CN102791864A - Uv相关联的mtrna融合转录体及其方法和用途 - Google Patents

Uv相关联的mtrna融合转录体及其方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了与UV暴露相关联的新型线粒体融合转录体和相关的缺失分子。本发明还提供了用于体内和体外检测mtDNA分子和相关联的融合转录体的方法，以及它们在筛选和测试皮肤护理产品中的用途。

Description

UV相关联的MTRNA融合转录体及其方法和用途
相关申请的交叉引用
本发明要求2010年3月1日提交的美国申请61/309,216的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及线粒体基因组领域。具体地，本发明涉及与UV暴露相关联的线粒体融合转录体和相关的缺失分子，以及它们在生物样品中的检测和监测。
背景技术
线粒体基因组
线粒体基因组是核酸的紧凑并且关键的序列。与33亿个bp的巨大核基因组（单倍体）相比，线粒体DNA或“mtDNA”包括16569个核酸碱基对（bp）的小基因组（Anderson等人，1981；Andrews等人，1999）。mtDNA遗传互补显著小于其核细胞伴侣的遗传互补（0.0005%）。然而，根据特异性的细胞功能，个体细胞携带103至104个线粒体（Singh和Modica-Napolitano，2002）。在核基因组和线粒体基因组之间常规地发生交流或化学的信号传递（Sherratt等人，1997）。此外，特异性核组分负责线粒体序列的维护和完整性（Croteau等人，1999）。一旦发生受精，由于线粒体在卵子内的克隆增殖，所以给定个体中所有mtDNA基因组都是相同的。然而突变事件可能诱导反映为体细胞突变的序列变异。这些突变可能在已知为异质性的情况下在全身的不同组织内积累。
线粒体融合转录组
线粒体基因组的不寻常处在于它是圆形的、无内含子DNA分子。基因组夹杂有具有特异性长度侧翼序列的重复基序。这些重复基序之间的序列倾向于在还没有被很好理解的情况下缺失。考虑到线粒体基因组中重复基序的数目，存在很多可能的缺失。最有名的例子是4977“共同缺失”。这种缺失已经与几种传闻中的病症和疾病相关联，并被认为随着老化频率增高（Dai等人，2004；Ro等人，2003；Barron等人，2001；Lewis等人，2000；Muller-Hocker，1998；Porteous等人，1998）。
各种其他的线粒体缺失已经与前列腺癌、皮肤癌和肺癌的早期发病相关联，以及与老化（例如Polyak等人，1998）、过早老化和暴露于致癌物质（Lee等人，1998）相关联。另外，研究人员已发现，紫外线辐射（UV）在非黑色素皮肤癌（NMSC）的发展和发病机理中是重要的（Weinstock 1998；Rees,1998），并且UV诱导人皮肤的mtDNA损伤（Birch-Machin,2000a）。在加拿大专利申请2,480,184中，例如线粒体基因组的次要弧区中的3895bp缺失被识别为UV-诱导DNA损伤的生物标记。之后3895bp缺失也已经与皮肤癌相关联（PCT申请PCT/CA2006/000652）。
如在申请人的共同待决的国际专利申请PCT/CA2009/000351中讨论的，从人线粒体基因组的大规模缺失图谱获得的知识已用于识别与疾病相关联的缺失。线粒体基因组的计算机分析例如已经使得申请人能够识别缺失位点，在DNA分子中开始缺失事件时，重新闭合或重新连接以产生具有开放阅读框(ORF)的融合的DNA序列。从这些研究中，申请人识别了显示出与恶性肿瘤相关的缺失分子和相关联的融合转录体的亚组。
申请人已识别了与UV暴露相关联的线粒体缺失和融合转录体的其他亚组。本文描述了这些研究的结果和它们在检测UV损伤中的应用。
发明内容
在一个方面，本发明提供了检测线粒体融合转录体的方法。
在另一个方面，本发明提供了检测线粒体融合转录体的方法，其中所述转录体与UV暴露相关联，所述方法包括以下步骤：(a)提供生物样品；和(b)检测所述样品中线粒体融合转录体的存在。
根据本发明的另一个方面，提供了用于确定对象中累积UV暴露的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供来自对象的生物样品；和(b)检测与UV暴露相关联的线粒体融合转录体的存在。
根据本发明的另一个方面，提供了与UV暴露相关联的分离的线粒体融合转录体。
根据本发明的另一个方面，提供了融合转录体用于检测UV暴露的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了融合转录体作为UV暴露的生物标记的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了用于检测UV暴露的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)探针，其具有与本发明的分离的融合序列部分基本互补的序列。
根据本发明的另一个方面，提供了检测人mtDNA基因组中缺失的方法，其中所述缺失与UV暴露相关联，所述方法包括以下步骤：(a)提供生物样品；(b)从所述生物样品提取mtDNA；和(c)检测mtDNA缺失分子的存在。
根据本发明的另一个方面，提供了用于确定对象中累积UV暴露的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供生物样品；(b)从所述生物样品提取mtDNA；和(c)检测与UV暴露相关联的mtDNA中缺失的存在。
根据本发明的另一个方面，提供了与UV暴露相关联的分离的mtDNA缺失分子。
根据本发明的另一个方面，提供了用于检测UV暴露的mtDNA缺失的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了mtDNA缺失作为用于UV暴露的生物标记的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了测试皮肤护理产品对预防、最小化、减轻或保护免受UV暴露或损伤的功效的方法，所述方法包括以下步骤：(a)准备具有期望特性的皮肤护理产品；(b)将皮肤护理产品施用至患者皮肤或皮肤等同物；(c)将皮肤或皮肤等同物暴露于UVR；(d)检测暴露的患者皮肤或暴露的皮肤等同物的样品中与UV暴露相关联的线粒体融合转录体的存在；和(e)将转录体的存在与参照值进行比较。
根据本发明的另一个方面，提供了测试新的皮肤护理产品或制剂用于预防、最小化、减轻或保护免受UV暴露或损伤的功效的方法，所述方法包括以下步骤：(a)准备具有期望特性的皮肤护理产品；(b)将所述皮肤护理产品施用于患者皮肤或皮肤等同物；(c)将皮肤或皮肤等同物暴露于UVR；(d)检测经暴露的患者皮肤或经暴露的皮肤等同物的样品中mtDNA缺失分子的存在，其中所述mtDNA缺失分子与UV暴露相关联；和(e)将所述分子的存在与参照值进行比较。
根据本发明的另一个方面，提供了对于预防、最小化、减轻或保护免受UV暴露或损伤的能力来筛选皮肤护理产品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将皮肤护理产品施用于患者的皮肤或皮肤等同物；(b)将所述皮肤或皮肤等同物暴露于UVR；(c)检测与UV暴露相关联的线粒体融合转录体的存在；和(e)将对于每种经测试的皮肤护理产品的融合转录体的存在与参照值进行比较和/或互相进行比较。
根据本发明的另一个方面，提供了对于预防、最小化、减轻或保护免受UV暴露或损伤的能力来筛选皮肤护理产品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将皮肤护理产品施用于患者的皮肤或皮肤等同物；(b)将所述皮肤或皮肤等同物暴露于UVR；(c)检测经暴露的患者皮肤或经暴露的皮肤等同物的样品中mtDNA缺失分子的存在，其中所述mtDNA缺失分子与UV暴露相关联；和(e)将对于每种经测试的皮肤护理产品的缺失分子的存在与参照值进行比较和/或互相进行比较。
根据本发明的另一个方面，提供了测试皮肤护理产品用于预防、减轻或保护免受皮肤老化或光老化的功效的方法，所述方法包括以下步骤：(a)准备具有期望特性的皮肤护理产品；(b)将所述皮肤护理产品施用于患者皮肤或皮肤等同物；(c)将皮肤或皮肤等同物暴露于UVR；(d)检测经暴露的患者皮肤或经暴露的皮肤等同物的样品中与UV暴露相关联的线粒体融合转录体的存在；和(e)将所述转录体的存在与参照值进行比较。
根据本发明的另一个方面，提供了测试新的皮肤护理产品或制剂用于预防、减轻或保护免受老化或光老化的功效的方法，所述方法包括以下步骤：(a)准备具有期望特性的皮肤护理产品；(b)将所述皮肤护理产品施用于患者皮肤或皮肤等同物；(c)将所述皮肤或皮肤等同物暴露于UVR；(d)检测经暴露的患者皮肤或经暴露的皮肤等同物的样品中mtDNA缺失分子的存在，其中所述mtDNA缺失分子与UV暴露相关联；和(e)将所述分子的存在与参照值进行比较。
根据本发明的另一个方面，提供了关于预防、减轻或保护免受皮肤老化或光老化的能力筛选皮肤护理产品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将皮肤护理产品施用于患者的皮肤或皮肤等同物；(b)将所述皮肤或皮肤等同物暴露于UVR；(c)检测与UV暴露相关联的线粒体融合转录体的存在；和(e)将对于每种经测试的皮肤护理产品的融合转录体的存在与参照值进行比较和/或互相进行比较。
根据本发明的另一个方面，提供了对于预防、减轻或保护免受老化或光老化的能力来筛选皮肤护理产品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将皮肤护理产品施用于患者的皮肤或皮肤等同物；(b)将所述皮肤或皮肤等同物暴露于UVR；(c)检测经暴露的患者皮肤或经暴露的皮肤等同物的样品中mtDNA缺失分子的存在，其中所述mtDNA缺失分子与UV暴露相关联；和(e)将对于每种经测试的皮肤护理产品的缺失分子的存在与参照值进行比较和/或互相进行比较。
附图说明
在参考附图的以下详细描述中，本发明的这些和其他特征将更加明显。
图1示出了在去除核苷酸位点548-4442之后，来自位点386-547:4443-5511的框架2的氨基酸序列。
图2示出了在去除核苷酸位点548-4442之后产生的阅读框。核苷酸382由红色盒子指示，其识别关于线粒体基因组的位点1的阅读框2的开始。
图3示出了通过去除核苷酸位点548-4442形成的框2融合转录体的起作用的序列。
图4示出了通过核苷酸位点548-4442的缺失形成的融合转录体的最终氨基酸序列。所述序列包括线粒体基因组的重组的核苷酸位点470-547和4443-5511。
图5A示出了使用mtDNA缺失分析的体内UVR剂量应答。
图5B示出了用于确定UV损伤的样品计算。
图6至9示出了皮肤等同物中UV剂量之后本发明的融合转录体2、3、11、12、20和32的表达。
图10至12示出了三种UV制剂的体内和体外测试。
图13和14示出了UV暴露之后对各种遮光剂和抗老化品牌的筛选。
图15示出了用于实施例3的日光模拟照射的UV光谱。
图16示出了用于实施例4的日光模拟照射的UV光谱。
具体实施方式
本发明提供了与UV暴露相关联的新型线粒体融合转录体和相关的mtDNA分子。本发明还提供了对生物样品中融合转录体和相关的mtDNA分子的检测和监测。同样地，本发明提供了融合转录体和相关mtDNA缺失在筛选和测试皮肤护理产品中的用途。
本发明的技术和程序一般来说根据本领域和各种通用参考书（见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版（1989）Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor，纽约，和Lakowicz,J.R.Principles ofFluorescence Spectroscopy，纽约：Plenum Press（1983））中的常规方法来实施。
定义
除非另外定义，本文所用的所有科学和技术术语具有本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同含义。除非另外指出，以下术语应理解为具有以下含义：
如本文所用的术语“约”意图指所述值或因子的变化。应理解的是，这种变化通常包括在本文提供的任何给定的值或因子中，不论是否特殊指出。例如，该变化可以是大约+/-10%。本领域所有技术人员还众所周知的是，存在必然与测量相关联的误差度。误差度会根据用于进行读取的装置的精度而改变。由于申请人不了解研究本发明的人所用的装置的精度，所以不能必要地定义测量误差度。同样，在此提交的核苷酸和氨基酸序列的准确度取决于所用仪器和方法的准确度。因此，小的序列变化认为包括在本申请的教导中。
如本文所用的，“线粒体融合转录体”或“融合转录体”的表述指的是RNA转录产物，其因突变的线粒体DNA序列的转录而产生，其中该突变可以包括线粒体缺失和其他大规模的线粒体DNA重排。
如本文所用的术语“杂交”指的是核酸可检测地和特异性地结合至第二核酸的能力。多核苷酸、寡核苷酸和它们的片段在杂交和清洗条件下杂交至直接靶核酸链，所述条件将与非特异性核酸的可检测结合的可测量的量最小化。高度严格的条件可以用于实现本领域内已知的选择性杂交条件。典型地，杂交和清洗条件根据常规杂交程序以高度严格的标准来实施。清洗条件一般为1-3x SSC、0.1-1%SDS、50-70℃，在约5至30分钟之后更换清洗溶液。
术语“减轻”包括阻止、预防、降低、或者改善一种或更多种症状、病征或UV损伤的特征，包括暂时和长期的。
如本文所用的“畸变”或“突变”包括野生型线粒体DNA序列中导致融合转录的改变，其包括但不限于显著的或大规模的mtDNA缺失。
如本文所用的“线粒体DNA”或“mtDNA”是存在于或起源于线粒体的DNA。
如本文所用的术语“对象”或“患者”指的是需要治疗的动物或被测试的动物。
如本文所用的术语“动物”指的是人和非人类的动物，其包括但不限于哺乳动物、鸟类和鱼类。
如本文所用的术语“来源于”，在用于对象时是指所述对象从特定来源获得，虽然不必直接来自该来源。
如本文所用的“诊断的”或“诊断”意味着将突变或突变的组合的存在或不存在或量作为UV暴露诊断或UV暴露管理的因子。
术语“皮肤”指的是身体的外部保护覆盖物，由真皮和表皮构成，并且理解为包括汗腺和皮脂腺、以及毛囊结构。在一个实施方案中，皮肤是哺乳动物皮肤、优选人的皮肤。
如本文所用的“生物样品”指的是包含可以从其获得感兴趣分子的细胞的组织或体液。例如，生物样品可以来源于皮肤细胞或组织，其中组织可以取自真皮或表皮、或者它们的组合。生物样品可以直接如从来源获得的或在预处理以改变样品特征之后使用。样品可以通过多种方法获得，包括但不限于钻取活组织检查，手术切除，和非侵入性或最小侵入性皮肤取样方法例如湿法擦拭，带提取（tapelift），小棉棒擦拭，使用无菌的手术刀片刮皮肤，使用木刮板、粘着垫(CapSureTM Clean-up Pad,Arcturus)的粘着表面、来自LCM MacroCapTM(Arcturus)的膜、来自LCM MacroCapTM(Arcturus)的加热的膜刮皮肤，和使用小号针（例如28号）刮皮肤，以便收集皮肤组织的微核（micro-cores）。这些方法是本领域众所周知的（例如见申请人的共同待决的申请PCT/CA2007/001790和PCT/CA2008/001801，其公开了多种用于收集皮肤样品的方法）。
基因组突变
mtDNA是在识别与疾病发作和于例如毒素、致癌物质或有害辐射的环境暴露相关联的风险因子或破坏性细胞过程中有用的生物标记。根据本发明，线粒体基因组中的大规模重排突变导致与UV暴露相关联的融合转录体的识别。因此，本文提供了编码该转录体的mtDNA和指向其的探针用于检测、诊断和监测UV暴露的用途。
本发明的方法还用于通过检测mtDNA缺失或其相关联的融合转录体来识别皮肤护理产品。因此，本申请提供各种方法来检测（和测量）生物样品中UV相关的损伤的量，以及筛选和测试能够降低或预防该损伤的产品。
本领域技术人员应理解，用于本发明的方法中的mtDNA分子可以来源于天然发生的突变的分离，或者可以基于本文所述的任何融合转录体的互补序列。示例性mtDNA序列和融合转录体在申请人的共同待决PCT申请（PCT/CA2009/000351）中公开，其内容通过引用并入本文。
突变基因组序列的检测
根据本发明的与UV暴露相关联的突变序列包括导致融合转录体产生的mtDNA缺失。而改变或变化可以在尺寸上从几个碱基至几千个碱基而很大不同，优选所述改变导致显著的或大规模的mtDNA缺失，也称为基因组畸变。
在申请人的共同待决专利申请（PCT/CA2009/000351）中已事先公开了用于提取和分离畸变的mtDNA分子的技术。该方法还包括用于选择适当的引物、探针和基因组序列（即具有新的mtDNA结合点的那些）的技术，其内容通过引用并入本文。
根据本发明的一方面，为了确定候选基因组序列，首先识别序列缺失的结合点。序列缺失主要通过直接和间接的重复元件来识别，所述元件的侧翼序列在5'和3'端缺失。从基因组中除去核苷酸的区段以及之后的基因组连接产生具有开放阅读框(ORF)和新型结合点的融合的DNA序列。
以下提供用在本发明的方法中的示例性mtDNA分子。如前所述（见PCT/CA2009/000351），这些mtDNA基于已知的线粒体基因组(SEQ ID NO:1)的改变，并且已经赋以融合或“FUS”的名称，其中A:B代表第一剪接基因的最后一个线粒体核苷酸与第二剪接基因的第一个线粒体核苷酸之间的结合点。在括号内提供剪接基因的识别，后面是对应的序列识别符号。下面提供的(AltMet)和(OrigMet)分别指替代的和最初的转译起始位点。
FUS 8469:13447(AltMet)(ATP合成酶FO亚组8(ATP酶8)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQ ID No:2)
FUS 10744:14124(NADH脱氢酶亚组4L(ND4L)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQ IDNo:3)
FUS 7974:15496(细胞色素c氧化酶亚组II(CON)与细胞色素b(Cytb))(SEQ ID No:4)
FUS 7992:15730(细胞色素c氧化酶亚组II(COM)与细胞色素b(Cytb))(SEQ ID No:5)
FUS 8210:15339(细胞色素c氧化酶亚组II(COM)与细胞色素b(Cytb))(SEQ ID No:6)
FUS 8828:14896(ATP合成酶FO亚组6(ATP酶6)与细胞色素b(Cytb))(SEQ ID No:7)
FUS 10665:14856(NADH脱氢酶亚组4L(ND4L)与细胞色素b(Cytb))(SEQ ID No:8)
FUS 6075:13799(细胞色素c氧化酶亚组I(COI)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQ IDNo:9)
FUS 6325:13989(细胞色素c氧化酶亚组I(COI)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQ IDNo:10)
FUS 7438:13476(细胞色素c氧化酶亚组I(COI)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQ IDNo:11)
FUS 7775:13532(细胞色素c氧化酶亚组II(COM)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQID No:12)
FUS 8213:13991(细胞色素c氧化酶亚组II(COM)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQID No:13)
FUS 9144:13816((ATP合成酶FO亚组6(ATP酶6)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQID No:14)
FUS 9191:12909(ATP合成酶FO亚组6(ATP酶6)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQID No:15)
FUS 9574:12972(细胞色素c氧化酶亚组III(COIN)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQID No:16)
FUS 10367:12829(NADH脱氢酶亚组3(ND3)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQ ID No:17)
FUS 11232:13980(NADH脱氢酶亚组4(ND4)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQ ID No:18)
FUS 8469:13447(OrigMet)(ATP合成酶FO亚组8(ATP酶8)与NADH脱氢酶亚组5(ND5))(SEQ ID No:19)
FUS 547:4443(Met与NADH脱氢酶亚组2(ND2))(SEQ ID No:20)
如以下实施例中描述的，一旦识别出序列就分析它们与UV暴露的相关性。这种测试可以在对象或患者体内实施（见实施例5），或者通过测试生长并剂量施加不同水平的UVR的皮肤培养物来实施（见实施例3和4）。这些序列的表达还可以监测一种或更多种管家基因，所述管家基因包括但不限于人PPIB、人PGK-1、人ACTB(β肌动蛋白)、人GUSB(β葡糖醛酸酶)、人B2M(β-2-微球蛋白)、人PPIA(肽基脯氨酸异构酶A(亲环蛋白A))、人GAPD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、人HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1)、人RPLPO=LRP(核糖体蛋白,大,PO)、人HMBS=PBGD(羟甲基胆色烷合成酶)、人TBP(TATA盒结合蛋白)、人TRFC(转铁蛋白受体(p90,CD71)，和人ABCC13(13号染色体–假基因)。
在本发明的一个实施方案中，确定下列mtDNA序列对预测、诊断或监测UV损伤是有用的，并且对测试和筛选对预防或减轻UV损伤有效的皮肤护理产品是有用的：
SEQ ID NO:3(FUS 10744:14124)
SEQ ID NO:4(FUS 7974:15496)
SEQ ID NO:12(FUS 7775:13532)
SEQ ID NO:13(FUS 8213:13991)
SEQ ID NO:19(FUS 8469:13447;OrigMet)
SEQ ID NO:20(FUS 547:4443).
在本发明的另一实施方案中，优选使用具有SEQ ID NO:19和20的mtDNA序列来实施本发明的方法。
除了上述序列之外，本发明还提供了用于预测、诊断和/或监测UV损伤或暴露的这些序列的变体或片段的用途。
如本文所用的“变体”指的是不同于本发明的mtDNA序列，但保持其必要特性的核酸。一般来说，变体整体上非常类似，并且在很多区域中与选择的mtDNA序列一致。特别地，本发明的变体包括剪接基因的结合点的至少一种核苷酸，并且可还包括一种或更多种与其相邻的核苷酸。在本发明的一个实施方案中，变体序列与本发明的任何一种mtDNA序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致，或者是其互补链。
在本发明中，“片段”指的是包含在所公开的基因组序列中的一部分的短核酸序列或者是其互补链。该部分包括至少一个包括剪接基因的结合点的核苷酸，并且还可以包括一个或更多个与其相邻的核苷酸。本发明的片段在长度上优选为至少约15nt，更优选为至少约20nt，又更优选为至少约30nt，并且甚至更优选为至少约40nt，至少约50nt，至少约75nt，或至少约150nt。“长度上至少为20nt”的片段例如旨在包括上面列出的任意一个mtDNA序列的20个或更多个连续碱基。在本文中“约”包括在任一端点或两个端点上的具体引用的值、多或少几个（5、4、3、2或1）个核苷酸的值。这些片段具有的用途包括但不限于，如本文中讨论的诊断探针和引物。当然，也考虑较大的片段（例如50、150、500、600、2000个核苷酸）。
引物和探针
本发明的另一个方面提供了能够识别本发明的mtDNA序列的引物或探针。如本文所用的，术语“引物”和“探针”指的是由于引物或探针中至少一个序列与靶区域中序列的互补性而形成具有靶核酸中序列的双链结构的寡核苷酸。根据本领域已知的方法可以标注探针。
一旦识别出与UV暴露相关联的畸变mtDNA，mtDNA例如与寡核苷酸阵列的杂交可以用于识别特定的突变，但可以使用任何已知的杂交方法。
适合用在本发明中的引物和探针的制备可以如申请人的共同待决的PCT申请中描述的来进行。在这点上，可以直接相对于本发明的示例性mtDNA融合分子制造探针，或者相对于其片段或变体。例如，可以使用SEQ ID NO：3、4、12、13、19和20中列出的序列设计引物或探针，其将检测包括感兴趣的融合序列的核酸序列。如本领域技术人员应理解的，引物或探针可以在高度严格的杂交条件下或较不严格的条件下与这些核酸分子杂交，所述条件对本领域技术人员是已知的，并且例如在Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons,New York(1989)),6.3.1-6.3.6中发现。本发明的引物和探针还可以与出现DNA滑移或者出现类似的序列改变事件的靶序列杂交。
在本发明的具体实施方案中，本发明的探针包含与畸变的mtDNA的至少一部分互补的序列，所述畸变的mtDNA包括剪接基因的结合点。该部分包括结合点A:B中涉及的至少一个核苷酸，并且可以进一步包括一个或更多个与其相邻的核苷酸。在这点上，本发明包括任何适合的靶向机制，所述机制利用涉及结合点A:B的和/或邻近结合点A:B的核苷酸选择mtDNA分子。
本发明考虑各种类型的探针（如申请人的共同待决PCT申请中描述的）。本发明的探针在长度上优选为至少约15nt，更优选为至少约20nt，又更优选为至少约30nt，并且甚至更优选为至少约40nt，至少约50nt，至少约75nt，或至少约150nt。“长度上至少为20nt”的探针例如旨在包括与本发明的mtDNA序列互补的20个或更多个连续碱基。当然，较大的探针（例如50、150、500、600、2000个核苷酸）可以是优选的。
本发明的探针还与生物样品中的核酸分子杂交，从而使本发明的方法成为可能。因此，在本发明的一个方面中，提供用于检测、诊断和/或监测UV损伤或暴露的杂交探针，其中该探针与畸变mtDNA分子的至少一部分互补。在本发明的另一个方面中，提供了探针和该探针用于筛选或测试在预防或减轻UV损伤或暴露中有效的皮肤护理产品的用途（或使用方法）。
试验
测量生物样品中畸变mtDNA的水平可以确定对象中的UV暴露水平。本发明因此包括用于检测、诊断或监测UV损伤或暴露的方法，所述方法包括获得一种或更多种生物样品，从样品提取mtDNA，并如下测定样品的畸变mtDNA：量化样品中一种或更多种畸变mtDNA序列的量，并将所检测的量与参照值进行比较。
如本领域技术人员应该理解的，参照值基于该方法是否用于检测、诊断或监测UV损伤或暴露。因此，该参照值可以涉及从一种或更多种已知经UV暴露的生物样品收集的mtDNA数据，从一种或更多种已知未经UV暴露的生物样品收集的mtDNA数据，和/或随着时间推移从一种或更多种生物样品采集的mtDNA数据。样品可以来源于极少暴露于日光、偶尔暴露于日光、经常暴露于日光的皮肤或血液，并且通过各种方法收集，所述方法包括但不限于钻取活组织检查，手术切除，和非侵入性或最小侵入性皮肤取样方法例如湿法擦拭，带提取（tapelift），小棉棒擦拭，使用无菌的手术刀片刮皮肤，使用木刮板、粘着垫(CapSureTM Clean-up Pad,Arcturus)的粘着表面、来自LCMMacroCapTM(Arcturus)的膜、来自LCM MacroCapTM(Arcturus)的加热的膜刮皮肤，和使用小号针（例如28号）刮皮肤，以便收集皮肤组织的微核。
检测mtDNA中突变存在的步骤可以选自本领域技术人员已知的任何技术。例如，分析mtDNA可以包括mtDNA测序、通过PCR扩增mtDNA、Southern印记杂交、Northern印记杂交、Western印记杂交、South-Western印记杂交、变性HPLC、与微阵列杂交、生物芯片或基因芯片、分子标记分析、生物传感器、熔融温度分析或上述任一项的组合。
在一个方面中，本发明提供了检测哺乳动物的UV暴露的方法，所述方法包括检测来自哺乳动物的组织样品中上述畸变线粒体DNA的存在。本发明还提供包括通过将样品与至少一种杂交探针杂交来检测来自哺乳动物的组织样品的方法。该探针可以相对于如本文描述的本发明的突变线粒体DNA序列来制造。
在另一个方面中，本发明提供了如上所述的方法，其中所述检测包括：a)利用至少一个本发明的探针来进行杂交反应，以允许至少一个探针与互补的畸变线粒体DNA序列杂交；b)通过量化与至少一个探针杂交的线粒体DNA的量，量化样品中至少一种畸变线粒体DNA序列的量；和c)将样品中线粒体DNA的量与至少一种已知的参照值进行比较。
本发明还包括用于检测、诊断或监测UV损伤或暴露的方法，该方法包括本领域已知的诊断成像试验。本发明的诊断试验可以容易地适用于高通量。高通量试验提供同时处理很多样品和显著降低筛选大量样品所需时间的优点。本发明因此考虑了本发明的核苷酸在高通量筛选或试验中的用途，用于检测和/或量化多个测试样品中的靶核苷酸序列。
融合转录体
本发明的另一个方面是对用在预测、诊断和/或监测UV损伤或暴露的方法中的融合转录体和相关联的杂交探针的识别。如申请人的共同待决的PCT申请中公开的，这种分子可以源自于天然存在的转录体的分离，或者替代地来源于通过根据本发明的方法分离的mtDNA的重组表达。这些mtDNA典型地包括具有来自第一基因的起始密码子和第二基因的终止密码子的剪接基因。因此，来源于此的融合转录体包括与剪接基因相关联的结合点。
融合转录体的检测
天然存在的融合转录体可以从生物样品提取并且根据本领域已知的任何适合的方法来识别，或者可以根据申请人的共同待决的PCT申请中描述的方法来进行。在本发明的一个实施方案中，稳定的多聚腺苷酸化的融合转录体如下识别：利用低聚（dT）引物靶向具有多聚腺苷尾的转录体，随后利用相对于靶转录体设计的引物对进行RT-PCR。
使用这些方法检测下列示例性的融合转录体：
SEQ ID NO:22(转录体2;10744:14124)
SEQ ID NO:38(转录体20;8469:13447;OrigMet)
融合转录体还可以通过本领域已知的重组技术来制造。这典型地涉及适合的宿主细胞的转化（包括转染、转导或感染），其具有包括感兴趣的mtDNA序列的表达载体。
不期望的融合转录体的检测
申请人还识别出了不期望特性的融合转录体，并证实在本发明的方法中有用。迄今为止，每个经识别的融合转录体作为线粒体基因组中缺失事件的结果出现，所述缺失事件导致两种基因融合以形成新序列，随后通过线粒体转录。相反地，以下详细描述的3895bp缺失导致D环融合，其位于mtDNA的非编码区域中。
为什么与融合转录体相关联的3895bp缺失的检测是不可预期的
线粒体融合转录体的大部分是通过两个相邻或不相邻的基因之间核苷酸含量的缺失来形成的（见上面的基因组突变部分和申请人的共同待决PCT申请）。在除去缺失的DNA之后，随后重组剩余的线粒体基因组以产生新的基因或转录体。如之前讨论的，该剪接基因包括5'-最原始基因的起始密码子和3'-最原始基因的终止密码子，来自最初的两种基因的遗传内容的作用不同。
相反地，来自核苷酸位点547-4443之间的遗传内容的缺失的融合转录体(转录体32;SEQ ID NO:39)是不可预期的，这是因为5'部分位于线粒体基因组的非编码替换环(D-环)(16024-576)内。尽管如此，当除去位点548-4442时，在框2中观察到来自位点386-547:4443-5511的完整阅读框（见图1和2）。框1和3具有很多终止密码子，因此不能产生阅读框（图2）。
框2融合转录体的5'端内容以位点386处的脯氨酸开始，但是只在位于高变段3(438-574)内的位点470处的第一个蛋氨酸处启动。融合转录体的3'端内容在tRNA蛋氨酸(4402-4469)内的位点4443处开始，并在NADH脱氢酶亚组2(4470-5511)的位点5511处终止（图3）。图4显示了通过线粒体基因组的位点548-4442的缺失形成的在位点470处启动的得到的融合转录体。
因此，本发明包括不同内容的融合转录体，即包括两种编码区域的剪接序列的那些以及包括剪接的编码区域和非编码区域的那些。
与UVR相关联的融合转录体
如以下实施例中描述的，一旦识别出线粒体融合转录体，就测试序列与UVR的相关性。该测试可以在体内实施，或者在生长并剂量施加不同水平的UVR的经培养的皮肤等同物中实施（见实施例6）。这些序列的表达还可以监测一种或更多种管家转录体，所述管家转录体包括但不限于人PPIB、人PGK-1、人ACTB(β肌动蛋白)、人GUSB(β葡糖醛酸酶)、人B2M(β-2-微球蛋白)、人PPIA(肽基脯氨酸异构酶A(亲环蛋白A))、人GAPD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、人HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1)、人RPLPO=LRP(核糖体蛋白,大,PO)、人HMBS=PBGD(羟甲基胆色烷合成酶)、人TBP(TATA盒结合蛋白)、人TRFC(转铁蛋白受体(p90,CD71)，和人ABCC13(13号染色体–假基因)。
在本发明的一个实施方案中，下列线粒体融合转录体已确定用于预测、诊断或监测UV损伤，以及用于测试和筛选在预防或减轻UV损伤中有效的皮肤护理产品：
SEQ ID NO:22(转录体2;10744:14124)
SEQ ID NO:23(转录体3;7974:15496)
SEQ ID NO:31(转录体11;7775:13532)
SEQ ID NO:32(转录体12;8213:13991)
SEQ ID NO:38(转录体20;8469:13447;OrigMet)
SEQ ID NO:39(转录体32;547:4443)
除了上述序列之外，本发明提供了这些序列的变体或片段用于预测、诊断和/或监测UV暴露的用途。本文所识别的融合转录体的变体或片段遵照上述关于基因组变体和片段识别的大小限制和百分比，或者由熟练的技术人员确定适合。
另外，以下列出了对应本发明的转录体2、3、11、12、20和32的假定蛋白质序列。编码假设的融合蛋白质的这些序列作为本发明的其他实施方案提供，并且可以认为在本发明的方法中有用。
SEQ ID NO:40(转录体2)
SEQ ID NO:41(转录体3)
SEQ ID NO:42(转录体11)
SEQ ID NO:43(转录体12)
SEQ ID NO:44(转录体20)
SEQ ID NO:45(转录体32)
引物和探针
一旦已经表征了融合转录体，就可以开发引物或探针用于靶向生物样品中的转录体。该引物和探针可以利用任何已知的方法（如上所述）或如在申请人的共同待决PCT申请中提供的实施例中陈述的来制备。例如可以制造探针用于融合转录体和检测技术，例如来自PanomicsTM的QuantiGene 2.0TM，其用于检测样品中转录体的存在。引物和探针可以直接相对于本发明的示例性融合转录体来制造，或者相对于其片段或变体。例如，SEQ ID NO：22、23、31、32、38和39中列出的序列可以用于设计检测包括感兴趣的融合序列的核酸序列。
如本领域技术人员应理解的，设计用于与本发明的融合转录体杂交的探针包含与转录体的至少一部分互补并优选表达剪接基因的结合点的序列。该部分包括与所表达的结合点互补的至少一个核苷酸，并且可以进一步包括一个或更多个与其相邻的互补核苷酸。在这点上，本发明包括任何适合的靶向机制，所述机制利用所涉及的和/或邻近剪接基因的结合点的核苷酸选择融合转录体。
本领域已知的各种类型的探针和标注方法都考虑用于制备转录体探针。该类型和方法以上已经关于基因组序列的检测进行了描述。本发明的转录体探针在长度上优选为至少约15nt，更优选为至少约20nt，又更优选为至少约30nt，并且甚至更优选为至少约40nt，至少约50nt，至少约75nt，或至少约150nt。“长度上至少为20nt”的探针例如旨在包括与本发明的mtDNA序列互补的20个或更多个连续碱基。当然，较大的探针（例如50、150、500、600、2000个核苷酸）可以是优选的。
本发明的探针还与生物样品中的融合转录体杂交，从而使本发明的方法成为可能。因此，在本发明的一个方面中，提供用于检测、诊断和/或监测UV损伤或暴露的杂交探针，其中该探针与本发明的融合转录体的至少一部分互补。在另一个方面中，提供了探针和该探针用于测试和筛选在预防或减轻UV损伤或暴露中有效的皮肤护理产品的用途（或使用方法）。
试验
根据本发明，已经证明了新融合转录体在暴露于日光模拟光的照射之后丰度增加（例如见实施例6）。体外和体内对这些新融合转录体的检测允许量化对UV辐射的暴露（UVB和UVA二者）。本发明因此包括用于检测、诊断或监测UV损伤或暴露的方法，所述方法包括获得一种或更多种生物样品，从样品中提取线粒体RNA，并如下检测样品的融合转录体：量化样品中一种或更多种融合转录体的量，并将所检测的量与参照值进行比较。
如本领域技术人员应该理解的，参照值基于该方法是否用于检测、诊断或监测UV损伤或暴露。因此，该参照值可以涉及从一种或更多种已知经UV暴露的生物样品收集的转录体数据，从一种或更多种已知未经UV暴露的生物样品收集的转录体数据，和/或随着时间推移从一种或更多种生物样品采集的转录体数据。样品可以来源于极少暴露于日光、偶尔暴露于日光、经常暴露于日光的皮肤或血液，并且通过上面描述的各种方法收集。
在一个方面中，本发明提供了检测哺乳动物的UV暴露的方法，所述方法包括检测来自哺乳动物的组织样品的上述融合转录体的存在。本发明还提供包括通过样品与至少一种杂交探针的杂交来检测来自哺乳动物的组织样品的方法。该探针可以相对于本文描述的本发明的融合转录体来制造。
在另一个方面中，本发明提供了如上所述的方法，其中所述检测包括：a)利用至少一个探针来进行杂交反应，以允许至少一个探针与互补的融合转录体序列杂交；b)通过量化与至少一个探针杂交的转录体的量，量化样品中至少一种融合转录体序列的量；和c)将样品中转录体的量与至少一种已知的参照值进行比较。
如上所述，本发明的诊断试验还可以包括本文描述的诊断方法和筛选工具，并且可以容易地适合于高通量。因此，本发明考虑本发明的融合转录体和相关联的探针在高通量筛选或试验中的用途，用于检测和/或量化多种测试样品中的靶核苷酸序列。
皮肤护理产品的测试和筛选
新制剂
新型UV相关联的融合转录体和相关mtDNA分子的丰度的变化的调控（通过具体活性物质或制剂例如遮光剂、抗氧化剂或抗老化产品的应用）可以用于评价产品在保护皮肤免受UV辐射造成的损伤的功效。该评价可以为利用皮肤等同物模型的新制剂的体外测试形式（见图10和11），或者通过利用生物样品的产品的体内测试进行（见图12）。
本发明因此考虑制备皮肤护理产品和测试皮肤护理产品在预防、最小化、减轻或保护免于UV保护或损伤中的功效的方法，其通过准备具有期望特性的产品（例如UVA滤光剂和/或UVB滤光剂），将皮肤护理产品施用于患者皮肤或皮肤等同物模型；将皮肤或皮肤等同物模型暴露于UVR；检测取自经暴露的患者皮肤或经暴露的皮肤等同物的样品中至少一种线粒体缺失分子和/或融合转录体的存在；和将缺失或转录体的存在与参照值（例如对照基因和/或转录体）进行比较。没有接受皮肤产品的对照的患者或皮肤等同物模型也可以用作参照值。
本领域技术人员应理解：阻止、预防、降低、或改善一种或更多种症状、病征或UV损伤的特征，包括暂时和长期的，表示新的产品（制剂）预防、最小化、减轻、或保护免于UV暴露或损伤的能力。在本发明的一种实施方案中，如以下提供的实施例中所示的进行产品分析。
在本发明的优选的实施方案中，用于测试新产品的方法包括在检测mtDNA缺失或融合转录体的存在的步骤之前，将对象的皮肤或皮肤等同物模型暴露于至少一个亚致死剂量的紫外线辐射(UVR)。另外，在测试之前，可以将皮肤或皮肤等同物暴露于一系列重复的亚致死剂量的UVR，例如UVR的日剂量。一般来说，UVR来自日光模拟UVR源，其中UVR包括UVA、UVB或UVA/UVB，然而也考虑日光暴露。还考虑对照序列，其包括但不限于前面讨论的管家基因和转录体。至于mtDNA缺失和融合转录体标记，这些可以单个地或串联地在所述方法的末端插入。
皮肤样品
患者的皮肤样品可以收集自皮肤的真皮层或表皮层，并可以如下获得：钻取活组织检查，手术切除，和非侵入性或最小侵入性皮肤取样方法例如湿法擦拭，带提取（tapelift），小棉棒擦拭，使用无菌的手术刀片刮皮肤，使用木刮板、粘着垫(CapSureTM Clean-up Pad,Arcturus)的粘着表面、来自LCM MacroCapTM(Arcturus)的膜、来自LCM MacroCapTM(Arcturus)的加热的膜刮皮肤，和使用小号针（例如28号）刮皮肤，以便收集皮肤组织的微核。样品可以直接如从来源获得的或在预处理以改变样品特征之后使用。因此，皮肤样品可以在使用前预处理，例如用防腐剂、试剂等。
本领域技术人员应理解，一次可以使用超过一种取样技术。另外，需要收集过程时，例如用于监测产品随时间推移的情况，在整个测试周期可以单独或一起使用相同或不同的技术。在这点上，皮肤收集可以只进行一次，或者以规律的间隔例如每天、每周或每个月进行。
皮肤等同物模型
申请人还开发了利用皮肤等同物模型体外测试皮肤护理产品的新体系。这些模型例如如实施例2中描述的来产生和生长，之后可以用皮肤护理产品对其进行处理并且剂量施加不同增量的UVR。将待测试产品简单地施用于皮肤等同物的表面，例如以2mg/cm2的密度，并均匀地铺展在整个细胞表面上。随后将皮肤等同物放在日光模拟器之下并暴露于一个或更多个剂量的UV光。剂量取决于各个实验布置和待测试的产品。然而，下面的表1和2中提供了典型的剂量方案几个实例。
产品筛选和个性化的皮肤护理
通过收集皮肤护理产品保护免于产生融合转录体和相关mtDNA缺失的能力的数据可以开发对防晒和抗老化更有效的产品。同样地，直到最近，在暴露于日光期间个体定期施用的遮光剂和防晒霜一般来说保护免于UVB的诱变效应，但不包含指向UVA辐射的有害效应的试剂。因此，皮肤护理产品的靶向筛选会有助于识别能够保护免于UVA和UVB辐射两者的那些。
这些因素主要使得确定进入市场的新产品的功效的工具的可用性成为必要，并通过研究过程，监测目前测量的成功和恰当性，从而预防对皮肤的UVR损伤。在施用产品和以有规律的间隔剂量施加UVR之后，通过收集皮肤样品测量患者的皮肤或皮肤等同物模型中线粒体DNA缺失的水平，这可以帮助确定该产品用于预防DNA和皮肤损伤（包括相关联的光老化和皮肤癌）的功效。
本发明的方法还可以用于药用和药用化妆品用途的普遍的皮肤筛选。例如，评价由于任意时间点的UV辐射和任何来自外部解剖定位造成对象皮肤中DNA损伤水平的能力，提供用于唯一的和提供信息的筛选测试的基础，以评价现有的和新的皮肤护理产品以及用于指定对象的皮肤护理方案的安全性和功效。另外，通过识别与UV保护相关联的特异性基因变化，可以容易地确定是否和在什么范围内应施用特定的皮肤护理产品或方案。
对于已经在售的皮肤护理产品，本发明的方法还帮助筛选用于评价它们预防、最小化、减轻或保护免于UV暴露或损伤的能力的试剂。这允许从业者或消费者评价哪个品牌最适合用于他们特定的皮肤护理需求。由本发明的方法筛选的产品包括但不限于遮光剂和抗老化精华和霜，并且可以成对评价或对3个或更多个产品分批进行评价。筛选方法可以如上对于测试新制剂所述的或以下实施例中所详述的来进行。
试剂盒
本发明提供用于检测或监测对象的UV暴露的诊断试剂盒。该试剂盒可以包括一种或更多种取样装置，与根据本发明的一种或更多种引物或探针组合。该试剂盒还可以包括用于使用其内含物的说明书。
试剂盒可以任选地包括进行诊断测试所需的试剂，例如缓冲剂、盐、检测试剂等。试剂盒中还可以包括其他组分，例如用于分离和/或处理生物样品的溶液。试剂盒的一种或更多种组分可以是冻干的，并且试剂盒还可以包括适用于冻干组分重构的试剂。
适当时，试剂盒还可以包含反应容器、混合容器和其他有利于测试样品制备的组分。试剂盒还可以任选地包括使用说明，其可以以纸张形式提供或者以计算机可读形式提供，例如软盘、CD、或DVD等。
在本发明的一个实施方式中，提供了用于诊断UV暴露的试剂盒，其包括取样装置和本发明的探针或引物。
为了更好地理解本文描述的发明，记载了以下实施例。应理解，这些实施例旨在描述本发明的示例性实施方案，不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
实施例1：HpEKp细胞的生长
材料
1.HpEKp细胞<15传代(CellnTec)
2.T75组织培养瓶(IWAKI)
3.TrypLETM Select(12563-011,Invitrogen)
4.10ml的无菌血清移液管(Sterile Stripette)(Star Labs)
5.自动吸液管
6.倒置TC显微镜
7.无菌的15ml离心管(Falcon)
8.2级组织培养柜[37℃,5%CO2](Binder)
9.水浴(37℃)
10.无菌的磷酸盐缓冲盐水
11.完全PCM培养基[CnT-57](CellnTec)
试验报告
1.从HpEKp细胞的瓶移除CnT-57培养基(90%融合)
2.用无菌的PBS(2ml)冲洗细胞，吸除。
3.每瓶加入1.5ml TrypLETM Select，以覆盖细胞。
4.放回培养箱中2至3分钟，直至细胞开始分开（用显微镜检查）。
5.在5ml CnT-57培养基中重悬细胞，剧烈抽吸2/3次，以重悬细胞。
6.以160×g旋转细胞5分钟。
7.移除培养基并重悬在5ml新鲜的CnT-57培养基中，剧烈抽吸2/3次。
8.移除20μl细胞悬浮液用于细胞计数。
9.稀释细胞并接种至浓度为4x103细胞/cm2。
10.将瓶放在加湿的37℃和5%CO2的培养箱里。
11.每隔2/3天添加15ml CnT-57培养基来维持细胞。
12.生长至90%融合，随后再次传代。
实施例2：表皮皮肤等同物产生
材料
1.HpEKp细胞<15传代(CellnTec)生长至90%融合(见实施例1)
2.T75组织培养瓶(IWAKI)
3.TrypLETM Select(12563-011,Invitrogen)
4.10ml的无菌血清移液管(Star Labs)
5.自动吸液管
6.倒置TC显微镜
7.无菌的15ml离心管(Falcon)
8.6孔培养板(Millipore)
9.Millicell PCF 0.4μm插入式培养皿(Millipore)
10.RapiDiff II染色包(BioStain)
11.24孔培养板(Millipore)
12.2级组织培养柜[37℃,5%CO2](Binder)
13.水浴(37℃)
14.无菌的磷酸盐缓冲盐水
15.无菌的镊子
16.完全PCM培养基[CnT-57](CellnTec)
17.完全3D-引物培养基[CnT-02-3DP](CellnTec)
试验报告
1.将四个Millicell PCF 0.4μm 12mm插入式培养皿(Millipore Cat#:PIHP01250)放入6孔培养板的每个孔中，铺板（plating out）实验所需数目。允许两个空白的插入式培养皿（用于监测融合–步骤15）。
2.从HpEKp细胞的瓶移除CnT-57培养基。
3.用无菌的PBS(2ml)冲洗细胞，吸除。
4.每瓶加入1.5ml TrypLETM Select，以覆盖细胞。
5.放回培养箱中2至3分钟，直至细胞分开（用显微镜检查）。
6.在5ml CnT-57培养基中重悬细胞以重悬细胞，剧烈抽吸2/3次。
7.以160×g旋转细胞5分钟。
8.移除培养基并重悬在5ml新鲜的CnT-57培养基中，剧烈抽吸2/3次。
9.移除20μl细胞悬浮液用于细胞计数。
10.稀释细胞至浓度为5×105细胞/ml。
11.在每个插入式培养皿的400μl CnT-57(或CnT-07)中加入2×105个细胞。
12.在插入式培养皿外部（培养板的孔中）加入适当量(~2ml)的CnT-57，使得插入式培养皿内部和外部的培养基水平相等并浸没细胞；确保没有气泡截留在膜下面。
13.将插入式培养皿放在加湿的37℃和5%CO2的培养箱里。
14.允许细胞生长2至3天。
15.用RAPI-DIFF II着色剂染色单个空白插入式培养皿。
16.如果单层融合，则进行步骤17，否则改变剩余的插入式培养皿中的培养基，再培养一天，随后对第二个空白插入式培养皿实施另一次染色。
17.用3D培养基(CnT-02-3DP)代替插入式培养基内部和外部的培养基（与接种时的量相同，步骤12）。
18.将插入式培养皿放入培养箱中过夜（15至16小时），以允许细胞形成细胞间粘合结构。
19.通过将所有培养基从插入式培养皿的内部吸出并放入24孔培养板的各个孔中来开始3D培养。在培养基外部加入(CnT-02-3DP)(250μl)。
20.如果实施时程研究，可以将插入式培养皿留在相同的板中，每2至3天更换培养基。
开始剂量处理之前在空气干燥条件下细胞生长14天。
实施例3：表皮皮肤等同物剂量施加-UVA照射
材料
1.Oriel 1000W UV日光模拟器(Newport Corp.)
2.大气衰减滤光器(Newport Corp.-81017)
3.Vis IR滤光器(Newport corp-87066)
4.PETG滤光器(RVI Medical Physics)
5.国际照明UVA光疗辐射计(Able Instruments-IL1402)
6.真皮皮肤等同物(见实施例2)
7.完全3D-引物培养基[CnT-02-3DP](CellnTec)
8.24孔培养板(Millipore)
9.无菌的磷酸盐缓冲盐水
10.无菌的镊子和解剖刀
所用的UV光谱（日光模拟）
大气衰减滤光器+Vis IR滤光器+PETG滤光器：如图15中所示。
实验方法
1.如实施例2所述的制造皮肤等同物并生长。
2.14天的空气干燥生长之后，SE备好用于剂量施加/处理。
3.从生长培养基除去皮肤等同物并放入包含200μl无菌PBS的新的24孔培养板中。
4.如果需要，将待测试产品以2mg/cm2的密度(或以任何特定剂量)施用至皮肤等同物的表面。用弯曲的无菌200μl微量移液器施用材料，并均匀地铺展在整个表面上。
5.一旦制备了皮肤等同物，在暴露于UV光之前将其放回培养箱中20分钟。
6.打开日光模拟器并在处理之前预热10分钟。用辐射计测量UV输出，强度用于计算所需的暴露时间。
7.将皮肤等同物放在日光模拟器之下，并暴露于X SED的UV光(如步骤6中根据实验要求计算的)。
8.在暴露之后将皮肤等同物再次放入3D培养基并放回培养箱。
9.剂量基于各个实验布置。表1中示出了一些实例。
10.剂量施加之后将SE从3D培养基中移除并在提取之前储存在-80℃。
表1
  实验布置
  剂量应答0.04SED，多剂量
  剂量应答0.08SED，多剂量
  SPF15产品0.08SED，多剂量
  抗老化产品0.08SED，多剂量
实施例4：表皮皮肤等同物按剂量施加-日光模拟光
材料
1.Oriel 1000W UV日光模拟器(Newport Corp.)
2.大气衰减滤光器(Newport Corp.-81017)
3.Vis IR滤光器(Newport corp-87066)
4.国际照明UVA光疗辐射计(Able Instruments-IL1402)
5.真皮皮肤等同物(见实施例2)
6.完全3D-引物培养基[CnT-02-3DP](CellnTec)
7.24孔培养板(Millipore)
8.无菌的磷酸盐缓冲盐水
9.无菌的镊子和解剖刀
所用的UV光谱（日光模拟）
大气衰减滤光器+Vis IR滤光器：如图16所示。
实验方法
1.如实施例2中所述的制造皮肤等同物并生长。
2.14天的空气干燥生长之后，SE备好用于剂量施加/处理。
3.从生长培养基除去皮肤等同物并放入包含200μl无菌PBS的新的24孔培养板中。
4.如果需要，将待测试产品以2mg/cm2的密度(或以任何特定剂量)施用至皮肤等同物的表面。用弯曲的无菌200μl微量移液器施用材料，并均匀地铺展在整个表面上。
5.一旦制备了皮肤等同物，在暴露于UV光之前将其放回培养箱中20分钟。
6.打开日光模拟器并在处理之前预热10分钟。用辐射计测量UV输出，强度用于计算所需的暴露时间。
7.将皮肤等同物放在日光模拟器之下，并暴露于X SED的UV光(如步骤6中根据实验要求计算的)。
8.在暴露之后将皮肤等同物再次放入3D培养基并放回培养箱。
9.剂量基于各个实验布置。表1中示出了一些实例。
10.剂量施加之后将SE从3D培养基中移除并在提取之前储存在-80℃。
表2
  实验布置
  剂量应答0.5SED，多剂量
  剂量应答1SED，多剂量
  SPF15产品1SED，多剂量
  抗老化产品0.5SED，多剂量
实施例5：体内UVR剂量应答
通过剂量施加各种水平的UVR随后通过擦拭来收集皮肤样品，对个体进行体内测试。参考图5，SED指的是标准红斑剂量，即引起红斑（或皮肤变红）需要的UVR的量。图5A示出了mtDNA缺失分析的剂量应答结果，所述mtDNA缺失分析通过在直至3.0SED的UVR剂量之后采集的皮肤擦拭样品上的定量实时PCR实施。该实验证明了UVR诱导的mtDNA损伤随着UVR剂量的增加而增加，直至开始出现红斑的点。在这点上，可能由于红斑组织中凋亡的水平增加使得样品中mtDNA损伤减弱。在对皮肤的长期损伤方面，这表明这是产生皮肤中观察到的长期mtDNA损伤的亚红斑剂量。如图5B中描述的计算损伤的倍数变化。
实施例6：与UV暴露相关联的融合转录体的识别
如上面实施例中描述的，经培养的皮肤等同物生长并利用日光模拟器剂量施加不同水平的UVR。
根据制造商的方案处理样品，使用QuantiGene样品处理试剂盒：培养的细胞(Cultured Cells)(Panomics QS0100)和QuantiGene 2.0试剂体系(Panomics QS0008)，并具体地在每个皮肤等同物中加入300μl稀释的裂解物混合物，然后在50摄氏度下孵育1.5小时，或者直至细胞出现膜的完全裂解。随后每个皮肤等同物以1:10稀释，并进行剩余的方案，用ACTB β-肌动蛋白作为管家靶向融合转录体2、3、11、12、20和32。检测每个样品的所有转录体三次，并为每个样品/转录体对同样建立无模板背景三次。
参考图6至9，在不同次数的重复剂量(OX、15X、18X、21X、24X、27X)下为实验目的使用0.5SED和1.0SED。为清楚起见，暴露于1.0SED 27X的那些皮肤等同物接受到最大水平的UVR。
这些结果证明了在增加的重复剂量下以及在0.5和1.0SED之间每个测试的融合转录体的量增加，这表明与UVR暴露的相关性。
实施例7：产品制剂和测试
以2mg/cm2测试不同水平的UVA滤光剂的三种不具名的制剂。每个制剂的样品在14天的皮肤等同物上用UVA和日光模拟光源来进行测试。同样地，对样品进行体内测试。通过sybr绿色定量实时PCR实施缺失分析。
实验制剂制备为由标准化妆品成分构成的化妆用乳剂。每种产品包含恒定水平的UVB滤光剂，但UVA滤光剂水平如下变化：
表3：新制剂的含量
  样品编号  UVB滤光剂  UVA滤光剂   星级评定
  1(图中的B)  3.8％  0％   1星
  2(图中的A)  3.8％  1.75％   3星
  3(图中的C)  3.8％  4.5％   5星
图10示出了在施用制剂(A、B或C)之后对暴露于UVA（图10）和日光模拟光（图11）的体外样品的PCR分析的结果。在图12中，提供了制剂的体内测试之后的结果。这些数据表明来自日光模拟光的UVR损伤的多因素特性，当只分离有UVA暴露时，损伤水平遵循遮光剂提供的UVA保护的百分比。然而，当在日光模拟光中组合了UVA和UVB UVR的暴露时，样品之间的损伤比率发生变化。对于样品A和B，与A高于期望不同的是，B可能低于期望，这是因为缺乏UVA滤光剂以及在日光模拟光中UVB，使得损伤超过了红斑阈值（00121部分），这表明样品中记录的损伤较小。
这些结果还证明了，由缺失水平和混合物中UVA滤光剂的量指示的损伤水平之间存在相反的相关性。为清楚起见，如在混合物B中，更少的UVA滤光剂导致较高的缺失水平。
实施例8：遮光剂和抗老化品牌筛选
在重复暴露于UVA之前，以2mg/cm2施用各种遮光剂和抗老化产品的样品。遮光剂的测试组包括来自英国/北美最好品牌的spf 15产品。抗老化产品包括来自很多最好品牌的一系列晚霜/精华（图13）。结果显示，尽管所有产品都具有相同的SPF等级(15)，但是用UVA和日光模拟UVR剂量施加之后，产品所提供的保护水平明显不同。这表明，SPF单独不足以评价遮光剂所提供的UVR保护的有效性，这是因为除了UVB暴露（通过SPF等级测量）之外的其他因素对mtDNA损伤是重要的，例如UVA保护和抗氧化活性。抗老化产品包括来自很多最好品牌的一系列晚霜/精华（图14）。这些数据表明，就mtDNA损伤而言，由抗老化型产品提供的保护有大的差异。这些产品中的很多包含抗氧化化合物作为它们的主要活性物质，这表明mtDNA损伤的测量可以区别这些制剂和实际有效的单个活性物质，以及表现出很少保护和没有保护的那些。
尽管已参考一些具体实施方案对本发明进行了说明，但是对本领域技术人员明显的是，在不偏离所附的权利要求中列出的本发明的目的和范围的情况下，可以进行各种修改。本文提供的任何实施例都是仅仅用于举例说明本发明的目的而包括的，并不意在以任何方式限制本发明。本文提供的任何附图都仅仅用于举例说明本发明的各个方面的目的，并不意在按比例绘制或以任何方式限制本发明。本文引用的所有现有技术的公开都通过引用其全部内容而并入本文。
文献目录
下面的参考文件主要在前面的描述中引用。这些参考文件的全部内容通过引用方式并入本文。
Figure BDA00002084201000261
Figure IDA00002084201500011
Figure IDA00002084201500031
Figure IDA00002084201500041
Figure IDA00002084201500051
Figure IDA00002084201500061
Figure IDA00002084201500071
Figure IDA00002084201500111
Figure IDA00002084201500121
Figure IDA00002084201500131
Figure IDA00002084201500141
Figure IDA00002084201500151
Figure IDA00002084201500161
Figure IDA00002084201500171
Figure IDA00002084201500181
Figure IDA00002084201500191
Figure IDA00002084201500201
Figure IDA00002084201500211
Figure IDA00002084201500231
Figure IDA00002084201500251
Figure IDA00002084201500261
Figure IDA00002084201500281
Figure IDA00002084201500301
Figure IDA00002084201500311
Figure IDA00002084201500321
Figure IDA00002084201500341
Figure IDA00002084201500351

Claims (44)

1.一种与UV暴露相关联的分离的线粒体融合转录体。
2.如权利要求1所述的融合转录体，其中所述转录体具有对应于SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的核酸序列。
3.如权利要求1所述的融合转录体，其中所述转录体具有对应于SEQ ID NO:39的核酸序列。
4.一种检测或监测生物样品中紫外线辐射（UVR）暴露的方法，所述方法包括检测所述生物样品中线粒体融合转录体的存在，其中所述转录体与UVR暴露相关联。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述生物样品是取自对象的皮肤样品。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述生物样品是组织培养样品。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述皮肤样品取自所述对象的表皮层。
8.如权利要求4所述的方法，还包括在检测所述融合转录体的存在的所述步骤之前，将所述样品暴露于至少一个亚致死剂量的紫外线辐射（UVR）。
9.如权利要求8所述的方法，其中将所述生物样品暴露于一系列重复的亚致死剂量的UVR。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述一系列重复的亚致死剂量包括将所述生物样品暴露于日剂量的UVR。
11.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述UVR来自日光模拟UVR源。
12.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述UVR包括UVA、UVB或UVA/UVB。
13.如权利要求4至12中任一项所述的方法，其中所述转录体具有对应于SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38或SEQ IDNO:39的核酸序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述转录体具有对应于SEQ ID NO:39的核酸序列。
15.一种确定对象中累积UV暴露的方法，所述方法包括在一段时间检测从所述对象获得的生物样品中与UV暴露相关联的线粒体融合转录体的存在的步骤。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述生物样品来自极少暴露于日光、偶尔暴露于日光、或者经常暴露于日光的皮肤。
17.如权利要求16所述的方法，其还包括将生物样品中转录体的存在与生物参照样品中转录体的存在或者与对照转录体进行比较的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述生物参照样品包括极少暴露于日光的皮肤样品、偶尔暴露于日光的皮肤样品、经常暴露于日光的皮肤样品或血液。
19.融合转录体用于检测UV暴露或作为用于UV暴露的生物标记的用途。
20.一种用于检测UV暴露的试剂盒，所述试剂盒包括：
-探针，所述探针具有与对应于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的核酸序列的一部分基本上互补的序列。
21.一种检测生物样品的人mtDNA基因组中的缺失的方法，其中所述缺失与UV暴露相关联，所述方法包括检测所述生物样品中mtDNA缺失分子的存在，其中所述mtDNA缺失分子具有对应于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:19的核酸序列。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述生物样品是取自对象的皮肤样品。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述生物样品是组织培养样品。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述皮肤样品取自所述对象的表皮层。
25.如权利要求21的所述的方法，其中所述方法用于检测或监测UV暴露。
26.如权利要求23所述的方法，还包括在检测所述mtDNA缺失分子的存在的所述步骤之前，将样品暴露于至少一个亚致死剂量的紫外线辐射(UVR)。
27.如权利要求26所述的方法，其中将所述生物样品暴露于一系列重复的亚致死剂量的UVR。
28.如权利要求29所述的方法，其中所述系列包括将所述生物样品暴露于日剂量的UVR。
29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述UVR来自日光模拟UVR源。
30.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述UVR包括UVA、UVB、或UVA/UVB。
31.一种与UV暴露相关联的分离的mtDNA缺失分子，其中所述mtDNA缺失分子具有对应于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:19的核酸。
32.一种用于确定对象中累积UV暴露的方法，包括在一段时间检测从所述对象获得的生物样品中与UV暴露相关联的mtDNA中的缺失的存在的步骤，其中所述mtDNA缺失具有对应于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQID NO:19的核酸序列。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述生物样品来自极少暴露于日光、偶尔暴露于日光、或经常暴露于日光的皮肤。
34.如权利要求33所述的方法，还包括将所述生物样品中缺失的存在与生物参照样品中缺失的存在或者与对照序列进行比较的步骤。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述生物参照样品包括极少暴露于日光的皮肤样品、或偶尔暴露于日光的皮肤样品、经常暴露于日光的皮肤样品和血液。
36.具有对应于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:19的核酸序列的mtDNA缺失用于检测UV暴露或作为用于UV暴露的生物标记的用途。
37.一种测试或筛选皮肤护理产品在预防、最小化、减轻或保护免受UV暴露、UV损伤、皮肤老化或光老化中的能力的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)对测试样品施用皮肤护理产品，所述测试样品包括皮肤或皮肤等同物；
(b)将所述测试样品暴露于紫外线辐射(UVR)；
(c)检测所述测试样品中以下的存在：
(i)与UV暴露相关联的线粒体融合转录体；或
(ii)与UV暴露相关联的并且具有对应于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的核酸序列的mtDNA缺失分子；和
(e)将检测步骤的结果与参照值进行比较。
38.如权利要求37所述的方法，其中在检测所述融合转录体或所述mtDNA缺失分子的存在的所述步骤之前，将所述测试样品暴露于至少一个亚致死剂量的UVR。
39.如权利要求38所述的方法，其中将所述测试样品暴露于一系列重复的亚致死剂量的UVR。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述一系列重复的亚致死剂量的UVR包括将所述测试样品暴露于日剂量的UVR。
41.如权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述UVR来自日光模拟UVR源。
42.如权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述UVR包括UVA、UVB、或UVA/UVB。
43.如权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述线粒体融合转录体具有对应于SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、或SEQ ID NO:39的核酸序列。
44.如权利要求37至43中任一项所述的方法，其中所述参照值是对照或者在其他皮肤护理产品中检测的值。
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