JP6970086B2 - 皮膚の創傷、障害、及び疾患を処置するための組成物及び方法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月８日出願の、米国仮特許出願第６２／３２０，３１６号の優先権の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイル上における以下の提出物の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名称：７６１３４２０００１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１６年１２月２８日、サイズ：３９４ＫＢ）。
本開示は、部分的には、表皮水疱症の１つ以上の症状を有する、またはそれを発症するリスクがある対象を含む、対象の皮膚における創傷、障害、または疾患の予防的、待期的、または治療的緩和を提供するための医薬組成物及び使用方法に関する。
多数の深刻な疾患関連皮膚状態は、これらの疾患に罹患している患者の１種以上の遺伝的障害と関連する。このような疾患の１つ、表皮水疱症（ＥＢ）は、軽微な損傷または摩擦、例えば、掻爬、擦過、または引掻きなどに応答して、罹患した個体の皮膚及び粘膜に水疱が生じて侵食される遺伝的障害の群である。栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）は、ＥＢの主な形態の１種である。この状態の徴候及び症状は、罹患した個体の中でも大きく異なり、軽度なもの（水疱形成が手、足、膝、及び肘にのみ影響を及ぼす可能性があるもの）から重篤なもの（広範にわたる水疱形成及び瘢痕化、場合により視力喪失、変形、及びその他の深刻な、時として致死的な健康状態をもたらすもの）にまで及ぶ。
栄養障害型表皮水疱症は、主に３種類に分類される。常染色体優性栄養障害型表皮水疱症（優性栄養障害型表皮水疱症またはＤＤＥＢと称される）は、典型的には、多くの場合に手、足膝及び肘に限定される水疱形成を伴う最軽症型である。他方の２種類の栄養障害型表皮水疱症、すなわち、Ｈａｌｌｏｐｅａｕ−Ｓｉｅｍｅｎｓ型劣性栄養障害型表皮水疱症、及び非Ｈａｌｌｏｐｅａｕ−Ｓｉｅｍｅｎｓ型劣性表皮水疱症（劣性栄養障害型表皮水疱症またはＲＤＥＢと総称される）は、より重篤である。ＲＤＥＢは、ほとんどの場合、皮膚及び粘膜の広範な水疱形成及び瘢痕化を特徴とする。水疱は、粘膜（口腔及び消化管の粘膜など）上を含む、全身にわたって日常的に存在し、これらの水疱の治癒によって広範な瘢痕化がもたらされる。口腔及び食道に対する損傷は、食べ物の咀嚼と嚥下を困難にし、慢性的な栄養失調及び低成長をもたらし得る。広範な瘢痕化の合併症としては、手指及び足指の融合、関節変形、ならびに視力喪失をもたらす眼炎を挙げることができる。さらに、ＲＤＥＢに罹患している患者は、扁平上皮癌腫を発症するリスクが高く、この疾患は、この患者集団において非常に侵襲的であり、多くの場合に生命を脅かすものになり得る。３種類の栄養障害型表皮水疱症は重篤さが異なるが、それらは多くの共通した特徴を有し、同じ遺伝子変異によって引き起こされる。
栄養障害型表皮水疱症は、Ｃｏｌ７ａ１遺伝子に対する変異によって引き起こされ、この遺伝子はコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖タンパク質（コラーゲン７）をコードする。この遺伝子に対する２４０超の異なる変異が、ＤＥＢ患者で同定されてきた。さらに、コラーゲン修飾リジルヒドロキシラーゼ３酵素（ＬＨ３）をコードする、ＰＬＯＤ３遺伝子発現の有意な減少も、栄養障害型表皮剥離患者で観察されている。コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖タンパク質が、皮膚を強化して安定化させるように機能する一方で、リジルヒドロキシラーゼ３は、機能的なコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖タンパク質の合成及び分泌に重要な役割を果たす。簡潔に述べると、Ｃｏｌ７ａ１転写物が翻訳されて、得られたペプチドは、それらのプロリン残基（プロリルヒドロキシラーゼによって）及びそれらのリジン残基（ＬＨ３などのリジルヒドロキシラーゼによって）のヒドロキシル化により翻訳後修飾される。次いで、ヒドロキシリジン残基がグリコシル化され得、続いて３つのグリコシル化ペプチドがプロコラーゲンとして知られるトリプルヘリックスを形成し、細胞から分泌される。次いで、分泌されたプロコラーゲンは高次構造に関連し、係留線維を形成し得る。次いで、係留線維は、上皮基底膜の接着を組織化する、安定化させる、かつ支援するのを助けるために利用可能である。上皮基底膜は、上皮を下層の疎性結合組織に係留することに関与し、真皮−表皮安定性（表皮真皮境界部の一体性）に不可欠である。Ｃｏｌ７ａ１遺伝子の変異、及びＰＬＯＤ３発現のレベル減少は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖タンパク質が表皮と真皮とを適切に結合する能力を、脆弱な皮膚の原因となる栄養障害型表皮水疱症患者において障害する。
表皮水疱症患者の処置選択肢は限られていて、現在のケアは、疾患の症状を管理することに焦点を当て、疼痛及び痒みを制御するために薬剤を提供すること、皮膚及び粘膜上の開放創に起因する感染症を回避するために経口抗生物質を投与すること、ならびに瘢痕化及び変形に対処するための外科的戦略を含む。表皮水疱症の根本的な原因を処置する治験方法としては、精製コラーゲン７、コラーゲン７を含有する線維芽細胞、またはコラーゲン７をコードするウイルスベクターを、皮内注射によって投与することが挙げられる。多くのＤＥＢ患者は、外傷多発部位の大部分（仙骨、臀部、足、腰部、及び手など）に広がる複数の創傷を有することから、皮内注射を伴ういずれの処置も、これらの広い創傷部分が全て、注射の時間間隔は不明確であるが、恐らくは反復して注射される必要があることになるため、極めて侵襲的であることになる。
したがって、表皮水疱症患者のための、この患者集団で観察されるコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖タンパク質の欠損、加えてリジルヒドロキシラーゼ３タンパク質の欠損に対処し得る低侵襲的／最小侵襲的／非侵襲的な処置選択肢の必要性が明確に存在する。
特許出願、特許公報、非特許文献、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号を含む、本明細書で引用される全ての参考文献は、個々の参考文献が参照によって組み込まれていると具体的かつ個別に示されたかのように、それら全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
これらの要望を満たすために、本開示は、部分的には、対象、特に表皮水疱症の１つ以上の症状を有する、またはそれを発症するリスクがある対象の皮膚における創傷、障害、または疾患の予防的、待期的、または治療的緩和を提供するための医薬組成物及び使用方法に関する。特に、本開示は、部分的には、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド及び／またはそれらのキメラポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与する（例えば、局所的に、または経皮的に投与する）ことによって個体を処置する方法に関する。
したがって、本開示の特定の態様は、ベクター、すなわち、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、またはそれらのキメラポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含むベクターを含むウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意のそれらのハイブリッドウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは複製欠損性である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、改変エンベロープを含む。いくつかの実施形態では、改変エンベロープは、野生型単純ヘルペスウイルスと比較して単純ヘルペスウイルスの組織向性を変化させる。いくつかの実施形態では、改変エンベロープは、変異体単純ヘルペスウイルス糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンは、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドアンプリコン、ＨＳＶ／ＥＢＶハイブリッドアンプリコン、及びＨＳＶ／ＥＢＶ／ＲＶハイブリッドアンプリコン、またはＨＳＶ／Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、前初期単純ヘルペスウイルス遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス遺伝子は、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１、またはＵＬ５５である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域における欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０及びＩＣＰ４遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異、ＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異、またはＩＣＰ４７及びＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上のウイルス遺伝子座内に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４ウイルス遺伝子座のうち１つ以上の中に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１ウイルス遺伝子座内に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的細胞中に送達される場合、標的細胞内で複製することができる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、局所または経皮投与に好適である。いくつかの実施形態では、１つ以上の導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の導入遺伝子は、１つ以上の異種プロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上の異種プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期プロモーター、伸長因子−１（ＥＦ１）プロモーター、及び／または任意のそれらの組合せのうち１つ以上である。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは２つの導入遺伝子を含み、各導入遺伝子がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、配列番号：２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは断片であり、この断片は、配列番号：２の少なくとも１００の連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の上皮基底膜組織化及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、配列番号：４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは断片であり、この断片は、配列番号：４の少なくとも１００の連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の１つ以上のコラーゲンポリペプチド上においてヒドロキシリジン残基の形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成、上皮基底膜組織化、及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも第１導入遺伝子及び第２導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子はコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、第２導入遺伝子はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリシストロン性である導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１及び第２ＯＲＦは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合、約等モル比である。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成、上皮基底膜組織化、及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドとリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドとの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａリンカーポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６または配列番号：２８の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成、上皮基底膜組織化、及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。
本開示のその他の態様は、対象の皮膚における創傷、障害、または疾患の予防的、待期的、または治療的緩和を提供する方法に関し、本方法は、対象の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足することができる医薬組成物を局所的に、または経皮的に投与することを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ベクター、すなわち、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、またはそれらのキメラポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含むベクターを含むウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意のそれらのハイブリッドウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは複製欠損性である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、改変エンベロープを含む。いくつかの実施形態では、改変エンベロープは、野生型単純ヘルペスウイルスと比較して単純ヘルペスウイルスの組織向性を変化させる。いくつかの実施形態では、改変エンベロープは、変異体単純ヘルペスウイルス糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンは、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドアンプリコン、ＨＳＶ／ＥＢＶハイブリッドアンプリコン、及びＨＳＶ／ＥＢＶ／ＲＶハイブリッドアンプリコン、またはＨＳＶ／Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、前初期単純ヘルペスウイルス遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス遺伝子は、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１、またはＵＬ５５である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域における欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０及びＩＣＰ４遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異、ＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異、またはＩＣＰ４７及びＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上のウイルス遺伝子座内に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４ウイルス遺伝子座のうち１つ以上の中に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１ウイルス遺伝子座内に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的細胞中に送達される場合、標的細胞内で複製することができる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、局所または経皮投与に好適である。いくつかの実施形態では、１つ以上の導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の導入遺伝子は、１つ以上の異種プロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上の異種プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期プロモーター、伸長因子−１（ＥＦ１）プロモーター、及び／または任意のそれらの組合せのうち１つ以上である。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは２つの導入遺伝子を含み、各導入遺伝子がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、配列番号：２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは断片であり、この断片は、配列番号：２の少なくとも１００の連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の上皮基底膜組織化及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、配列番号：４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは断片であり、この断片は、配列番号：４の少なくとも１００の連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の１つ以上のコラーゲンポリペプチド上においてヒドロキシリジン残基の形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成、上皮基底膜組織化、及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも第１導入遺伝子及び第２導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子はコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、第２導入遺伝子はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリシストロン性である導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１及び第２ＯＲＦは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合、約等モル比である。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成、上皮基底膜組織化、及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドとリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドとの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａリンカーポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６または配列番号：２８の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成、上皮基底膜組織化、及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１日当たり１回、２回、３回、４回、５回またはそれを超える回数で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象の１箇所以上の患部及び／または非患部に投与される。いくつかの実施形態では、皮膚の疾患または障害は、表皮水疱症、皮膚癌、乾癬、扁平苔癬、ループス、酒さ、湿疹、皮膚カンジダ症、蜂巣炎、膿痂疹、褥瘡性潰瘍、丹毒、尋常性魚鱗癬、皮膚筋炎、肢端皮膚炎、うっ血性皮膚炎、ネザートン症候群、単純型表皮水疱症（ＬＡＭＢ３遺伝子）、常染色体劣性先天性魚鱗癬、色素性乾皮症、及び類天疱瘡のうち１つ以上である。
本開示のその他の態様は、単離キメラポリペプチド、すなわち、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及びリンカーポリペプチドを含む単離キメラポリペプチドであって、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドが、リンカーポリペプチドによって分離されている単離キメラポリペプチドに、同じものをコードするポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチドを含むベクターに、ならびにベクターを含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンは、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドアンプリコン、ＨＳＶ／ＥＢＶハイブリッドアンプリコン、及びＨＳＶ／ＥＢＶ／ＲＶハイブリッドアンプリコン、またはＨＳＶ／Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、前初期単純ヘルペスウイルス遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス遺伝子は、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１、またはＵＬ５５である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域における欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０及びＩＣＰ４遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異、ＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異、またはＩＣＰ４７及びＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上のウイルス遺伝子座内にポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４ウイルス遺伝子座のうち１つ以上の中にポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１ウイルス遺伝子座内にポリヌクレオチドを含む。
本開示のその他の態様は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、または任意のそれらの組合せをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含むベクターであって、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムであるベクターに、ならびにベクターを含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、前初期単純ヘルペスウイルス遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス遺伝子は、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１、またはＵＬ５５である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域における欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０及びＩＣＰ４遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異、ＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異、またはＩＣＰ４７及びＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上のウイルス遺伝子座内に１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４ウイルス遺伝子座のうち１つ以上の中に１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１ウイルス遺伝子座内に１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１種のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする２種のポリヌクレオチドを含む。
本開示のその他の態様は、単純ヘルペスウイルスを収集する方法に関し、対象となるベクターは、単純ヘルペスウイルス内にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、本方法は、宿主細胞を、ヘルパーウイルスをコードするベクターと接触させるステップ、宿主細胞を、本明細書に記載される１種以上のポリヌクレオチドを含むＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンと接触させるステップ、及び宿主細胞によって生成された単純ヘルペスウイルスを収集するステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、補完宿主細胞を、本明細書に記載される１種以上のポリヌクレオチドを含む組換え単純ヘルペスウイルスゲノムベクターと接触させるステップ、及び補完宿主細胞によって生成された単純ヘルペスウイルスを収集するステップを含む。いくつかの実施形態では、収集した単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、または任意のそれらの誘導体である。
本開示のその他の態様は、本明細書に記載される医薬組成物及び医薬組成物を投与するための説明書を含むキットに関する。
本開示のその他の態様は、ベクター、すなわち、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、またはそれらのキメラポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含むベクターを含むウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関することに関する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意のそれらのハイブリッドウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは複製欠損性である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンは、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドアンプリコン、ＨＳＶ／ＥＢＶハイブリッドアンプリコン、及びＨＳＶ／ＥＢＶ／ＲＶハイブリッドアンプリコン、またはＨＳＶ／Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、前初期単純ヘルペスウイルス遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス遺伝子は、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１、またはＵＬ５５である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域における欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０及びＩＣＰ４遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異、ＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異、またはＩＣＰ４７及びＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上のウイルス遺伝子座内に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４ウイルス遺伝子座のうち１つ以上の中に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１ウイルス遺伝子座内に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的細胞中に送達される場合、標的細胞内で複製することができる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、局所または経皮投与に好適である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、皮下または皮内投与に好適である。いくつかの実施形態では、１つ以上の導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは２つの導入遺伝子を含み、各導入遺伝子がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、配列番号：２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは断片であり、この断片は、配列番号：２の少なくとも１００の連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の上皮基底膜組織化及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、配列番号：４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは断片であり、この断片は、配列番号：４の少なくとも１００の連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の１つ以上のコラーゲンポリペプチド上においてヒドロキシリジン残基の形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成、上皮基底膜組織化、及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドは、配列番号：３０の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドは断片であり、この断片は、配列番号：３０の少なくとも１００の連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドは、対象における創傷治癒を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも第１導入遺伝子及び第２導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子及び第２導入遺伝子は各々、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子はコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、第２導入遺伝子はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子はコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、第２導入遺伝子はケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードし、第２導入遺伝子はケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも第１導入遺伝子、第２導入遺伝子、及び第３導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子はコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、第２導入遺伝子はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードし、第３導入遺伝子はケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。
本開示のその他の態様は、対象の皮膚における創傷、障害、または疾患の予防的、待期的、または治療的緩和を提供する方法に関し、本方法は、ベクターを含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ベクターは組換え単純ヘルペスウイルスゲノムであり、医薬組成物は、対象の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ベクター、すなわち、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、またはそれらのキメラポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含むベクターを含むウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意のそれらのハイブリッドウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは複製欠損性である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、前初期単純ヘルペスウイルス遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス遺伝子は、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１、またはＵＬ５５である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域における欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０及びＩＣＰ４遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異、ＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異、またはＩＣＰ４７及びＵＬ４１遺伝子中の不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上のウイルス遺伝子座内に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４ウイルス遺伝子座のうち１つ以上の中に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１ウイルス遺伝子座内に１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的細胞中に送達される場合、標的細胞内で複製することができる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、局所または経皮投与に好適である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、皮下または皮内投与に好適である。いくつかの実施形態では、１つ以上の導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、配列番号：２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは断片であり、この断片は、配列番号：２の少なくとも１００の連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の上皮基底膜組織化及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、配列番号：４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは断片であり、この断片は、配列番号：４の少なくとも１００の連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の１つ以上のコラーゲンポリペプチド上においてヒドロキシリジン残基の形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドは、ポリペプチドが対象の１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、対象の係留線維形成、上皮基底膜組織化、及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドは、配列番号：３０の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドは断片であり、この断片は、配列番号：３０の少なくとも１００の連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドは、対象における創傷治癒を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも第１導入遺伝子及び第２導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子及び第２導入遺伝子は各々、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子はコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、第２導入遺伝子はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子はコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、第２導入遺伝子はケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードし、第２導入遺伝子はケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも第１導入遺伝子、第２導入遺伝子、及び第３導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１導入遺伝子はコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、第２導入遺伝子はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードし、第３導入遺伝子はケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象に局所的に、または経皮的に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象の皮下に、または皮内に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１日当たり１回、２回、３回、４回、５回またはそれを超える回数で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象の１箇所以上の患部及び／または非患部に投与される。いくつかの実施形態では、皮膚の疾患または障害は、表皮水疱症、皮膚癌、乾癬、扁平苔癬、ループス、酒さ、湿疹、皮膚カンジダ症、蜂巣炎、膿痂疹、褥瘡性潰瘍、丹毒、尋常性魚鱗癬、皮膚筋炎、肢端皮膚炎、うっ血性皮膚炎、ネザートン症候群、単純型表皮水疱症（ＬＡＭＢ３遺伝子）、常染色体劣性先天性魚鱗癬、色素性乾皮症、及び類天疱瘡のうち１つ以上である。
図１Ａ〜図１Ｆは、野生型及び改変単純ヘルペスウイルスゲノムの概略図を示す。 図１Ａは、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図１Ｂは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。 図１Ｃは、２つの導入遺伝子、すなわち、１つはコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、他方はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする遺伝子を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示し、この導入遺伝子はＤＮＡの同じ鎖上でコードされる。図１Ｄは、２つの導入遺伝子、すなわち、１つはコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、他方はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする遺伝子を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示し、この導入遺伝子はＤＮＡの逆向きの鎖上においてアンチセンス配向でコードされる。 図１Ｅは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されるコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする、ポリシストロン性の導入遺伝子を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図１Ｆは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リンカーポリペプチド、及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする、導入遺伝子を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。 図２Ａ〜図２Ｇは、野生型及び改変単純ヘルペスウイルスゲノムの追加の概略図を示す。 図２Ａは、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図２Ｂは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５のコード配列の欠失ならびにＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７のプロモーター配列の欠失を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示し、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする２つの導入遺伝子がＩＣＰ４遺伝子座に組み込まれる。 図２Ｃは、ＩＣＰ４（両方のコピー）及びＩＣＰ２２のコード配列の欠失を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示し、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする２つの導入遺伝子がＩＣＰ４遺伝子座に組み込まれる。図２Ｄは、ＩＣＰ０及びＩＣＰ４（両方のコピー）のコード配列の欠失を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示し、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする２つの導入遺伝子がＩＣＰ４遺伝子座に組み込まれる。 図２Ｅは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４（両方のコピー）、及びＩＣＰ２２のコード配列の欠失を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示し、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする２つの導入遺伝子がＩＣＰ４遺伝子座に組み込まれる。図２Ｆは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７のコード配列の欠失を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示し、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする２つの導入遺伝子がＩＣＰ４遺伝子座に組み込まれる。 図２Ｇは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５のコード配列の欠失を含む改変単純ヘルペスウイルスゲノムを示し、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする２つの導入遺伝子がＩＣＰ４遺伝子座に組み込まれる。 「ＫＢ１０３」、すなわち、ヒトコラーゲン７（ＣＯＬ７Ａ１）発現カセットを持つ複製欠損単純ヘルペス１型ウイルス（ＨＳＶ−１）の概略図を示す。 図４Ａ〜図４Ｂは、ＫＢ１０３感染ＲＤＥＢヒト皮膚ケラチノサイト（図４Ａ）及びＲＤＥＢヒト皮膚線維芽細胞（図４Ｂ）からのＣＯＬ７転写レベルの用量依存的増加を示す。転写物をβ−アクチンレベルと比較して定量化し、非感染細胞の発現を基準として正規化した。 図５Ａ〜図５Ｂは、ＫＢ１０３感染細胞で検出されたヒトＣｏｌ７タンパク質発現を示す。図５Ａは、示された感染多重度（ＭＯＩ）での、非感染正常及びＲＤＥＢ線維芽細胞、加えてＫＢ１０３に感染させた線維芽細胞におけるヒトＣｏｌ７タンパク質発現を示す。図５Ｂは、示された感染多重度（ＭＯＩ）での、非感染正常及びＲＤＥＢケラチノサイト、加えてＫＢ１０３に感染させたケラチノサイトにおけるヒトＣｏｌ７タンパク質発現を示す。ヒトＧＡＰＤＨタンパク質発現をローディング対照として示す。 免疫蛍光法によって評価されるような、非感染（対照）またはＫＢ１０３感染（Ｃ７、ＭＯＩ ３）ＲＤＥＢヒト皮膚線維芽細胞（ＥＢ ＨＤＦ）、正常ヒト皮膚ケラチノサイト（正常ＨＤＫ）、及びＲＤＥＢヒト皮膚ケラチノサイト（ＲＤＥＢ ＨＤＫ）におけるヒトＣＯＬ７Ａ１タンパク質発現を示す。 示されたＭＯＩでの、非感染正常及びＲＤＥＢヒト皮膚ケラチノサイト、加えてＫＢ１０３に感染させたケラチノサイトにおけるヒトＣｏｌ７及びＬＨ３タンパク質発現を示す。ヒトＧＡＰＤＨタンパク質発現をローディング対照として示す。 示されたＭＯＩでの、非感染正常及びＲＤＥＢヒト皮膚線維芽細胞、加えてＫＢ１０３に感染させた線維芽細胞におけるヒトＴＳＰ−１タンパク質発現を示す。ヒトＧＡＰＤＨタンパク質発現をローディング対照として示す。 図９Ａ〜図９Ｂは、ラット尾部コラーゲン１（図９Ａ）及びヒトフィブロネクチン（図９Ｂ）の濃度を増加させて処理したウェルへの、示されたＭＯＩにおける非感染（対照）ＲＤＥＢヒト皮膚ケラチノサイト、及びＫＢ１０３に感染させたケラチノサイトの細胞接着を示す。 免疫蛍光法による、ＫＢ１０３感染皮膚等価物器官型培養物における基底膜領域（ＢＭＺ）でのＣｏｌ７沈着を示す。 ＫＢ１０３感染マウスから単離した組織におけるウイルスゲノムコピー数及びヒトＣｏｌ７転写レベルの定量化を示す。 基底膜領域（ＢＭＺ）でのヒトＣｏｌ７沈着の開始を含む、免疫蛍光法による、ＫＢ１０３感染マウスからの皮膚組織におけるヒトＣｏｌ７タンパク質発現を示す。
本開示は、部分的には、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、及び／またはそれらのキメラポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物はベクターを含み、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、及び／またはそれらのキメラポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、対象の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足するのに好適な１つ以上の導入遺伝子を含む。本開示はまた、部分的には、本明細書に記載される医薬組成物を投与すること（例えば、局所的に、または経皮的に投与すること）によって、対象の皮膚における創傷、障害、または疾患（例えば、栄養障害型表皮水疱症）の予防的、待期的、または治療的緩和を提供する方法にも関する。
以下の説明は、例示的な方法、パラメータなどについて示す。しかしながら、このような説明は、本開示の範囲に対する限定として意図されるのではなく、むしろ、例示的な実施形態の説明として提供されると認識されるべきである。
一般的技術
本明細書で記載または参照される技術及び手順は、当業者により一般によく理解され、従来の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、シリーズＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）に記載されていて、広く利用されている方法などを使用して一般的に用いられる。
定義
本発明について詳細に記載する前に、本発明は特定の組成物または生物系に限定されず、当然のことながら、これは変更され得ると理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみの記載を目的とし、限定することを意図するものではないこともまた理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（分子）」への言及は、場合により２つ以上のこのような分子の組合せなどを含む。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者であれば容易に分かる各々の値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（かつ記載する）。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸」という用語、及びそれらの変化形は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）に、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）に、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるポリヌクレオチドにおける任意のその他の種類に、ならびにポリマーが、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含有することを条件として、非ヌクレオチド骨格を含有するその他のポリマーに一般的であることとする。したがって、これらの用語は、既知の種類の核酸配列改変、例えば、天然に存在するヌクレオチドのうち１つ以上と類似体との置換、及びヌクレオチド間改変を含む。
本明細書で使用される場合、核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係に置かれている場合、「ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ（機能的に連結）」または「ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ（機能的に連結）」されている。例えば、プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列に機能的に連結されている、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合にコード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味する。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、細胞の発現または複製のいずれかを目的として、異種核酸を細胞に導入するために使用される別個の要素を指す。発現ベクターとしては、プロモーター領域などの調節配列と機能的に連結される核酸を発現することができるベクターが挙げられ、調節配列はこのような核酸の発現をもたらすことができる。したがって、発現ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適切な宿主細胞への導入時に、核酸の発現をもたらすその他のベクターなどを指す場合がある。適切な発現ベクターは当業者に周知であり、これらとしては、真核細胞中で複製可能なもの及びエピソームのままであるもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸、すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの連続ストレッチを指す。典型的には、核酸は、翻訳開始シグナルまたは開始コドン、例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧなど、及び終止コドンを含む。
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ｍＲＮＡ配列の中間で、例えば、その最初の開始コドン後に翻訳開始が可能になるヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用される場合、「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」は、オープンリーディングフレームの５’末端及び／または３’末端における非翻訳核酸を指す。ポリヌクレオチド中における１箇所以上のＵＴＲの含有は、ポリヌクレオチドの転写後調節、ｍＲＮＡ安定性、及び／または翻訳に影響を及ぼす場合がある。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、細胞中に導入された後、ＲＮＡに転写されて、適切な条件下で翻訳かつ／または発現されることができるポリヌクレオチドを指す。いくつかの態様では、導入遺伝子は、それが導入された細胞に所望の特性を付与する、またはさもなければ所望の治療結果もしくは診断結果をもたらす。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という用語は同じ意味で使用され、２つ以上のアミノ酸のポリマーを指す場合がある。
本明細書で使用される場合、「対象」、「宿主」、または「個体」は、ヒト、飼育及び家畜動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペットの動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど、加えて研究で使用される動物、例えば、マウス及びラットなどを含む、哺乳動物に分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用される場合、「局所投与」または「局所的に投与すること」は、組成物を含む製剤を、対象の皮膚の全てまたは一部に直接または別の方法で接触させることによる、対象への組成物の送達を指す。用語は、局所的及び経皮的な経路を含むが、これらに限定されないいくつかの投与経路を包含する。局所投与は、対象の表皮もしくは真皮に、またはその特定の層に組成物を送達するための手段として使用される。
本明細書で使用される場合、「有効量」は、少なくとも、特定の障害に関する１つ以上の症状の測定可能な改善または予防をもたらすのに必要な最小量である。有効量はまた、処置のあらゆる毒性または有害作用を、治療的に有益な効果が上回る量である。予防的使用について、有益なまたは所望の結果としては、リスクを排除もしくは低減させること、重症度を低下させること、または疾患の発症、疾患の発症中に現れるその合併症及び中間病理学的表現型を遅延させることなどの結果が挙げられる。治療的使用について、有益なまたは所望の結果としては、疾患に起因する１つ以上の症状を減少させること、疾患に罹患している患者の生活の質を向上させること、疾患の進行を遅延させること、及び／または生存を長期化することなどの臨床結果が挙げられる。有効量は、１回以上の投与において投与され得る。
医薬組成物
ポリヌクレオチド
一態様では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖（Ｃｏｌ７）ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７（ＫＲＴ１７）ポリペプチド、及び／またはそれらのキメラポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、キメラポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物はベクターを含み、ベクターは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む１つ以上の導入遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、医薬組成物はベクターを含み、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、及び／またはそれらのキメラポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、キメラポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子、及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は合成ＲＮＡを含み、合成ＲＮＡは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む１つ以上の導入遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、医薬組成物は合成ＲＮＡを含み、合成ＲＮＡは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、及び／またはそれらのキメラポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、キメラポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子、及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。
コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一例は、配列番号：１である。本開示のポリヌクレオチドはまた、配列番号：１の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドも含む。
いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドのＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドである。コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドのＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、または少なくとも３５０、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２５００、少なくとも５０００、少なくとも７５００であるが、８８３５未満の連続ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドのホモログであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。対象となるポリペプチドのホモログであるポリペプチドを同定する方法は、当業者には周知である。
いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列のＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドである。Ｎ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片は、配列番号：２の少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、または少なくとも２５００であるが、２９４４未満の連続アミノ酸を含んでよい。
いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが対象の１つ以上の標的細胞中に送達される場合に、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチドの機能を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチドの活性を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドの発現は、対象の係留線維形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドの発現は、対象の上皮基底膜組織化及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドの発現は、対象の表皮真皮境界部の一体性を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。
リジルヒドロキシラーゼ３
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一例は、配列番号：３である。本開示のポリヌクレオチドはまた、配列番号：３の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドも含む。
いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドのＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドである。リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドのＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：３の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、または少なくとも２０００であるが、２２１７未満の連続ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：４の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドのホモログであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。対象となるポリペプチドのホモログであるポリペプチドを同定する方法は、当業者には周知である。
いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：４のアミノ酸配列のＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドである。Ｎ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片は、配列番号：４の少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、または少なくとも７００であるが、７３８未満の連続アミノ酸を含んでよい。
いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが対象の１つ以上の標的細胞中に送達される場合に、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの機能を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの活性を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの発現は、対象の１つ以上のコラーゲンポリペプチド上においてヒドロキシリジン残基の形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの発現は、対象の係留線維形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの発現は、対象の上皮基底膜組織化及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの発現は、対象の表皮真皮境界部の一体性を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。
いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、対象の同じ細胞に送達される。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１鎖（ＶＩＩ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが対象の同じ細胞中に送達される場合、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、等モル比でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを発現する。
ケラチンＩ型細胞骨格１７
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一例は、配列番号：２９である。本開示のポリヌクレオチドはまた、配列番号：２９の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドも含む。
いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドである。コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドのＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２９の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、または少なくとも３５０、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１２５０であるが、１２９９未満の連続ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：３０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：３０の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのホモログであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。対象となるポリペプチドのホモログであるポリペプチドを同定する方法は、当業者には周知である。
いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：３０のアミノ酸配列のＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドである。Ｎ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片は、配列番号：３０の少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４２５であるが、４３２未満の連続アミノ酸を含んでよい。
いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが対象の１つ以上の標的細胞中に送達される場合に、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドの機能を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドの活性を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドの発現は、対象における創傷治癒を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。
リンカーを含むキメラポリペプチド
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、切断可能なリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。切断可能なリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例としては、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｔ２Ａリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｐ２Ａリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｅ２Ａリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｆ２Ａリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドをコードする。リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例は、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、及び配列番号：１１である。本開示のポリヌクレオチドはまた、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドも含む。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドのＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドである。リンカーポリペプチドのＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または少なくとも６０であるが、６６未満の連続ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２のアミノ酸配列のＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドである。Ｎ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片は、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２の少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、または少なくとも２０であるが、２２未満の連続アミノ酸を含んでよい。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つ以上のフューリン切断部位をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位をコードするポリヌクレオチドは、古典的フューリン切断部位の配列（Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ）と同じまたは実質的に類似しているアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、リンカーポリペプチドの上流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、リンカーポリペプチドの下流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｔ２Ａリンカーポリペプチドの上流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｔ２Ａリンカーポリペプチドの下流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｐ２Ａリンカーポリペプチドの上流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｐ２Ａリンカーポリペプチドの下流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｅ２Ａリンカーポリペプチドの上流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｅ２Ａリンカーポリペプチドの下流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｆ２Ａリンカーポリペプチドの上流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｆ２Ａリンカーポリペプチドの下流でコードされる。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リンカーポリペプチド、及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、５’から３’に、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、５’から３’に、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リンカーポリペプチド、及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例は、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、及び配列番号：２７である。本開示のポリヌクレオチドはまた、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドも含む。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、キメラポリペプチドのＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドである。キメラポリペプチドのＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、または少なくとも１００００であるが、１１１２１未満の連続ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リンカーポリペプチド、及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６または配列番号：２８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リンカーポリペプチド、及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６または配列番号：２８の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リンカーポリペプチド、及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６または配列番号：２８のアミノ酸配列のＮ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片をコードするポリヌクレオチドである。Ｎ末端切断型、Ｃ末端切断型、または断片は、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６または配列番号：２８の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００、少なくとも１７５０、少なくとも２０００、少なくとも２２５０、少なくとも２５００、少なくとも２７５０、少なくとも３０００、少なくとも３２５０、または少なくとも３５００であるが、３７０６未満の連続アミノ酸を含んでよい。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが対象の１つ以上の標的細胞中に送達される場合に、キメラポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、１つ以上の標的細胞中で発現された後に切断される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、１つ以上の標的細胞中で発現される場合に、リンカーポリペプチド内で切断される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは２つのポリペプチドに切断され、１つはコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを含み、他方はリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの機能を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの発現は、１つ以上の標的細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドの活性を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの発現は、対象の１つ以上のコラーゲンポリペプチド上においてヒドロキシリジン残基の形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの発現は、対象の係留線維形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの発現は、対象の上皮基底膜組織化及び／または上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの発現は、対象の表皮真皮境界部の一体性を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。
本開示のポリヌクレオチドは、コドン最適化されてよい。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒト細胞のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、マウス細胞のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ラット細胞のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ハムスター細胞のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、イヌ細胞のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、酵母細胞のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、細菌細胞のためにコドン最適化される。本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチド、ＲＮＡポリヌクレオチド、または１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチド及び１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドの組合せであってよい。
ベクター
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される１種以上のポリヌクレオチドを含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。いくつかの実施形態では、ベクターはＤＮＡベクターである。一般に、対象中で１種以上のポリペプチドを産生するためにポリヌクレオチドを維持、増殖、または発現させるのに好適なベクターが、使用されてよい。好適なベクターの例としては、プラスミド、コスミド、エピソーム、トランスポゾン、及びウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、麻疹、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターなど）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞中で自律複製できる。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞中で自律複製できない。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主ＤＮＡ中に組み込むことができる。対象となる１種以上のポリヌクレオチドを含有するベクターを作製する方法は、当業者には周知である。
いくつかの実施形態では、ベクターは、単純ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスベクターは、ヘルペスウイルスアンプリコンベクターである。構造的特徴及びベクターを作製する方法を含む、ヘルペスウイルスアンプリコンベクターが、一般に当該技術分野において既知である（ｄｅ Ｓｉｌｖａ Ｓ．ａｎｄ Ｂｏｗｅｒｓ Ｗ．“Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”．Ｖｉｒｕｓｅｓ ２００９，１，５９４−６２９）。いくつかの実施形態では、ベクターはＨＳＶ−１アンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンである。ＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンの例としては、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドアンプリコン、ＨＳＶ／ＥＢＶハイブリッドアンプリコン、ＨＳＶ／ＥＢＶ／ＲＶハイブリッドアンプリコン、及びＨＳＶ／Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙハイブリッドアンプリコンを挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ／ＥＢＶハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ／ＥＢＶ／ＲＶハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ／Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙハイブリッドアンプリコンである。
いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスベクターは、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上の有毒な単純ヘルペスウイルス遺伝子の発現を減少させる、または排除するように操作されている。組換え単純ヘルペスウイルスゲノムを操作する方法は、一般にＷＯ２０１５／００９９５２に記載されている。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、不活性化変異を含む。不活性化変異の例としては、欠失、挿入、点変異、及び再構成を挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１及びＵＬ５５単純ヘルペスウイルス遺伝子のうち少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または８つ全てに不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−２ゲノムである。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ４（１つもしくは両方のコピー）、ＩＣＰ２７、及び／またはＵＬ５５遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ４（１つもしくは両方のコピー）、ＩＣＰ２７、及び／またはＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域における欠失である（例えば、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７コード配列がインタクトであるが、転写的に活性ではない）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子のコード配列における欠失ならびにＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域における欠失を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１遺伝子中に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−２ゲノムである。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０及びＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）、及びＩＣＰ２２遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４（１つもしくは両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７及び／またはＵＬ５５遺伝子中の不活性化変異は、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４（１つもしくは両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７及び／またはＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子のコード配列における欠失を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子中に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１遺伝子中に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子及びＵＬ４１遺伝子中に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−２ゲノムである。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４（１つまたは両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−２ゲノムである。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれを超えるウイルス遺伝子座内に本開示の１種以上のポリヌクレオチドを含む。好適なウイルス遺伝子座の例としては、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１及びＵＬ５５単純ヘルペスウイルス遺伝子座を挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４遺伝子座のうち１つ以上の中に本開示の１種以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＬＨ３をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチド及び他方のＩＣＰ４遺伝子座にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチド及び他方のＩＣＰ４遺伝子座にＬＨ３をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方にＬＨ３をコードするポリヌクレオチド及び他方のＩＣＰ４遺伝子座にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルスなど）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＵＬ４１遺伝子座内に本開示の１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４７遺伝子座内に本開示の１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４遺伝子座のうち１つ以上の中に本開示の１種以上のポリヌクレオチド、及びウイルスＵＬ４１遺伝子座内に本開示の１種以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＬＨ３をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＬＨ３をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＬＨ３をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＬＨ３をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＬＨ３をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＬＨ３をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルスなど）。
ベクターは、宿主細胞中におけるポリヌクレオチドの発現に好適な形態で、本開示のポリヌクレオチドを含んでよい。発現ベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに機能的に連結される１つ以上の調節配列を含んでよい。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。好適なエンハンサーの例としては、哺乳動物遺伝子からのエンハンサー配列（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、インスリンなど）、及び真核細胞ウイルスからのエンハンサー配列（複製起点の後期側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側におけるポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなど）を挙げてよいが、これらに限定されない。哺乳動物宿主細胞中での転写に好適なプロモーターの例としては、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など）のゲノムから得られるプロモーター、または異種哺乳動物プロモーター（アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターからなど）からのものを挙げてよいが、これらに限定されず、このようなプロモーターが宿主細胞と適合することを条件とする。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、１つ以上の異種プロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上の異種プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期プロモーター、伸長因子−１（ＥＦ１）プロモーター、及び／または任意のそれらの組合せのうち１つ以上である。いくつかの実施形態では、１つ以上の異種プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時間的プロモーター、空間的プロモーター、誘導性プロモーター及び抑制性プロモーターのうち１つ以上である。調節配列としては、ヌクレオチド配列、加えて組織特異的調節配列及び／または誘導性配列の構成的発現を指示するものを挙げてよい。発現ベクターの設計は、本開示のポリヌクレオチドと接触させる宿主細胞、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得る。本開示の発現ベクターは、宿主細胞中に導入されることにより、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはポリペプチド（例えば、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、キメラポリペプチドなど）を産生し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、本明細書に記載される１種以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上の導入遺伝子を含む。１つ以上の導入遺伝子は、ベクター中において任意の配向で挿入されてよい。ベクターが２つ以上の導入遺伝子（例えば、２つ以上、３つ以上など）を含む場合、導入遺伝子は、お互いに同じ配向または逆配向で挿入されてよい。理論に束縛されることを望むものではないが、アンチセンス配向でベクター中に２つの導入遺伝子を導入すると、リードスルーを回避し、各導入遺伝子の適切な発現の確保を助ける場合がある。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、及び／またはそれらのキメラポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする単一の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、各々がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする２つの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、各々がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする３つの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする単一の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、各々がリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする２つの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、各々がリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする３つの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする単一の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、各々がケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする２つの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、各々がケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする３つの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする単一の導入遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの導入遺伝子（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれを超える導入遺伝子）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも第１導入遺伝子がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、少なくとも第２導入遺伝子がリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも第１導入遺伝子がリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードし、少なくとも第２導入遺伝子がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも第１導入遺伝子がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、少なくとも第２導入遺伝子がケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも第１導入遺伝子がケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードし、少なくとも第２導入遺伝子がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも第１導入遺伝子がリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードし、少なくとも第２導入遺伝子がケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも第１導入遺伝子がケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードし、少なくとも第２導入遺伝子がリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも第１導入遺伝子がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、少なくとも第２導入遺伝子が、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも第１導入遺伝子がリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードし、少なくとも第２導入遺伝子が、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも第１導入遺伝子がケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードし、少なくとも第２導入遺伝子が、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも３つの導入遺伝子（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれを超える導入遺伝子）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも第１導入遺伝子がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードし、少なくとも第２導入遺伝子がリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードし、少なくとも第３導入遺伝子がケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリシストロン性である導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、ならびに第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、ならびに第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを、ならびに第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１及び第２ＯＲＦは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。
いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性導入遺伝子は、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３ＯＲＦは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。
好適なＩＲＥＳの例としては、ウイルス由来のＩＲＥＳ（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、古典的な豚コレラウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどに由来するＩＲＥＳ）ならびに細胞ｍＲＮＡ由来のＩＲＥＳ（例えば、増殖因子ｍＲＮＡ、例えば、線維芽細胞増殖因子２、血小板由来増殖因子Ｂ、及び血管内皮増殖因子などに由来するＩＲＥＳ、転写因子ｍＲＮＡ、例えば、アンテナペディア、ウルトラパイソラックスム（ｕｌｔｒａｐｉｔｈｏｒａｘｍ）、及びＮＦ−κＢ抑制因子などに由来するＩＲＥＳ、癌遺伝子ｍＲＮＡ、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｐｉｍ−１、及びプロテインキナーゼｐ５８ＰＩＴＳＬＲＥなどに由来するＩＲＥＳなど）を挙げてよいが、これらに限定されない。
本開示のベクターは、追加のコード配列及び非コード配列をさらにコードしてよい。追加のコード配列及び非コード配列の例としては、追加のポリペプチドタグ、イントロン、５’及び３’ＵＴＲなどをコードする配列を挙げてよいが、これらに限定されない。好適なポリペプチドタグの例としては、精製タグ、例えば、ｈｉｓタグ、ｆｌａｇタグ、マルトース結合タンパク質及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグなど、検出タグ、例えば、測光的に検出される場合があるタグ（例えば、赤色蛍光タンパク質など）及び検出可能な酵素活性を有するタグ（例えば、アルカリホスファターゼなど）など、分泌配列、リーダー配列、及び／または安定化配列、プロテアーゼ切断部位（例えば、フューリン切断部位、ＴＥＶ切断部位、トロンビン切断部位）を含有するタグなどの任意の組合せを挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、ポリヌクレオチドの安定性、局在化、及び／または翻訳効率を増加させる。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、１種以上のポリヌクレオチドの安定性、局在化、及び／または翻訳効率を増加させるように改変される。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、タンパク質発現のレベル及び／または持続時間を改善する。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、オフターゲット導入遺伝子発現をブロックする、または低減させる場合がある（例えば、特定の細胞型（例えば、ニューロン細胞）において、細胞周期の特定の時間で、特定の発達段階などで発現を阻害する）エレメント（例えば、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位など）を含む。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、特定の細胞型で導入遺伝子発現を増強する場合があるエレメント（例えば、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位など）を含む。
合成ＲＮＡポリヌクレオチド
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される１種以上のポリヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡ、特に合成ｍＲＮＡに関する。いくつかの実施形態では、合成ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、５’キャップ構造を含む。５’キャップ構造の例としては、ｃａｐ−０、ｃａｐ−１、ｃａｐ−２、及びｃａｐ−３構造、ならびにそれらの誘導体を挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、合成ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、３’ポリ（Ａ）尾部を含む。いくつかの実施形態では、合成ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、合成ｍＲＮＡポリヌクレオチド内に含有される１つ以上のコード配列に隣接する１つ以上の５’及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、合成ｍＲＮＡポリヌクレオチドの安定性、局在化、及び／または翻訳効率を増加させる。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、合成ｍＲＮＡポリヌクレオチドの安定性、局在化、及び／または翻訳効率を増加させるように改変される。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、タンパク質発現のレベル及び／または持続時間を改善する。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、タンパク質発現のレベル及び／または持続時間を改善するように改変される。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、オフターゲット発現を制限する場合がある（例えば、特定の細胞型（例えば、ニューロン細胞）において、細胞周期の特定の時間で、特定の発達段階などで発現を阻害する）エレメント（例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位など）を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、Ｋｏｚａｋ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列と同じまたは実質的に類似している。対象となる１種以上のポリヌクレオチドを含有する合成ｍＲＮＡポリヌクレオチドを作製する方法は、当業者には周知である。
いくつかの態様では、本開示の合成ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、１種以上の改変リボヌクレオチドを含む。改変リボヌクレオチドの例としては、２−チオウリジン、５−アザウリジン、プソイドウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、５−アミノウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メチル−５−アザウリジン、５−アミノ−５−アザウリジン、５−ヒドロキシ−５−アザウリジン、５−メチルプソイドウリジン、５−アミノプソイドウリジン、５−ヒドロキシプソイドウリジン、４−チオ−５−アザウリジン、４−チオプソイドウリジン、４−チオ−５−メチルウリジン、４−チオ−５−アミノウリジン、４−チオ−５−ヒドロキシウリジン、４−チオ−５−メチル−５−アザウリジン、４−チオ−５−アミノ−５−アザウリジン、４−チオ−５−ヒドロキシ−５−アザウリジン、４−チオ−５−メチルプソイドウリジン、４−チオ−５−アミノプソイドウリジン、４−チオ−５−ヒドロキシプソイドウリジン、２−チオシチジン、５−アザシチジン、プソイドイソシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、Ｎ４−アミノシチジン、Ｎ４−ヒドロキシシチジン、５−メチルシチジン、５−アミノシチジン、５−ヒドロキシシチジン、５−メチル−５−アザシチジン、５−アミノ−５−アザシチジン、５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、５−メチルプソイドイソシチジン、５−アミノプソイドイソシチジン、５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４−メチル−５−アザシチジン、Ｎ４−メチルプソイドイソシチジン、２−チオ−５−アザシチジン、２−チオプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチルシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシシチジン、２−チオ−５−メチルシチジン、２−チオ−５−アミノシチジン、２−チオ−５−ヒドロキシシチジン、２−チオ−５−メチル−５−アザシチジン、２−チオ−５−アミノ−５−アザシチジン、２−チオ−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、２−チオ−５−メチルプソイドイソシチジン、２−チオ−５−アミノプソイドイソシチジン、２−チオ−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４−メチル−５−メチルシチジン、Ｎ４−メチル−５−アミノシチジン、Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシシチジン、Ｎ４−メチル−５−メチル−５−アザシチジン、Ｎ４−メチル−５−アミノ−５−アザシチジン、Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、Ｎ４−メチル−５−メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４−メチル−５−アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４−アミノ−５−アザシチジン、Ｎ４−アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４−アミノ−５−メチルシチジン、Ｎ４−アミノ−５−アミノシチジン、Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシシチジン、Ｎ４−アミノ−５−メチル−５−アザシチジン、Ｎ４−アミノ−５−アミノ−５−アザシチジン、Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、Ｎ４−アミノ−５−メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４−アミノ−５−アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−アザシチジン、Ｎ４−ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチルシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチル−５−アザシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノ−５−アザシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−メチルシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−アミノシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−メチル−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−アミノ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−メチルプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−アミノプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−メチルシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−アミノシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−メチル−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−アミノ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−メチルプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−アミノプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチルシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチル−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチルプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−アミノアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシアデノシン、７−デアザアデノシン、８−アザアデノシン、Ｎ６−メチル−７−デアザアデノシン、Ｎ６−メチル−８−アザアデノシン、７−デアザ−８−アザアデノシン、Ｎ６−メチル−７−デアザ−８−アザアデノシン、Ｎ６−アミノ−７−デアザアデノシン、Ｎ６−アミノ−８−アザアデノシン、Ｎ６−アミノ−７−デアザ−８−アザアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシ−７−デアザアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシ−８−アザアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシ−７−デアザ−８−アザアデノシン、６−チオグアノシン、７−デアザグアノシン、８−アザグアノシン、６−チオ−７−デアザグアノシン、６−チオ−８−アザグアノシン、７−デアザ−８−アザグアノシン、及び６−チオ−７−デアザ−８−アザグアノシンを挙げてよいが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、２つの別個の合成ｍＲＮＡポリヌクレオチド内に含有される。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、２つの別個の合成ｍＲＮＡポリヌクレオチド内に含有される。いくつかの実施形態では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、２つの別個の合成ｍＲＮＡポリヌクレオチド内に含有される。いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、３つの別個の合成ｍＲＮＡポリヌクレオチド内に含有される。
いくつかの実施形態では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡポリヌクレオチド内に含有される単一の連続ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格ポリペプチドを、及び第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、ならびに第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、ならびに第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを、ならびに第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、２つのＯＲＦは、ＩＲＥＳによって分離されている。
いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、単一の連続ポリヌクレオチドは、単一の合成ｍＲＮＡ中において、第１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを、第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを、及び第３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３ＯＲＦは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。
好適なＩＲＥＳの例としては、ウイルス由来のＩＲＥＳ（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、古典的な豚コレラウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどに由来するＩＲＥＳ）ならびに細胞ｍＲＮＡ由来のＩＲＥＳ（例えば、増殖因子ｍＲＮＡ、例えば、線維芽細胞増殖因子２、血小板由来増殖因子Ｂ、及び血管内皮増殖因子などに由来するＩＲＥＳ、転写因子ｍＲＮＡ、例えば、アンテナペディア、ウルトラパイソラックスム（ｕｌｔｒａｐｉｔｈｏｒａｘｍ）、及びＮＦ−κＢ抑制因子などに由来するＩＲＥＳ、癌遺伝子ｍＲＮＡ、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｐｉｍ−１、及びプロテインキナーゼｐ５８ＰＩＴＳＬＲＥなどに由来するＩＲＥＳなど）を挙げてよいが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含むキメラポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドは、合成ｍＲＮＡポリヌクレオチド内における単一のＯＲＦ上でコードされる。
本開示の合成ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、追加のコード配列をさらにコードしてよい。追加のコード配列の例としては、追加のポリペプチドタグをコードする配列を挙げてよいが、これに限定されない。好適なポリペプチドタグの例としては、精製タグ、例えば、ｈｉｓタグ、ｆｌａｇタグ、マルトース結合タンパク質及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグなど、検出タグ、例えば、測光的に検出される場合があるタグ（例えば、赤色蛍光タンパク質など）及び検出可能な酵素活性を有するタグ（例えば、アルカリホスファターゼなど）など、分泌配列、リーダー配列、及び／または安定化配列、プロテアーゼ切断部位（フューリン切断部位など）を含有するタグなどの任意の組合せを挙げてよいが、これらに限定されない。
送達ビヒクル
本開示の特定の態様は、本明細書に記載される１種以上のポリヌクレオチドを含む送達ビヒクルを含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、１つ以上の標的細胞中に１種以上のポリヌクレオチドを送達するのに好適である。
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルはウイルスである。ウイルス送達ビヒクルの例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意のそれらのハイブリッドウイルスを挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスは複製欠損性である。いくつかの実施形態では、ウイルスは複製可能である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、非改変野生型ウイルスの組織向性と比較して、その組織向性を変化させるように改変されている。１種以上のポリヌクレオチドを含むウイルスを作製する方法は、当業者には周知である。
いくつかの実施形態では、ウイルス送達ビヒクルは、単純ヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス送達ビヒクルは、例えば、ＷＯ２０１５／００９９５２に開示されるプロセスによって作製されてよい。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、改変エンベロープを含む。いくつかの実施形態では、改変エンベロープは、１種以上の（例えば、１種、２種、３種、４種またはそれを超える）変異体単純ヘルペスウイルス糖タンパク質を含む。単純ヘルペスウイルス糖タンパク質の例としては、糖タンパク質ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、及びｇＬを挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、改変エンベロープは、野生型単純ヘルペスウイルスと比較して単純ヘルペスウイルスの組織向性を変化させる。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペス１型ウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペス２型ウイルスである。
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、非ウイルス送達ビヒクルである。いくつかの実施形態では、非ウイルス送達ビヒクルは、化学系送達ビヒクル（化学系送達試薬）である。化学系送達ビヒクルの例としては、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム（カチオン性リポソーム、非カチオン性リポソーム、及び混合物）、エキソソーム、荷電脂質、ならびにカチオン性ポリマー（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミンなど）を挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、非ウイルス送達ビヒクルは、非化学的送達ビヒクルである。非化学的送達ビヒクルの例としては、エレクトロポレーション、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、及び粒子に基づくビヒクル（遺伝子銃、磁性補助トランスフェクション、インペールフェクション、粒子衝撃など）を挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、非ウイルス送達ビヒクルは、デンドリマー、リポソーム、エキソソーム、荷電脂質またはカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、非ウイルス送達ビヒクルはデンドリマーである。いくつかの実施形態では、非ウイルス送達ビヒクルはリポソームである。いくつかの実施形態では、非ウイルス送達ビヒクルはエキソソームである。いくつかの実施形態では、非ウイルス送達ビヒクルは荷電脂質である。いくつかの実施形態では、非ウイルス送達ビヒクルはカチオン性ポリマーである。非ウイルス送達ビヒクルとの複合体で、対象となる１種以上のポリヌクレオチドを作製する方法は、当業者には周知である。
薬学的に許容される担体
本開示の特定の態様は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、局所及び／または経皮投与／適用に十分な担体である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、皮下及び／または皮内投与／適用に十分な担体である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、最小侵襲的または非侵襲的である。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、この担体としては、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸など、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベンなど、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンなど、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなど、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及びその他の炭水化物、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡなど、糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなど、ポリオール、例えば、グリセロールなど（例えば、１０％グリセロールを含む製剤）、塩形成対イオン、例えば、ナトリウムなど、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、ならびに／または非イオン界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを挙げてよいが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体の徹底した考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で利用可能である。
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、局所または経皮適用／投与に好適である。局所または経皮適用／投与での使用に好適な担体の例としては、軟膏、ペースト、クリーム、懸濁液、エマルジョン、脂肪軟膏、ゲル、粉末、ローション、溶液、噴霧剤、パッチ、マイクロニードルアレイ、及び吸入剤を挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、軟膏、ペースト、クリーム、懸濁液、エマルジョン、脂肪軟膏、ゲル、粉末、ローション、溶液、噴霧剤、及び吸入剤のうち１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は軟膏を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体はペーストを含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体はクリームを含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は懸濁液を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体はエマルジョンを含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体はゲルを含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は粉末を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体はローションを含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は溶液を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は噴霧剤を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は吸入剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬担体は、パッチ（例えば、皮膚に接着するパッチ）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体はマイクロニードルアレイを含む。医薬組成物送達に好適なマイクロニードルアレイを作製する方法及び使用する方法は、一般に当該技術分野において既知である（Ｋｉｍ Ｙ．ｅｔ ａｌ．“Ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１２，６４（１４）：１５４７−６８）。
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、局所または経皮適用／投与に好適な、２種、３種、４種、５種またはそれを超える異なる薬学的に許容される担体の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、１種以上の追加成分をさらに含む。追加成分の例としては、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトース及びその他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、甘味料、香味料、芳香剤、着色剤、保湿剤、日焼け止め、抗菌剤、ポリヌクレオチドを安定させる、またはそれらの分解を防止することができる剤などを挙げてよいが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるような医薬組成物及び製剤は、本明細書に記載される１種以上のポリヌクレオチドを含む送達ビヒクルを、１種以上の薬学的に許容される担体と混合することによって調製されてよい。インビボ投与に使用される製剤は、一般に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜に通して濾過することにより、容易に達成されてよい。
処置方法
本開示は、部分的には、対象の皮膚における創傷、障害、または疾患の予防的、待期的、または治療的緩和を提供するための医薬組成物及び使用方法に関する。皮膚の疾患または障害の例としては、表皮水疱症、皮膚癌、乾癬、扁平苔癬、ループス、酒さ、湿疹、皮膚カンジダ症、蜂巣炎、膿痂疹、褥瘡性潰瘍、丹毒、尋常性魚鱗癬、皮膚筋炎、肢端皮膚炎、うっ血性皮膚炎、ネザートン症候群、単純型表皮水疱症（ＬＡＭＢ３遺伝子）、常染色体劣性先天性魚鱗癬、色素性乾皮症、及び類天疱瘡を挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、皮膚の疾患または障害は、表皮水疱症である。いくつかの実施形態では、対象は、表皮水疱症の１つ以上の症状を有する、またはそれを発症するリスクがある。
本明細書に記載されるポリヌクレオチド及び医薬組成物は、表皮水疱症（例えば、劣性栄養障害型表皮水疱症、優性栄養障害型表皮水疱症など）の１つ以上の症状に対する処置を含む、対象の皮膚における創傷、障害、または疾患の予防的、待期的、または治療的緩和を提供するのに有用である。本開示の医薬組成物は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって、例えば、経口投与、舌下投与、頬側投与、局所投与、直腸投与、吸入によって、経皮投与、皮下注射、皮内注射、静脈内（ＩＶ）注射、動脈内注射、筋肉内注射、心臓内注射、骨内注射、腹腔内注射、経粘膜投与、膣内投与、硝子体内投与、関節内投与、関節周囲投与、局部投与、皮膚上投与、または任意のそれらの組合せを含むが、これらに限定されない方法によって投与されてよい。医薬組成物は、様々な経路、例えば、皮下、皮内、局所、経皮、及び経粘膜投与を含むが、これらに限定されない経路によって個体に送達されてよい。したがって、本開示はまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは医薬組成物のいずれかを、個体（表皮水疱症を有する、またはそれを発症するリスクがある個体など）に送達する方法を包含する。
いくつかの実施形態では、対象の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足することができる、有効量の医薬組成物を投与することを含む、対象の皮膚における創傷、障害、または疾患の予防的、待期的、または治療的緩和が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮内に、及び／または皮下に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所的に、及び／または経皮的に投与される。いくつかの実施形態では、対象の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足することができる、有効量の医薬組成物を局所的に投与することを含む、対象の皮膚における創傷、障害、または疾患の予防的、待期的、または治療的緩和が提供される。医薬組成物は、本明細書に記載される任意の医薬組成物であってよい。いくつかの実施形態では、個体は、表皮水疱症に罹患している。いくつかの実施形態では、個体は、栄養障害型表皮水疱症に罹患している。いくつかの実施形態では、個体は、優性栄養障害型表皮水疱症に罹患している。いくつかの実施形態では、個体は、劣性栄養障害型表皮水疱症に罹患している。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１日当たり１回、２回、３回、４回、５回またはそれを超える回数で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の１箇所以上の患部に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の１箇所以上の非患部に投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、表皮水疱症の１つ以上の症状を処置または軽減するために使用されてよい。表皮水疱症（例えば、劣性栄養障害型表皮水疱症、優性栄養障害型表皮水疱症など）の症状としては、皮膚上の水疱（特に手、足、膝、及び肘上の水疱）、粘膜上の水疱、皮膚の瘢痕化、粘膜の瘢痕化、皮膚びらん、指の爪及び／または足の爪の変形、指の爪及び／または足の爪の喪失、内部水疱形成（声帯、食道、及び上気道上を含む）、皮膚の肥厚（特に、手掌及び足底上の皮膚の肥厚）、頭皮の水疱形成、頭皮の瘢痕化、脱毛（瘢痕性脱毛症）、薄く見える皮膚、萎縮性瘢痕化、稗粒腫、歯の状態（虫歯及び形成不全のエナメルなど）、関節変形、手指及び足指の融合、ならびに嚥下障害を挙げてよいが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、個体の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足することができる、有効量の医薬組成物を投与することを含む、表皮水疱症に罹患している個体を治療的に処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮内に、及び／または皮下に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所的に、及び／または経皮的に投与される。いくつかの実施形態では、個体の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足することができる、有効量の医薬組成物を局所的に投与することを含む、表皮水疱症に罹患している個体を治療的に処置する方法が提供される。医薬組成物は、本明細書に記載される任意の医薬組成物であってよい。いくつかの実施形態では、個体は、栄養障害型表皮水疱症に罹患している。いくつかの実施形態では、個体は、優性栄養障害型表皮水疱症に罹患している。いくつかの実施形態では、個体は、劣性栄養障害型表皮水疱症に罹患している。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１日当たり１回、２回、３回、４回、５回またはそれを超える回数で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の１箇所以上の患部に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の１箇所以上の非患部に投与される。
いくつかの実施形態では、個体の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足することができる、有効量の医薬組成物を投与することを含む、表皮水疱症に罹患している個体を予防的に処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮内に、及び／または皮下に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所的に、及び／または経皮的に投与される。いくつかの実施形態では、個体の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足することができる、有効量の医薬組成物を局所的に投与することを含む、表皮水疱症に罹患している個体を予防的に処置する方法が提供される。医薬組成物は、本明細書に記載される任意の医薬組成物であってよい。いくつかの実施形態では、個体は、栄養障害型表皮水疱症に罹患している。いくつかの実施形態では、個体は、優性栄養障害型表皮水疱症に罹患している。いくつかの実施形態では、個体は、劣性栄養障害型表皮水疱症に罹患している。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１日当たり１回、２回、３回、４回、５回またはそれを超える回数で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の１箇所以上の患部に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の１箇所以上の非患部に投与される。
いくつかの実施形態では、個体の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足することができる、有効量の医薬組成物を投与することを含む、表皮水疱症を発症するリスクがある個体を予防的に処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮内に、及び／または皮下に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所的に、及び／または経皮的に投与される。いくつかの実施形態では、個体の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足することができる、有効量の医薬組成物を局所的に投与することを含む、表皮水疱症を発症するリスクがある個体を予防的に処置する方法が提供される。医薬組成物は、本明細書に記載される任意の医薬組成物であってよい。いくつかの実施形態では、個体は、栄養障害型表皮水疱症を発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、個体は、優性栄養障害型表皮水疱症を発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、個体は、劣性栄養障害型表皮水疱症を発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１日当たり１回、２回、３回、４回、５回またはそれを超える回数で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の１箇所以上の患部に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の１箇所以上の非患部に投与される。
いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを個体に投与すると、個体の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドのレベルを増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを個体に投与すると、個体の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドの機能を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを個体に投与すると、個体の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１鎖ポリペプチド及び／またはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド及び／またはケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドの活性を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。
いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを個体に投与すると、個体の係留線維形成を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを個体に投与すると、個体の上皮基底膜組織化を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを個体に投与すると、個体の上皮基底接着を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを個体に投与すると、個体の表皮真皮境界部の一体性を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを個体に投与すると、個体の創傷治癒を増強する、増加させる、増大させる、かつ／または補足する。理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載される医薬組成物のうち１種以上を投与することによって、個体の１つ以上の細胞中でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドのレベルを増加させる、増大させる、かつ／または補足することは、個体における機能的なコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖タンパク質の産生及び分泌の増加を可能にすることになると考えられている。理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載される医薬組成物のうち１種以上を投与することによって、個体の１つ以上の細胞中でリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドのレベルを増加させる、増大させる、かつ／または補足することは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドの翻訳後修飾を増加させて、個体における機能的なコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖タンパク質の産生及び／または分泌を増強することになると考えられている。理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載される医薬組成物のうち１種以上を投与する（細胞を、ポリペプチドを発現する２つの別個のポリヌクレオチドと接触させることにより、細胞を、２つのポリペプチドを別個に発現する単一の連続ポリヌクレオチドと接触させることにより、または細胞を、キメラポリペプチドを発現する単一の連続ポリヌクレオチドと接触させることにより投与する）ことによって、個体の同じ細胞中でコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドのレベルを増加させる、増大させる、かつ／または補足することは、機能的なコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖タンパク質の産生及び分泌を増強することに対して相加効果を有することになるとさらに考えられている。理論に束縛されることを望むものではないが、機能的なコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖タンパク質の産生及び分泌の増加は、係留線維形成の改善を可能にし、個体の上皮基底膜の接着を組織化する、安定化させる、かつ支援するのを助けることになると考えられている。理論に束縛されることを望むものではないが、最終的にこのことは、表皮水疱症に罹患している患者の真皮−表皮安定性の増加をもたらし、既存の創傷を処置して、処置部における創傷の再形成を防止または遅延させることになると考えられている。
単離ポリヌクレオチド及びポリペプチド
本開示の特定の態様は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。本開示のその他の態様は、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。本開示のその他の態様は、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。
本開示のその他の態様は、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって分離されている、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リンカーポリペプチド、及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つ以上のフューリン切断部位をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、リンカーポリペプチドの上流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、リンカーポリペプチドの下流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｔ２Ａリンカーポリペプチドの上流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｔ２Ａリンカーポリペプチドの下流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｐ２Ａリンカーポリペプチドの上流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｐ２Ａリンカーポリペプチドの下流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｅ２Ａリンカーポリペプチドの上流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｅ２Ａリンカーポリペプチドの下流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｆ２Ａリンカーポリペプチドの上流でコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、Ｆ２Ａリンカーポリペプチドの下流でコードされる。
コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一例は、配列番号：１である。コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、配列番号：１の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドも含む。
リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一例は、配列番号：３である。リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、配列番号：３の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドも含む。
ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一例は、配列番号：２９である。ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、配列番号：２９の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドも含む。
リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例は、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、及び配列番号：１１である。リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドも含む。
コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リンカーポリペプチド、及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例は、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、及び配列番号：２７である。キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドも含む。
本開示のさらなる態様は、ベクター内に含有される、本明細書に記載される１種以上（例えば、１種以上、２種以上、３種以上など）の単離ポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または任意のそれらのハイブリッドウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、単純ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上など）の導入遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスベクターは、ヘルペスウイルスアンプリコンベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはＨＳＶ−１アンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンである。ＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンの例としては、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドアンプリコン、ＨＳＶ／ＥＢＶハイブリッドアンプリコン、ＨＳＶ／ＥＢＶ／ＲＶハイブリッドアンプリコン、及びＨＳＶ／Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙハイブリッドアンプリコンを挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ／ＥＢＶハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ／ＥＢＶ／ＲＶハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ／Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙハイブリッドアンプリコンである。本開示のさらなる態様は、本明細書に記載される１種以上のポリヌクレオチドを含有するウイルス送達ビヒクルを作製する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、宿主細胞を、本明細書に記載される１種以上の単離ポリヌクレオチドを含有する１種以上のウイルスベクターと接触させること、及び宿主細胞によって生成されたウイルス送達ビヒクルを収集することを含む。細胞を培養する方法及び対象となる１種以上のウイルスベクターと細胞を接触させる方法（例えば、形質導入またはトランスフェクションによる）は、当業者には周知である。
いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスベクターは、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上の有毒な単純ヘルペスウイルス遺伝子の発現を減少させる、または排除するように操作されている。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、不活性化変異を含む。不活性化変異の例としては、欠失（例えば、遺伝子のコード配列の欠失または遺伝子の転写調節エレメントのうち１つ以上の欠失）、挿入、点変異、及び再構成を挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上の前初期遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１及びＵＬ５５単純ヘルペスウイルス遺伝子のうち少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または８つ全てに不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子中にある不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４遺伝子中にある不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２２遺伝子中にある不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２７遺伝子中にある不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中にある不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びＵＬ５５遺伝子中に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子中にある不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノム、組換えＨＳＶ−２ゲノム、または任意のそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−２ゲノムである。
いくつかの実施形態では、単離組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれを超えるウイルス遺伝子座内に本開示の１種以上（例えば、１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上など）のポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）を含む。好適なウイルス遺伝子座の例としては、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１及びＵＬ５５単純ヘルペスウイルス遺伝子座を挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、単離組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４遺伝子座のうち１つ以上の中に本開示の１種以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＬＨ３をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチド及び他方のＩＣＰ４遺伝子座にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチド及び他方のＩＣＰ４遺伝子座にＬＨ３をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方にＬＨ３をコードするポリヌクレオチド及び他方のＩＣＰ４遺伝子座にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルスなど）。いくつかの実施形態では、単離組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＵＬ４１遺伝子座内に本開示の１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４７遺伝子座内に本開示の１種以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４遺伝子座のうち１つ以上の中に本開示の１種以上のポリヌクレオチド、及びウイルスＵＬ４１遺伝子座内に本開示の１種以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＬＨ３をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＬＨ３をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＬＨ３をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＬＨ３をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＬＨ３をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＬＨ３をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルス、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座にＫＲＴ１７をコードするポリヌクレオチドを持つ組換えウイルスなど）。
いくつかの態様では、本明細書に記載される単離ポリヌクレオチドは、合成ｍＲＮＡ内に含有される。いくつかの実施形態では、合成ｍＲＮＡは、１種以上の改変リボヌクレオチドを含む。
本開示の特定の態様は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを含む単離ポリペプチドに関する。本開示のその他の態様は、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含む単離ポリペプチドに関する。本開示のその他の態様は、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含む単離ポリペプチドに関する。
本開示のその他の態様は、リンカーポリペプチドによって分離されている、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含む単離キメラポリペプチドに関する。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、１つ以上のフューリン切断部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、フューリン切断部位のアミノ酸配列は、古典的フューリン切断部位の配列（Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ）と同じまたは実質的に類似している。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、リンカーポリペプチドのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、１つ以上のフューリン切断部位は、リンカーポリペプチドのＣ末端にある。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までに、１つ以上のフューリン切断部位及びＴ２Ａリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までに、Ｔ２Ａリンカーポリペプチド及び１つ以上のフューリン切断部位を含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までに、１つ以上のフューリン切断部位及びＰ２Ａリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までに、Ｐ２Ａリンカーポリペプチド及び１つ以上のフューリン切断部位を含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までに、１つ以上のフューリン切断部位及びＥ２Ａリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までに、Ｅ２Ａリンカーポリペプチド及び１つ以上のフューリン切断部位を含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までに、１つ以上のフューリン切断部位及びＦ２Ａリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までに、Ｆ２Ａリンカーポリペプチド及び１つ以上のフューリン切断部位を含む。
いくつかの態様では、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを含む単離ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を含む。単離ポリペプチドはまた、配列番号：２の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドも含んでよい。
いくつかの態様では、リジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含む単離ポリペプチドは、配列番号：４のアミノ酸配列を含む。単離ポリペプチドはまた、配列番号：４の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドも含んでよい。
いくつかの態様では、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドを含む単離ポリペプチドは、配列番号：３０のアミノ酸配列を含む。単離ポリペプチドはまた、配列番号：３０の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチドも含んでよい。
いくつかの態様では、キメラポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を含有するコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを含む。キメラポリペプチドはまた、配列番号：２の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドも含んでよい。
いくつかの態様では、キメラポリペプチドは、配列番号：４のアミノ酸配列を含有するリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含む。キメラポリペプチドはまた、配列番号：４の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドも含んでよい。
いくつかの態様では、キメラポリペプチドは、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２のアミノ酸配列を含有するリンカーポリペプチドを含む。キメラポリペプチドはまた、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するリンカーポリペプチドも含んでよい。
いくつかの態様では、キメラポリペプチドは、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６または配列番号：２８のアミノ酸配列である。キメラポリペプチドはまた、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６または配列番号：２８の配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
宿主細胞
本開示の特定の態様は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを含む１種以上の宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載される単離組換え単純ヘルペスウイルスベクターのいずれかである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞など）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真菌細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞など）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓ２細胞など）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞株からの細胞である。好適な宿主細胞または細胞株の例としては、２９３、ＨｅＬａ、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＣＡＣＯ−２、Ａ５４９、Ｌ９２９、３Ｔ３、Ｋ５６２、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、ＨＵＶＥＣ、Ｖｅｒｏ、Ｎ２０、ＣＯＳ−７、ＰＳＮ１、ＶＣａＰ、ＣＨＯ細胞などを挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または任意のそれらのハイブリッドウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、単純ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、宿主細胞はヘルパーウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスを含む宿主細胞を、本明細書に記載されるベクターと接触させる。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスを含む宿主細胞を、本明細書に記載されるＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンと接触させることにより、本明細書に記載される１種以上のベクターを含むウイルスの作製がもたらされる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、接触させた宿主細胞の上清から収集される。ヘルパーウイルスを含む宿主細胞を、ＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１／ハイブリッドアンプリコンと接触させることによってウイルスを生成する方法は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は補完宿主細胞である。いくつかの実施形態では、補完宿主細胞は、本明細書に記載されるウイルスベクターのいずれにおいても不活性化されている１つ以上の遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、補完宿主細胞を、本明細書に記載される組換え単純ヘルペスウイルスゲノムと接触させる。いくつかの実施形態では、補完宿主細胞を、本明細書に記載される組換え単純ヘルペスウイルスゲノムと接触させることにより、本明細書に記載される１種以上のベクターを含むウイルスの作製がもたらされる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、接触させた宿主細胞の上清から収集される。補完宿主細胞を、組換え単純ヘルペスウイルスと接触させることによってウイルスを生成する方法は、一般にＷＯ２０１５／００９９５２に記載されている。
製品またはキット
本開示の特定の態様は、本明細書に記載される医薬組成物を含む製品またはキットに関する。いくつかの実施形態では、製品またはキットは、対象の皮膚における創傷、障害、または疾患の予防的、待期的、または治療的緩和を提供する医薬組成物を投与するための説明書を含む添付文書を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１種以上のポリヌクレオチドを含む送達ビヒクル及び薬学的に許容される担体は、同じ容器または別個の容器内にある。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及びシリンジが挙げられる。容器は、様々な材料、例えば、ガラス、プラスチック（ポリ塩化ビニルもしくはポリオレフィンなど）、または合金（ステンレス鋼もしくはハステロイなど）などから形成されてよい。いくつかの実施形態では、容器は、容器上に、または容器と関連するラベルを含み、ラベルは使用のための指示を示す。製品またはキットは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルターなどを含む、商業的及び使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含んでよい。
本明細書は、当業者が本発明を実施できるのに十分であると考えられる。本明細書に示される、かつ記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が前述の記載から当業者には明らかとなり、それは添付の特許請求の範囲内であることになる。
本開示は、以下の実施例の参照によってより完全に理解されることになる。しかしながら、その実施例が、本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例及び実施形態は例示目的のためだけにすぎず、それらを考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆されることになり、本出願の趣旨及び範囲内ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであると理解される。
実施例１：改変単純ヘルペスウイルスベクターの生成、及びベクターを含有するウイルスの作製／単離
標的哺乳動物細胞中で１つ以上の導入遺伝子を発現することができる改変単純ヘルペスウイルスゲノムベクターを作製するために、単純ヘルペスウイルスゲノム（図１Ａ）を、前初期遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、及びＩＣＰ２７を不活性化するように改変する一方で、前初期遺伝子ＩＣＰ２２を、異種誘導性プロモーターを含むように改変する。これにより、哺乳動物細胞中のゲノムの毒性が減少する。次に、カセットを、制限クローニングによって改変ヘルペスウイルスゲノム中に挿入する。カセットは、標的哺乳動物細胞中で導入遺伝子を発現することができる異種プロモーターを含有する。プロモーターを、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、加えて下流調節エレメント（図１Ｂ）をコードする核酸配列に機能的に連結し、ｍＲＮＡの適切な産生を確保する。あるいは、カセットは２つの導入遺伝子を含み、その各々が、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドまたはリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドのいずれかをコードする核酸に機能的に連結されたそれ自体の異種プロモーターを有する。導入遺伝子は、ＤＮＡの同じ鎖上で（図１Ｃ）、またはＤＮＡの逆向きの鎖上においてアンチセンス配向で（図１Ｄ）のいずれかでコードされる。各導入遺伝子と、それ自体のプロモーター及び調節エレメントとの連結によって、別個のｍＲＮＡ転写物上で各コード配列の独立した発現が可能になる。異なるプロモーターから導入遺伝子を発現させることは、コード配列を異なるプロモーター型に機能的に連結させる能力を可能にし、これにより、異なるレベルで、細胞周期の異なる時間で、異なる細胞型で、または異なるインデューサーもしくはリプレッサーの制御下において導入遺伝子の発現が亢進され得る。
改変ヘルペスウイルスゲノムを、内部リボソーム進入部位によって分離されたコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドをコードする単一ｍＲＮＡを発現するカセットを含むようにも構築する（図１Ｅ）。これにより、標的細胞中で発現される場合に、各ポリペプチドのおよそ等モル産生が可能になる。最後に、改変ヘルペスウイルスゲノムを、キメラポリペプチドを発現するカセットを含むように構築する。このキメラポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までに、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、切断可能なペプチドリンカー、及びリジルヒドロキシラーゼ３ポリペプチドを含む（図１Ｆ）。
追加の改変ヘルペスウイルスゲノムを、各々がコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドを発現する２つのカセットを含むように構築し、各カセットを、野生型単純ヘルペスウイルスゲノム（図２Ａ）のＩＣＰ４遺伝子座のコピー中に挿入する（図２Ｂ〜図２Ｇ）。これらの追加の組換えヘルペスウイルスゲノムを、様々な組合せのヘルペスウイルス遺伝子欠失／改変を用いて構築する。
両方のＩＣＰ４遺伝子コピーのコード配列の欠失、加えてＩＣＰ２７及びＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失を含有する組換えヘルペスウイルスゲノムを構築する。これらの組換えウイルスを、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子が正常な動態では発現されないように、ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域中に不活性化変異を含有するようにさらに改変する（図２Ｂ）。
コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドの発現カセットを、ヘルペスＩＣＰ４遺伝子の両方の遺伝子座に組み込むように、組換え単純ヘルペスウイルスをさらに構築する。これらの組換えウイルスとしては、ＩＣＰ２２遺伝子及び両方のＩＣＰ４遺伝子コピーのコード配列の欠失（図２Ｃ）、ＩＣＰ０遺伝子及び両方のＩＣＰ４遺伝子コピーのコード配列の欠失（図２Ｄ）、ＩＣＰ０及びＩＣＰ２２遺伝子、ならびに両方のＩＣＰ４遺伝子コピーのコード配列の欠失（図２Ｅ）、ＩＣＰ０、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子、ならびに両方のＩＣＰ４遺伝子コピーのコード配列の欠失（図２Ｆ）、ならびにＩＣＰ０、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子、ならびに両方のＩＣＰ４遺伝子コピーのコード配列の欠失（図２Ｇ）を含有するウイルスが挙げられる。図２Ｃ〜図２Ｇに示したベクターに基づいて、ＩＣＰ０及び／またはＵＬ４１遺伝子座中に１つ以上の追加のエフェクター（例えば、ＬＨ３、ＫＲＴ１７）をコードする１つ以上の導入遺伝子をさらに含む、追加のベクターを構築する。
これらの改変単純ヘルペスウイルスゲノムベクターを、ヘルペスウイルス遺伝子を発現するように改変した操作Ｖｅｒｏ細胞にトランスフェクトする。これらの操作Ｖｅｒｏ細胞は、ウイルス内にパッケージングされた改変ゲノムを有する複製欠損単純ヘルペスウイルスを上清中に分泌する。次いで、上清を収集して濃縮し、５μｍのフィルターに通して滅菌濾過する。
実施例２：複製欠損ＨＳＶ−１を用いたＣｏｌ７発現の回復
以下の実施例は、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子を発現するように改変した複製欠損単純ヘルペス１型ウイルスの構築、及びＲＤＥＢ患者から単離した細胞中で観察されるいくつかの欠損を回復させるための、このようなウイルスベクターの使用について記載している。
方法
細胞及び細胞培養物
正常及びＲＤＥＢヒト皮膚線維芽細胞及びケラチノサイトを、以前に記載されているように単離した（ＮＧ，Ｙ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２：３５２２−３５３４、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｈ．（１９７５）Ｃｅｌｌ ６：３３１−４２）。細胞を、標準的な技術に従って培養した。
ＫＢ１０３の構築
ＫＢ１０３ベクターを、Ｄ３ＧＦＰ、すなわち、ウイルスＩＣＰ４の代わりにＧＦＰを持つ複製欠損ＨＳＶ−１ベクター骨格から生成した。Ｄ３ＧＦＰ中のＧＦＰの配列を、トランスファープラスミドを使用して、ＣＯＬ７Ａ１をＩＣＰ４組換えプラスミドｐＳＡＳＢ３のＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることによって、ヒトＣＯＬ７Ａ１のコード配列と置き換えた。ＣＯＬ７Ａ１含有トランスファープラスミド及びＤ３ＧＦＰベクターの混合トランスフェクション／感染を、ＶｅｒｏＤ細胞に対して実施した。ＧＦＰを発現しなかった得られたプラークを単離し、Ｃｏｌ７タンパク質発現についてウェスタンブロットによって試験した。
ウイルス精製
ＫＢ１０３ウイルスを、標準的な技術に従って精製した（Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ，Ｒ．ａｎｄ Ｆｒａｅｆｅｌ，Ｃ．Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１４を参照のこと）。
ウイルス感染
細胞を、ウイルス感染の１日前に、およそ５０％コンフルエントの状態で６ウェルプレート中に２連または３連で播種した。細胞計数及びＭＯＩ決定のため、追加のウェルに並行して播種した。細胞播種から２４時間後、１つのウェルからの細胞をトリプシン処理し、計数してＭＯＩを算出し、ウイルスストックを解凍して、所望のＭＯＩを達成するために細胞培養培地中で希釈した。培養培地を、感染させる各ウェルから吸引し、５００μＬのＫＢ１０３含有培地（または対照培地）を各ウェルに添加した。プレートを、１５〜２０分ごとに断続的に振盪しながら、３７℃で５〜７．５％ＣＯ２を用いて１．５〜２時間インキュベートし、次いで、１．５〜２ｍＬの完全細胞培養培地を各ウェルに添加して、プレートを３７℃で２４〜７２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞及び上清を採取して分析のために処理した。
ｍＲＮＡ定量化
Ｃｏｌ７転写物を、製造業者のプロトコールに従ってＳＹＢＲ ＰＣＲアッセイ（Ｓｙｂｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、感染後に初代ＲＤＥＢケラチノサイトから単離したＲＮＡから増幅した。Ｃｏｌ７転写レベルを、β−アクチン転写レベルを基準として正規化した。
ウェスタンブロット分析
細胞溶解物を感染から４８時間後に細胞から生成し、ウェスタンブロットを、以下の抗体を使用して標準的な技術に従って実施した：ウサギ抗ヒトＣｏｌ７ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＨＰＡ０４２４２０）、マウス抗ヒトＧＡＰＤＨ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−３６５０６２）、ウサギ抗ＬＨ３抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈ、カタログ番号１１０２７−１−ＡＰ）、及びマウス抗ＴＳＰ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−５９８８７）。
免疫蛍光法
細胞を感染前にカバーガラス上に播種し、感染後４８時間固定して、一次ウサギ抗ヒトＣｏｌ７ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＨＰＡ０４２４２０）で染色し、洗浄してから、蛍光標識抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ３ Ａ１１０１２）でさらに染色した。細胞核を、標準的な技術を使用してＤＡＰＩで染色した。
細胞接着
９６ウェルプレートを、１００μＬの反応容量で１０、２０、または５０μｇ／ｍＬのラット尾部コラーゲン１（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｕｐｐｌｙ）またはヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて４℃で一晩コーティングし、次いで、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロックした。Ｍｏｃｋ（対照）感染またはＫＢ１０３感染ＲＤＥＢケラチノサイト（１００μＬのＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２＋０．１％ＢＳＡ中に２．４×１０４細胞）をプレートに添加し、３７℃で４０〜９０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄して非結合細胞を全て除去し、接着細胞をＰＦＥで２０分間固定した。次いで、固定細胞を７０％エタノールで処理し、クリスタルバイオレットで染色して１００％エタノール中に溶解し、６３０ｎｍで吸光度を測定することによって定量化した。
皮膚等価物（ＳＥ）器官型培養物
ＲＤＥＢ線維芽細胞及びケラチノサイトで構成した皮膚等価物器官型培養物を使用して、基底膜領域（ＢＭＺ）におけるＣｏｌ７の発現を評価した。簡潔に述べると、ＲＤＥＢ線維芽細胞（１ウェル当たり２×１０５細胞）を、６ウェルプレート中のフィブリンゲルマトリックス内に包埋し、ＤＭＥＭ＋アスコルビン酸及びアプロチニンを含有する１０％血清中において、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで、ＲＤＥＢケラチノサイト（１ウェル当たり１×１０６細胞）をマトリックス上に播種し、５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２ケラチノサイト培地中でコンフルエントになるまで増殖させると、気液界面で上昇した。上昇から２日後、ＫＢ１０３ウイルスを培養物に（３のＭＯＩで）添加し、１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、培養物を洗浄し、５〜１４日間インキュベートして層化及び上皮への分化を促した。皮膚等価物（ＳＥ）をプレートから手作業で剥がし、最適切削温度化合物内に包埋して液体窒素中で凍結し、モノクローナル抗Ｃｏｌ７抗体を用いた免疫蛍光染色のために、６ｍｍの切片に切断した。
結果
正常細胞及びＲＤＥＢ細胞におけるＫＢ１０３薬理学
Ｃｏｌ７欠損を治すために、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子をＲＤＥＢ患者から単離した初代細胞に送達するという多数のエクスビボ手法が行われてきた（Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１（２）２５１−５、Ｗｏｏｄｌｅｙ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．１２１（５）１０２１−８）。主要な疾患の特徴に関する永続的な収集の達成は成功しているが、表皮水疱症を処置するためのエクスビボ遺伝子送達戦略は、高コスト、不十分な生着、外科的創面切除、複合包帯及び創傷ケア、ならびに術後感染の高い可能性を含む、多数の主要な欠点を有する。遺伝子治療の魅力的な代替経路は、遺伝子産物を送達するためのウイルスまたは非ウイルスベクターの使用である。しかしながら、プラスミドＤＮＡを使用する非ウイルスベクターは、注射または局所的に投与した場合、非常に低い遺伝子導入効率に悩まされ、一方でヒト遺伝子治療試験において最も広く使用されているウイルスベクター（レトロウイルスベクター）は、非分裂細胞に感染しない。このことは、レトロウイルス遺伝子治療には適切な分裂細胞集団を作製するための組織の操作（創傷など）が必要となるため、皮膚への遺伝子送達にとって問題である。大容量のアデノウイルスベクターは、ゲノムサイズの転写単位を送達し、長時間にわたって形質導入細胞中で生存し得るが、アデノウイルス粒子の毒性及び免疫原性、加えてベクター作製中におけるヘルパーウイルスの必要性が、ヒト遺伝子治療戦略におけるそれらの使用にとって大きなハードルとして残る。複製欠損ＨＳＶベクターが多数の前臨床試験で送達ビヒクルとして用いられてきたが、表皮水疱症またはその他の皮膚科用途のための、ＨＳＶに基づくウイルスベクターの使用を支持する前臨床的証拠は、一切報告されていない。
この目的のために、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子をコードする複製欠損単純ヘルペス１型ウイルス（ＨＳＶ−１）を、ＤＥＢ患者の遺伝子治療処置に有用な新規ベクターとして開発した。ＨＳＶ−１ウイルスを、ウイルスＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子の完全な欠失を有するように改変すると、ＩＣＰ４欠失は、前初期ウイルス遺伝子ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７の転写を亢進する上流プロモーター配列の除去をもたらした。ウイルスを、欠失したＩＣＰ４遺伝子座の両方のコピー内でコードされるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期プロモーター駆動ヒトＣＯＬ７Ａ１発現カセットを含むようにさらに改変すると、ヒトＣＯＬ７Ａ１を標的細胞に送達するのに好適な、ＫＢ１０３と称される複製欠損ＨＳＶ−１ベクターをもたらした（図３）。
ヒト細胞中でＣｏｌ７を送達かつ発現するＫＢ１０３の能力を試験するために、及びＲＤＥＢ患者のＣｏｌ７欠損を回復するために、患者由来のヒト皮膚線維芽細胞及びケラチノサイトを、健康な個体、加えてＲＤＥＢに罹患している個体から単離し、これらの初代細胞を様々なＭＯＩでＫＢ１０３に感染させた。感染から２４〜７２時間後、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子発現を、形質導入細胞におけるリアルタイムＰＣＲによって測定した一方で、並行してＣｏｌ７タンパク質発現を、ウェスタンブロット及び免疫蛍光分析の両方によって分析した。
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子発現の用量依存的増加を、ＫＢ１０３に感染させたＲＤＥＢケラチノサイト（図４Ａ）及び線維芽細胞（図４Ｂ）で観察した。ＫＢ１０３感染によって、０．３、１、及び３のＭＯＩで感染させたＲＤＥＢケラチノサイトのＣＯＬ７Ａ１遺伝子発現は、それぞれおよそ７．５倍、１２．５倍、及び２５倍増加した（図４Ａ）。驚くべきことに、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子発現のさらに大きな劇的変化を、感染ＲＤＥＢ線維芽細胞で観察した。０．１及び０．３のＭＯＩでの感染がＣＯＬ７Ａ１遺伝子発現の中程度の増加を示した一方で、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子発現のおよそ３０倍の増加を、１のＭＯＩで感染させたＲＤＥＢ線維芽細胞で測定したが、３のＭＯＩで感染させたこの細胞型では６０倍の増加を観察した。このデータは、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子発現が、ＫＢ１０３での感染後、ＲＤＥＢ初代細胞中で大幅に上方制御されたことを示した。
結果として、強力なＣｏｌ７タンパク質発現も、ＫＢ１０３に感染させた細胞中で観察した。Ｃｏｌ７タンパク質発現を、０．３、１、及び３のＭＯＩにおけるＫＢ１０３での感染から４８時間後、正常及びＲＤＥＢケラチノサイト（図５Ａ）及び線維芽細胞（図５Ｂ）の両方で検出し、Ｃｏｌ７タンパク質発現の明らかな用量依存的増加を、より高いウイルス力価で観察した。Ｃｏｌ７の発現を、感染細胞からの上清及び細胞溶解物の両方で観察した。驚くべきことに、０．３のＭＯＩで感染させたＲＤＥＢ線維芽細胞は、非感染正常線維芽細胞で観察したものよりも高レベルのＣｏｌ７を示し（図５Ｂ）、このことは、低ウイルス力価であっても、ＫＢ１０３を使用したＲＤＥＢ線維芽細胞におけるＣｏｌ７発現の完全な回復を示唆した。高ウイルス用量（３のＭＯＩ）を使用した細胞形態に対する明らかな効果は、一切観察されなかった。さらに、高用量のＫＢ１０３を使用した線維芽細胞またはケラチノサイト細胞増殖に対する負の影響は、ＧＡＰＤＨ発現によって決定したように、これらの実験では一切示されなかった。
上記の実験と一致して、Ｃｏｌ７タンパク質発現の強力かつ用量依存的増加を、Ｃｏｌ７タンパク質発現の免疫蛍光検出によって実証した通り、ＫＢ１０３に感染させた正常及びＲＤＥＢ細胞で確認した（図６）。予想通り、Ｃｏｌ７タンパク質は、非感染ＲＤＥＢヒト皮膚線維芽細胞またはケラチノサイトでは一切検出せず、限られたＣｏｌ７タンパク質を、非感染正常ケラチノサイト及び線維芽細胞で検出した。しかしながら、ＫＢ１０３での感染は、非感染正常細胞で観察したレベル以上に、ＲＤＥＢ線維芽細胞及びケラチノサイトのＣｏｌ７タンパク質発現を回復させることができた。さらに、ＫＢ１０３の感染効率（３のＭＯＩで）は、各感染複製物の３つ以上の独立したパネルにおける評価に基づいて≧９５％であると算出され、このことは、ＫＢ１０３がＣＯＬ７Ａ１発現カセットを効率的に送達かつ発現したことを示した。総合すると、このデータは、ＫＢ１０３が、正常及びＲＤＥＢ初代細胞中でＣＯＬ７Ａ１を送達かつ発現することができ、さらにＫＢ１０３が、ヒト皮膚線維芽細胞及びケラチノサイトの両方で十分に忍容されたことを示唆した。
ＲＤＥＢ細胞中におけるＫＢ１０３の機能評価
次に、ＫＢ１０３から発現したヒトＣｏｌ７タンパク質の機能性を、ヒト皮膚線維芽細胞及びケラチノサイトにおいて調査した。最初に、リジルヒドロキシラーゼ３のレベルに対するＣｏｌ７発現の効果を、ＫＢ１０３感染細胞で試験した。ＬＨ３は、細胞外マトリックスの沈着及び組織化に必要であり、ＬＨ３レベルはＲＤＥＢ皮膚中で低減すると報告されている（Ｗａｔｔ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（９）：ｐ．ｅ０１３７６３９）。ＬＨ３は、先行研究と一致して、正常なケラチノサイトと比較して非感染ＲＤＥＢケラチノサイトでは、ほとんどまたは全く観察されなかった（図７、レーン１対５）。しかしながら、予想外にも、ＬＨ３レベルの用量依存的増加を、Ｃｏｌ７タンパク質発現の増加に付随して、ＫＢ１０３に感染させたＲＤＥＢケラチノサイトで観察し（図７）、このことは、ＫＢ１０３がＲＤＥＢ細胞中でＣｏｌ７タンパク質発現だけでなく、ＬＨ３発現も回復させることができたことを示唆した。
次に、ＴＳＰ−１レベルに対するＣｏｌ７発現の効果を試験した。ＴＳＰ−１は、血管新生の負の制御因子であり、これはＲＤＥＢ線維芽細胞中で増加すると報告されている（Ｎｇ，Ｙ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２（１４）：ｐ．３５２２−３４）。先行研究と一致して、より高レベルのＴＳＰ−１を、正常ヒト皮膚線維芽細胞に対して非感染ＲＤＥＢヒト皮膚線維芽細胞で観察した（図８、レーン１及び４）。驚くべきことに、ＴＳＰ−１タンパク質発現は、ＫＢ１０３に感染させる正常またはＲＤＥＢ線維芽細胞のいずれかの感染時に強力に阻害された（図８）。このデータは、ＫＢ１０３が、感染細胞中でＣｏｌ７及びＬＨ３レベルを増加させるだけでなく、負の制御因子ＴＳＰ−１を阻害することによって血管新生を促進する可能性があることも示唆した。
最後に、コラーゲン１またはフィブロネクチンのいずれかに対するＲＤＥＢケラチノサイトの細胞接着を増加させるＫＢ１０３の能力を試験した。コラーゲン１及びフィブロネクチンの両方に対する細胞接着の用量依存的増加を、様々なＭＯＩでＫＢ１０３に感染させたＲＤＥＢケラチノサイト中で観察した（図９Ａ及び図９Ｂ）。試験した全てのＭＯＩにおけるＲＤＥＢケラチノサイトの感染は、非感染（対照）細胞と比較して、全ての濃度の両基質で処理したウェルに対する接着性がより高いことを示した。総合すると、このデータは、ＫＢ１０３から発現したヒトＣｏｌ７タンパク質が形質導入細胞中で機能的であったことを示した。このタンパク質の機能性は、ＬＨ３タンパク質レベルを増加させるその能力、ＴＳＰ−１タンパク質レベルを減少させるその能力、ならびにｍｏｃｋ感染試料と比較してコラーゲン１及びフィブロネクチンの両方への細胞接着を改善するその能力によって示された。
ＲＤＥＢ器官型培養物におけるＫＢ１０３薬理学及び毒性
ＲＤＥＢ線維芽細胞及びケラチノサイトで構成した皮膚等価物（ＳＥ）器官型培養物を使用して、基底膜領域（ＢＭＺ）におけるＫＢ１０３から発現したＣｏｌ７タンパク質の発現を評価した。ＲＤＥＢ線維芽細胞及びケラチノサイトをｍｏｃｋ感染または３のＭＯＩでＫＢ１０３に感染させて、５日間インキュベートして層化及び上皮への分化を促した。得られた皮膚等価物（ＳＥ）を単離して切断し、Ｃｏｌ７タンパク質発現を検出する免疫蛍光法のために染色した。Ｃｏｌ７発現を、ＫＢ１０３に感染させた細胞からのこれらの器官型培養物中で検出し、ＢＭＺにおけるＣｏｌ７タンパク質沈着の開始を、ｍｏｃｋ感染対照物と比較して観察した（図１０）。このデータは、ＫＢ１０３がＣＯＬ７Ａ１を送達し、Ｃｏｌ７タンパク質を効率的に発現することができただけでなく、Ｃｏｌ７タンパク質が、Ｃｏｌ７タンパク質についてインビボで予測した組織化のパターンと同様に、器官型培養物中で組織化し始めたことを示唆した。
総じて、これらの実験は、複製欠損ＨＳＶ−１ベクターが、表皮水疱症患者から単離した初代細胞中にＣＯＬ７Ａ１発現カセットを送達するためのビヒクルとして用いられる可能性があることを初めて明らかにした。さらに、これらのデータは、Ｃｏｌ７タンパク質が、健康な個体、加えて皮膚科障害に罹患している個体からの２種類の異なるヒト細胞型において、この発現カセットから高レベルで発現され得たことを明らかにした。最後に、Ｃｏｌ７タンパク質は、それがＬＨ３の発現を増加させ、ＴＳＰ−１の発現を減少させ、コラーゲン１及びフィブロネクチンへの細胞接着を増加させることができ、Ｃｏｌ７のインビボ組織化と同様のパターンで器官型培養物中において組織化し得たことから、機能的であることが分かった。理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に提示したデータは、ＫＢ１０３及びその他のＨＳＶ−１ベクターが、表皮水疱症及び／またはその他の皮膚科用途に対する新規のインビボ処置戦略として有用である可能性があることを示唆している。
実施例３：複製欠損ＨＳＶ−１を使用したインビボＣｏｌ７発現
以下の実施例は、ヒトＣｏｌ７タンパク質をインビボで発現するための送達ビヒクルとしての、複製欠損単純ヘルペス１型ウイルス（ヒトＣＯＬ７Ａ１導入遺伝子を含有するように改変した）の使用について記載している。
方法
ＫＢ１０３の構築及び精製
ＫＢ１０３ウイルスを、上記の実施例２に記載の通りに構築かつ精製した。
ウイルス感染
ＫＢ１０３ウイルスを、以下の通りに皮内注射によって野生型Ｂａｌｂ／ｃまたはｓｋｈ１エリートマウスに送達した：各動物に、ウイルス／部位の１×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）での５０μＬの容量で、動物の隣接領域内の２〜４部位に１回注射した。動物を、ＫＢ１０３投与から４８時間後に犠牲死させ、注射部位を採取してリアルタイムｑＰＣＲまたは免疫蛍光分析のいずれかのために処理した。
ｑＰＣＲ分析のために、皮膚組織を、６ｍｍのパンチ生検器具を使用して筋膜に至るまで切離した。生検材料を２つの試験片に二分し、各試験片を、液体窒素を使用して急速凍結した。全ＲＮＡ及びＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡキットを使用して生検材料の半分から単離した。
免疫蛍光分析のために、直径およそ１ｃｍの円形部を注射部位の皮膚から切除し、半分に切断して、円形部の中心部分が上向きとなるようにＯＣＴに載せた。調製した試料を液体窒素冷却イソペンタン中で急速凍結し、−８０℃で保存した。
ｍＲＮＡ定量化
Ｃｏｌ７転写物を、２ステッププロトコールを使用してＫＢ１０３注射後にマウス皮膚組織から単離したＲＮＡから増幅した：製造業者のプロトコールに従って、１）ｃＤＮＡ合成を、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１８−０８０−０５１）を使用して実施し、２）ｑＰＣＲ増幅を、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２０４３４５）を使用して実施した。１００ｎｇのｃＤＮＡを各反応に使用した。Ｃｏｌ７転写レベルを、ＧＡＰＤＨ転写レベルを基準として正規化した。
ゲノムコピー定量化
ＫＢ１０３注射マウスにおけるＫＢ１０３ウイルスゲノムのコピー数を、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２０４３４５）を使用してｑＰＣＲ増幅により定量化した。１００ｎｇのマウスゲノムＤＮＡを各反応に使用し、マウスゲノムＧＡＰＤＨを対照として使用した。
免疫蛍光法
ＫＢ１０３を注射したマウスからの組織切片を固定し、続いて一次ウサギ抗ヒトＣｏｌ７ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＨＰＡ０４２４２０）で染色し、洗浄してから蛍光標識抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ３ Ａ１１０１２）でさらに染色した。細胞核を、標準的な技術を使用してＤＡＰＩで染色した。
結果
ヒトＣｏｌ７タンパク質のインビボ送達及び発現を成功させるＫＢ１０３の能力を試験するために、マウスにＫＢ１０３ウイルスを皮内投与した。感染マウス組織のウイルスゲノムコピー数を評価し、高レベル（＞１，０００，０００ウイルスゲノムコピー／１００ｎｇのマウスＤＮＡ）のＫＢ１０３ウイルスゲノム送達をマウス中で観察した（図１１）。次に、ヒトＣｏｌ７をインビボで発現するウイルスの能力の能力を検査した。ＫＢ１０３感染マウスにおけるヒトＣｏｌ７転写物の定量を測定し、対照マウスハウスキーピング遺伝子の発現と比較して評価した。高レベルのヒトＣｏｌ７転写物を感染マウス組織中で観察し（図１１）、このことは、送達されたウイルスゲノムが、それらのヒト遺伝子カーゴの発現を成功させることができたことを示唆した。最後に、Ｃｏｌ７タンパク質を発現するＫＢ１０３の能力を感染マウスで試験した。マウス皮膚組織を感染後にマウスから切除し、Ｃｏｌ７タンパク質発現を、マウス組織の免疫組織化学染色法によって評価した。高レベルのヒトＣｏｌ７タンパク質を、組織染色後に検出した（図１２）。驚くべきことに、ヒトＣｏｌ７タンパク質がマウス真皮においてＫＢ１０３ウイルスから発現されただけでなく、ＫＢ１０３感染マウスの基底膜領域におけるヒトＣｏｌ７沈着の開始も観察した（図１２）。理論に束縛されることを望むものではないが、このデータは、以下を示唆している：１）ＫＢ１０３ウイルスが関連組織へのインビボ感染を成功させ、多数のゲノムコピーをこれらの組織に送達することができ、２）関連組織へのＫＢ１０３ウイルスの送達が、このウイルス上でコードされたヒト遺伝子の有意な発現をもたらし、３）ＫＢ１０３が、ヒトＣｏｌ７タンパク質のインビボ発現を成功させるだけでなく、このタンパク質は（例えば、基底膜領域において）組織化を開始することができ、ある意味、罹患した個体において内因性Ｃｏｌ７欠損を回復させるその能力を示唆している。

Claims (14)

  1. ａ）コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む組換え単純ヘルペスウイルスゲノムを含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）と、
    ｂ）薬学的に許容される担体と
    を含む、前記医薬組成物。
  2. 前記組換えゲノムを含むＨＳＶが複製欠損性である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、または任意のそれらの誘導体である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上の有毒なＨＳＶ遺伝子の発現を減少させる、または排除するように操作されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、不活性化変異を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 前記不活性化変異は、１つ以上の前初期ＨＳＶ遺伝子中にある、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 前記不活性化変異が、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１、及びＵＬ５５からなる群から選択される少なくとも１つの単純ヘルペスウイルス遺伝子の中にある、請求項５に記載の医薬組成物。
  8. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、前記ＩＣＰ４ウイルス遺伝子座のうち１つ以上の中に前記１つ以上の導入遺伝子を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 前記薬学的に許容される担体が、局所投与、経皮投与、皮下投与、皮内投与、経粘膜投与又はそれらの任意の組み合わせに好適である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 前記コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチドが、配列番号：２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 医薬としての使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. 前記医薬組成物が、対象の皮膚の創傷、障害、または疾患の予防的、待期的、または治療的緩和の提供において使用するためのものであって、
    前記皮膚の障害または疾患は、栄養障害型表皮水疱症である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 前記医薬組成物が、前記対象に局所的に、経皮的，皮下的，または皮内的に投与される、請求項１２に記載の使用のための医薬組成物。
  14. 前記対象が、ヒトである、請求項１２又は１３に記載の使用のための医薬組成物。
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