CN110312506A - 用于阻挡紫外线辐射的组合物和方法 - Google Patents

用于阻挡紫外线辐射的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110312506A
CN110312506A CN201780083265.4A CN201780083265A CN110312506A CN 110312506 A CN110312506 A CN 110312506A CN 201780083265 A CN201780083265 A CN 201780083265A CN 110312506 A CN110312506 A CN 110312506A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lite
composition
light
gur
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780083265.4A
Other languages
English (en)
Inventor
X.Z.S.徐
J.刘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Michigan
Original Assignee
University of Michigan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Michigan filed Critical University of Michigan
Publication of CN110312506A publication Critical patent/CN110312506A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/987—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of species other than mammals or birds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/86—Products or compounds obtained by genetic engineering

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开涉及能够吸收UVA和UVB光的组合物。特别是，本公开涉及UV屏蔽组合物，所述组合物包含能够吸收UV光(例如UV‑A和/或UV‑B光)的LITE‑1多肽的至少一部分。

Description

用于阻挡紫外线辐射的组合物和方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年11月14日递交的美国临时申请序列号62/421,672的益处，其通过参考以其全部结合至本文中。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明在国立卫生研究院授予的EY022315和GM083241的政府支持下进行。政府拥有本发明的某些权利。
公开领域
本公开涉及能够吸收UVA和UVB光的组合物。特别是，本公开涉及UV屏蔽组合物，其包含能够吸收UV光(例如UV-A和/或UV-B光)的LITE-1多肽的至少一部分。
公开背景
暴露于紫外线(UV)辐射的有害影响可分为急性或慢性。UV-A和UV-B暴露的急性影响既短暂又可逆。这些影响主要包括晒伤(或红斑)和晒黑(或色素变黑)。UV暴露的慢性影响可能严重得多，甚至危及生命，并且包括皮肤过早老化、抑制免疫系统、眼睛损伤和皮肤癌。
根据美国卫生与人类服务部关于致癌物的国家毒理学计划报告，广谱UV辐射为一种致癌物，其DNA损伤被认为是造成美国每年发生的大多数的估计的150万皮肤癌和因转移性黑素瘤所致的8000例死亡的原因。
尽管太阳对维生素D合成具有重要性，但谨慎的做法是限制皮肤暴露于来自阳光和晒黑床的UV辐射。美国皮肤病学会建议采取光保护措施，包括在每当暴露于阳光时使用防晒霜。短期过度暴露会导致晒伤的疼痛和瘙痒，其在极端情况下会产生更严重的影响如起泡。
需要用于防止UV光损伤的另外的组合物和方法。
概述
许多动物组织/细胞为光敏的，但在后生动物仅发现了两种类型的光受体(视蛋白和隐花色素)。产生的问题是动物界中是否存在未知类型的光受体。LITE-1为一种七次跨膜味觉受体(GR)同源物，介导秀丽隐杆线虫(C. elegans)的UV光诱导的回避行为。然而，尚不清楚LITE-1是否起化学受体或光受体的作用。在开发本公开的实施方案的过程期间进行的实验确定了LITE-1直接吸收UVA和UVB光两者，其消光系数为视蛋白和隐花色素的10-100倍，表明LITE-1在捕获光子方面高度有效。与采用非朊基发色团捕获光子的典型光受体蛋白不同，LITE-1严格依赖于其蛋白质构象来吸收光子。这种实验进一步鉴定了对LITE-1功能至关重要的两个色氨酸残基。有趣的是，与GPCR不同，LITE-1采取反向膜拓扑结构。因此，味觉受体同源物LITE-1代表动物界中不同类型的光受体。
因此，本公开涉及能够吸收UVA和UVB光的组合物。特别是，本公开涉及UV屏蔽组合物，其包含能够吸收UV光(例如UV-A和/或UV-B光)的LITE-1和/或GUR-3多肽的至少一部分。
例如，在一些实施方案中，在一些实施方案中，本公开提供一种组合物，其包含：a)LITE-1多肽或其片段、部分或模拟物；和b) 至少一种载体。本公开不限于特定的LITE多肽。在一些实施方案中，LITE-1为野生型秀丽隐杆线虫LITE-1 (例如SEQ ID NO:1或与SEQ IDNO:1有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列)。在一些实施方案中， LITE-1肽从秀丽隐杆线虫分离、重组或合成。在一些实施方案中，LITE-1多肽包含一个或多个突变。在一些实施方案中，突变不为W77或W328。在一些实施方案中，GUR-3多肽为野生型秀丽隐杆线虫GUR-3 (例如SEQID NO:2或与SEQ ID NO:2有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列)。在一些实施方案中，GUR-3多肽包含一个或多个突变(例如Y79W)。在一些实施方案中，LITE-1或GUR-3多肽吸收UVA和/或UVB光。在一些实施方案中，载体为药学上可接受的载体。本公开不限于特定载体。在一些实施方案中，载体包括一种或多种选自例如防腐剂、润肤剂、乳化剂、表面活性剂、保湿剂、胶凝剂、增稠剂、调理剂、成膜剂、稳定剂、抗氧化剂、调质剂、光泽剂、消光剂(mattifying agent)、增溶剂、颜料、染料或香料的载体。在一些实施方案中，组合物为药用组合物、化妆品组合物、防晒霜、气雾剂、保湿剂、凝胶剂、软膏剂、棒剂、霜剂或洗剂。在一些实施方案中，组合物配制成用于局部给予。
在进一步的实施方案中，组合物配制成用于工业用途。例如，在一些实施方案中，本公开提供包含LITE-1和/或GUR-3多肽的膜、镜片、结构元件或涂层。在一些实施方案中，载体为聚合物或塑料。
仍然其他实施方案提供一种保护皮肤免受UVA和/或UVB光的方法，所述方法包括：使受试者的皮肤与本文所述的组合物接触。
仍然其他实施方案提供本文所述的组合物保护皮肤免受UVA和/或UVB光的用途。
基于本文包含的教导，另外的实施方案对于相关领域的技术人员为显而易见的。
附图简述
图1A-C显示LITE-1采取不寻常的膜拓扑结构，其C-末端面向细胞外和N-末端位于细胞内。(A) LITE-1膜拓扑结构示意图。(B) LITE-1显示出独特的膜拓扑结构，其C-末端面向细胞外和其N-末端位于细胞质中。(C) BiFC图像，其显示LITE-1的N-末端位于细胞质中。
图2显示图1B的对照图像。
图3A-D显示LITE-1的光吸收依赖于其构象。(A) 用尿素使LITE-1变性完全消除其光吸收。显示的为模拟和尿素处理的LITE-1的光谱数据。(B) 用尿素使细菌视紫红质(bRho)变性不会消除其光吸收。(C) 用NaOH使LITE-1变性完全消除其光吸收。(D) 用NaOH使细菌视紫红质(bRho)变性不会消除其光吸收。
图4A-I显示LITE-1吸收UVA和UVB光，并且LITE-1的异位表达赋予光敏细胞光敏性。(A) LITE-1在肌细胞中的转基因表达赋予行为测定所显示的光敏性。(B-D) LITE-1在肌细胞中的转基因表达赋予钙成像所显示的光敏性。沿着(B)和(C)中的迹线的阴影表示SEM。(D) 条形图。n≥7。(E-F) LITE-1的纯化。(E)中显示的为用考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。(F)中显示的为用抗1D4探测的Western印迹，抗1D4识别附接于LITE-1的C-末端的1D4标签。(F)中上样的每个样品的量为E中的1/10。(G) LITE-1显示出强烈的UVA和UVB光吸收，而BSA则没有。(I) LITE-1在光子吸收方面比隐花色素和视蛋白更有效得多。
图5显示作为肌细胞中转基因的LITE-1的异位表达赋予光敏性。
图6A-H显示从蠕虫肌肉中纯化的LITE-1、牛视紫红质(Rho)和腺苷A2A受体(A2AR)的光谱特性的比较。(A-B) LITE-1、Rho和A2AR在相同条件下从转基因蠕虫中并行纯化。(A)考马斯染色。(B) Western。(C) LITE-1在0.5 mM下显示出强的光吸收，而A2AR则没有。(D)Rho在0.5 mM下显示出最小的光吸收，并且在较高浓度(2.7 mM)下仅显示出适度的光吸收。注意：(C)和(D)中的Y轴标度不同。(E-F) 用尿素使LITE-1变性完全消除其光吸收(E)，而相同的处理不能消除Rho的光吸收，而是将其500 nm吸光度峰移至370 nm (F)。(G-H) 用NaOH使LITE-1变性完全消除其光吸收(E)，而对Rho进行相同处理则没有，而是将其500 nm吸光度峰移至370 nm (F)。
图7A-B显示H2O2对LITE-1光吸收的影响。(A) H2O2处理完全消除LITE-1的光吸收。(B) H2O2处理不会消除细菌视紫红质(bRho)的光敏性，但会将其吸光度峰从568 nm移至370nm。
图8A-I显示通过将色氨酸残基引入到另一个GR家族成员GUR-3中的光受体的基因工程。(A) GUR-3中的Y79突变成W促进行为测定所显示的体内光敏性。GUR-3Y79W和GUR-3在肌细胞中表达为转基因。使蠕虫暴露于20秒脉冲的UVB光(280±10 nm, 0.03 mW/mm2)，并且在光照期间显示出肌肉收缩诱导的麻痹的那些评分为阳性。n=50。误差棒：SEM。***p<0.00001 (t检验)。(B-D) GUR-3中的Y79突变成W促进钙成像所显示的体内光敏性。沿着(B-C)中的迹线的阴影表示SEM。(D) 条形图。n=20。***p<0.00001 (t检验)。(E-F) GUR-3Y79W和GUR-3的纯化。(E)中显示的为用考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。(F)中显示的为用抗1D4探测的Western印迹，抗1D4识别附接于GUR-3Y79W和GUR-3以及LITE-1的C-末端的1D4标签。将LITE-1并行纯化作为参考。正如预测的那样，GUR-3显示出比LITE-1略大的分子量。(F)中上样的每个样品的量为(E)中的1/10。在室温和在非还原条件下(不含β-ME和DTT)制备用于SDS-PAGE和Western的样品以避免LITE-1的聚集。(G-H) GUR-3中的Y79突变成W极大地增强体外UVB光(280 nm)的吸收。(I) 表示LITE-1膜拓扑结构和本研究中研究的残基位置的图解模型。
图9A-G显示LITE-1中的残基S226和A332对于其在体内对UVA光的敏感性至关重要。(A) S226F和A332V突变破坏行为测定所显示的体内LITE-1功能。(B-E) S226F和A332V突变破坏钙成像所显示的体内LITE-1功能。沿着(B-D)中的迹线的阴影表示SEM。(E) 条形图。n≥7。***p<0.00001 (具有Bonferroni检验的ANOVA)。(F-G) 突变形式LITE-1的纯化。(F)中显示的为用考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。(G)中显示的为用抗1D4探测的Western印迹，抗1D4识别附接于LITE-1变体的C-末端的1D4标签。(G)中上样的每个样品的量为(F)中的1/10。
图10A-B显示LITE-1中的残基S226和A332对于其在体内对UVA而非UVB光的敏感性至关重要。(A-B) LITE-1S226F和LITE-1A332V在myo-3启动子下于肌细胞中表达为转基因。(B)光被引向蠕虫，诱导肌肉收缩，导致蠕虫麻痹(运动速度降至零)。
图11A-I显示LITE-1中的残基S226和A332为其在体外UVA而非UVB光吸收所需要的。(A-B) S226F和A332V突变破坏LITE-1在体外的UVA而非UVB光的吸收。(C) S226F和A332V突变不会破坏行为测定所显示的LITE-1在体内对UVB光的敏感性。(D-H) S226F和A332V突变不会破坏钙成像所显示的LITE-1在体内对UVB光的敏感性。沿着(D-G)中的迹线的阴影表示SEM。(H) 条形图。n≥10。***p<0.00001 (进行Bonferroni检验的ANOVA)。(I)LITE-1吸收UVB而非UVA光显示出抗光漂白。
图12A-L显示LITE-1中的两个色氨酸残基W77和W328为体内和体外LITE-1功能所需要的。(A-B) 突变W77和W328而非其他4个W残基破坏行为测定所显示的LITE-1在体内对UVA和UVB光两者的敏感性。使野生型(WT)和转基因蠕虫暴露于20秒脉冲的UVA光(A)或UVB光(B)。(C-F) W77F和W328F突变破坏钙成像所显示的LITE-1在体内对UVA光的敏感性。沿着(C-E)中的迹线的阴影表示SEM。(F) 条形图。n≥6。***p<0.00001 (进行Bonferroni检验的ANOVA)。(G-J) W77F和W328F突变破坏钙成像所显示的LITE-1在体内对UVB光的敏感性。沿着(G-I)中的迹线的阴影表示SEM。(J) 条形图。n≥10。***p<0.00001 (进行Bonferroni检验的ANOVA)。(K-L) W77F和W328F突变破坏LITE-1在体外对UVA和UVB光两者的吸收。
图13A-B显示LITE-1中的两个色氨酸残基W77和W328为其体内对UVA和UVB光两者的敏感性所需要的。(A-B) LITE-1W77F和LITE-1W328F在myo-3启动子下于肌细胞中表达为转基因。UVA (350±20 nm, 0.8 mW/mm2) (A)或UVB (280±10 nm, 0.03 mW/mm2) (B)光被引向蠕虫。
图14显示秀丽隐杆线虫GR家族蛋白的序列比对，以及与GUR-3相关的另外数据。(A) LITE-1中的两个色氨酸残基W77和W328用星号标记。(B) GUR-3中的Y79突变成W不会促进麻痹测定所显示的其体内对UVA光的敏感性。(C-E) GUR-3中的Y79突变成W不会促进钙成像所显示的其体内对UVA光的敏感性。(C)和(D) 成像迹线。(E) 条形图。n=20。p=0.779 (t检验)。(F-G) GUR-3中的Y79突变成W促进运动测定所显示的其体内对UVB而非UVA光的敏感性。
图15A-F显示与GUR-3相关的另外的数据。(A) GUR-3中的Y79突变成W不会促进麻痹测定所显示的其体内对UVA光的敏感性。(B-D) GUR-3中的Y79突变成W不会促进钙成像所显示的其体内对UVA光的敏感性。(B)和(C) 成像迹线。(D) 条形图。n=20。p=0.779 (t检验)。(E-F) GUR-3中的Y79突变成W促进运动测定所显示的其体内对UVB而非UVA光的敏感性。
图16显示秀丽隐杆线虫LITE-1肽的序列(SEQ ID NO:1)。
图17显示秀丽隐杆线虫GUR-3肽的序列(SEQ ID NO:2)。
定义
为了便于理解本公开，以下定义许多术语和短语：
本文使用的术语“有效量”是指足以实现有益或期望的结果的治疗剂(例如本公开的LITE-1或GUR-3多肽)的量。有效量可以一次或多次给予、应用或剂量进行给予，并且不旨在限于特定的制剂或给予途径。
本文使用的术语“共同给予”是指给予受试者至少两种试剂(例如本公开的肽)或疗法。在一些实施方案中，共同给予两种或更多种试剂/疗法为同时的。在一些实施方案中，在第二试剂/疗法之前给予第一试剂/疗法。本领域的技术人员理解的是，所使用的各种试剂/疗法的制剂和/或给予途径可以变化。本领域的技术人员可易于确定用于共同给予的合适剂量。在一些实施方案中，当共同给予试剂/疗法时，相应的试剂/疗法以低于适合于其单独给予的剂量给予。因此，在其中共同给予试剂/疗法降低已知潜在有害(例如毒性)试剂的必需剂量的实施方案中，共同给予为尤其期望的。
本文使用的术语“毒性的”是指与给予毒物之前的相同细胞或组织相比较对细胞或组织的任何有害或损害作用。
本文使用的术语“药用组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物尤其适合于体内、体内或离体的诊断或治疗用途。
本文使用的术语“药学上可接受的载体”是指任何标准药用载体，比如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种类型的润湿剂。组合物还可包含稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和辅剂的实例(参见例如Martin, Remington'sPharmaceutical Sciences, 第15版, Mack Publ. Co., Easton, PA [1975])。
本文使用的术语“局部可接受的”意指成分适合于与人体皮肤(包括头皮)接触，而没有不当毒性、不相容性、刺激性、不稳定性、过敏反应等。
本文使用的术语“样品”在其最广泛的意义上使用。样品可包含细胞、组织或流体、从细胞分离的核酸或多肽等。
本文使用的术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中去除不期望的组分。本文使用的术语“基本上纯化的”是指至少60%不含，优选地75%不含，和最优选地90%或更多不含通常与其相关的其他组分的分子。
“氨基酸序列”和术语比如“多肽”或“蛋白质”不意在将氨基酸序列限于与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸序列。
本文使用的术语“天然蛋白质”表示蛋白质不含由载体序列编码的氨基酸残基；也就是说，天然蛋白质仅含有当其在自然中存在时的蛋白质中发现的那些氨基酸。天然蛋白质可通过重组方法产生，或者可从天然存在的来源中分离。
本文使用的术语“部分”在指涉蛋白质(如在“给定蛋白质的一部分”中)时是指该蛋白质的片段。片段的大小可在4个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去1个氨基酸的范围内。
当用于指涉蛋白质时，术语“野生型”是指由并非被操纵以产生合成蛋白质的那种的细胞、组织或生物体的基因组编码的蛋白质。
当用于指涉多肽时，术语“变体”和“突变体”是指与另一种通常相关的多肽相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质。一种类型的保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；非天然氨基酸像对氨基苯丙氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。 优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。更罕见的是，变体可具有“非保守”变化(例如用色氨酸置换甘氨酸)。类似的微小变化也可包括氨基酸缺失或插入(即添加)或两者。可使用本领域熟知的计算机程序(例如DNAStar软件)，发现确定哪些和多少氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指导。可在功能测定中测试变体。优选的变体具有小于10%，和优选地小于5%，和仍然更优选地小于2%的变化(无论是取代、缺失等)。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代的氨基酸。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”进行描述。出于本公开的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS: The European Molecular Biology OpenSoftware Suite, Rice等, 2000,Trends in Genetics 16: 276-277)的Needle程序(优选地版本3.0.0或更高版本)中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970, J.Mol. Biol. 48: 443-453)确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用的任选参数11644.000-EP7为空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62 (BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并计算如下：(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
本文使用的术语“受试者”是指通过本公开的实施方案的方法治疗的生物体。这种生物体优选地包括(但不限于)哺乳动物(例如鼠、猿、马、牛、猪、犬、猫等)，和最优选地包括人类。在本公开的上下文中，术语“受试者”通常是指将接受或已接受治疗(例如给予本公开的肽和任选地一种或多种其他试剂)以预防UV光诱导的损伤或其他需要治疗的病况的个体。
公开详述
光感对于从细菌到人类范围内的所有生命门类至关重要(Wang和Montell, PflugersArch 454, 821-847 2007; Yau和Hardie, Cell 139, 246-264 2009)。生物体已进化形成了各种类型的光受体蛋白(下文称为光受体)来检测光(Falciatore和Bowler, Curr TopDev Biol 68, 317-350 2005; Wang和Montell, 2007, 同上; Yau和Hardie, 2009, 同上)。这些光受体显示出不同的光谱特性，其中一些感应蓝色和其他感测绿色和红色，覆盖广谱的光(Falciatore和Bowler, 2005, 同上; Wang和Montell, 2007, 同上; Yau和Hardie, 2009, 同上)。光受体一般地由两个部分组成：宿主蛋白和非朊基发色团(例如视网膜)，后者负责光吸收(Wang和Montell, 2007, 同上; Yau和Hardie, 2009, 同上)。除了视网膜中的成像光受体细胞之外，还在广泛范围的动物物种中鉴定出越来越多的非成像光敏细胞/组织(Wang和Montell, 2007, 同上; Yau和Hardie, 2009, 同上)。例如，脊椎动物视网膜中的神经节和水平细胞的子集为光敏的(Yau和Hardie, 2009, 同上)。在哺乳动物的皮肤(例如角质形成细胞和黑素细胞)、大多数脊椎动物的瞳孔、非哺乳类脊椎动物的松果体、鸟类的下丘脑和昆虫的体表也发现了光敏细胞(Bellono等, Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 110, 2383-23882013; Foster和Soni, Rev Reprod 3, 145-150 1998; Moore等, Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 110, E3225-32342013; Xiang等, Nature 468, 921-926 2010; Yau和Hardie, 2009, 同上)。然而，与表达许多类型光受体的微生物和植物形成对比，在动物界仅鉴定出两组这种蛋白质：视蛋白和隐花色素(Wang和Montell, 2007, 同上; Yau和Hardie, 2009, 同上)。因此产生的问题是后生动物中是否存在未知类型的光受体。
线虫秀丽隐杆线虫检测并响应各种各样的感官线索，比如机械力(例如触碰和拉伸)、化学物质(例如气味物和促味剂)和温度，代表用于研究感官知觉的流行的遗传模型生物体(de Bono和Maricq, Annu Rev Neurosci 28, 451-501 2005)。尽管没有眼睛，但秀丽隐杆线虫也对光有反应(Edwards等, PLoS Biol 6, e198 2008; Ward等, NatureNeurosci 11, 916-922 2008)。具体地讲，短波长的光(特别是UV光)诱导秀丽隐杆线虫的回避行为(负趋光性)，其由一组感光神经元介导，为蠕虫提供保护机制，以避免在阳光下致死剂量的UV (Liu等, Nat Neurosci 13, 715-722 2010; Ward等, 2008, 同上)。LITE-1为无脊椎动物七次跨膜(7-TM)味觉受体(GR)家族的成员，为UV光诱导的回避行为需要的(Edwards等, 2008, 同上; Liu等, 2010, 同上)。LITE-1的异位表达可赋予对光不敏感细胞光敏性(Edwards等, 2008, 同上; Liu等, 2010, 同上)。尽管有这种间接证据表明LITE-1为候选光受体，但仍存在其他可能性。例如，与长波长的光不同，UV照射产生活性氧类(ROS)比如H2O2，这转而可引起类似于UV光诱导的回避行为反应(Bhatla和Horvitz,Neuron 85, 804-818 2015)。鉴于LITE-1为味觉受体(GR)家族的成员，因此已经指出LITE-1可起化学受体的作用(Yau和Hardie, 2009, 同上)。在这种情况下，LITE-1将感知光产生的化学物质而非光本身。
为了解决这个难题，在开发本公开的实施方案的过程期间进行的实验从蠕虫溶解产物中纯化了LITE-1蛋白，并且发现其直接吸收UVA和UVB光。LITE-1的这种特性和其在体内产生光诱发的功能输出的能力一起，表明LITE-1为光受体。发现LITE-1具有许多独特的特征，使其区别于其他光受体。这些包括极高的光吸收效率、感知UVA和UVB光两者的能力、对光吸收构象的严格依赖性、强烈抗UV光漂白以及与视蛋白相比较的反向膜拓扑结构。这些结果将味觉受体同源物LITE-1鉴定为独特的光受体，其具有在任何已知的光受体未见的特征。因此，动物界存在新型的光受体。此外，这种实验鉴定了LITE-1中对光吸收至关重要的两个色氨酸残基。引人注目的是，显示将这种色氨酸残基引入到另一个GR家族成员促进光敏性。
因此，本文提供包含LITE-1和/或GUR-3的组合物及其化妆品、药用和工业用途(例如以防止UV光对皮肤或眼睛的损伤)。本文描述组合物和用途和方法的示例性非限制性实例。
I. 包含LITE-1和/或GUR-3的组合物
如本文所述，本公开的实施方案提供包含LITE-1多肽的组合物(例如化妆品、药用或工业组合物)。
A. 多肽和肽
本公开不限于特定的LITE-1多肽或获得LITE-1多肽的方法。在一些实施方案中，LITE-1多肽为秀丽隐杆线虫LITE-1多肽或其片段、模拟物或变体。例如，在一些实施方案中，LITE-1多肽为SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1有至少80 %(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的序列。在一些实施方案中，GUR-3多肽为野生型秀丽隐杆线虫GUR-3 (例如SEQ ID NO:2或与SEQ IDNO:2有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列)。在一些实施方案中，GUR-3多肽包含一个或多个突变(例如Y79W)。在一些实施方案中，LITE-1或GUR-3的变体和片段保留GUR-3的至少一种活性(例如吸收UV-A和/或UB-B光的能力)。
在一些实施方案中，本公开提供LITE-1或GUR-3的变体(例如一个或多个氨基酸的突变)。在一些实施方案中，突变不在77或328位。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。示例性的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
基因编码的氨基酸可分为4个家族：(1) 酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)；(2) 碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3) 非极性的(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和(4) 非荷电极性的(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同分类为芳族氨基酸。以类似的方式，氨基酸库可分组为：(1) 酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)；(2) 碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3) 脂肪族的(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，丝氨酸和苏氨酸任选地分别分组为脂肪族羟基；(4) 芳族的(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(5) 酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6) 含硫的(半胱氨酸和甲硫氨酸) (例如Stryer编辑,Biochemistry, 第17-21页, 第2版, WH Freeman and Co., 1981)。
在一些实施方案中，变体包括“非保守”变化(例如用色氨酸置换甘氨酸)。可使用计算机程序发现确定哪些氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指导。
百分比序列同一性可通过例如Gap程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage, 用于Unix的版本8, Genetics Computer Group, University Research Park,Madison WI)，使用默认设置来确定，该程序使用Smith和Waterman的算法(Adv. Appl.Math., 1981, 2, 482-489)。
在一些实施方案中，可从本文所述的肽缺失1、2、3或4个氨基酸。在一些实施方案中，可将1、2、3或4个氨基酸插入到肽中或者添加至C或N末端。在一些实施方案中，肽内的1、2、3或4个氨基酸可用其他氨基酸置换(参见上文)。
在一些实施方案中，天然存在的氨基酸用例如非天然存在的氨基酸置换，所述非天然存在的氨基酸比如正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，比如Ellman等, Meth. Enzym., 1991, 202, 301-336中描述的那些氨基酸残基类似物。为了产生这种非天然存在的氨基酸残基，可使用Noren等, Science, 1989, 244, 182 和Ellman等 (同上)的程序。其他合适的方法描述于White等, Methods, 2013, 60, 70-74;Gentilucci等, Curr Pharm Des 2010, 16, 3195-3203; Hodgson & Sanderson, ChemSoc Rev 2004, 33, 422-430和Krebs等, Chemistry 2004, 10:544-553中。
可进一步修饰本文所述的LITE-1多肽和肽。修饰的实例包括(但不限于)用增加稳定性和改善活性的氨基酸置换不稳定的氨基酸、用D-氨基酸置换一个或多个L-氨基酸、减小肽的大小(例如LITE-1的功能片段)、环化肽、内部烃“装订(stapling)”(其稳定肽构象)、肽或多肽的PEG化及C-末端酰胺化或N-末端乙酰化(如例如Brinckerhoff等 (Int’l J.Cancer, 1999, 83, 326-334)中所述)或N-焦谷氨酰化(pyroglutamylation)(如例如Green等 (J. Endocrinol., 2004, 180, 379-388)中所述)、链长在4-18范围内的各种脂肪酸的缀合(如例如DasGupta等 (Biol. Pharma. Bull., 2002, 25, 29-36)中所述)等。
在一些实施方案中，提供本文所述的肽的肽模拟物。小分子肽模拟物的开发通常涉及鉴定能够抑制靶向相互作用的最小功能性肽单元。越来越多的文献表明，高亲和力配体可选自噬菌体上展示的肽文库(Sulochana等, Curr. Pharm. Des., 2007, 13, 2074-86; Cwirla等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 6378-82; Scott等,Science, 1990, 249, 386-90; 和Devlin等, Science, 1990, 249, 404-6)，并且许多应用已经针对拮抗蛋白质配体的功能(Dower, Curr. Opin. Chem. Biol., 1998, 2, 328-34; 和Sidhu等, Methods Enzymol., 2000, 328, 333-63)。因为文库可能非常大(1011或更多单个成员)，所以既不需要关于如何偏倚文库的初始假设，也不需要通过生物扩增和重新筛选来选择性富集稀有的结合噬菌体。通过对其编码DNA进行测序可易于鉴定那些结合的序列。
在一些实施方案中，如此鉴定的肽配体进一步用作起点用于开发新的定向治疗剂的组合化学方法或基于药物化学的肽模拟方法。另外，确定这些肽对其底物的高结合亲和力的结构基础有助于治疗剂的合理设计。
使用任何合适的方法获得或产生本文所述的LITE-1和GUR-3多肽和肽片段。在一些实施方案中，从秀丽隐杆线虫纯化LITE-1多肽(参见例如以下实施例IX)。在一些实施方案中，通过比如制备可溶性提取物和使用色谱方法在不同固体支持体基质上富集提取物的方法，从其天然来源分离和纯化本公开的LITE-1或GUR-3蛋白。在一些实施方案中，在含有各种蛋白酶抑制剂的缓冲液中制备秀丽隐杆线虫的可溶性提取物，随后通过色谱柱(例如琼脂糖凝胶基质、阳离子-离子交换基质、凝胶过滤基质或反相基质)或使用本文所述的亲和纯化方法对提取物进行序贯色谱。可选择从这种色谱柱收集的存在LITE-1或GUR-3的级分(例如通过活性或大小测定)。
在一些实施方案中，编码本文所述的LITE-1或GUR-3多肽的核酸为重组产生的(例如在哺乳动物、昆虫、真菌或细菌细胞中)。将编码LITE-1或GUR-3多肽的重组cDNA分子掺入到表达载体中，将该表达载体引入合适的宿主细胞中，培养宿主细胞，并分离表达的蛋白。
表达载体为在合适的宿主中克隆的基因拷贝的转录及其mRNA的翻译所需的DNA序列。这些载体可在多种细胞比如细菌、酵母、哺乳动物、植物和昆虫细胞中表达原核生物或真核生物基因。蛋白质也可在许多病毒系统中表达。
适当构建的表达载体含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点，或者能够整合至宿主细胞染色体中。这种载体还含有选择性标志物、有限数目的有用限制酶位点、高拷贝数和强启动子。启动子为指导RNA聚合酶与DNA结合并启动RNA合成的DNA序列，强启动子导致高频率的这种启动。本公开的优选表达载体与本公开的重组cDNA分子有效连接，即载体能够指导附接的重组cDNA分子的复制和重组cDNA分子编码的蛋白质的表达两者。表达载体可包括(但不限于)克隆载体、修饰的克隆载体和特别设计的质粒或病毒。
用于表达本公开的蛋白的合适的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物、植物和昆虫细胞。对于每种类型的细胞和其中的物种，某些表达载体如以下所公开的那样为合适的。
原核生物可用于表达本公开的蛋白。合适的细菌宿主细胞包括各种大肠杆菌(E. coli)菌株、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株和各种假单胞菌属(Pseudomonas)的种。在这些系统中，使用质粒载体，其含有衍生自与宿主相容的物种的复制位点和控制序列。用于大肠杆菌的合适载体为pBR322的衍生物，pBR322为根据Bolivar等, Gene, 2:95(1977)衍生自大肠杆菌物种的质粒。常见的原核生物控制序列(其在本文定义为包括转录、启动的启动子(任选地与操纵子一起)，以及核糖体结合位点序列)，包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等, Nature, 198:1056 (1977))、色氨酸启动子系统(Goeddel等,Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980))和λ衍生的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等, Nature, 292:128 (1981))。然而，可使用与原核生物相容的任何可用的启动子系统。优选的原核生物表达系统包括大肠杆菌及其表达载体。
真核生物可用于表达本公开的蛋白。真核生物通常由酵母和哺乳动物细胞代表。合适的酵母宿主细胞包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。合适的哺乳动物宿主细胞包括COS和CHO (中国仓鼠卵巢)细胞。
用于真核生物的表达载体包含衍生自适当的真核生物基因的启动子。用于酵母细胞表达载体的合适启动子包括用于合成糖酵解酶的启动子，包括用于酿酒酵母中3-磷酸甘油酸激酶基因的那些(Hitzman等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980))和巴斯德毕赤酵母中作为醇氧化酶基因用于甲醇代谢的那些(Stroman等, 美国专利第4,808,537和4,855,231号)。其他合适的启动子包括来自烯醇酶基因的那些(Holland, M. J.等, J. Biol.Chem., 256:1385 (1981))或从YEp13获得的Leu2基因(Broach, J.等, Gene, 8:121(1978))。
优选的酵母表达系统包括巴斯德毕赤酵母及其表达载体。
用于哺乳动物细胞表达载体的合适启动子包括来自SV40的早期和晚期启动子(Fiers等, Nature, 273:113 (1978))或者其他病毒启动子，比如衍生自多瘤、腺病毒II、牛乳头瘤病毒或禽肉瘤病毒的那些。合适的病毒和哺乳动物增强子也可掺入到这些表达载体中。
用于植物细胞表达载体的合适启动子包括Depicker, A.等, Mol. Appl. Gen.,1:561 (1978)中所述的胭脂碱合成启动子。
用于昆虫细胞表达载体的合适启动子包括Smith等人在美国专利第4,745,051号所述系统的修饰形式。表达载体包含杆状病毒(baculovirus)多角体蛋白启动子，在其控制下可放置编码蛋白的cDNA分子。
通过将本公开的表达载体引入其中来转化宿主细胞。使用适合于每种类型的细胞的标准技术进行转化。描述于Cohen, S.N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110(1972)中的使用氯化钙的钙处理，或者Maniatis等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第254页, Cold Spring Harbor Press (1982)中所述的RbC1方法用于原核生物或含有实质细胞壁屏障的其他细胞。酵母的转化如Van Solingen, P.等, J. Bacter.,130:946 (1977)和Hsiao, C.L.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)中所述进行。使用Graham和van der Eb, Virology, 52:546 (1978)的磷酸钙程序转化没有太多细胞壁的哺乳动物细胞。如Shaw, C.等, Gene, 23:315 (1983)中所述，通过用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染来转化植物细胞。用表达载体转化大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母的优选方法包括电穿孔。
转化的宿主细胞在生物学领域熟知的条件比如培养基的类型、温度、含氧量、流体运动等下进行培养，并且如本文所述进行纯化。
在一些实施方案中，肽从头合成。可使用多种肽合成方法。实例包括(但不限于)固相肽合成(SPPS), (R.B. Merrifield (1963). "Solid Phase Peptide Synthesis. I.The Synthesis of a Tetrapeptide". J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154;Mitchell, A.R.K., S.B.H.; Engelhard, M.; Merrifield, R.B. (1978). "A newsynthetic route to tert-butyloxycarbonylaminoacyl-4-(oxymethyl)phenylacetamidomethyl-resin, an improved support for solid-phase peptidesynthesis". J. Org. Chem. 43 (13): 2845-2852)。合成方法的最新发展进一步描述于Hojo, Curr Opin Struct Biol 2014, 26C, 16-23; Ramakers等, Chem Soc Rev 2014,43, 2743-2756和Chandrudu等, Molecules 2013, 18, 4373-4388中。
在SPPS中，用可基于其构建肽链的功能单元('接头')处理不可溶但多孔的小固体珠粒。肽将保持共价附接于珠粒，直至通过试剂比如无水氟化氢或三氟乙酸从其上切割下来。因此，肽“固定”于固相上并可在过滤过程期间保留下来，而液相试剂和合成的副产物被冲洗掉。
SPPS的一般原理为偶联-洗涤-脱保护-洗涤的重复循环之一。固相附接肽的游离N-末端胺与单个N-保护的氨基酸单元偶联(见下文)。然后将该单元脱保护，显示出新的N-末端胺，其上可附接其他的氨基酸。该技术的优越性部分地在于在每次反应之后进行洗涤循环，去除过量的试剂同时所有生长中的感兴趣的肽保持共价附接于不溶性树脂上的能力。
有两种主要使用的SPPS形式-Fmoc和Boc。与核糖体蛋白合成不同，固相肽合成以C-末端至N-末端方式进行。氨基酸单体的N-末端被这两个基团中的任何一个保护，并添加至脱保护的氨基酸链上。
B. 制剂
本公开的实施方案提供化妆品、药用和工业组合物和制剂。
在一些实施方案中，局部药用和化妆品组合物包括(但不限于)软膏剂、霜剂、洗剂、油剂、凝胶剂、唇膏、防晒霜、棒剂、喷雾剂、糊剂、摩丝和气雾剂。
包含本文所述的LITE-1和/或GUR-3多肽的局部组合物(例如化妆品或药用制剂)，可进一步包含本领域技术人员已知的其他局部可接受的成分，比如至少一种选自以下的成分：防腐剂、润肤剂、乳化剂、表面活性剂、保湿剂、胶凝剂、增稠剂、调理剂、成膜剂、稳定剂、抗氧化剂、调质剂、光泽剂、消光剂、增溶剂、颜料、染料和香料。
在一个实施方案中，本公开的化妆品组合物呈抗皱或抗衰老霜剂(特别是旨在施用于称为“衰老”的皮肤(例如来自实足年龄为40岁或更高的个体的皮肤))、用于敏感和/或刺激的皮肤的组合物、或者用于化妆面部、身体或嘴唇的皮肤的产品(比如粉底或唇膏)的形式。在一个有利的实施方案中，本公开的化妆品组合物为保护皮肤免受UV损伤的组合物，特别是防晒霜组合物。
本文所述的LITE-1或GUR-3多肽可用作化妆品或药用制剂中的唯一活性成分，或者与一种或多种活性成分组合使用。有利的局部化妆品或药用组合物可包含LITE-1和/或GUR-3多肽和一种或多种选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶和猕猴桃蛋白酶(actinidin)的蛋白酶。在一个示例性实施方案中，蛋白酶为稳定化蛋白酶，和更优选地，一种或多种蛋白酶可为通过交联比如US 2011-0177052 (Chavan)(通过参考结合至本文中)中所述的那些形成的稳定化蛋白酶。进一步有利的局部化妆品或药用组合物包含LITE-1和/或GUR-3多肽和一种或多种能够刺激、改善或者以其他方式调节皮肤中的蛋白酶体活性的另外的皮肤护理成分，比如(作为实例)描述于US 2009-0130139 (Mekideche)、美国专利第7,220,417号(Nizard等)和美国专利第7,919,468号(Reboud-Ravaux等)中所述的那些成分，所有这些文献通过参考结合至本文中。
另外的局部化妆品或药用组合物可包含一种或多种另外的海洋来源的局部皮肤护理成分，其具有类似的、另外的和/或互补的有益皮肤效果。作为实例，用于这种局部组合物的合适的另外的海洋来源的局部皮肤护理成分可包括US 2010-0047219 (Ceccoli等)、US2010-0316720 (Statz等)，US 2009-0142370 (Shih等)、美国专利第7,128,914号(Leclerc等)、美国专利第7,220,517号(Nizard等)中所述的那些成分(所有这些文献通过参考结合至本文中)以及皱波角叉菜(Chondrus crispus)提取物。
CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, 第二版(1992)描述了适合于局部使用并且可与LITE-1和/或GUR-3组合使用的各种化妆品和药用活性和非活性成分。这些类别成分的非限制性实例包括以下化合物：磨料、吸收剂、具有美学目的的化合物比如香料、颜料、染料、精油、收敛剂等(例如丁香油、薄荷醇油、樟脑油、桉树油、丁子香酚、乳酸薄荷酯、金缕梅蒸馏液)、抗痤疮剂(例如水杨酸或过氧化苯甲酰)、防絮凝剂、消泡剂、抗微生物剂(例如碘丙基丁基氨基甲酸酯)、抗氧化剂(例如抗坏血酸及其衍生物或茶提取物)、抗皱活性物质(例如类视黄醇或β-羟基酸)、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、溶胀剂、螯合剂、添加剂、杀生物剂、变性剂、增稠剂和维生素类及其衍生物或等同物、成膜材料、聚合物、遮光剂、pH调节剂、还原剂、脱色剂或光亮剂(例如氢醌、曲酸、抗坏血酸、桑椹提取物、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖胺)、调理剂(例如保湿剂)、抗炎剂(例如皮质类固醇)和防晒剂。
在一些实施方案中，组合物包含一种或多种通常由本领域的技术人员使用的生理学上合适的溶剂，比如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。
根据本公开的仍然另一个有利的实施方案，使本公开的LITE-1多肽溶解于化妆品或药用载体比如脂质体中，或吸附于粉末状有机聚合物、矿物支持体比如滑石和膨润土上，和更通常地溶解于任何生理学上合适的载体中或固定于其上。
在一些实施方案中，LITE-1和/或GUR-3多肽以约0.0005-500 ppm之间的浓度，和任选地以0.01-5 ppm之间的浓度存在于组合物中。
在一些实施方案中，本公开的组合物还含有至少一种另外的活性成分。可以非限制性方式引用以下类别的成分：
防晒剂，紫外线和红外线屏蔽剂，
抗自由基剂，
DHEA (脱氢表雄酮)，-维生素A，并且特别是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯，
维生素B3，并且特别是烟酰胺、生育酚的烟酸酯，
维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇，
维生素C，并且特别是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸酯镁和钠，
维生素E、F、H、K、PP和辅酶Q10，
金属蛋白酶抑制剂、TIMP的激活剂，
氨基酸，并且特别是精氨酸、鸟氨酸、羟基脯氨酸、羟基脯氨酸二棕榈酸酯、棕榈酰甘氨酸、羟基赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、N-酰基化氨基酸，
天然或合成肽，包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其亲脂性衍生物、异构体和与其他分子比如金属离子(即铜、锌、锰、镁等)的复合物，以商品名MATRIXYL®、ARGIRELINE®、COLLAXYL™、PEPTIDE VINCI 02™、CHRONOGEN™、LAMINIXYL IS™、PEPTIDE Q10™出售的肽，
通过水解或任何其他方法获得的肽植物提取物，比如大豆提取物、单粒小麦提取物、葡萄提取物、油菜籽提取物、亚麻籽提取物、稻米提取物、玉米提取物或豌豆提取物、角豆树提取物、豆类提取物、蚕豆提取物，
酵母提取物、卤虫(artemia salina)提取物，
脱氢乙酸(DHA)，
天然或合成植物甾醇，
α-和β-羟基酸、硅烷醇，
糖胺类，葡糖胺、D-葡糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺，
多酚类、异黄酮类、类黄酮类，比如葡萄提取物、松树提取物、橄榄提取物，
脂类比如神经酰胺或磷脂，
动物油类比如角鲨烯或角鲨烷，
植物油类，比如杏仁油、椰子油、蓖麻油、荷荷巴油、橄榄油、油菜籽油、花生油、葵花油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、大豆油、棉花油、苜蓿油、罂粟油、南瓜籽油、月见草油、小米油、大麦油、黑麦油、红花油、西番莲油、榛子油、棕榈油、杏仁油、鳄梨油、金盏花油、乙氧基化植物油或乳木果油，
所述以上化合物可为天然的(比如植物肽水解产物)或合成来源的(比如肽化合物)。
另外，可向组合物中加入添加剂比如溶剂、稀释剂、染料、防晒剂、自晒黑剂、颜料、填充剂、防腐剂、气味吸收剂、增稠剂、乳化剂、润湿剂、润肤剂、香料、抗氧化剂、成膜剂、螯合剂、掩蔽剂和调理剂。
本公开进一步提供包含本文所述的LITE-1多肽的工业组合物。在一些实施方案中，这种组合物可用于保护免受UVA和/或UVB光。在一些实施方案中，LITE-1多肽包埋在膜或涂层中(例如用于镜片比如太阳镜或眼镜、窗户、车窗等上)。
II.使用方法
在一些实施方案中，本文所述的组合物可用于保护免受UVA和/或UVB光。在一些实施方案中，局部制剂可用于保护皮肤免受损伤性UV光。例如，在一些实施方案中，受试者在常规(例如每天一次或每天多次)的基础上将这种制剂施用于皮肤以防止皮肤损伤。在一些实施方案中，受试者在日晒之前和/或期间将包含LITE-1的组合物施用于皮肤。
在一些实施方案中，将LITE-1和/或GUR-3多肽或者包含LITE-1和/或GUR-3多肽的膜或涂层掺入到镜片(例如眼镜、太阳镜或隐形眼镜)中以保护眼睛免受日晒。在一些实施方案中，将LITE-1和/或GUR-3多肽、包含LITE-1和/或GUR-3多肽的膜或涂层掺入到窗户、汽车挡风玻璃或其他结构元件中以保护免受日晒。
实验
提供以下实施例以便表明和进一步说明本公开的某些优选实施方案和方面，而不应理解为限制其范围。
实施例I.
该实施例证实LITE-1采取与常规7-TM受体相反的膜拓扑结构。
作为第一步，考虑LITE-1是否与任何已知的光受体相关。预计LITE-1含有7-TM结构域(图1A)。后生动物中唯一已知的7-TM光受体为视蛋白，但LITE-1与视蛋白在序列水平上没有显著的同源性(Edwards等, 2008, 同上; Liu等, 2010, 同上)。由于昆虫OR (嗅觉受体)和GR (味觉受体)成员两者显示出具有与常规7-TM受体相反的膜拓扑结构(Benton等, PLoS Biol 4, e20 2006; Zhang等, PloS one 6, e24111 2011)，因此质疑LITE-1和视蛋白是否在膜拓扑结构水平上甚至是相关的。为了探测LITE-1的膜拓扑结构，针对LITE-1的N-和C-末端产生抗体(图1A)。用这些抗体进行的免疫染色未显示出蠕虫组织中一致的LITE-1表达，表明LITE-1在体内以非常低的水平表达。因此，产生使用肌肉特异性启动子在肌细胞中表达LITE-1的转基因动物，因为LITE-1可在这些细胞中以更高水平功能性表达，尽管重组LITE-1仍有可能无法完全保留天然蛋白的所有功能特性(Edwards等, 2008, 同上; Liu等, 2010, 同上)。结果发现，LITE-1抗体可检测原代培养的肌细胞中的LITE蛋白(图1B)。令人惊讶的是，LITE-1的C-末端似乎是在细胞外，因为针对LITE-1的C-末端的抗体在非透化条件下细胞外应用时可检测到LITE-1 (图1B)。这种染色对LITE-1具有特异性，因为在对照肌细胞中未观察到信号(图2)。相比之下，相同的方案未能用针对其N-末端的抗体检测到LITE-1，尽管如在透化条件下所示，在这些细胞中清楚地表达蛋白(图1B)。为了提供另外的证据，使Myc标签与LITE-1的N-末端融合并获得相同的结果(图1B)。这表明LITE-1的N-末端在细胞内。
为了收集进一步的证据，使用BiFC (双分子荧光互补)方法(Hu等, Mol Cell 9,789-798 2002)。在这种方法中，YFP的N-和C-末端片段与亮氨酸拉链结构域融合，分别产生N-YFP::ZIP和C-YFP::ZIP (图1C)。拉链结构域然后将两个YFP片段组合在一起以重建荧光YFP蛋白(图1C)。使N-YFP::ZIP附接于LITE-1的N-末端，并且发现这种N-YFP::ZIP::LITE-1融合物与C-YFP::ZIP互补以在从动物急性切除的活肌细胞中重建YFP荧光，但不与缺乏拉链结构域的C-YFP:ΔZIP互补(图1C)。该观察结果进一步证实LITE-1的N-末端位于细胞内。结论是与视蛋白相比较，LITE-1采取反向膜拓扑结构。因此，LITE-1似乎在序列或结构水平上与任何已知光受体不密切相关。
实施例II.
该实施例证实LITE-1蛋白从蠕虫溶解产物中的纯化。
进行了实施例，其询问这个问题-LITE-1是光受体吗与已知的光受体缺乏明显的相似性并不一定使LITE-1不适合作为光受体。为了解决这个问题，一种简单但明确的方法为检查纯化的LITE-1蛋白是否可通过分光光度法捕获光子(Wang和Montell, 2007, 同上; Yau和Hardie, 2009, 同上)。通过这种方法证实了所有已知的光受体(图3C)。为此，搜索以下表达系统，所述表达系统会允许我们纯化足够量的LITE-1蛋白用于分光光度分析。因此，肌细胞受到关注，因为其构成主要量的蠕虫组织，并已成功地用作异源系统以功能性表达受体和通道(Salom等, FASEB J 26, 492-502 2012; Wang等, Neuron 75, 838-8502012)。重要的是，已显示出LITE-1可在肌肉中功能性表达，因为其表达可赋予这些否则对光不敏感的细胞光敏性(Edwards等, 2008, 同上; Liu等, 2010, 同上)，尽管尚不清楚这种光敏性是否由光或光产生的化学物质引起的。确实，如先前所报道的那样(Edwards等,2008, 同上; Liu等, 2010, 同上)，UV光可诱导异位表达LITE-1的体壁肌肉的收缩，导致身体麻痹(图4A，图5)。为了提供更直接和定量的证据，使用遗传编码的钙传感器RCaMP通过钙成像记录肌细胞对UV光的反应。结果发现UV照射在异位表达LITE-1的肌细胞中诱导稳健的钙瞬变，但在对照肌细胞中则不然(图4B-D)。这些实验表明LITE-1在肌细胞中功能性表达。它们还表明LITE-1确实可赋予对光不敏感的细胞光敏性，证实其可潜在地用作光遗传工具。
由于LITE-1抗体不适合用于亲和纯化，因此测试了许多针对小亲和标签比如Myc、FLAG和1D4的单克隆抗体，并且发现1D4抗体最有效地起作用。使用这种抗体能够将LITE-1(膜蛋白)亲和纯化成均质，如通过SDS-PAGE和后接的考马斯染色(图4E)和通过Western印迹(图4F)所测定的。该结果也通过银染色证实。
实施例III.
该实施例证实纯化的LITE-1蛋白吸收光子。
通过使纯化的LITE-1蛋白经受分光光度分析，发现其呈现出强烈的UV光吸收，在280 nm和320 nm处有两个吸光度峰(图4G)。因此，LITE-1可捕获UVB和UVA光两者(UVB的WHO定义：280-315 nm；UVA的WHO定义：315-400 nm)。作为比较，在相同浓度(0.4 μM)下，BSA没有显示出这种吸收(图4G)。另外，细菌视紫红质(bRho)为从Sigma公司获得的商品，在其特征峰568 nm处呈现出最小吸收(图4H)。只有在10x浓度(4 μM)下才能检测到细菌视紫红质(bRho)的适度光吸收，这仍然比在LITE-1发现的要弱得多(图4H)。应当注意的是，尽管bRho与LITE-1相比较呈现出较弱的光吸收，但其消光系数(图4H中的62,000相对于图4I中的63,000)以及其光谱特性两者均与文献中报道的一致(图4H-I)，表明bRho样品的质量为可靠的。LITE-1的两个吸光度峰的消光系数> 106 M-1cm-1，为所有已知光受体的10-100倍(图4I)。因此，LITE-1在捕获光子方面具有高效率。
为了进行更直接的比较，纯化的牛视紫红质(Rho)在蠕虫肌肉中异位表达(Salom等, 2012, 同上)，并且在相同条件下与LITE-1并行进行(图6A-B)。与LITE-1相比较，纯化的牛视紫红质(Rho)在其特征峰处也显示出弱得多的光吸收(图6C-D)，提供了证实LITE-1在捕获光子方面高度有效的另外证据。牛视紫红质(Rho)的相对弱的光吸收不是因为纯化的Rho样品质量低，因为纯化的Rho的消光系数实际上与文献中报道的非常相似(图6D相对于图4I)。另外，纯化的Rho的特征吸光度峰为500 nm，这与文献中公开的相同(图6D相对于图2I)。这组对照实验也确认了实验系统，其包括蛋白表达、纯化、浓度测定和光谱分析。
在另一个对照实验中，纯化的哺乳动物腺苷A2A受体(A2AR)在蠕虫肌肉中异位表达(Salom等, 2012, 同上) (图6A-B)。与LITE-1和视蛋白一样，A2AR也为7-TM受体，但预计不会是光敏性的。确实，发现如所预测的那样，当纯化并且与LITE-1和牛Rho并行测试时该受体不吸收光(图6C)。因此，多个对照实验支持LITE-1吸收光子并且以高效率吸收光子。LITE-1的这种特性连同其产生各种光诱导的功能性输出的能力[例如光诱导的肌肉收缩和钙瞬变以及回避行为(图4A-D，图5)，表明LITE-1为光受体。LITE-1也是唯一对UVA和UVB光两者均显示出强吸收的光受体。
实施例IV.
该实施例证实LITE-1对于光吸收严格依赖于其构象。
接下来的实验试图表征LITE-1的光吸收。光受体通常由两部分组成：宿主蛋白和非朊基发色团(Falciatore和Bowler, Curr Top Dev Biol 68, 317-350 2005; Wang和Montell, 2007, 同上; Yau和Hardie, 2009, 同上)。光受体的光谱特性无疑受宿主蛋白的影响。然而，光受体吸收光的绝对能力不依赖于宿主蛋白，因为光吸收是由发色团(例如视黄醛、黄素、胆汁三烯和对香豆酸)介导的(Falciatore和Bowler, 2005, 同上; Marti等, J Biol Chem 266, 18674-18683 1991; Radding和Wald, J Gen Physiol 39, 909-922 1956)。因此，使光受体变性通常将其吸光度峰移至不同的波长，但不会消除它们，因为它们是由相关的发色团介导的(Dutta等, Biochemistry 49, 6329-6340 2010; Hagins,J Biol Chem 248, 3298-3304 1973; Hubbard, Nature 221, 432-435 1969; Maglova等, Biochimica Et Biophysica Acta 975, 271-276 1989)。令人惊讶的是，对于LITE-1，情况似乎并非如此。用尿素使LITE-1变性完全消除了LITE-1的光吸收，消除280和320 nm两个峰(图3A)。作为比较，相同的尿素处理未能消除细菌视紫红质(bRho)的光吸收，而是将其吸光度峰从568 nm移至370 nm (图3B)，其后者为游离视黄醛(bRho的发色团)的特征峰(Sperling和Rafferty, 1969)。用纯化的牛视紫红质(Rho)观察到类似的现象(图3E-F)。值得注意的是，变性的bRho的280 nm峰保持不变(图3B)，这与该峰由bRho蛋白的色氨酸残基的固有光吸收介导的概念一致。该峰在图3A中的变性LITE-1没有那么明显，因为所用LITE-1的浓度为bRho的1/10。LITE-1也用其他变性剂比如NaOH进行处理，并观察到类似的现象(图3C-D)。这些观察结果表明，与典型的光受体不同，LITE-1对于光吸收严格依赖于其构象。
实验还测试了H2O2。有趣的是，H2O2处理完全消除了LITE-1的光吸收(图7A)。作为氧化剂，H2O2可损伤蛋白、脂类和核酸的功能(Fridovich, Med Princ Pract 22, 131-1372013)。LITE-1的氧化可能影响其光吸收所需要的LITE-1的构象。类似地，H2O2处理还通过将其吸光度峰从568 nm移至370 nm来破坏bRho的光谱指纹(图7B)。因此，H2O2似乎在体外抑制LITE-1和bRho两者的光吸收。
实施例V.
该实施例证实遗传筛查鉴定对LITE-1功能至关重要的残基。
为了更好地理解LITE-1光吸收，实验试图鉴定对LITE-1功能至关重要的残基。在针对UV光诱导的回避行为缺陷的突变动物的遗传筛查中，分离了几个lite-1突变等位基因(Liu等, 2010, 同上)。假设跨膜结构域中的突变更可能影响LITE-1的光吸收而不是其与下游信号传导分子的偶联。因此，两个突变体lite-1(xu8)和lite-1(xu10)引起注意，因为突变的残基(分别为A332V和S226F)位于推定的跨膜结构域中(图8I)。目的是纯化LITE-1蛋白的这些突变形式，然后在体外表征其光吸收。实验首先在体内测试了其作用，并且发现如所预期的那样，A332V和S226F突变在体内破坏LITE-1功能。具体地讲，在行为测定中，异位表达携带任一突变的LITE-1的蠕虫对UVA光不再敏感(图9A和10A)。另外，这两个点突变几乎消除了异位表达LITE-1的肌细胞中UVA光诱发的钙瞬变(图9B-E)。实验成功地将LITE-1A332V和LITE-1S226F蛋白纯化成均质(图9F-G)。LITE-1A332V和LITE-1S226F显示出与野生型LITE-1不同的吸收光谱：其两者均失去320 nm峰但在280 nm处保持正常吸收(图11A-B)。因此，这两个突变破坏了LITE-1对UVA而非UVB光的吸收。这与以下事实一致：遗传筛查针对分离对UVA而非UVB光的反应有缺陷的突变体，因为用于诱发和测定趋光性行为的显微镜的光学系统不传输UVB光(Liu等, 2010)。
鉴于LITE-1A332V和LITE-1S226F蛋白在体外保持正常的UVB光吸收，可以预测LITE-1的这两种突变形式在体内应保持对UVB光的敏感性。为了测试这个想法，建立了光路，通过该光路将UV光直接导向蠕虫。确实，尽管表达LITE-1的这两种突变形式的转基因蠕虫对UVA光不敏感(图9A和10A)，然而其对UVB光敏感(图11C和10B)。另外，与野生型LITE-1的情况一样，UVB光还在异位表达LITE-1的这两种突变形式的肌细胞中诱导稳健的钙瞬变(图11D-H)。这些结果与来自光谱分析的数据一致(图11A-B)。因此，似乎可以分离LITE-1对UVA和UVB光的吸收，并且还提供证实LITE-1光吸收特异性的进一步证据。
实施例VI.
该实施例证实，UVB而非UVA光的LITE-1吸收显示出对光漂白的抗性。
延长的光照漂白光受体(Wang和Montell, 2007, 同上; Yau和Hardie, 2009, 同上)。实验测试了LITE-1的这种特性，并且发现预先暴露于UV光可通过消除其320 nm峰而易于漂白LITE-1吸收UVA光的能力(图11I)。令人惊讶的是，这种处理保留了280 nm峰(图11I)，表明LITE-1捕获UVB光的能力更稳定并且对光漂白具有相对抗性。该实验揭示出区分LITE-1对UVA和UVB光的吸收的另外特征。
实施例VII.
该实施例证实LITE-1功能需要两个色氨酸残基。
成功鉴定对LITE-1吸收UVA光至关重要的残基鼓励探索可能构成其吸收UVB光的基础。色氨酸残基显示出UVB光的固有吸收，在280 nm处达到峰值。还已知色氨酸的光吸收非常耐光漂白(Wu等, 2008, 同上)。这两个特征一起导致了质疑LITE-1中的色氨酸残基是否在介导其UVB光的吸收中发挥作用的实验。LITE-1中发现了6个色氨酸残基(图8I)。然而，如果这些色氨酸残基中的任何一个对LITE-1功能都重要，那么预计它们不会被遗传筛查所检出，因为筛查中使用的诱变剂(EMS)一般地会将色氨酸残基突变为终止密码子而不是产生错义突变。
因此，为了测试以上假设，进行了实验，其通过定点诱变将6个色氨酸残基中的每一个突变为丙氨酸，并表达LITE-1的相应突变形式作为肌细胞中的转基因。实验首先在体内检查了其功能。当突变为丙氨酸时，两个色氨酸残基W77和W328在行为测定中消除了LITE-1在体内对UVA光的敏感性(图12A和13A)，而突变其他4个色氨酸残基没有引起显著影响(图12A)。当将W77和W328突变为F (苯丙氨酸)时，实验获得了类似的结果(图12A)。此外，两种色氨酸突变W77F和W328F几乎消除了异位表达LITE-1的肌细胞中UVA光诱导的钙瞬变(图12C-F)。这些数据证实了W77和W328在LITE-1体内功能方面的关键作用。
最后，实验将LITE-1的两种突变形式LITE-1W77F和LITE-1W328F纯化成均质(图9F-G)，并在体外检查其光吸收。引人注目的是，W77F和W328F突变不仅消除了LITE-1在320 nm处对UVA光的吸收，而且还几乎消除了其在280 nm处对UVB光的吸收(图12K-L)。与该光谱数据一致，发现这两种色氨酸突变在行为测定中消除了LITE-1在体内对UVB光的敏感性(图12B和13B)。另外，UVB光在异位表达LITE-1的这两种突变形式的肌细胞中引起很少(如果有的话)钙瞬变(图12G-J)。残留的反应来自其他色氨酸残基。因此，两个色氨酸残基W77和W328对LITE-1体内和体外功能两者至关重要。这些实验鉴定了LITE-1体内和体外功能所需的关键分子决定簇。
实施例VIII.
该实施例证实光受体的基因工程。
为了提供支持这两个色氨酸残基在介导光吸收中的关键作用的进一步证据，想知道将这种色氨酸残基引入到另一种蛋白质中是否会促进光吸收。另一方面，单独的色氨酸残基不能增强LITE-1的高光吸收能力，并且必须涉及LITE-1的其他部分，其可用作支持这两个色氨酸残基捕获光子的功能的“骨架”。因此推断，与LITE-1相关的那些蛋白(比如其他GR基因)可能具有这样的骨架结构，并从而具有更高的可能性被改造成光受体。秀丽隐杆线虫GR家族含有5个成员。除LITE-1外，没有其他GR基因在相应的位置具有两个色氨酸残基(图14A)。注意到尽管GUR-3在序列水平上与LITE-1不那么相似(与LITE-1具有40%的序列同一性)，但其在适当的位置具有一个色氨酸残基，其对应于LITE-1中的W328 (图14A)。考虑GUR-3起化学受体的作用(Bhatla和Horvitz, Neuron 85, 804-818 2015)。正如预期的那样，GUR-3在肌细胞中的异位表达在行为测定中没有促进其对UV光的敏感性(图8A、14B和14F-G)，表明GUR-3不是光敏的。确实，钙成像显示出UV光在异位表达GUR-3的肌细胞中诱发很少(如果有的话)的钙反应(图8B-D和14C-E)。然后实验将GUR-3中的残基Y79突变为W(GUR-3Y79W)，其对应于LITE-1中的W77 (图14A)。引人注目的是，异位表达带有色氨酸的GUR-3Y79W的蠕虫然后变得对UVB光敏感(图8A和14G)。UVA光对这些蠕虫无效(图14B-F)。该结果是预期的，因为LITE-1的UVA吸收需要另外的关键元件，比如残基A226和S332以及可能的其他元件(图9A-E)。实验还检查了肌细胞中UVB光诱发的钙瞬变，并且发现带有色氨酸的GUR-3Y79W的异位表达极大地增强了这些细胞中UVB光诱导的钙反应(图8B-D)。因此，将色氨酸残基引入到GUR-3促进光敏性。
已经在体内表征了GUR-3Y79W和GUR-3的光敏性，然后实验将两种蛋白纯化成均质(图8E-F)，并在体外检查其光吸收(图8G-H)。正如预期的那样，GUR-3显示出很少(如果有的话) UVB光吸收(图8H)。相比之下，在GUR-3Y79W观察到280 nm处UVB光的强吸收(图8G)。这种带有色氨酸的GUR-3Y79W蛋白的消光系数达到106 M-1cm-1 (1.1x106 M-1cm-1)的水平，约为对LITE-1发现的水平的三分之一。该数据为观察到的GUR-3Y79W的光敏性提供了生化基础。
实施例IX.
该实施例描述实施例I-VIII的材料和方法。
实验模型和对象细节
将秀丽隐杆线虫品系在20℃下维持在接种有OP50细菌的线虫生长培养基(NGM)板上。液体培养用于产生大量用于蛋白纯化的蠕虫。通过将质粒DNA直接注入到雌雄同体性腺中产生转基因系。在用于蛋白纯化之前，整合的转基因品系至少6次异型杂交。
免疫荧光
使用标准方案对原代培养的细胞进行免疫染色(Christensen等, Neuron 33, 503-514 2002)。肌细胞共表达LITE-1和GFP或者单独表达GFP作为由肌肉特异性启动子myo-3驱动的转基因。使妊娠的雌雄同体溶解以释放出卵，并通过几丁质酶处理和研磨使胚胎解离，通过5 μm膜过滤，铺板在涂有花生凝集素的盖玻片上，并在20℃下于含有10%血清(340-345mOsm)的L15中进行培养。为了进行非透化表面染色，活细胞首先用PBS中的3% BSA和5%正常山羊血清(NGS)阻断30分钟，并然后在室温下于PBS (1.5% BSA)中与一抗(1 μg/ml)一起温育1小时。用PBS洗涤3次后，细胞用PBS中的1.5%多聚甲醛(PFA)固定10分钟，随后用PBS洗涤3次，并以二抗(1:2000, Cy3缀合的)温育1小时。用PBS洗涤5次后，安装盖玻片用于成像分析。为了进行透化染色，细胞首先在室温下用PBS中的1.5% PFA固定10分钟，用PBS冲洗3次，并用PBS中的0.5% Trition X-100透化5分钟。用PBS洗涤3次之后，细胞用BSA和NGS阻断，与一抗一起温育并洗涤5次。与二抗一起温育1小时后，在安装之前将盖玻片冲洗5次。N-和C-末端肽(15个残基)用于免疫兔子以产生LITE-1抗体，其在用于染色之前进行亲和纯化(YenZym Antibodies)。
蛋白纯化和分光光度分析
蠕虫在黑暗中进行培养。它们首先在NGM板上培养，然后转移至10升S培养基中使用发酵罐(New Brunswick, 20℃, 50%溶解氧, 300 rpm搅动, pH7.2)在来自浓缩HB101细菌的支持下进行液体培养。在发酵罐中2代(约7-8天)之后，收获蠕虫并悬浮于80 ml补充有蛋白酶抑制剂混合物(Complete Mini, 不含EDTA)的25 mM双-trsi-丙烷BTP缓冲液(pH7.2)中。所有纯化步骤均在黑暗中进行。使用微流化器(Microfluidics Inc.)来打破蠕虫(120psi, 5个循环)。通过在4℃下以1,000 g低速离心10分钟除去碎片之后，收集上清液并再次在4℃下高速(100,000 g)离心1小时以沉淀细胞膜，其用在含有500 mM NaCl的BTP缓冲液(pH7.2)中的20 mM正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷(DDM; Affymentrix)溶解。通过以40,000 g离心30分钟去除未溶解的物质后，将提取物上样至α1D4亲和柱上。注意：1D4标签附着于表达为蠕虫肌肉中的转基因的LITE-1和GUR-3的C-末端，如针对A2A受体所述(Salom等,2012, 同上)。牛视紫红质(Rho)在其C-末端具有该标签序列。用洗涤缓冲液(10 mM DDM在25 mM BTP缓冲液[pH7.2]和500 mM NaCl中)洗涤之后，用在该缓冲液中稀释的1.5 mg/ml1D4肽洗脱LITE-1。将纯化的LITE-1上样至分子大小分离柱(GE healthcare Bio-Sciences)上以去除1D4肽，之后进行分光光度分析。当纯化牛视紫红质(Rho)时，2 mM 9-顺式-视黄醛用于重悬浮沉淀的细胞膜，并在用DDM溶解之前温育30分钟。当纯化LITE-1、GUR-3或A2A受体时，不进行该处理。用于SDS-PAGE的纯化的蛋白样品在室温(不加热)下于非还原条件下制备以避免聚集。
首先通过Bradford测定法(Bio-Rad Inc.)测定纯化的蛋白质的浓度，然后使用视紫红质作为标准品通过SDS-PAGE和后接的考马斯染色进行证实。还使用视紫红质作为标准品，在SDS-PAGE后通过银染色独立地证实浓度数据。
在石英比色皿中于UV-Vis分光光度计(Varian Cary 50)上进行分光光度分析。样品和参比空白均以相同的洗涤缓冲液稀释。注意：在分光光度分析之前从样品中去除1D4肽(参见上文)。对于涉及用变性剂或H2O2处理的那些实验，在分光光度分析之前，将LITE-1与这些试剂一起在室温下温育5分钟。所有测定均在黑暗中进行。
行为、钙成像和分子生物学
在耦合来自Kramer Scientifics的M2Bio镜片系统的Zeiss荧光解剖镜(ZeissDiscovery)下，对于NGM板上培养的第1天妊娠的成体雌雄同体进行身体麻痹测定。使用与用于测定趋光性行为的方案(Liu等, 2010, 同上; Ward等, 2008, 同上)类似的方案，在没有OP50的NGM板上进行测定。UVA光脉冲(350±20 nm, 0.8 mW/mm2, 最长20 sec)通过10x镜片组合2.5x变焦从Arc灯(X-Cite 120)递送至蠕虫。为了递送UVB光，将280±10 nm激发滤色镜(来自Semrock, 0.03 mW/mm2)连接于灯的液体光导的末端，然后使用显微操纵器使其直接指向蠕虫。手动移动盘子以保持蠕虫在视野中。在另一项测定中，通过使用Wormlab系统(MBF Bioscience)监测运动速度随着时间推移的降低来量化身体麻痹。使用如上所述的液体光导将UVA和UVB光导向蠕虫。为了使内源性lite-1基因对UV光下的运动速度的影响最小化(Liu等, 2010, 同上)，对于所有基因型，在lite-1(xu7)突变体背景下进行该测定。除非另外指明，否则在每个实验中测定总计20-50只动物的每种基因型。在运行功率分析之后，发现每个测定的样本大小足够(P>0.8)。每只蠕虫进行5次测定，并且一旦蠕虫麻痹，即停止测定以使其恢复以进行下一轮测试。
如前所述，在倒置显微镜(Olympus IX73)上于60x镜片下进行肌细胞的钙成像(Li等, Cell 159, 751-765 2014; Xiao等, Cell 152, 806-817 2013)。使用myo-3启动子将RCaMP表达为肌细胞中的转基因。YFP也在相同启动子下表达为转基因以使得能够按比率成像。将蠕虫粘在琼脂糖垫上并浸泡在溶液(10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM KCl, 145 mMNaCl,1.2 mM MgCl2, 2.5 mM CaC12, 和10 mM葡萄糖)中。UV光(UVA: 340±20 nm, 0.7mW/mm2; UVB: 280±10 nm, 0.02 mW/mm2; 5 sec)通过安装于显微操纵器上的液体光导直接投射至蠕虫上。用Roper CoolSnap CCD相机获取图像并用MetaFluor软件(MolecularDevices)进行处理。为了使内源性光敏系统的贡献最小化，所有基因型(包括WT)在该背景下携带lite-1(xu7)突变(Liu等, 2010)。量化RCaMP/YFP荧光比率的峰值百分比变化。
所有LITE-1和GUR-3构建体在C-末端携带1D4标签，除了图1以外，其中LITE-1中不包含这样的标签。Myc标签仅包含在图1B中使用的构建体中。许多质粒含有SL2::YFP片段，其指导YFP表达为肌细胞中的共表达标志物。SL2在哺乳动物表达载体中发挥类似于IRES所起的作用。
量化和统计分析
在每个图的图例中表明量化和统计参数，包括误差棒(SEM)、n数目和p值。对于涉及多组比较的那些，应用ANOVA，随后进行事后检验。p值<0.05被认为是显著的。
通过参考的结合
本文提及的每篇专利文件和科学论文的全部公开通过参考结合用于所有目的。
等同物
本公开可以其他特定形式实施而不背离其精神或基本特征。因此，前述实施方案在所有方面均被认为是说明性的，而不是限制本文所述的公开。因此，本公开的范围由所附权利要求而不是由前述的描述指明，并且在权利要求的等同物的含义和范围内的所有变化均旨在包含在其中。

Claims (27)

1.一种组合物，所述组合物包含：
a) LITE-1多肽或其部分；和b) 至少一种载体。
2.权利要求1的组合物，其中所述LITE-1为野生型秀丽隐杆线虫LITE-1。
3. 权利要求1或2的组合物，其中所述LITE-1选自SEQ ID NO:1和与SEQ ID NO:1有至少90%同一性的序列。
4. 权利要求1或2的组合物，其中所述LITE-1选自SEQ ID NO:1和与SEQ ID NO:1有至少95%同一性的序列。
5. 权利要求1或2的组合物，其中所述LITE-1选自SEQ ID NO:1和与SEQ ID NO:1有至少99%同一性的序列。
6.权利要求1-5中任何一项的组合物，其中所述LITE-1多肽从秀丽隐杆线虫分离。
7.权利要求1-5中任何一项的组合物，其中所述LITE-1多肽为重组的。
8.权利要求1-7中任何一项的组合物，其中所述LITE-1多肽包含一个或多个突变。
9.权利要求8的组合物，其中所述突变不为W77或W328。
10.一种组合物，所述组合物包含：
a) GUR-3多肽或其部分；和b) 至少一种载体。
11. 权利要求10的组合物，其中所述GUR-3选自SEQ ID NO:2和与SEQ ID NO:2有至少90%同一性的序列。
12. 权利要求10的组合物，其中所述GUR-3选自SEQ ID NO:2和与SEQ ID NO:2有至少95%同一性的序列。
13. 权利要求10的组合物，其中所述GUR-3选自SEQ ID NO:2和与SEQ ID NO:2有至少99%同一性的序列。
14.权利要求10-13中任何一项的组合物，其中所述GUR-3多肽为重组的。
15.权利要求10-14中任何一项的组合物，其中所述GUR-3多肽包含一个或多个突变。
16.权利要求15的组合物，其中所述突变包括Y79W。
17.权利要求10-16中任何一项的组合物，其中所述GUR-3多肽吸收UVA和/或UVB光。
18.权利要求10-17中任何一项的组合物，其中所述载体为药学上可接受的载体。
19.权利要求10-18中任何一项的组合物，其中所述载体包括一种或多种选自防腐剂、润肤剂、乳化剂、表面活性剂、保湿剂、胶凝剂、增稠剂、调理剂、成膜剂、稳定剂、抗氧化剂、调质剂、光泽剂、消光剂、增溶剂、颜料、染料和香料的载体。
20.权利要求1-19中任何一项的组合物，其中所述组合物选自药用组合物、化妆品组合物、防晒霜、保湿剂、凝胶剂、软膏剂、棒剂、霜剂和洗剂。
21.权利要求1-20中任何一项的组合物，其中所述组合物配制成用于局部给予。
22.权利要求1-21中任何一项的组合物，其中所述组合物配制成用于工业用途。
23.权利要求22的组合物，其中所述组合物选自膜和涂层。
24.权利要求22或23的组合物，其中所述载体为聚合物或塑料。
25.一种包含权利要求22-24中任何一项的组合物的镜片、窗户或结构元件。
26.一种保护皮肤免受UVA和/或UVB光的方法，所述方法包括：使受试者的皮肤与权利要求1-25中任何一项的组合物接触。
27.权利要求1-25中任何一项的组合物保护皮肤免受UVA和/或UVB光的用途。
CN201780083265.4A 2016-11-14 2017-11-13 用于阻挡紫外线辐射的组合物和方法 Pending CN110312506A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662421672P 2016-11-14 2016-11-14
US62/421672 2016-11-14
PCT/US2017/061305 WO2018089893A1 (en) 2016-11-14 2017-11-13 Compositions and methods for blocking ultraviolet radiation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110312506A true CN110312506A (zh) 2019-10-08

Family

ID=62109738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780083265.4A Pending CN110312506A (zh) 2016-11-14 2017-11-13 用于阻挡紫外线辐射的组合物和方法

Country Status (3)

Country Link
US (3) US10864153B2 (zh)
CN (1) CN110312506A (zh)
WO (1) WO2018089893A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110312506A (zh) 2016-11-14 2019-10-08 密歇根大学董事会 用于阻挡紫外线辐射的组合物和方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1649968A (zh) * 2002-03-28 2005-08-03 科学和工业研究委员会 一种得自海洋无脊椎动物的天然无毒多色荧光蛋白染料和含有所述染料的组合物及其应用
CN102395679A (zh) * 2009-03-06 2012-03-28 阿森尼克斯公司 控制植物害虫的方法和组合物
CN102791864A (zh) * 2010-03-01 2012-11-21 米托米克斯公司 Uv相关联的mtrna融合转录体及其方法和用途
CN109072255A (zh) * 2016-04-08 2018-12-21 克里斯托生物技术股份有限公司 用于治疗皮肤的伤口、病症和疾病的组合物和方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010151880A2 (en) * 2009-06-26 2010-12-29 The Salk Institute For Biological Studies Increasing lifespan by modulating crtc expression or localization, and methods of screening for modulators of same
US9364414B2 (en) * 2011-02-01 2016-06-14 Isp Investments Inc. Method to protect skin from ultraviolet radiation using novel peptides involved in the improvement of microparasol organization in keratinocytes
CN110312506A (zh) 2016-11-14 2019-10-08 密歇根大学董事会 用于阻挡紫外线辐射的组合物和方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1649968A (zh) * 2002-03-28 2005-08-03 科学和工业研究委员会 一种得自海洋无脊椎动物的天然无毒多色荧光蛋白染料和含有所述染料的组合物及其应用
CN102395679A (zh) * 2009-03-06 2012-03-28 阿森尼克斯公司 控制植物害虫的方法和组合物
CN102791864A (zh) * 2010-03-01 2012-11-21 米托米克斯公司 Uv相关联的mtrna融合转录体及其方法和用途
CN109072255A (zh) * 2016-04-08 2018-12-21 克里斯托生物技术股份有限公司 用于治疗皮肤的伤口、病症和疾病的组合物和方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHATLA N等: "《Light and hydrogen peroxide inhibit C. elegans feeding through gustatory receptor orthologs and pharyngeal neurons》", 《NEURON》 *
EDWARDS S L等: "《A Novel Molecular Solution for Ultraviolet Light Detection in Caenorhabditis elegans》", 《PLOS BIOL》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US11744790B2 (en) 2023-09-05
US10864153B2 (en) 2020-12-15
US20190336430A1 (en) 2019-11-07
US20230255874A1 (en) 2023-08-17
US20210169767A1 (en) 2021-06-10
WO2018089893A1 (en) 2018-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Montserret et al. Involvement of electrostatic interactions in the mechanism of peptide folding induced by sodium dodecyl sulfate binding
CN104968360B (zh) 用于治疗和/或护理皮肤、毛发和/或粘膜的化合物以及它们的化妆美容或药物组合物
Derossi et al. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.
JP2015514721A (ja) ニューロンの開口分泌を阻害する化合物（ｉｉｉ）
US10676513B2 (en) Modification and compositions of human secretoglobin proteins
CN104321049B (zh) 抑制神经元胞吐的化合物
Silva et al. Angiotensin II-derived constrained peptides with antiplasmodial activity and suppressed vasoconstriction
JP2024015429A (ja) 皮膚、毛髪、爪および／または粘膜の処置および／またはケアに有用な化合物
KR101968873B1 (ko) 세포 침투 효과가 우수한 보툴리늄 유래 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물
Wang et al. Rhodamine B-conjugated encrypted vipericidin nonapeptide is a potent toxin to zebrafish and associated with in vitro cytotoxicity
US20230255874A1 (en) Compositions and methods for blocking ultraviolet radiation
CN105849123A (zh) 蛋白酶抗性肽
Marcelo Der Torossian et al. Highly potential antiplasmodial restricted peptides
Tisseyre et al. Cell penetration properties of a highly efficient mini maurocalcine Peptide
Miloslavina et al. An unusual peptide from Conus villepinii: synthesis, solution structure, and cardioactivity
Der Torossian Torres et al. The importance of ring size and position for the antiplasmodial activity of angiotensin II restricted analogs
Silva et al. New linear antiplasmodial peptides related to angiotensin II
Hayashi et al. A novel fluorescent protein purified from eel muscle
Koroev et al. A synthetic fragment of the receptor for glycation end products and its analogue improve memory in transgenic Alzheimer’s disease mouse model
Apland et al. Inhibition of neurotransmitter release by peptides that mimic the N-terminal domain of SNAP-25
CN102428095A (zh) 新型蛋白酶体激活性抗衰老肽及含有所述肽的组合物
ES2404053T3 (es) Composición cosmética y/o farmacéutica que comprende un principio activo capaz de activar el citocromo c
Upadhyay et al. Nano-assemblies enhance chaperone activity, stability, and delivery of alpha B-crystallin-D3 (αB-D3)
Ferreira et al. Effects of Amino Acid deletion on the antiplasmodial activity of angiotensin II
Terracciano et al. Synthesis, conformational analysis, and cytotoxicity of new analogues of the natural cyclodepsipeptide jaspamide

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination