-1的微生物表达来说，pMKet构建体显著优于不具有启动子的现有质粒或本文所述的其他修饰。
在另一示例性研究中，将尿素用于复性缓冲液中，并且将PS 20用作洗涤剂。将胍用于变性。复性在RT和2-8℃下进行(复性缓冲液如先前所述)。复性之后，使用旋转柱对样品进行渗滤以消除DTT。由于高电导率，每种RF方法都被稀释。肝素柱设置为具有5mlHiTrap肝素，使用缓冲液A(平衡)：PBS，pH 7.0；缓冲液B(洗涤)：PBS，0.6M NaCl，pH 7.0；缓冲液C(洗脱)：PBS，1.2M NaCl，pH 7.0。在每个步骤之后进行取样，以便使用SDS-PAGE进行分析。设置总结于以下表4中：
表4.复性条件
表5显示了相应的产量：
表5.产量的汇总
级分名称 mg
标准1:10(0.2ug)
标准1:20(0.1ug)
Hep 8A洗液 0.1
Hep 8A洗脱液 2.2
Hep 8B洗液 0.0
Hep 8B洗脱液 3.5
Hep 8C洗液 0.2
Hep 8C洗脱液 0.2
Hep 8D洗液 0.0
Hep 8D洗脱液 0.1
Hep 9A洗液 0.0
Hep 9A洗脱液 0.0
Hep 9B洗液 0.0
Hep 9B洗脱液 0.0
Hep 10A洗液 0.0
Hep 10A洗脱液 1.0
Hep 10B洗液 0.1
Hep 10B洗脱液 1.4
Hep 10C洗液 0.0
Hep 10C洗脱液 0.0
Hep 10D洗液 0.0
Hep 10D洗脱液 0.2
在SDS-PAGE中解析蛋白质，并且量化的FGF-1回收率显示于图4A-4B中表示的数据中。使用Agilent Advance Bio SEC 300A设置尺寸排阻色谱法，孔径2.7μm。运行缓冲液包括pH 7.4的具有0.5MNaCl的PBS。将流速调整为0.75mL/min，并且运行20分钟。在A215nm处观察吸光度。每次运行都评价相应的SEC峰。在使用胍作为变性溶液的过程中，复性缓冲液A和B显示出较好的结果。此外，看起来用于IB溶解的离液剂不影响复性的性能。当使用尿素时，复性缓冲液C和D稍好于A和B(成本较低)。还看出，在4℃时复性稍好。
实施例3：散装原料药的制造条件
发酵和包涵体的初步回收
示例性研究涉及发酵、包涵体的收获/回收、纯化、分离和修饰FGF-1多肽(SEQ IDNO:2)散装原料药(BDS)的测试。使用包含表达SEQ ID NO:2的修饰FGF-1多肽的核酸序列的大肠杆菌BL21 pMKet的主细胞批次(MCB)进行TTHX1114 BDS的cGMP制造。
将含有MCB的解冻小瓶的内容物混合并用于接种含有用于预培养的合成培养基的种子瓶：5.2g/L(NH4)2SO4、4.4g/L NaH2PO4 x 2H2O、4.0g/L KCl,5.3g/L柠檬酸x H2O、1.3g/L Na2HPO4 x 2H2O、0.5g/L NaCl、1g/L MgSO4 x 7H2O、0.3g/L CaCl2 x 2H2O、0.1g/L FeCl3x 6H2O、1x TES(21mg/L ZnSO4 x 7H2O、24mg/L MnSO4 x H2O、8mg/L CuSO4 x 5H2O、4mg/LCoSO4 x 7H2O、0.3mg/L H3BO3、0.2mg/L Na2MoO4 x 2H2O)、10g/L甘油、50mg/L卡那霉素、10g/L bacto酵母提取物和16g/L phytone蛋白胨。在37℃下孵育接种的种子瓶，直到培养物达到OD为约2-5。
以起始体积50L培养基(30g/L甘油、5.2g/L(NH4)2SO4；4.4g/L NaH2PO4 x 2H2O；4.0g/L KCl；5.3g/L柠檬酸x H2O；1.3g/L Na2HPO4 x 2H2O；0.5g/L NaCl；1.0g/L MgSO4 x7H2O；0.3g/L CaCl2 x 2H2O；0.1g/L FeCl3 x 6H2O；1x TES(21mg/L ZnSO4 x7H2O、24mg/LMnSO4 x H2O、8mg/L CuSO4 x 5H2O、4mg/L CoSO4 x 7H2O、0.3mg/L H3BO3、0.2mg/LNa2MoO4 x 2H2O)、1mL/L消泡剂、10g/L bacto酵母提取物和16g/L phytone蛋白胨)在150L生物反应器中进行主要培养。将主要培养物接种500mL预培养物，然后在37℃、pH 6.8下在没有氧气限制的情况下孵育。通过添加25％氢氧化铵和1M磷酸来调整pH。在培养基中甘油的初始量(30g/L)被消耗(通过pO2-峰指示)之后，开始以2.333kg/h的进料速率的以45％甘油水溶液的恒定进料。进料开始之后大约10小时，通过添加异丙基-β-D-1-硫代-吡喃半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为1mM来诱导产物形成，并且降低甘油进料的添加速率(以0.973kg/h的进料速率的45％甘油水溶液)。从诱导至收获的时间被称为诱导期或产物形成期。
通过将发酵培养基冷却至约18±2℃来停止诱导期，并且取样以用于显微分析。通过离心(具有8L转鼓的连续CEPA离心机，流速为40至100L/h)回收生物质，并且在冷却至18℃±2℃的同时以18,000x g离心。在≤15℃下将细胞糊重新悬浮在细胞破碎缓冲液(48mMTris，2mM EDTA，96mM NaCl，pH 7.4)中，并且通过在950±50巴下的两个高压匀化循环(SPX匀化器)将重新悬浮的细胞破碎。在匀化步骤期间，不断冷却含有产物的溶液。
在细胞破碎之后，通过如先前那样的离心来回收包涵体(IB)，并且通过使用不同缓冲液的五个连续洗涤循环洗涤可溶性杂质(200L搅拌槽)：洗液1和2，50mM Tris，2mMEDTA，1.5M NaCl，0.2％聚山梨酯80，pH 7.4；洗液3和4，50mM Tris，2mM EDTA，100mM NaCl，2％聚山梨酯80，20mM DTT，pH 7.4；洗液5，50mM Tris，2mM EDTA，100mM NaCl，20mM DTT，pH7.4。洗涤完成之后，在≤-60℃下储存包涵体。
包涵体的溶解和复性
为了溶解和进一步加工，将一半洗涤的包涵体(约1kg)从储存取出并在2-8℃下解冻(1-3天)。将IB重新悬浮在总计25L溶解缓冲液(50mM Tris，2mM EDTA，6M胍，100mM NaCl，pH 7.4)中。使用ULTRA-TURRAX(IKA)，以S50N-G45G探针在5 000至8000rpm下持续8-10min，接着以S50N-G45F探针在7 000至10 000rpm下再持续8-10min来完成分散，并且最终搅拌60min。在IB重新悬浮之后，添加DTT至最终浓度为50mM，并且将二硫键还原为硫醇持续15小时。然后使用Pall Centrasette系统(具有PES膜的10kDa Sartocon，Sartorius StedimBiotech，部件号3021463907E)，通过超滤再次去除DTT。然后将产物缓慢添加至550L复性缓冲液(1M精氨酸盐酸盐，0.1M NaCl、5mM EDTA、30mM NaOH、1mM GSSG；5mM GSH，pH 7.4)中并孵育9小时。最后，通过深层过滤来使产物澄清，随后经0.2μm生物负载减少膜(Sartopore2XLG胶囊；0.8/0.2μm保留率；过滤膜由PES制成，Sartorius Stedim Biotech，部件号5445307G)过滤至500L袋中。
随后将过滤的含有修饰FGF-1多肽(SEQ ID NO:2)的复性蛋白质溶液用于进一步下游加工，如下文所述。
散装原料药的色谱纯化和填充
在用水1:1稀释之后，使用填充有Capto DeVirs(Cytiva，BPG 300x500，部件号17-5466)的柱(15.6L体积)捕获重折叠的FGF-1多肽(SEQ ID NO:2)，以确保结合。用线性梯度0％至100％的缓冲液1B(对应于100％至0％的缓冲液1A)，以21.2-179.9L/h的流速，在室温下运行，对柱进行洗脱。洗脱之后，将柱经5CV保持在100％缓冲液1B中。缓冲液1B＝78.13g/L氯化钠；0.20g/L氯化钾；1.78g/L磷酸氢二钠二水合物；0.27g/L磷酸二氢钾；pH 7.4(对应于100％至0％的缓冲液1A：8.00g/L氯化钠；0.20g/L氯化钾；1.78g/L磷酸氢二钠二水合物；0.27g/L磷酸二氢钾；pH 7.4)。缓冲液1A＝8.00g/L氯化钠；0.20g/L氯化钾；1.78g/L磷酸氢二钠二水合物；0.27g/L磷酸二氢钾；pH 7.4。缓冲液1B为78.13g/L氯化钠；0.20g/L氯化钾；1.78g/L磷酸氢二钠二水合物；0.27g/L磷酸二氢钾；pH 7.4。
将洗脱液收集在单个级分中。收集的洗脱液用0.2μm过滤器(Sartopore 2XLG货品号：5445307G8)过滤，并在15-25℃下储存少于24h。使用Capto DeVirs柱捕获之后的产量为大约120g修饰FGF-1多肽(SEQ ID NO:2)，浓度为约1.74g/L洗脱液。
在此柱步骤之后，通过添加硫酸铵(1.0M最终浓度)和氯化钠(2.5M最终浓度)将产物条件化以用于精细纯化。通过疏水相互作用色谱法(HIC)，使用填充有丁基琼脂糖凝胶4FF(Cytiva，BPG 300x500，部件号17-0980)并且在pH 7.4的20mM磷酸氢二钠二水合物中平衡的柱(10.6L体积)完成精细纯化。用三个床体积的相同缓冲液洗涤柱。用线性梯度0％至100％的缓冲液2B(对应于100％至0％的缓冲液2A)，以51.3L/h的流速，在室温下运行，经10CV，对产物进行洗脱。缓冲液2A＝20mM磷酸氢二钠二水合物；pH 7.4，并且缓冲液2B＝2.5M氯化钠，1M硫酸铵，20mM磷酸氢二钠二水合物，pH 7.4。将洗脱液转移至Stedim袋(1x50L)中。精细纯化步骤之后的产量为约92g修饰FGF-1多肽(SEQ ID NO:2)，浓度为3g/L。使用丁基琼脂糖凝胶FF柱的精细纯化步骤的产率为大约50％，与通过使用肝素树脂进行精细纯化步骤的大约20％的产率相比，显著提高。
根据上文方法纯化的散装原料药(BDS)呈溶液储存在丁基琼脂糖凝胶FF柱的洗脱缓冲液中。观察到修饰FGF-1多肽(SEQ ID NO:2)以用梯度洗脱，并且因此，缓冲液不具有精确的组成，但是含有大约800mM氯化钠、320mM硫酸铵和20mM磷酸氢二钠二水合物，pH为7.4。
使用蠕动泵，将纯化的BDS过滤(Millipak 100 Gamma Gold，0.22μm，Merk，部件号MPGL1GCF3)至第二Stedim无菌袋中。来自上述过程的散装原料药的总产量为约82g，来自50L培养物。
如上文所制备的原料药的填充通过将过滤的蛋白质溶液无菌分配至γ灭菌的、无热原的、具有高密度聚乙烯螺帽的聚乙烯瓶中进行。将散装原料药的等分试样储存在约-60℃±10℃的温度下。
实施例4：药物制剂
用于评估包含SEQ ID NO:2的修饰FGF-1多肽的药物制剂的不同变化的示例性一般化研究包括在两种不同的表面活性剂条件下，在三种不同的pH下，比较10mM相对于1mM组氨酸缓冲液，以鉴别稳定性优化并且降解趋势降低的药物制剂。通过两种方法确定稳定性，方法诸如扩展的目视检查、尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)、FlowCam分析。目视检查在白色光源(13W荧光灯管)下对黑色和白色背景进行。在每个时间点获取所有制剂的数字照片。FlowCam颗粒成像系统结合了光学、电子学和射流学，以用于颗粒的自动分析。光学系统用于捕获流体中的颗粒穿过流动池时的实时图像。成像软件提供了评估颗粒大小和形态的能力。所有样品均在75托下脱气30分钟，然后进行纯净分析。
例如，使用扩展的目视检查方法以观察药物沉淀，并且使用SE-HPLC分析观察药物降解和高分子量(HMW)物质形成。在制备药物制剂之后，最终制剂在室温(大约20℃)下储存在工作台上的有盖试管架中。在制备之后第0、5、14、28和59天进行目视检查和SE-HPLC分析。
在示例性研究中，在样品制备之后不久进行目视检查，其中pH高于6.5。不论组氨酸浓度如何，pH 5.8的样品更适合于使药物保持溶液形式，并且在10mM组氨酸缓冲液中直到制备之后59天才看到颗粒，并且在1mM组氨酸缓冲液中在第28天仅观察到一种悬浮的颗粒。第5天之后未检查所有PS20制剂，因为通过SE-HPLC，在第5天，它们全部恢复得低于其PS80相对物。
进行两轮表面活性剂筛选。在第一轮中，在pH 6下在10mM柠檬酸盐、300mM NaCl中配制浓度为约0.1mg/mL(100μg/mL)的修饰FGF-1多肽(SEQ ID NO:2)。测试了各种表面活性剂，并且向FGF-1制剂中掺杂了表面活性剂储备溶液以获得最终浓度，如下所示：0.1％(w/v)泰洛沙泊、0.01％(w/v)聚山梨酯80(PS80)和0.1％(w/v)泊洛沙姆188(F-68)。将不具有表面活性剂的FGF-1制剂用作对照。在单独一轮表面活性剂筛选中，将FGF-1多肽(SEQ IDNO:2)在约0.25mg/mL(250μg/mL)的浓度下配制于1.046M NaCl，0.419M硫酸铵，20mM磷酸氢二钠二水合物，pH 7.4(丁基洗脱液)中。对于第二轮表面活性剂筛选，将含有10mM柠檬酸盐和300mM NaCl的制剂或丁基洗脱液制剂中的修饰FGF-1多肽(SEQ ID NO:2)渗析成各种制剂(参见表6)，并且渗析之后，原料药在相应制剂缓冲液中的浓度从0.25mg/mL降低至约0.1mg/mL，并且将其以约1.25mL的体积填充至Crystal Zenith小瓶中。下表提供了第二轮表面活性剂筛选的细节。
表6.用于表面活性剂筛选的制剂，第2轮
通过在环境温度下，以1000rpm暴露于摇动器上的搅拌应激约4小时来测试每种制剂的样品小瓶，并且将一小瓶同一制剂用作静态无应激对照(在环境温度下储存4小时)。4小时搅拌应激之后，对受过应激的样品进行五个冷冻和解冻循环(在-20℃下储存直到冷冻，然后放置于环境温度直到解冻)。在冷冻-解冻循环期间内，将未受应激的样品在5℃下储存。在搅拌和冷冻-解冻应激结束后，通过目视检查和FlowCam分析样品。
对于第一轮表面活性剂筛选，所有静态样品在有和没有表面活性剂的情况下都是透明、无色的并且显示出一些细小的颗粒。经过搅拌和冷冻-解冻循环的不含表面活性剂的样品看起来略微不透明，并且含有许多细小的颗粒。含有0.1％泰洛沙泊或0.1％ F-68的样品是透明、无色的并且在搅拌和冷冻-解冻循环后表现出白色片状沉淀。而含有0.01％PS80的受应激的样品是透明且无色的，带有许多细小的颗粒。在FlowCam分析中，所有静态样品都显示出刚能看得见的粒子计数适度减少。与其他表面活性剂条件的搅拌样品相比，含有0.1％ F-68的搅拌样品显示出颗粒计数最低。然而，受应激的F-68样品仍然显示出刚能看得见的颗粒的显著增加。在没有表面活性剂的情况下搅拌和冷冻-解冻样品产生最高的刚能看得见的颗粒浓度。
对于第二轮表面活性剂筛选，所有静态样品在没有表面活性剂的情况下都是透明的、无色的并且表现出一些可见颗粒。新DS(丁基洗脱液)山梨醇样品的外观比其他样品澄清并且溶液中表现出许多细小的气泡。除具有NaCl和0.1％ PS20的新DS(洗脱洗脱液)外，所有含有PS20的静态样品均透明、无色的且不含可见颗粒。含有0.1％PS20的新DS NaCl样品是透明、无色的并且显示出一些可见颗粒。含有山梨醇的搅拌样品通常是透明、无色的并且显示出一些可见颗粒。含有NaCl的搅拌样品通常在外观上略微不透明并且表现出可见颗粒。
所有含有PS80的静态样品都是透明、无色的并且通常不含可见颗粒。含有山梨醇的搅拌样品通常是透明、无色的并且显示出一些可见颗粒。含有NaCl的搅拌样品通常在外观上略微不透明并且表现出可见颗粒。所有含有F-68的静态样品都是透明、无色的并且不含可见颗粒。所有含有F-68的搅拌样品通常是透明、无色的并且显示出一些可见颗粒。关于第二轮表面活性剂筛选之后的FlowCam分析，相对于具有NaCl的制剂，具有山梨醇的制剂通常显示出较低减少的刚能看得见的颗粒浓度。在所有表面活性剂条件下，与旧原料药(柠檬酸盐制剂)相比，无论制剂如何(山梨醇对NaCl)，新原料药(丁基洗脱液)在应激之后表现出显著较低的刚能看得见的颗粒浓度。总体而言，含有0.10％ PS80的山梨醇制剂中的新DS(丁基洗脱液)在应激之后表现出最小的刚能看得见的颗粒含量的变化量。
在SE-HPLC分析中，山梨醇制剂中的新DS(丁基洗脱液)以及0.05％或0.1％ PS80在静态和应激条件下都显示出可比的曲线。具有0.05％或0.10％ PS80的山梨醇制剂中的所有新DS(丁基洗脱液)样品显示出一个HMW峰(峰1的面积％为约7％，并且主峰的面积％为约92-93％)，相比之下，含有山梨醇和PS20的新DS(丁基洗脱液)表现出两种HMW物质(HMW峰1的面积％为约0.5％，HMW峰2的面积％为7.8-8％，并且主峰的面积％为约91.6-91.8％)。
随后用各种药物制剂针对SEQ ID NO:2的修饰FGF-1多肽进行了加速稳定性研究。加速稳定性研究在8周内通过各种测定评价了制剂，同时在五个不同储存温度下储存。在初始时间点(时间零)、短期应激和最终时间点(40℃，T＝2周，且所有其他温度，T＝8周)收集数据。还进行了pH变化研究，作为药物制剂评价和优化研究的一部分。加速稳定性研究的结论是，对于在组氨酸/聚山梨酯/山梨醇制剂中包含SEQ ID NO:2的修饰FGF-1多肽的药物制剂来说，低pH是最佳的，并且这通过目视检查、FloCam分析和SE-HPLC，以两种方式得以支持。例如，在SE-HPLC中，低pH样品的主峰较高，指示在低pH水平下的聚集和/或降解较少，留下更多完整的单体待检测。然而，与较低pH的样品相比，较高pH的样品在每个时间点的可溶性聚集体的百分比更高。HMW物质随着时间的推移的这些增加似乎也随着pH增加而恶化。换句话说，随着时间的推移，在pH与存在的HMW物质之间观察到正相关。
在另一研究中，制剂中组氨酸的浓度从10mM降低至1mM，并且使用SE-HPLC评估了所述变化对HMW峰面积百分比的影响。如表8中所提供，与pH大于6.0的制剂相比，pH 5.8的制剂，无论组氨酸浓度如何，都显示出较低的HMW峰。
比较了候选制剂的不同变化，例如，在两种不同表面活性剂条件下，在三种不同pH值下，10相对于1mM组氨酸缓冲液(表7)。选择了比较的参数以确定在1mM组氨酸缓冲液中，pH是否仍受到控制，与10相反。比较这些制剂的主要目标是推断有前景的候选制剂和/或其任何变化是否在室温下为100(±20％)μg/mL TTHX1114制剂提供长达1个月的合适稳定性。其次，期望了解是否可以在组氨酸浓度降低并且/或者pH略微升高的变化中实现相同程度的稳定性，因为这些调整可能潜在地得到在应用时更舒缓的滴眼剂。
表7.用于稳定性测试的样品设置
通过以下确定稳定性：(i)观察药物沉淀的扩展的目视检查方法和(ii)观察药物降解和HMW物质形成的SE-HPLC分析。制备之后，最终制剂在室温(大约20℃)下储存在工作台上的有盖试管架中。在制备之后第0、5、14、28和59天进行目视检查和SE-HPLC分析。在特定时间点表现不佳的制剂被排除在后续时间点的分析之外。此外，在第59天再次测量剩余制剂的pH，以确保在研究过程中没有发生漂移。
稀释剂和储备溶液制备
制备了两种不含L-组氨酸的基础稀释剂：稀释剂A(0.2％PS80/10％山梨醇)，并且通过将PS80和山梨醇溶解在去离子(DI)H2O中制备。用DI H2O将其稀释至500mL，然后通过0.2μm聚醚砜(PES)膜真空过滤单元过滤。第二种基础稀释剂是稀释剂B(0.2％PS20/10％山梨醇)，并且通过将PS20和山梨醇溶解在DI H2O中制备。用DI H2O将其稀释至500mL，然后通过0.2μm PES膜真空过滤单元过滤。
在制备基础稀释剂之后，制备两种不同的渗析缓冲液浓缩储备溶液。储备液A(9.29mM组氨酸/0.929％ PS80/46.43％山梨醇)通过将山梨醇、PS80和L-组氨酸添加并溶解在DI H2O中制备。用DI H2O将其稀释至3.5L，并通过瓶盖0.2μm PES膜真空过滤器将其中的2L过滤到已灭菌的2L瓶中。储备液B(9.18mM组氨酸/0.909％PS20/45.45％山梨醇)通过将山梨醇、PS80和L-组氨酸添加并溶解在DI H2O中制备。用DI H2O将其稀释至2750mL，并通过瓶盖0.2μmPES膜真空过滤器将其中的2L过滤到单独的已灭菌的2L瓶中。
在从-70℃储存冰箱取出修饰FGF-1多肽(SEQ ID NO:2)等分试样之后，使其在室温下解冻1小时，同时将储备溶液以所需的1x浓度稀释至渗析缓冲液中：2mM组氨酸/0.2％聚山梨酯80或20/10％山梨醇。将解冻的样品充分混合并在280nm处测量O.D。在室温(RT)下进行渗析，样品与渗析缓冲液的比率为1:100(30mL样品:3000mL渗析缓冲液)，随后更换2次缓冲液。第一次更换在开始时间之后2小时进行，第二次更换在开始时间之后4小时进行。第二次更换之后，使样品在RT下渗析过夜(再持续13小时)。然后在2mM组氨酸/0.2％ PS80或20/10％山梨醇中配制TTHX114。
将两种渗析的样品分成两个部分(2A.1+2A.2和2B.1+2B.2)。向2A/B.1溶液中，通过添加补充有10x 180mM组氨酸的稀释剂A或B，将组氨酸浓度增加至20mM。这些10x组氨酸溶液通过将1.117gL-组氨酸添加到各自40mL的稀释剂A和B中制备。
对于溶液2A.1，将1.6mL 10x组氨酸的稀释剂A溶液添加到14.4mL渗析的样品中。对于溶液2B.1，将1.8mL含10x组氨酸的稀释剂B添加到14.6mL渗析的样品中，然后添加1.6mL稀释剂B。除了使2A.1和2B.1溶液中的组氨酸浓度达到20mM之外，这些稀释液还使这些部分中的TTHX1114浓度达到200μg/mL。将两个渗析的样品(2A/B.2溶液)的其他部分简单地用补充有2mM组氨酸的稀释剂A或B稀释至200μg/mL TTHX1114(通过用相应稀释剂1:90稀释180mM溶液制备)。2A.1+2A.2和2B.1+2B.2的所有组分都是2x。样品通过0.2μm乙酸纤维素针头式过滤器过滤。对颗粒悬浮物进行了目视检查，并且以0-3的尺度和>3的单一等级进行评级，其中0表示没有可见的悬浮颗粒物。
结果：不管组氨酸浓度如何，pH 5.8样品都更好地将药物保持在溶液中，并且直到制备后59天才在10mM组氨酸缓冲液中观察到颗粒，并且在第28天在1mM组氨酸缓冲液中仅观察到一个悬浮颗粒。第5天之后未检查所有PS20制剂，因为通过SE-HPLC，在第5天，它们全部恢复得低于其PS80相对物。代表性SE-HPLC峰如图7所示。
表8：组氨酸浓度、随时间推移的pH变化研究的汇总
维持pH
在第0天调整至所需pH(参见表6)之后，在第59天再次评价pH，以确保制剂的pH没有漂移。在研究过程中，两种组氨酸浓度的样品均很好地保持其pH，并且没有观察到显著的漂移。
缓冲液ID 目标pH 第0天pH 第59天pH
3A.1 5.8 5.83 5.84
3A.4 5.8 5.77 5.73
总体来说，此项研究阐明了制剂中的药物产品(SEQ ID NO:2的FGF-1多肽)在RT下稳定至少28天。优化的制剂是pH 5.8的10mM组氨酸/0.1％ PS80/5％山梨醇制剂，因为在延长的时间段内没有可见颗粒，通过SE-HPLC的主峰面积几乎恒定，通过SE-HPLC的随时间推移的可溶性聚集体的百分比低，并且pH随时间推移受到控制。对于含有1mM组氨酸/0.1％PS80/5％山梨醇的制剂观察到类似的趋势，使其成为发现药物产品(SEQ ID NO:2的FGF-1多肽)稳定至少59天的另一制剂。
实施例5.修饰的人FGF-1的质粒、克隆和表达
此实施例描述了修饰FGF-1多肽(SEQ ID NO:2)在细菌中的产生。为了实现工程化的(修饰的)人FGF-1(TTHX1114)在大肠杆菌(BL21感受态细胞)中的表达，优化了靶蛋白的编码序列的大肠杆菌表达，包括密码子使用、转录和翻译效率以及mRNA稳定性并且通过GenScript进行从头合成并亚克隆到表达质粒中。所选质粒TTHX1114_pMKet的质粒图谱示出于图6中。设计的构建体编码修饰FGF-1多肽的遗传信息，而没有任何末端融合。
对于修饰FGF-1多肽的周质积累，通过外膜蛋白的前导肽(ompA，oA)在N-末端融合成熟蛋白。此前导序列是前蛋白易位到周质空间所需的，它在易位后通过信号肽酶I(SP-1)被裂解。质粒具有赋予卡那霉素抗性的序列。将插入序列亚克隆到质粒骨架TTHX1114_pMKet中。将周质构建体亚克隆到pMKet骨架中(质粒名称：oA-TTHX1114_pMKet)。修饰FGF-1多肽的表达受Tac启动子控制，所述启动子是IPTG依赖性启动子。
设计了周质构建体以确保在筛选之后，在修饰FGF-1ORF下游插入额外序列，以实现例如伴侣蛋白的双顺反子共同表达，工程化hFGF-1的示例性密码子优化核苷酸序列中两个终止密码子(下划线)与BamHI限制位点(斜体)之间的序列提供如下(长度：438bp，包括侧接位点)：
下面提供了周质积累的修饰FGF-1多肽的示例性序列：
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAFNLPPGNYKKPKLLYSSNGGHFLRILPDGTVDGTRDRSDQHIQLQLSAESVGEVYIKSTETGQYLCMDTDGLLYGSQTPNEECLFLERLEENHYNTYISKKHAEKNWFVGLKKNGSVKRGPRTHYGQKAILFLPLPVSSD(SEQ ID NO:208)。
易位后，生成了SEQ ID NO:2的成熟FGF-1多肽。
实施方案
实施方案1提供了一种制剂，其包含：
(a)修饰FGF-1多肽，其包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，或具有与SEQ IDNO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含至少1、2、3、4或5个单氨基酸突变；和
(b)L-甲硫氨酸。
实施方案2提供了根据实施方案1所述的制剂，其中所述制剂是用于眼内递送的可注射制剂。
实施方案3提供了根据实施方案1所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含位于SEQ ID NO:1的第一个残基上游的N-末端甲硫氨酸残基。
实施方案4提供了根据实施方案1所述的制剂，其中所述多肽还包含位于所述N-末端甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一个残基之间的延伸肽。
实施方案5提供了根据实施方案4所述的制剂，其中所述延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基，或包含SEQ ID NO.4-8中所示的任一序列。
实施方案6提供了根据实施方案1-5中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽是所述多肽的成熟形式。
实施方案7提供了根据实施方案1-6中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:14-18的序列。
实施方案8提供了根据实施方案1-6中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:24-28的序列。
实施方案9提供了根据实施方案1-6中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:93-117的序列。
实施方案10提供了根据实施方案1-6中任一项所述的，其中所述多肽还包含在延伸肽N-末端的甲硫氨酸残基。
实施方案11提供了根据实施方案1-6中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:118-141的序列。
实施方案12提供了根据实施方案1-11中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽以包含136个氨基酸的形式表达。
实施方案13提供了根据实施方案1-11中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含至少141个氨基酸。
实施方案14提供了根据实施方案1-13中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含在SEQ ID NO:1的第67位的突变。
实施方案15提供了根据实施方案1-14中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽还包含SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短。
实施方案16提供了根据实施方案1-15中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:146-149的序列。
实施方案17提供了根据实施方案1-16中任一项所述的制剂，其中所述多肽还包含延伸肽，所述延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。
实施方案18提供了根据实施方案1-16中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:174-204的序列。
实施方案19提供了根据实施方案1-18中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:205中所示的序列。
实施方案20提供了根据实施方案19所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽是所述多肽的成熟形式。
实施方案21提供了根据实施方案1-20中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自以下的一个或多个突变：Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val。
实施方案22提供了根据实施方案1-20中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含SEQ ID NO:1的一个或多个突变，所述突变选自以下：Lys12Val、Cys16Ser、Ala66Cys、Cys117Val和Pro134Val，并且其中所述修饰FGF-1多肽还包含肽ALTEK的至少一个残基。
实施方案23提供了根据实施方案1-22中任一项所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽包含一个或多个突变，所述突变包含SEQ IDNO:1的以下突变：Cys16Ser、Ala66Cys和Cys117Val，其中所述修饰FGF-1多肽包含位于SEQ ID NO:1的第一个残基上游的甲硫氨酸残基，以及位于所述N-末端甲硫氨酸与SEQ ID NO:1的第1位之间的肽ALTEK的至少一个残基。
实施方案24提供了根据实施方案1所述的制剂，其中所述制剂包含人血清白蛋白(HSA)和/或聚山梨酯80。
实施方案25提供了根据实施方案1所述的制剂，其中所述修饰FGF-1多肽在所述制剂中是大于95％纯的单体形式。
实施方案26提供了根据实施方案25所述的制剂，其还包含以下中的至少一种：
a.至少约50mM磷酸氢二钠二水合物；
b.至少约100mM氯化钠；
c.至少约10mM硫酸铵；
d.至少约0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；
e.至少约5mM L-甲硫氨酸，和
f.至少约0.01％聚山梨酯80(w/v)。
实施方案27提供了根据实施方案26所述的制剂，其中所述制剂包含EDTA，EDTA的浓度为至少约0.01mM至约10mM。
实施方案28提供了根据实施方案26所述的制剂，其中所述制剂包含硫酸铵，并且其中硫酸铵的浓度为至少约0.01mM至约100mM。
实施方案29提供了根据实施方案26所述的制剂，其中所述制剂包含至少约0.01mM至约100mM的L-甲硫氨酸。
实施方案30提供了根据实施方案1所述的制剂，其中所述修饰FGF-1以适合于治疗选自以下的一种或多种疾病、病症或病状的浓度存在：Fuch营养不良、大疱性角膜病变、疱疹性角膜病变、先天性遗传性内皮营养不良1、先天性遗传性内皮营养不良2、多形性角膜后层营养不良、干眼综合征、圆锥角膜、格子状角膜营养不良、颗粒状角膜营养不良、斑状角膜营养不良、施奈德结晶状角膜营养不良、先天性基质角膜营养不良、斑点状角膜营养不良、角膜损伤、眼外伤、化学性损伤、起疱性损伤、基质损伤和芥子气角膜病变。
实施方案31提供了根据实施方案1或30所述的制剂，其中所述制剂是前房内施用的。
实施方案32提供了根据实施方案1或30所述的制剂，其中所述制剂是玻璃体内施用的。
实施方案33提供了根据实施方案1-31中任一项所述的制剂，其中所述制剂在约-20℃的温度下稳定至少约2周至约4周。
实施方案34提供了一种用于生产治疗有效的修饰FGF-1多肽的可扩展方法，所述方法包括：
a.将重组核酸构建体引入合适的大肠杆菌细胞中，其中所述重组核酸构建体包含编码所述修饰FGF-1多肽的序列，以用于细胞质表达，所述序列被插入在包含pBR322衍生的ori序列的载体中；
b.使所述细胞在包含合适的抗生素的合成生长培养基中生长约20小时；以及
c.从所述细胞回收治疗有效的修饰FGF-1多肽，
其中在步骤c回收的修饰FGF-1的产量是不包括使用包含pBR322衍生的ori序列的载体、所述合成生长培养基或其组合的方法的至少2倍。
实施方案35提供了根据实施方案34所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列；或包含在SEQ ID NO:1的第12、16、66、117和134位的一个或多个突变的序列。
实施方案36提供了根据实施方案34所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽包含(i)Ala66Cys突变、(ii)Cys16Ser突变、(iii)Cys117Ser突变中的一个或多个。
实施方案37提供了根据实施方案34所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽包含位于SEQ ID NO:1的第一个残基上游的N-末端甲硫氨酸残基。
实施方案38提供了根据实施方案34所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽还包含位于所述N-末端甲硫氨酸残基与SEQ ID NO:1的第一个残基之间的延伸肽。
实施方案39提供了根据实施方案38所述的方法，其中所述延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。
实施方案40提供了根据实施方案39所述的方法，其中所述延伸肽包含SEQ IDNO.4-8中所示的任一序列。
实施方案41提供了根据实施方案34-40中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽是所述多肽的成熟形式。
实施方案42提供了根据实施方案34-41中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:14-18的序列。
实施方案43提供了根据实施方案34-42中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:24-28的序列。
实施方案44提供了根据实施方案34-43中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:93-117的序列。
实施方案45提供了根据实施方案34-44中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽还包含在所述延伸肽N-末端的甲硫氨酸残基。
实施方案46提供了根据实施方案34-45中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:118-141的序列。
实施方案47提供了根据实施方案34-46中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽以包含136个氨基酸的形式表达。
实施方案48提供了根据实施方案34-46中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽以其成熟形式包含至少141个氨基酸。
实施方案49提供了根据实施方案34-48中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽还包含SEQ ID NO:1的前五个残基中的一个或多个的截短。
实施方案50提供了根据实施方案34-49中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽包含选自SEQ ID NO:146-149和174-204的序列。
实施方案51提供了根据实施方案34-50中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽还包含延伸肽，所述延伸肽包含SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基。
实施方案52提供了根据实施方案34-51中任一项所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽包含如SEQ ID NO:2SEQ ID NO:205中所示的序列。
实施方案53提供了根据实施方案34所述的方法，其中所述合适的细胞是大肠杆菌细胞，菌株BL21、K12 HMS174或W3110。
实施方案54提供了根据实施方案34所述的方法，其中所述重组核酸构建体是包含T7或tac启动子的pMKet_TTHX1114。
实施方案55提供了根据实施方案34所述的方法，其中所述合成培养基包含作为碳源的甘油、蛋白胨和酵母。
实施方案56提供了根据实施方案34所述的方法，其中表达pMKet_TTHX1114的BL21细胞在37℃下，在卡那霉素的存在下生长20小时。
实施方案57提供了根据实施方案34所述的方法，其中所述重组核酸构建体包含用于增加来自所述细胞的所述修饰FGF-1多肽的产量的一种或多种修饰。
实施方案58提供了根据实施方案57所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括使所述细胞中所述修饰FGF-1多肽的表达增加的序列优化。
实施方案59提供了根据实施方案57所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括选择合适的启动子，以便增加来自所述细胞的所述修饰FGF-1多肽的产量。
实施方案60提供了根据实施方案34所述的方法，其还包括使所述细胞在足够的营养培养基中生长，以便使细胞增殖最大，其中所述足够的营养培养基包含碳源，并且其中所述碳源是葡萄糖或甘油。
实施方案61提供了根据实施方案57所述的方法，其中所述质粒是pMKet或其衍生或修饰。
实施方案62提供了根据实施方案34-61中任一项所述的方法，其还包括引入用于使来自所述细胞的所述修饰FGF-1多肽的产量最大的一种或多种修饰，其中所述一种或多种修饰过程选自：在编码所述修饰FGF-1多肽的所述重组核酸内的修饰；在包含一个或多个可操作地与编码所述修饰FGF-1多肽的所述重组核酸相关的一个或多个调控元件的所述重组核酸内的修饰；对包含所述重组核酸的所述质粒的修饰；对所述细胞株的修饰或对细胞株的选择，以便使细胞增殖最大；以及对所述细胞生长培养基的改良。
实施方案63提供了根据实施方案34所述的方法，其中引入重组核酸包括对所述细胞中的所述重组核酸进行电穿孔。
实施方案64提供了根据实施方案34所述的方法，其中从所述细胞回收所述修饰FGF-1多肽包括从所述细胞的周质包涵体回收所述蛋白质。
实施方案65提供了根据实施方案64所述的方法，其中回收包括使所述包涵体在变性缓冲液中溶解，以及回收所述修饰FGF-1多肽。
实施方案66提供了根据实施方案65中任一项所述的方法，其中所述变性缓冲液包含尿素或胍。
实施方案67提供了根据实施方案66所述的方法，其中所述变性缓冲液还包含2mMEDTA。
实施方案68提供了根据实施方案65-67中任一项所述的方法，其还包括通过添加DTT还原回收的修饰FGF-1多肽，还包括通过渗滤去除DTT。
实施方案69提供了根据实施方案65-68中任一项所述的方法，其中回收的修饰FGF-1多肽在复性缓冲液中进行复性。
实施方案70提供了根据实施方案69所述的方法，其中所述复性缓冲液包含L-精氨酸。
实施方案71提供了根据实施方案69或70中任一项所述的方法，其中所述复性缓冲液包含5mM半胱氨酸或2mM胱氨酸或两者。
实施方案72提供了根据实施方案69-71中任一项所述的方法，其中所述FGF-1通过具有肝素的疏水相互作用柱(HIC)被捕获。
实施方案73提供了根据实施方案34所述的方法，其中回收治疗有效的重组突变体hFGF1蛋白包括纯化所述蛋白质，其中纯化包括以下中的一种或多种：液相色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、超速离心、横向流过滤和渗滤。
实施方案74提供了一种药物组合物，其包含通过根据实施方案34-73中任一项所述的方法产生的修饰FGF-1多肽、其冻干粉末级分或其液体制剂。
实施方案75提供了一种治疗患有选自以下的疾病、病症或病状的对象的方法：Fuch营养不良、大疱性角膜病变、疱疹性角膜病变、先天性遗传性内皮营养不良1、先天性遗传性内皮营养不良2、多形性角膜后层营养不良、干眼综合征、圆锥角膜、格子状角膜营养不良、颗粒状角膜营养不良、斑状角膜营养不良、施奈德结晶状角膜营养不良、先天性基质角膜营养不良、斑点状角膜营养不良、角膜损伤、眼外伤、化学性损伤、起疱性损伤、基质损伤和芥子气角膜病变，所述方法包括向有需要的对象施用合适剂量的以下物质：(i)根据实施方案1-33中任一项所述的可注射制剂，或(ii)根据实施方案74所述的药物组合物。
实施方案76提供了一种试剂盒，其包括FGF-1的可注射制剂。
实施方案77提供了根据实施方案76所述的试剂盒，其包括滴瓶，其中所述滴瓶能够提供至少一个剂量的在根据实施方案1-33中任一项所述的制剂或在根据实施方案74所述的药物组合物中的修饰FGF-1。
实施方案78提供了根据实施方案76或77所述的试剂盒，其中所述滴瓶还包括无菌过滤器。
实施方案79提供了根据实施方案76-78中任一项所述的试剂盒，其中所述容器包括注射器。
实施方案80提供了根据实施方案79所述的试剂盒，其中所述注射器包括选自结核菌素聚丙烯和玻璃的材料。
实施方案81提供了根据实施方案79或80所述的试剂盒，其中所述注射器预填充有根据实施方案1-33中任一项所述的可注射制剂或根据实施方案74所述的药物组合物。
实施方案82提供了根据实施方案79-81中任一项所述的试剂盒，其还包括电子控制单元。
实施方案83根据实施方案82所述的试剂盒，其中所述电子控制单元能够控制一定体积的根据实施方案1-33中任一项所述的可注射制剂或根据实施方案74所述的药物组合物的施用，其中所述体积为至少约10μL至约100μL。
序列表
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Claims (38)

1.一种药物制剂，其包含：
修饰FGF-1多肽，
浓度为约1mM至约20mM的柠檬酸盐或组氨酸，
浓度为约0.01％至约10％(w/v)的表面活性剂，和
浓度为约1％至约10％(w/v)或约50mM至约200mM的张力调节剂，
其中所述修饰FGF-1多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列并且包含以下氨基酸残基：第16位的Ser、第66位的Cys和第117位的Val。
2.根据权利要求1所述的药物制剂，其包含浓度为约1mM或约10mM的组氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的药物制剂，其中所述表面活性剂的浓度为约0.1％(w/v)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨酯。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，其中所述聚山梨酯是PS-20或PS-80。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的药物制剂，其中所述聚山梨酯是PS-80。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的药物制剂，其中所述张力调节剂是山梨醇，并且其中所述药物制剂包含浓度为约5％(w/v)的山梨醇。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂的pH为约4.5至约6.5。
9.根据权利要求8所述的药物制剂，其中所述制剂的pH为约5.8。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的药物制剂，其中所述修饰FGF-1多肽的浓度为约0.0005μg/mL至约200μg/mL。
11.根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述修饰FGF-1多肽的浓度为约100μg/mL。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的药物制剂，其中如通过以下中任一项所测量，所述修饰FGF-1多肽在室温下储存时稳定至少28天：(i)通过目视检查，没有可见颗粒，以及(ii)在SE-HPLC测定中，高分子量物质的峰面积小于5％。
13.根据权利要求12所述的药物制剂，其中所述修饰FGF-1多肽在室温下储存时稳定至少50天。
14.根据权利要求13所述的药物制剂，其中当所述制剂在室温下储存时，所述修饰FGF-1多肽稳定至少59天。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的药物制剂，其中所述制剂适用于外用应用、呈滴眼剂应用、眼内注射或眼周注射。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的药物制剂，其中所述制剂是用于眼内递送的可注射制剂。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的药物制剂，其中所述制剂是用于玻璃体内递送的可注射制剂。
18.一种散装原料药制剂，其包含：修饰FGF-1多肽；浓度为至少约200mM至约1000mM的氯化钠；浓度为约50mM至约500mM的硫酸铵；浓度为约1mM至约50mM的磷酸氢二钠，其中所述修饰FGF-1多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列并且包含以下氨基酸残基：第16位的Ser、第66位的Cys和第117位的Val。
19.根据权利要求18所述的散装原料药制剂，其中所述修饰FGF-1多肽的浓度为至少约0.1g/mL至约10g/mL。
20.根据权利要求19所述的散装原料药制剂，其中所述修饰FGF-1多肽的浓度为约3g/mL。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的散装原料药制剂，其包含浓度为约800mM的氯化钠。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的散装原料药制剂，其包含浓度为约320mM的硫酸铵。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的散装原料药制剂，其包含浓度为约20mM的磷酸氢二钠。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的散装原料药制剂，其中所述散装原料药制剂的pH为约7至约9。
25.根据权利要求24所述的散装原料药制剂，其中所述散装原料药制剂的pH为约7.4。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的散装原料药制剂，其中所述修饰FGF-1多肽在-60℃±10℃的温度下储存时稳定。
27.一种制造方法，其包括对从细菌细胞的培养物中的包涵体分离的复性的修饰FGF-1多肽的纯化，所述细菌细胞用包含用于编码所述修饰FGF-1多肽的核酸的载体转染，其中所述纯化包括使用与作为配体的硫酸葡聚糖偶联的高度交联琼脂糖基础基质捕获所述复性的修饰FGF-1多肽，接着使用填充有丁基琼脂糖凝胶树脂的色谱柱，通过疏水相互作用色谱法精细纯化。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述修饰FGF-1多肽从所述精细纯化步骤的回收率比在其他方面相同的制造方法中使用填充有肝素树脂的色谱柱通过疏水相互作用色谱法进行的精细纯化步骤之后所述修饰FGF-1多肽的回收率高约10％至约40％。
29.一种用于生产治疗有效的修饰FGF-1多肽的可扩展方法，所述方法包括：
a.将包含编码所述修饰FGF-1多肽的核酸序列的重组核酸构建体引入大肠杆菌细胞，其中所述构建体被配置为将翻译的修饰FGF-1多肽靶向所述细胞的周质空间中，
b.使所述细胞在包含合适的抗生素的合成生长培养基中生长约20小时；以及
c.从所述细胞回收治疗有效的修饰FGF-1多肽，
其中在1L或更大的规模下，回收的修饰FGF-1的产量为至少3g/L。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的可扩展方法，其中所述修饰FGF-1多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列并且包含以下氨基酸残基：第16位的Ser、第66位的Cys和第117位的Val。
31.根据权利要求29或30所述的可扩展方法，其中所述大肠杆菌细胞选自菌株BL21、K12 HMS174和W3110。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的可扩展方法，其中所述重组核酸构建体是包含T7或tac启动子的pMKet_TTHX1114。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的可扩展方法，其中所述合成生长培养基包含作为碳源的甘油、蛋白胨和酵母。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的可扩展方法，其中所述大肠杆菌细胞是BL21细胞，并且其中使表达pMKet_TTHX1114的所述BL21细胞在37℃下，在卡那霉素的存在下生长约20小时。
35.根据权利要求29-34中任一项所述的可扩展方法，其中所述重组核酸构建体包含用于增加来自所述细胞的所述修饰FGF-1多肽的产量的一种或多种修饰。
36.根据权利要求35所述的可扩展方法，其中所述一种或多种修饰包括使所述细胞中所述修饰FGF-1多肽的表达增加的核酸序列密码子优化。
37.一种用于编码修饰FGF1-1多肽的核酸序列，所述核酸包含序列SEQ ID NO:207。
38.一种细菌表达载体，其包含可操作地连接至Tac启动子的SEQ ID NO:207。
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